Comparaison de trois trousses de dosage de l'hormone lutéotrope, analyse de l'influence des isoformes de charge sur l'immunoréactivité

Immunoanal Biol Sp#c (1992) 32, 19-28 © Elsevier, Paris

19

Analyses prospectives et revues gdnerales

Comparaison de trois trousses de dosage de I'hormone lutdotrope, analyse de I'influence des isoformes de charge sur I'immunordactivitd G Gervasi, C Gaillard, M Castanier, R Scholler Fondation de recherche en hormonologie, 67, boulevard Pasteur, 94260 Fresnes, France

(Re£u le 18 novembre 1991 ; accept~ le 9 decembre 1991)

Resumd - - Les criteres de qualit6 de deux trousses immunoradiometriques (LH-COATRIA bioMerieux, LH-IRMA

Immunotech) et d'une trousse radio-immunologique (LH K-PR Cis bio international) ont et~ 6tudies et les resultats obtenus apr~s dosage par les trois methodes de 155 s~rums compares. L'analyse de ces crit~res a confirme les ameliorations apportees par les techniques immunometriques dans les domaines de la fidelite, de la limite de detection et de la. specificite. En ce qui concerne I'exactitude, des differences significatives ont ete observees au niveau des recuperations des surcharges de standard international (1 er IRP 68/40). Cette etude preliminaire a permis de dissocier les differences de niveau dues aux conditions purement techniques (effet de rnatrice, calibration) de celles liees ~. la rnicroheterogeneite de hLH. Les concentrations rnesurees par les techniques Cis et bioMerieux, malgre les differences de niveau relevees sur les 155 serums doses, n'ont pas conduit & des interpretations cliniques divergentes. Des rapports hLH bioMerieux / hLH Immunotech et hLH Cis / hLH Immunotech aberrants ont ete releves, pour environ 20% des serums doses, et n'ont pu etre relies & une situation clinique precise. Dans deux cas, les concentrations de hLH ont ete trouvees indetectables en Immunotech et superieures & 20 UI/I avec les autres trousses; par ailleurs, hLH contenue dans ces serums etait capable d'induire une activite biologique, in vitro, sur des cellules de Leydig de rat en culture. La separation par chromatofocalisation des isoformes de charge de hLH contenues dans un de ces deux serums n'a pas permis de mettre en evidence la presence de formes particulieres qui pourraient expliquer les differences d'immunoreactivite enregistrees. Bien qu'environ 80% des differences de niveau obtenues puissent s'expliquer par des problemes de calibration ou par les effets de matrice, la cause exacte des importantes discordances obtenues pour certains serums particuliers reste encore & determiner. hLH / RIA / Irma / isoformes / chromatofocalisation

Summary - - Comparison of three lutropin radioimmunoassays, influence of charge isoforms on immunoreactivity. Assay performance criteria of two immunoradiometric kits (LH-COATRIA bioMerieux, LH IRMA Immunotech) and of one radioimmunoassay (LH K-PR Cis bio international) were studied and the results obtained with the 3 methods in 155 serum samples were compared. They confirmed the improvements introduced by immunometric assays as regards precision, detection limits and specificity. Concerning accuracy, significant differences were observed about international standard (1 er IRP 68/40) recoveries with these three kits. This preliminary study allowed to dissociate technicol discrepancies (matrix effects, calibration) from those related to hLH microheterogeneity. Despite level differences in results from the 155 serum samples, concentrations measured by Cis and bioMerieux kits did not lead to differing clinical conclusions. About 20% outlying hLH bioM#rieux / hLH Immunotech and hLH Cis / hLH Immunotech ratios were found in the 155 serum samples assayed and could not be related to particular clinical features, hLH concentrations were found to be undetectable in two serum samples with the Immunotech technique, while they were found to be over 20 UI/I with the other kits; furthermore, hLH present in these serums was bioactive on cultured rat Leydig cells. Chromatofocusing, used to separate hLH isoforms from one of these two serums, did not allowed characterization of any special hLH forms which could explain the differences in immunoreactivity. Although 80% of the discrepancies in level observed with these three kits could be explained by calibration and matrix effects problems, the exact cause of the significant disagreements between results from some particular serums remains to be determined.

