Comment j'aborde en 1986 l'exploration thyroïdienne In Vitro par les techniques immuno-analytiques non isotopiques

TECHNIQUES AU QUOTIDIEN

,, Comment j'aborde en 1986 I'exploration thyro' 'dienne In Vitro par les techniques immuno-analytiques non isotopiques ,, L. DELVIGNE . Laboratoire de Pharmacologie-Biochimie, service du Pr. G. OLIVE, H6pital Saint Vincent de Paul, 74, avenue Denfert-Rochereau, 75014 Paris . L.A.B.M. La Fontaine, 1, rue du Chateau La Fontaine, 91220 Br(~tigny-sur-Orge

Entre I'apparition sur le march6 frangais des premieres trousses de dosage de la thyroxine totale s~rique (T4) par mdthode enzymo-immunologique (EIA) en phase homog~ne (EMIT*) et I'inscription & la nomenclature des actes de biologie mddicale en 1985 des techniques d'immuno-analyse non isotopiques, la multiplication des r6actifs, mat6riels, et/ou syst~mes pose au Biologiste privd un probl~me de choix en particulier en mati~re d'exploration thyro'h dienne ,, in vitro ,,. Celle-ci ne peut ~tre abordde au laboratoire que par les dosages plasmatiques des hormones thyroxine (T4) , tri-iodothyronine (T3), thyrdostimuline (TSH), des fractio.ns libres circulantes T3L (FT3), T4L (FT4) et de la Thyroxin Binding Globulin (TBG). Le Biologiste devra s'orienter en fonction de ses impdratifs propres (nombre et frdquence des param~tres demand~s, matdriel existant ou en projet d'dquipement, disponibilitd et qualitd du personnel technique, coot des analyses...) et faire un tri dans les multiples informations et offres proposdes par les ingdnieurs commerciaux pour sdlectionner les m6thodologies garantissant la qualitd des r~sultats. Ayant commencd & dtudier les techniques EIA d~s 1977 en milieu hospitalier (1, 2,.3) j'ai adoptd des mdthodologies ,, ouvertes ,, (ne liant pas appareillage et r~actifs), I'importance de mon laboratoire privd ne me permettant pas d'acqudrir un syst~me sp~cifique ,, fermd ,,. Ces mdthodologies ont fait I'objet de travaux de validation soit par I'dquipe hospitali~re ou la Commission Scientifique (4) auxquelles j'appartiens, soit par des auteurs qui ont suivis des protocoles similaires.

m6morisation de la derni6re courbe accept~e et correction possible de. la courbe & valider. TRI-IODO-THYRONIN E TOTALE et THYREOSTIMULINE Les trousses ENZYMUM-TEST (***) permettent le dosage de la T 3 et de la TSH par m~thode EIA ELISA (en phase h6t~rog~ne sur tubes rev~.tus). Ces dosages peuvent (~tre effectu~s manuellement mais sont grandement facilit~s par I'utilisation d'un syst~me ES-22 (***) (5) qui comprend : un micro-ordinateur Epson HX-20 pilotant une unit~ de distribution/lavage/transfert connect6e & un photom~tre 4010 (pouvant ~tre utilis~ en biochimie clinique), Cet ensemble semi-automatique prend en charge les analyses apr~s distribution des ~chantillons et du premier tampon jusqu'au calcul des r~sultats par une courbe de type ,, spline ,, avec correction possible de la courbe & valider. L'appareil accepte les d~terminations en simple, double et triple exemplaires. THYROXIN BINDING GLOBULIN L'utilisation des plaques LC PARTIGEN ( . . . . ) permet le dosage de la TBG s~rique par immunodiffusion radiale (d6termination du diam~tre d'immunopr6cipitation et calcul & partir d'une courbe d'~talonnage). RAPPORT T4/TBG A partir des d~terminations pr6c6dentes, on calcule le rapport T4/TBG dont on a m ontr6 comme pour I'index de thyroxine libre (ITL) la correlation avec les concentrations de T 4 libre (6, 7) ce qui permet une approche d'un param~tre actuellement non dosable en EIA.

