Apoptose ovocytaire

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Dixièmes journées nationales de la FFER (Deauville, 5–7 octobre 2005)

Apoptose ovocytaire Apoptosis in oocyte R. Lévy Laboratoire de biologie de la reproduction, hôpital Nord, CHU de Saint-Étienne, 42055 Saint-Étienne, France Reçu le 28 juin 2005 ; accepté le 7 juillet 2005 Disponible sur internet le 26 août 2005

Résumé Des phénomènes d’apoptose ont été décrits dans le blastocyste ainsi que, plus récemment, dans l’embryon préimplantatoire. Le développement des embryons pourrait dépendre d’un nombre seuil de cellules apoptotiques ou d’un ratio déterminant des cellules apoptotiques par rapport aux cellules saines de l’embryon. Cette apoptose serait aggravée par des conditions suboptimales de culture, mais trouverait sa ou ses causes dans une apoptose des gamètes (en particulier l’ovocyte) ayant permis l’obtention de l’embryon. L’étude du contrôle génétique de l’apoptose ovocytaire revêt ainsi une importance considérable. En dehors du contexte de la culture in vitro, l’étude de l’apoptose ovocytaire permet d’avancer dans la compréhension de la physiologie de l’insuffisance ovarienne observée lors de la ménopause ou des atteintes des cellules germinales après traitement anticancéreux, afin d’envisager de nouvelles perspectives thérapeutiques voire préventives. © 2005 Elsevier SAS. Tous droits réservés. Abstract Apoptosis has been reported in oocyte and preimplantation embryo. The developmental potential of embryo could be related to its rate of apoptosis. This apoptotic fate could be modulated by suboptimal culture conditions: however, a critical role is played by gamete quality and in particular, oocyte apoptosis. Thus, the investigation of apoptosis-related genes and mechanisms in oocyte is crucial. New technologies, such as microarrays, may contribute to the elucidation of molecular pathways involved in oocyte survival and maturation. Besides in vitro culture and ART, the study of oocyte apoptosis could benefit to research in the fields of menopause or cancer treatment. © 2005 Elsevier SAS. Tous droits réservés. Mots clés : Apoptose ; Contrôle génétique ; Céramide ; Cellules germinales ; Ovocyte Keywords: Apoptosis; Genetic control; Ceramide Germ cells; Oocyte

1. Introduction Le concept de mort cellulaire programmée (MCP) ou mort cellulaire naturelle est apparu dans les années 1960 pour décrire la dégénérescence séquentielle des muscles intersegmentaires du ver à soie. L’exemple classiquement cité concerne l’élimination active à des moments précis de l’embryogenèse de cellules parfaitement identifiées de C. elegans. Ce type de mort cellulaire résulte de l’activation de gènes de la mort cellulaire excluant tout caractère aléatoire et Adresse e-mail : [email protected] (R. Lévy). 1297-9589/$ - see front matter © 2005 Elsevier SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.gyobfe.2005.07.006

non contrôlé du processus. L’apoptose appartient au concept de MCP mais est définie par un substrat morphologique et biochimique spécifique permettant de la distinguer de la nécrose. Il est intéressant de noter que la première observation d’apoptose dans l’ovaire (chez le lapin) est également l’une des premières observations de ce type de mort cellulaire au monde (1885). L’apoptose, décrite dans les tissus en développement et les tissus adultes, régule l’homéostasie tissulaire de l’embryon et de l’adulte et l’élimination de cellules défectueuses ou surnuméraires. Elle peut également être impliquée dans des processus de maturation.

