Clonage et expression de la protéine 14-alpha-déméthylase de Candida albicans chez Pichia pastoris

84 type Glcb1,3Glc. Après association avec un his-tag, la protéine a été purifiée et marquée au FITC par la technique classique. Le CBM a la particularité de posséder cinq sites de fixation pour le glucose et surtout, un Kd considérablement augmenté à température ambiante (3,5. 10 7M à 25 8C). Ceci est remarquable pour un CBM dont l’affinité pour son substrat ne dépasse généralement pas 10 3M. Celui-ci est également spécifique car son affinité chute de 100 fois envers le glucose ou le cellopentaose (Glc1,4)5. Enfin, la protéine est très stable et se conserve plusieurs mois à 4 8C sans changement d’activité. Le profil de détection du CBM4-2-FITC (1 mM) a été évalué vis à vis de plusieurs souches de Candida albicans. Sur blastoconidies viables, une fixation du CBM est observée uniquement au niveau de la base du bourgeon, tandis que le marquage par la Concanavaline A-FITC utilisée en témoin montre une fluorescence uniforme. Le marquage par le CBM4-2 est similaire à celui obtenu par d’autres auteurs avec la dectine marquée par un fluorochrome ou des anticorps anti b-1,3 glucanes. Après traitement par la pronase ou simple chauffage, le b glucane est détectable sur l’ensemble de la surface de la cellule non viable. Le CBM42 reconnaît les b glucanes de différentes espèces de Candida. Par ailleurs, dans ces conditions, les images obtenues en microscopie à partir de filaments sont comparables à celles obtenues avec un marqueur de chitine. En conclusion, le CBM4-2 pourrait constituer un réactif d’intérêt pour la détection des Candida et l’étude de l’interaction hôte—fungi viables, en particulier l’étude des phénomènes de reconnaissance précoce et de mise en place de la réponse immune innée. ´ fe ´ rence Re [1] Boraston. et al. Biochemistry 2001;40:14679—85. http://dx.doi.org/10.1016/j.mycmed.2012.12.043

Clonage et expression de la protéine 14-alphadéméthylase de Candida albicans chez Pichia pastoris

E. Robert, N. Alvarez Rueda *, P. Le pape ´ partement de parasitologie et de mycologie me ´ dicale, universite ´ De ´ s, EA1155—IICiMed, faculte ´ de Nantes, Nantes Atlantique Universite de pharmacie de Nantes, Nantes, France *Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected]. L’enzyme 14-a-déméthylase (CaErg11p, CaCYP51) codée par le gène CaERG11 chez Candida albicans est impliquée dans la biosynthèse de l’ergostérol, principal stérol de la membrane plasmique des micromycètes. Cette enzyme est nécessaire à l’élimination d’un groupement méthyle sur le carbone 14 du squelette stéroïde du lanostérol. Son inhibition par les antifongiques azolés aboutit à l’accumulation de stérols 14-méthyl 3, 6 diol toxiques pour la levure. L’utilisation de certains azolés en prophylaxie ou en curatif a fortement contribué à l’apparition de phénomènes de résistance ayant pour origines, la surexpression et/ou les mutations des gènes codant pour les pompes à efflux (CDR1, CDR2, MDR1) et la surexpression et/ou les mutations du gène CaERG11. Concernant ce dernier gène, nombreuses sont les mutations décrites dans la littérature et l’impact des substitutions d’acides aminés correspondantes sur l’interaction avec les azolés est encore aujourd’hui estimé par un modèle 3D d’homologie entre la séquence protéique et la structure cristallisée du CYP51 de Mycobacterium tuberculosis. Or, les différences de séquences sont telles que l’explication de l’impact n’est pas toujours possible. L’expression hétérologue et la purification de la protéine CaErg11p deviennent alors indispensables pour les études de cristallisation et de modélisation. Par ailleurs, un modèle plus pertinent permettrait le docking rationnel de nouvelles molécules antifongiques. D’autre part, l’obtention de la protéine