MATI~RIEL ET MI=THODES

RESULTATS

THYROXINE TOTALE

THYROXINE TOTALE

La trousse EMIT-14 dosant la thyroxine par m~thode EIA en phase homog6ne (sans ~tape de s6paration), se prate & de nombreuses adaptations qui peuvent aller de la manipulation enti~rement manuelle avec lecture sur un bon spectrophotom6tre & I'automatisme complet sur un analyseur de type ,, Progress ,, (**), automate de biochimie clinique, discontinu, optimisd, programmable, ouvert & tous types de r6actifs. Une fois I'appareil charg6 avec les ~chantillons et les r6actifs, la r6alisation des analyses ne n6cessite aucune intervention manuelle jusqu'& 1'6dition des r6sultats. La fonction ,, spline ,, permet 1'6talonnage non lin6aire, en simple ou en double, avec

Apr6s avoir utilis~ Iongtemps la trousse EMIT-T, en m~thode manuelle, nous I'avons adapt6e & I'analyseur Progress avec les r6sultats suivants : - Rdp~tabilit~

:

Etudi~e sur 4 pools de s~rums de patient de concentrations 2.6 - 6.9 - 7.3 et 14.7/~g/dl, les coefficients de variation (CV) varient de 8,4 % pour la plus basse concentration & 1,5 % pour la plus 6levee. - Reproductibilit~

:

Etudi~e sur un s~rum de contr61e de concentration moyenne 6.7/~g/dl, le CV obtenu est de 4,9 %.

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•, - - - .

TECHNIQUES

AU

QUOTIDIEN

L'appareil g~re automatiquement les param~tres du contr61e de qualitd (r6pdtabilitd, reproductibilit~). - Lin~adt~

•

Etudide sur des d i l u t i o n s de raison 2 d'un sdrum de concentration dlevde (18 #g/dl), on obtient une droite de rdgression entre les valeurs th~oriques et les valeurs calcul6es Y = 0,99 X - 0,26, pratiquement confondue avec la bissectrice. - Correlation

- Correlation

•

Etudide de 80 sdrums, la corrdlation avec la RIA donne Y = 1,03 X - 0,26 avec r -- 0,99 (figure 2). ~U/ml (EIA)

• / Corr61ation ~// . " Y = - 0.26 + 1.03X -~ '' r = ,99a . v e= ~c . n , . ~ . "

•

59 s~rums ont dt6 doses et les r~sultats compares & ceux obtenus avec la mdthode manuelle (corr61ation manuelle/RIA • Y = 1,03 X + 1,46). On obtient la droite de rdgression Y = 0,99 X + 0,18 avec r = 0,99 (figure 1). La comparaison par paires apparides ne montre aucune diff6rence entre les dosages rdalisds par I'une ou I'autre mdthode. / /

•

~.:t-

--4-'

+. "

_ a PROGRESS, (~gldl) • '

•

,"

'+

+"

4- •

4-

4-.

,p.

'+'+

~U/ml

10 ./" 4-./.

4-f, + +. "H"

4-

4-

4-+

.~ ~"

10

Y = 0.99 X + 0.18 N = 599 r = 0.99

20

30

40

(RIA)

Figure 2 Dosage de la TSH : correlation entre la m~thode manuelle ELISA Enzymuntest et la RIA

4-

+4--I"

Les 54 valeurs comprises entre 2 et 12/~U/ml sont reprises dans la figure 3 et donnent une droite tr~s proche de Y = X.

4-

I 5

MANUEL (/~gldl)

Corr61ation Y = - 0.03 + X r = .97 avec n = 54.

pU/ml (EIA)

10

Figure 1 Dosage de la T4 totale : corrdlation entre ies m6thodes EMIT automatis~e et manuelle

T

1

j +

• ~

TSH

+

Au cours d'un protocole d'dvaluation effectual sans I'aide de I'ES 22, nous avons obtenu les rdsultats suivants : - R~p~tabilitd

• •

+.

•

:

Etudide sur 2 pools de sdrums de c o n c e n t r a t i o n s moyennes 2 et 46/~U/ml, les CV obtenus sont de 8,1 et 1,9 % - Reproductibilitd

$.

:

4-

Etudide avec 2 s~rums de contr61e de concentrations moyennes 2.12 et 6.12/~U/ml, les CV obtenus sont de 6.1 et 5 , 1 % . - Lin~arit~

÷

"P. ,

!

10

:

Etudide sur des d i l u t i o n s de raison 2 d'un s~rum de concentration dlevde dans le standard ,, 0 ,, de la trousse, on obtient u n e droite proche de la bissectrice d'~quation Y = 0,95 X - 0,07.