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Chez les mammifères, des phénomènes d’apoptose ont été décrits dans le blastocyste ainsi que, plus récemment, dans l’embryon préimplantatoire [1]. Le développement de l’embryon pourrait dépendre d’un nombre critique de cellules apoptotiques ou d’un ratio des cellules apoptotiques par rapport aux cellules saines de l’embryon. En fonction d’un seuil à déterminer, l’embryon poursuivrait ou non son développement. L’apoptose présente dans l’embryon serait aggravée par des conditions suboptimales de culture, mais trouverait sa ou ses causes dans une apoptose des gamètes (en particulier l’ovocyte) ayant permis l’obtention de l’embryon [1–3]. À cet égard, l’étude du contrôle génétique de l’apoptose ovocytaire revêt une importance considérable. En dehors du contexte particulier de la culture in vitro, l’étude de l’apoptose ovocytaire permet d’avancer dans la compréhension de l’ontogenèse de l’appareil génital féminin, de la physiopathologie de l’insuffisance ovarienne observée lors de la ménopause ou des atteintes des cellules germinales après traitement anticancéreux, afin d’envisager de nouvelles perspectives thérapeutiques voire préventives [4–6].

2. Apoptose ovocytaire et variations physiologiques 2.1. Période fœtale Pendant l’ovogenèse, s’établit le stock définitif de follicules primordiaux qui entreront ultérieurement en phase de croissance folliculaire. La taille de ce stock résulte de trois phénomènes : les mitoses goniales, le moment d’entrée en méiose et la vitesse–importance du processus de dégénérescence. Ce processus de dégénérescence par apoptose est très important car près de 80 % des cellules germinales présentes dans le fœtus à mi-gestation (7 × 106 dans l’espèce humaine) auront disparu à la naissance : il en demeure, dans l’ovaire, 1 × 106 peu après la naissance et 3 × 105 à la puberté. Les périodes de dégénérescence des cellules germinales sont bien identifiées : ce sont les phases de mitoses goniales, la prophase (stades préleptotène et pachytène) de la méiose I et la période de formation des follicules primordiaux. Les résultats expérimentaux confirment que la mort cellulaire, lors de ces périodes, se produit par apoptose [7–10]. En 2005, Fulton a étudié, dans l’ovaire fœtal humain, la cinétique des mécanismes de prolifération, de mitose et de d’apoptose des cellules germinales lors de la formation des follicules primordiaux, vers la 18e semaine de gestation [11]. L’ensemble des caspases 2, 3, 7, 8 et 9 a pu être détecté dans l’ovaire fœtal humain. Le nombre de cellules germinales exprimant la caspase 3 clivée active augmente entre la 14e et la 19e semaine de gestation, chute à la 20e semaine de gestation : elle n’est plus exprimée dans les follicules primordiaux. Les travaux de Fulton suggèrent une augmentation progressive de l’apoptose dans l’ovaire humain à la période où se forment les follicules primordiaux. La cause de cette apoptose n’est pas parfaitement élucidée : chaque ovocyte aurait impérativement besoin de s’associer à un nombre suffisant