Compte rendu de congrès/Proceeding of congress recombinante permettrait le criblage de molécules par inhibition de son activité enzymatique. L’implication des mutations K143R et S405F dans la résistance aux azolés a été récemment confirmée par des études d’expression hétérologue chez la levure S. cerevisiae ; ces substitutions intervenant probablement dans une diminution de l’affinité ciblemédicament. Nous avons introduit ces deux mutations dans le gène CaERG11 par mutagenèse dirigée et ajouté un tag histidine pour sa purification. Le clonage du gène a été effectué dans un plasmide d’expression chez la levure Pichia pastoris. L’expression de la protéine recombinante ERG11p (CYP51) dans le surnageant de culture de P. pastoris a été suivie après induction dans le milieu méthanol (BMMY) pendant sept jours. Après concentration et migration sur gel de polyacrylamide 10 %, puis transfert sur membrane de nitrocellulose, la protéine a été révélée à l’aide d’un anticorps anti-histidine et d’un sérum polyclonal antiCYP51 de levure. Parallèlement, les protéines ont été purifiées par chromatographie d’affinité sur colonne de Nickel Hi-Trap. Les rendements de purification ainsi que les difficultés liées à la dégradation protéique sont discutées. Au final, la purification des enzymes poly-mutée et sauvage vise à réaliser des études de modélisation moléculaire et de criblage de nouvelles molécules antifongiques capables de contourner certains mécanismes de résistance. http://dx.doi.org/10.1016/j.mycmed.2012.12.044

Élastase, collagénase et gliotoxine d’Aspergillus fumigatus au cours de l’aspergillose invasive murine I. Ourliac a, O. Grovel b, F. Pouchus b, P. Le Pape a,* a ´ partement de parasitologie et de mycologie me ´ dicale, De EA1155- IICiMed, France b ´ de Nantes, Nantes Atlantique EA 2160 — MMS, universite ´ s, Nantes, France universite *Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected].

Durant le processus infectieux, Aspergillus fumigatus rencontre des micro-environnements variés auxquels il doit s’adapter pour survivre et disséminer chez l’hôte. Sa virulence, phénomène multiparamétrique, est associée entre autre à la production de gliotoxine et d’enzymes protéolytiques à l’origine de dommages cellulaires ou de l’obtention de nutriments. L’importance de ces paramètres doit être prise en compte dans l’interprétation des résultats des modèles d’interactions cellulaires hôte-pathogène et d’expérimentation animale. Dans le but de disposer d’un lot de souches aspergillaires bien caractérisées, 12 isolats cliniques d’A. fumigatus ont été sélectionnés dans notre souchotèque. Pour chaque souche, les activités elastinolytique et collagénolytique ont été déterminées à l’aide de leurs substrats respectifs (azocoll et elastine-congored) et d’inhibiteurs de sérine et de métalloprotéases. La production de gliotoxine sécrétée a également été quantifiée. Parallèlement, la virulence de chacun des isolats a été évaluée dans deux modèles expérimentaux d’aspergillose invasive chez la souris immunodéprimée non neutropénique après inoculation intranasale ou intraveineuse de spores. Par rapport à l’instillation intranasale, l’inoculation intraveineuse multiplie le risque d’atteinte du foie par 12 (OR = 11,6 [4,52—31,05], p < 10 5) tandis qu’elle inverse le risque pour le cerveau (OR = 0 [0—0,7], p < 10 5). Dans les conditions expérimentales, les souches produisent une activité collagénolytique variable allant de 1,6 à 25,7 unités équivalent clostridiopeptidase A. Cette activité est inhibée de 25 à 68 % par le PMSF. De même, l’activité élastinolytique varie de 1,6 à 25,7 unités arbitraires et la quantité de gliotoxine sécrétée varie de 0,15 à 233 mg en fonction de la souche. Les corrélations les plus fortes entre les paramètres dosés