Figure 3 Dosage de la TSH : corrdlation entre la mdthode manuelle ELISA Enzymuntest et la RIA (de 2 ~. 12/~Ulml)

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/~Ulml

. . . .

(RIA)

TECHNIQUES AU QUODIDIEN

* ** ***

CONCLUSION

J'ai opt~ dans I'exploration thyro'fdienne ,, in vitro ,, pour des m~thodes : -

....

fiables,

Syva-BioM~rieux, B.P. 63, 69573 Dardilly Cedex. Kone France, 4, all6e du Cantal 91020 Evry. Boehringer M a n n h e i m France, B.P. 59, 38242 Meylan Cedex Hoechst-Behring, 260, av. Napol6on Bonarparte 92500 Reuil-Malmaison.

- automatisables ou semi-automatisables, - permettant, en pratique quotidienne, le d6pistage des hypo ou hyperthyro'fdies et de leur si~ge (Tableau I). DI~PISTAGE DES HYPO ET HYPER THYROi'DIES ET DE LEUR SIlaGE PAR LES DOSAGES PLASMATIQUES HYPOTHYROi'DI ES Rapport T4/TBG

origine basse • T S H / ~ origine haute : TSH normale

HYPERTHYROi'DI ES Rapport T4/TBG /'4 : origine basse • THS normale T3

/

• origine haute • TSH ./4

Tableau I Cette approche, actuelle et personnelle, n'emp~che pas de suivre le d6veloppement des m~thodes de dosage non isotopiques de TSH (( ultra-sensible ), et de la fraction libre circulante de la T4, int6ressante dans le suivi th~rapeutique.

BIBLIOGRAPHIE

1. L. DELVIGNE, A. TREIGNER, G. OLIVE, J.-L. CHAUSSAIN, P. GEORGES. Measurement of serum thyroxin (s T4) by homogeneous enzyme immunoassay in normal children and in thyroid disorders. In W. De Gruyter and S.-B. PAL Ed., "Enzyme labelled immunoassay of hormones and drugs". Edit Berlin New-York, 1978, 189-193. 2. L. DELVIGNE, A. TREIGNER, G. OLIVE, J.-L. CHAUSSAIN, P. GEORGES. D6termination de la thyroxine s6rique (T4) par dosage immunoenzymatique chez I'enfant. G. SIEST, M.-H. GALTEAU Ed. dans Comptes rendus du 4e colloque de Pont-&-Mousson Masson, 1978, 807-811. 3. L. DELVIGNE, A. TREIGNER, P. GEORGES. Enzymo-lmmunologie (E.I.) Radio-lmmunologie (R.I.) : techniques compt~mentaires ou concurrentes dans I'exploration thyro~dienne. - VIIP Jour Nat. de Biologie, Grenoble/Lyon 1980, SIMEP 6d. Villeurbanne 1980, 43-47. 4. Hormones thyrol"diennes en Blologie Clinique. - Journ~e Scientifique du 1.1.1982. - Monographie 6ditde par la Commission Hormonologie de la S.F.B.C. - 217 p. Lyon 1982. 5. D. LAMIABLE, H. MILLART, R. VISTELLE, R. FAY, H. CHOISY. Implantation du bilan biotogique d'exploration thyrofdidnne par immunoenzymoIogie - 1er symp. sur les tech. E.L.I.S.A., Deauville 26/27.10.1984. - Monographie Boehringer M.F., 22-31. 6. C.-F. CUSICK. Ratio of thyroxine to thyroxine-binding globulin. Ann. Clin. Biochem., 1981, 18, 93-96. 7. E.-C. ATTWOOD, G.-E. ATKIN. The T4/'rBG ratio: a re-evaluation with particular reference to tow and high serum TBG levels. Ann. Clin. Biochem., 19, 101-103. 8. M. RIEU, A.-F. CREFF. L'exploration thyro~'dlenne en 1986. Prat. Med., 382, 6-8.

A retourner & • Madame FULLA (CORATA) Laboratoire de Radio-lmmunologie ACHARD (7 e ~tage) HSpital COCHIN - 27, rue du F a u b o u r g Saint-Jacques - 75674 PARIS CEDEX 14

Immunoanalyse avec marqueurs - R~cepteurs- Prot~ines liantes

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