de cellules somatiques prégranulosa pour survivre, selon un modèle qui rappelle celui du développement du système nerveux. Certaines neurotrophines sont d’ailleurs impliquées dans le processus de formation du follicule primordial chez le rongeur et chez l’humain [12,13], et, ultérieurement, dans l’acquisition de la compétence cytoplasmique de l’ovocyte permettant le développement embryonnaire, chez le bovin [14]. D’autres facteurs participent à la régulation : l’expression de l’activine A augmente de façon transitoire dans les cellules germinales humaines juste avant la formation des follicules primordiaux [15], alors que les cellules germinales continuent à exprimer c-kit et la neurotrophine 4 [12,16]. Ainsi, l’apoptose s’accélère, aboutissant à une élimination accrue de cellules germinales juste avant la formation du follicule primordial, qui paraît offrir un environnement protecteur à l’ovocyte en méiose. L’importance de l’apoptose ovocytaire en période fœtale ne doit pas faire oublier qu’il existe une apoptose ovocytaire massive postnatale, puis dans l’ovaire adulte (seuls 300– 400 ovocytes seront ovulés durant la période d’activité génitale, 99,9 % subissent une atrésie par apoptose), qui s’accélère avec l’âge et culmine chez la femme dans la cinquième décade, aboutissant à la ménopause (< 102–103 ovocytes). L’atrésie peut survenir à tout stade de maturation du follicule ; cependant, en fonction de la taille du follicule, la lignée cellulaire responsable de l’apoptose diffère : • l’apoptose de l’ovocyte déclenche l’atrésie des follicules primordiaux, primaires et petits préantraux ; • l’apoptose des cellules épithéliales folliculaires déclenche l’atrésie des gros follicules, depuis le follicule préantral tardif jusqu’au follicule antral. 2.2. Chez l’adulte âgée On connaît le déclin de la fertilité de la femme avec l’âge. On peut l’expliquer par l’épuisement de la réserve ovarienne [17], par une diminution de la réponse ovarienne, mais d’autres mécanismes sont aussi impliqués : qualité ovocytaire, anomalies chromosomiques. 2.2.1. Fragmentation de l’ADN Fujino et al. [18] ont étudié la qualité ovocytaire chez la souris âgée, et observé un taux élevé de fragmentation de l’ADN (TUNEL) associé à un taux de fécondation médiocre. Les ovocytes engagés dans le processus apoptotique ne seraient pas fécondables. L’apoptose serait ainsi un moyen d’éliminer les ovocytes défectueux à cause d’un âge maternel avancé et inaptes à la fécondation. 2.2.2. L’antigène Fas Wu et al. confirment ces résultats en 2000 dans l’espèce humaine [19]. Le potentiel de développement des ovocytes diminue avec l’âge, in vitro et in vivo. La médiocre qualité ovocytaire et la faible fertilité chez la femme âgée sont associées à une fragmentation accrue de l’ADN avec des signes morphologiques d’apoptose. L’antigène Fas, présent à la

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membrane ovocytaire, pourrait être l’élément inducteur de cette apoptose. 2.2.3. Céramide et Sphingosine-1-phosphate (S1P) Dans l’ovaire humain, les taux de céramide s’élèvent dans les années précédant la ménopause [20]. Chez la souris, Perez et al. ont, en 2005, démontré que le céramide est transféré depuis les cellules du cumulus (lieu de production) vers l’ovocyte avant le déclenchement de l’apoptose : le céramide déclenche alors, chez la souris âgée, une apoptose de la cellule germinale [21]. Cette apoptose ne se produit pas en cas d’anomalie des gap-junctions. De même, lorsque l’on traite les souris âgées par le S1P, le transport du céramide vers l’ovocyte a lieu, mais aucune apoptose n’est observée secondairement. Ainsi, l’origine de l’apoptose germinale chez la souris âgée semble multifactorielle impliquant une altération du transport du céramide (gap-junctions), une hypersensibilité de l’ovocyte à l’apoptose induite par le céramide, ainsi qu’une augmentation de Bax (protéines et transcrits).

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au milieu de culture réduit considérablement la survenue de l’apoptose des CGPs dans les premières heures [26,27]. Qu’en est-il in vivo ? Un examen de l’embryon de souris entier montre qu’il existe très peu de CGPs en apoptose dans les crêtes gonadiques (< 1 %) et que les CGPs en apoptose sont presque exclusivement localisées en dehors des futures gonades [28]. Quels sont les mécanismes impliqués dans l’apoptose des CGPs ? L’un des mécanismes par lequel KL réduit significativement l’apoptose des ovocytes aux stades pachytène– leptotène est le maintien d’une faible expression en Bax (facteur proapoptotique) [29]. En 2005, l’action antiapoptotique du KL–SCF a été confirmée sur l’ovocyte dans des ovaires en culture riches en follicules primordiaux : le déclencheur du signal semble être le récepteur membranaire c-kit, via PI3 K/AKT, avec une régulation par les protéines de la famille de Bcl2 [30]. Dans ce modèle, KL–SCF accroît l’expression des protéines antiapoptotiques Bcl2 et BclxL et réduit celle du facteur proapoptotique Bax. 3.3. Contrôle génétique

3. Régulation et contrôle génétique 3.1. Facteurs proapoptotiques inducteurs de mort ovocytaire : deux candidats 3.1.1. Système Fas–FasL (Fas = Fas antigène = Fas récepteur) Fas est un récepteur transmembranaire de 45 kd qui appartient à la famille de récepteurs du tumor necrosis factor (TNF) et du neural growth factor (NGF). La protéine Fas ligand (31 kd) est son ligand. Le couple Fas–FasL est impliqué dans les mécanismes d’immunorégulation dans le système immunitaire tel que l’élimination des cellules auto-immunes périphériques par apoptose. Fas est présent dans l’ovaire postnatal humain, dans les ovocytes de follicules primordiaux et primaires [22]. Comme Fas ligand est également présent dans les ovocytes de follicules I, II et III de souris [23] et que l’interaction Fas–FasL induit l’apoptose, ce couple constitue un candidat pour le contrôle de l’apoptose ovocytaire. 3.1.2. TNF␣ TNFa est un polypeptide de 17 kd principalement sécrété par les macrophages mais également présent dès la naissance dans les ovocytes de rat [24]. Ces résultats ont été confirmés récemment par Naz et al. [25] qui ont montré la présence de messagers pour TNFa et son récepteur de type II, TNF RII, dans l’ovocyte préovulatoire humain. 3.2. Facteurs de survie ovocytaire Les cellules germinales primordiales (CGPs) isolées à partir des embryons de souris subissent, après quatre–cinq heures de culture in vitro, une mort cellulaire présentant toutes les caractéristiques d’apoptose. L’addition de kit ligand (KL)– stem cell factor (SCF) ou de leukemia inhibitor factor (LIF)

La mort cellulaire programmée est un ensemble d’événements strictement contrôlés par au moins 100 produits de gènes qui activent ou inhibent le suicide cellulaire. Parmi eux, les plus étudiés sont les membres de la famille de Bcl2, qui peuvent être divisés en deux groupes : les inhibiteurs de l’apoptose (Bcl2, BclxL, Bclw, Mcl1, A1) et les inducteurs (Bax, Bak, Mtd, BH3). Parmi les inducteurs, certains renferment de multiples domaines (domaines BH1, BH2 et BH3 comme Bax, Bak, Mtd) ou un domaine unique (contenant uniquement BH3, comme Bad, Bim, Hrk, Bid). Les membres de cette famille s’organisent en homo- ou hétérodimères. Les concentrations en protéines pro- ou antiapopotiques (balance) formées déterminent l’évolution d’une cellule. 3.3.1. Famille Bax–Bcl2 Les membres de la famille de Bcl2 sont des éléments fondamentaux des voies responsables du contrôle de l’apoptose des ovocytes et des cellules épithéliales de la granulosa [31]. Bcl2 est un proto-oncogène inhibiteur de l’apoptose. Bax (exprimé par les cellules de la granulosa et l’ovocyte) s’hétérodimérise avec Bcl2 pour bloquer son action antiapoptotique [32]. Bcl2 code pour une famille de protéines ancrées dans la membrane externe des mitochondries, et capables d’inhiber, au cours de la phase d’exécution de l’apoptose, le facteur AIF (apoptosis inducing factor). Le knock-out de ces deux gènes (Bax ou Bcl2) altère la population de follicules primordiaux [33,34], ce qui suggère une modulation par ces gènes de l’intensité de l’apoptose ovocytaire au cours de l’organogenèse ovarienne. 3.1.1.1. Lagostomus maximus : un modèle de suppression de l’apoptose et d’hyperproduction d’ovocyte dans l’ovaire adulte. L. maximus ovule 400–800 ovocytes par cycle, dont seuls 8–10 sont fécondés. Cette production massive d’ovocy-

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tes pourrait être expliquée par un très faible taux d’apoptose au sein des follicules dans l’ovaire adulte, lié à une inversion du classique rhéostat Bcl2–Bax (très forte expression de Bcl2, expression constitutive de Bax). 3.1.1.2. Bax et les méfaits du tabac. Les travaux de Matkainen et al. démontrent que tout facteur induisant un déséquilibre en faveur de Bax est susceptible d’accentuer la perte d’ovocytes [35,36]. Le promoteur du gène Bax contient deux éléments de réponse pour le récepteur Ahr (aryl hydrocarbone), un facteur de transcription largement exprimé dans les follicules ovariens et qui est activé lors de son couplage avec des toxines de type hydrocarbures aromatiques polycycliques. L’administration ex vivo d’hydrocarbures à des ovaires de souris entraîne une augmentation de la transcription du gène Bax et l’apoptose consécutive des ovocytes. L’apoptose induite par ces hydrocarbures peut être inhibée dans les souris Bax–/– ou en présence d’un antagoniste de Ahr. Matkainen et al. obtiennent des effets similaires chez des souris ayant subi une xénogreffe de tissu ovarien humain. À noter que la source principale d’hydrocarbures aromatiques polycycliques est la combustion des énergies d’origine fossile et la fumée de cigarette... 3.1.1.3. Bax et insuffısance ovarienne. Chez la souris jeune Bax–/–, on note une multiplication par trois du nombre de follicules primordiaux dans leur réserve ovarienne par rapport à des souris sauvages Bax+/+. Ce surplus de follicules est maintenu à un âge avancé : des souris de 20–22 mois conservent ainsi des centaines de follicules à tout stade de leur développement et une hypertrophie utérine (stéroïdedépendante) qui contraste avec l’atrophie ovarienne et utérine des souris Bax+/+ [37]. Les ovocytes en métaphase II de souris Bax–/– obtenus après hyperstimulation ovarienne permettent l’obtention d’embryons en FIV, mais aucune grossesse spontanée n’a pu être obtenue. Perez et al., dès 1997, montrent également que les souris Bax–/– présentent une résistance accrue à l’apoptose induite par la doxorubicine, une substance anticancéreuse [38]. 3.3.2. Caspases La caspase 3 est présente dans l’ovocyte [39]. Le knockout de la caspase 2 aboutit à la production d’ovaires contenant un nombre accru de follicules primordiaux [40,41] ; les ovocytes sont alors résistants à l’apoptose induite par les agents utilisés en chimiothérapie [41]. Bien qu’il soit possible de bloquer l’apoptose post-thérapeutique anticancéreuse en agissant sur des protéines comme Bax (famille Bcl2) ou la protéase caspase 2 dans un modèle de souris knock-out, cela ne peut évidemment pas être transposé à l’espèce humaine. La piste d’un lipide naturellement produit, le sphingosine-1phosphate, semble plus prometteuse. 3.3.3. Perspectives thérapeutiques : sphingomyélinase acide Les radiations ionisantes et certains agents utilisés en chimiothérapie déclenchent l’apoptose de différentes cellules

somatiques et germinales en provoquant la synthèse d’un sphingolipide membranaire, le céramide, produit par hydrolyse de la sphingomyéline. Les souris déficientes en sphingomyélinase acide présentent certains avantages [42] : • in vivo, les ovaires de souris déficientes en sphingomyélinase acide (ASMase) contiennent deux fois plus de follicules que les souris sauvages, par inhibition massive de l’apoptose fœtale des cellules germinales ; • ex vivo, la survie de leurs cellules germinales, mises en culture sans hormone de croissance, est nettement augmentée (< 30 % d’apoptose versus > 85 % pour les cellules germinales sauvages). De plus, les cellules germinales ne sont pas sensibles à la doxorubicine, une substance anticancéreuse. Le céramide, agent proapoptotique, peut être métabolisé en sphingosine, puis en sphingosine-1-phosphate, le S1P. Or, le S1P est un puissant antagoniste des réponses au stress cellulaire et de l’apoptose induite par le céramide, ces deux fonctions expliquant son précieux rôle protecteur : • ex vivo, les ovocytes de souris sauvages traités en culture avec des doses croissantes de sphingosine-1-phosphate, sont de la même façon résistants à l’apoptose que les ovocytes des souris déficientes en sphingomyélinase acide ; • in vivo, l’injection locale intraovarienne (pour éviter d’éventuels effets systémiques) de sphingosine-1phosphate (S1P) deux heures avant irradiation (à dose suffisante pour détruire 80 % du capital folliculaire) inhibe spécifiquement et complètement l’apoptose ovocytaire massive provoquée par la radiothérapie. Les ovocytes qui ont été ainsi protégés par le S1P sont fécondables et permettent un développement embryonnaire normal in vitro, mais aussi in vivo [43]. Récemment, des études sur deux générations de 500 petits nés après irradiation des ovaires protégés par le S1P ont été réalisées et sont rassurantes. Tilly et Kolesnick dressent ainsi une « scène du crime » dont le thème est la destruction des ovocytes (la victime) par l’apoptose induite par les traitements anticancéreux (le suspect et son mobile) [44]. Si l’on admet que le céramide est l’arme du crime, les auteurs proposent d’empêcher les crimes futurs par l’utilisation préventive du S1P. Ces résultats encourageants ont ouvert une voie de recherche intéressante. Toutefois, avant d’envisager, en clinique, l’utilisation de la sphingosine-1-phosphate dans la prévention de la stérilité féminine post-thérapeutique anticancéreuse, le rôle protecteur du S1P doit être examiné sur des tissus humains, en particulier des ovocytes. De plus, le mécanisme d’action cellulaire et moléculaire du S1P doit être précisé : type de récepteur, voie d’activation. 3.3.4. Perspectives diagnostiques : vers une carte d’identité génétique de l’ovocyte Il est possible d’établir un profil d’expression pour différents gènes sur ovocyte ou embryon unique, depuis l’ovocyte jusqu’à l’embryon éclos [45,46]. Le profil d’expression de 15 ovocytes humains en métaphase II (non fécondés), prove-

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nant de différentes patientes, a pu être établi par RT-PCR quantitative pour cinq des plus fréquents gènes de la famille de Bcl-2 : deux gènes pro- (Bax et hara-kiri (Hrk)) et trois gènes antiapoptotiques (Bag1, Bclx et Mcl1). La part de chaque gène a pu être clairement déterminée pour chaque ovocyte, aboutissant à trois profils d’expression : ovocytes enclins à l’apoptose, ovocytes bien protégés contre l’apoptose, et ovocytes avec un équilibre entre gènes pro- et antiapoptotiques. Ces résultats confirment l’hypothèse d’un niveau d’apoptose variable d’un ovocyte à l’autre : la balance entre l’expression des gènes pro- et antiapoptotiques pourrait être un élément clé de la survie et du développement embryonnaire. En 2005, Wells et al. ont analysé par technique de RT-PCR en temps réel l’expression de neuf gènes dans chacun des quatre ovocytes humains en métaphase II étudiés (ovocytes non fécondés en FIV) [46]. Globalement, les quantités d’ARNm pour chaque gène sont plus importantes dans l’ovocyte que dans l’embryon clivé, sauf pour le groupe de gènes impliqués dans la régulation de l’apoptose et/ou le cycle cellulaire (TP53, RB1 et ATM), exprimé en très faible quantité dans l’ovocyte. Enfin, la technologie des microarrays à ADN permet désormais l’identification de très nombreux gènes exprimés dans les ovocytes primordiaux de primates [47] ou de souris [48]. Arraztoa et al. ont ainsi identifié 95 gènes, parmi les 7680 analysés, exprimés deux fois plus intensément dans les ovocytes primordiaux de primates que dans le placenta humain utilisé comme référence. L’analyse bio-informatique a permis d’établir un profil fonctionnel des gènes surexprimés : cycle cellulaire (14 %), transport (13 %), transduction du signal (10 %), cytosquelette (7 %), facteur de transcription (5 %), réponse immunitaire (5 %) et apoptose (5 %). Cette même technique permet d’établir le profil d’expression — 1361 transcrits identifiés — d’un unique ovocyte humain [49]. 3.4. Maturation ovocytaire 3.4.1. S1P et maturation ovocytaire L’exposition au choc thermique réduit les taux de clivage et de formation de blastocyste. Le sphingosine-1-phosphate (S1P) protége les ovocytes bovins du choc thermique (41 °C) lors de leur maturation. L’addition de 50 nM de S1P au milieu de maturation n’a aucun effet sur les ovocytes maturés à 38,5 °C mais permet aux ovocytes maturés à 41 °C de maintenir un taux de clivage et de développement normaux. À j8, les blastocystes des deux groupes (témoin, S1P) ne présentent aucune différence en termes d’activité caspases, de nombre total de cellules ou de pourcentage de cellules apoptotiques. De plus, l’utilisation d’un inhibiteur de la S1P endogène — un inhibiteur de la sphingosine kinase — réduit dans tous les cas les taux de clivage et de développement, que les ovocytes soient maturés à 38,5 ou 41 °C. Le S1P protége ainsi les ovocytes d’un choc thermique ; il intervient également dans la maturation de l’ovocyte, et ce même en l’absence de choc thermique [50].

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3.4.2. Fas et FasL L’expression de Fas et FasL a été étudiée avant et après activation de la voie de Fas par un agoniste anti-Fas, durant la maturation in vitro d’ovocytes bovins en présence ou en absence de FSH. Fas a été détecté sous forme de transcrit et de protéine dans l’ovocyte et les cellules du cumulus, alors que la protéine FasL n’a pu être décelée que dans les cellules du cumulus. L’activation de la voie de Fas et la présence de FSH lors de la maturation in vitro ont augmenté l’incidence de l’apoptose des cellules du cumulus, mais n’a eu aucun effet sur la compétence ovocytaire [51]. 4. Apoptose ovocytaire et fécondation in vitro 4.1. Durée de culture in vitro Fujino et al. (1996) rapportent que la durée de la culture in vitro des ovocytes affecte leur qualité par l’observation d’une augmentation du taux de fragmentation de l’ADN [18]. Takase et al. (1995) confirment que la dégénérescence in vitro des ovocytes de souris non fécondés se fait par apoptose [52]. 4.2. Apoptose ovocytaire et fragmentation embryonnaire 4.2.1. Non... Van Blerkom et al. ont analysé la fragmentation de l’ADN ovocytaire dans l’espèce humaine et chez la souris par TUNEL en y associant le marquage des PS (phosphatidyl serines) par annexine V [53]. Ils concluent qu’il est prématuré d’affirmer que la fragmentation de l’ADN dans les ovocytes en métaphase II, mise en évidence par TUNEL, est indicatrice d’apoptose. Ils affirment que : • l’apoptose est rare dans les ovocytes humains et de souris ; • les marquages par annexine V et TUNEL ne semblent pas corrélés ni dans l’espace, ni chronologiquement, comme le seraient des marqueurs successifs de la cascade des évènements retrouvés au cours de l’apoptose ; • les échecs de fécondation en FIV ne sont pas associés au marquage par annexine V et TUNEL ; • quand une fluorescence TUNEL est détectée, sa survenue est spécifique de la patiente, et non liée à l’âge maternel. 4.2.2. Oui... Perez et al. en 1999 [54] ont complété l’étude de Van Blerkom, sur ovocytes de souris uniquement, par l’étude de l’activité caspase et confirmé les observations de Fujino et al. : la fragmentation de l’ADN observée dans les ovocytes ovulés est liée de façon indéniable à l’apoptose. Les auteurs attribuent les résultats contradictoires de Van Blerkom à des difficultés techniques, ceux-ci ayant modifié la méthode de marquage TUNEL [55]. Le mode opératoire concernant le marquage par annexine V des ovocytes effectué par l’équipe de Van Blerkom pourrait expliquer les résultats obtenus et l’absence de corrélation entre les deux techniques (TUNEL et annexine V) (Lévy, données non publiées).

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4.2.3. Les télomères... Le débat a été récemment relancé par Keefe et al., qui affirment que la taille des télomères déterminée dans les ovocytes humains est un élément prédictif de la fragmentation cytoplasmique de l’embryon. Le raccourcissement des télomères induirait ainsi une apoptose dans l’embryon humain préimplantatoire. Il évoque même une théorie impliquant les télomères dans les altérations de la fonction reproductive chez la femme âgée [56]. 4.2.4. Fas soluble... Fas soluble (sFas) est réputé inhiber l’apoptose médiée par Fas en s’opposant à la transduction du signal de mort cellulaire. Pour la première fois, sFas a pu être mesuré dans les fluides folliculaires (FF) et les milieux contenant les complexes cumulo-ovocytaires (CM) de patientes bénéficiant d’une FIV. Les auteurs confirment certaines données comme un taux folliculaire plus élevé de sFas (FF) en cas d’ovocyte mature, suggérant un taux d’apoptose modéré et un taux plus bas de sFas dans les CM uniquement si l’ovocyte est fécondé. Ils observent également des éléments inattendus comme un taux plus bas de sFas, surtout dans le CM, en cas d’embryon de morphologie parfaite ou l’obtention d’une grossesse clinique corrélée à un taux plus bas de sFas dans le CM des embryons transférés [57]. 4.2.5. Le transfert de cytoplasme : la solution ? Les facteurs intervenant dans l’arrêt de développement embryonnaire précoce sont pour la plupart déterminés au stade zygote voire dans l’ovocyte. Ces facteurs maternels qui pourraient jouer sur le développement préimplantatoire sont des ARNms cytoplasmiques, des protéines antioxydantes, de petits peptides des lipides et des organelles. Tilly a clairement démontré que la survie ovocytaire était sous le contrôle de molécules régulatrices de mort cellulaire capables de déclencher ou d’inhiber l’apoptose [4]. Depuis MuggletonHarris et al. [58], on sait que le transfert de produits maternels via le transfert de cytoplasme, chez la souris, influence positivement le développement embryonnaire et permet de lever le blocage au stade de deux cellules chez la souris. Depuis la première grossesse dans l’espèce humaine, en 1997, après transfert de cytoplasme, plus de 30 enfants sont nés sans que l’on sache précisément l’indication de cette technique, ce que l’on injecte, en quelle quantité, ce qu’en seront les effets à long terme [59]. Dans certains cas, le transfert de cytoplasme, motivé par une fragmentation embryonnaire constante, a permis, chez l’homme, d’améliorer la qualité embryonnaire et d’obtenir une grossesse. Depuis, Perez et al. (1999) ont démontré, chez la souris, que l’injection intracytoplasmique de mitochondries isolées suffisait pour empêcher la fragmentation ovocytaire, faisant de ces organelles des candidats éligibles [54]. 5. Conclusion L’étude de l’apoptose ovocytaire connaît une pleine expansion. Cependant, l’étude de l’apoptose ovocytaire est diffici-

lement dissociable de l’apoptose des cellules de la granulosa et de la qualité des communications entre cellule germinale et cellules épithéliales. En physiologie, l’étude du contrôle génétique et des facteurs de régulation de l’apoptose ovocytaire (famille Bcl-2 en particulier) bouleverse les dogmes et permet d’envisager des traitements pour retarder l’âge de survenue de la ménopause. En pathologie, les travaux de Tilly sur le céramide, et surtout sur son métabolite, le S1P, ouvrent de nouvelles voies d’étude pour lutter contre les effets néfastes des thérapeutiques lourdes anticancéreuses. En FIV, d’anciens (TUNEL, annexine V) et de nouveaux marqueurs (Fas soluble, télomère etc.) apparaissent, reliant qualité– maturité ovocytaire (apoptose) et qualité embryonnaire. Dans tous les cas, ces études, certes encourageantes, demandent à être confirmées et les mécanismes cellulaires et moléculaires en cause dûment identifiés. Dans certains cas (S1P), seuls les essais cliniques sur l’homme permettront de conclure à l’efficacité de ces nouvelles stratégies.

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