hLH / RIA / Irma / isoforms / chromatofocussing

i

20

G Gervasi et al

Introduction

L'hormone luteinisante humaine (hLH) partage avec I'hormone folliculo-stimulante (hFSH), I'hormone thyreotrope (hTSH) et la choriogonadotropine humaine (hCG) produite par le placenta, des analogies de structures. Ce sont des heterodimeres constitues par deux sous-unites dissemblables, appelees alpha et beta, associees entre elles par des liaisons non covalentes. Ces deux chafnes sont glycosylees et riches en ponts disulfure. La sous-unite alpha est commune aux trois gonadotropines ainsi qu'& hTSH; en revanche, la chafne beta a une structure particuliere pour chaque hormone [14]. Chacune des sous-unites de hLH contient des chafnes oligosaccharidiques fixees sur la fonction amine des asparagines (Nglycosylation), deux en position 52 et 78, sur la chafne alpha et une en position 30 sur la cha?ne beta. La structure de ces glycanes est complexe et tres heterogene, elle comporte en general un noyau commun pentasaccharidique biantennaire sur lequel se branchent divers types de sucres [28]. Les etapes de maturation cellulaire post-traductionnelles : acquisition de la structure tertiaire, glycosylation et association des deux sous-unites conferent & hLH son activite biologique et immunologique [6, 18, 21, 30]. Cette structure tridimensionnelle a pu etre evaluee & I'aide de methodes immunologiques [22] ou physico-chimiques [8] mais I'etude directe par diffraction des rayons X n'a pu etre effectuee car la microheterogeneite, due notamment & la partie oligosaccharidique de cette molecule, empeche I'obtention de cristaux stables. Les methodes de dosage classiquement utilisees pour doser hLH sont soit biologiques soit immunologiques. Les premieres sont realisees sur des cellules de Leydig en culture, isolees & partir de testicules de rat [5] ou de souris [25]; elles restent delicates de mise au point. Les secondes sont de deux types : les methodes par competition dans lesquelles hLH &doser et hLH marquee entrent en competition vis-&-vis d'un nombre donne et limite de sites de liaison d'un anticorps anti-hLH et les methodes immunometriques de genre ,,sandwich,, utilisant deux anticorps en exces, le plus souvent monocionaux; Pun est generalement fixe sur un support solide, I'autre porte une marque generatrice d'un signal; ces deux anticorps sont diriges contre des sites antigeniques (epitopes) distincts de hLH. Les avantages et inconvenients respectifs de chacune de ces methodologies ont ete largement discutes [2, 4, 17, 29]. Des Iors qu'on utilise deux techniques differentes de dosage, la multiplicite des isoformes circulantes de hLH est generalement evoquee

pour justifier les discordances qui sont enregistrees pour un meme echantillon. Ces discordances qui existaient deja & I'epoque des premiers dosages radio-immunologiques [3, 24] se sont considerablement multipliees et accentuees depuis I'apparition des methodes ,,sandwich,, utilisant des anticorps monoclonaux [1, 2, 7, 13]. Nous presentons ici une partie du travail dans lequel nous avons etudie I'origine des differences de niveau observees entre les taux de hLH mesures & I'aide de trois trousses radio-immunologiques et le r61e que pouvait jouer I'heterogeneite des formes circulantes dans ces differences. Nous avons explore, dans un premier temps, les criteres de qualite de ces trois methodes, compare les resultats obtenus apres le dosage d'echantillons seriques provenant de sujets normaux ou presentant une pathologie; nous avons, ensuite, selectionne des serums pour tenter de mettre en evidence, & I'aide de chromatofocalisations dont nous ne presenterons qu'un seul exemple, I'existence de formes particulieres de LH, en esperant pouvoir expliquer par la presence de ces isoformes les differences d'immunoreactivite constatees.

Materiel

et mdthodes

E-chantillons s6riques Cent cinquante-cinq echantillons s~riques ont 6t6 preleves sur des sujets presentant une pathologie (hypogonadisme, sterilite primaire ou secondaire, am6norrhee, hypofertilite) ou sur des sujets normaux dont 25 hommes, 25 femmes menopausees, 30 femmes & diff#rents stades de leur cycle menstruel, quatre hommes et quatre femmes stimules par une injection de 100 FLG de GnRH. Parmi ces echantillons, le s6rum provenant d'un sujet consultant pour une st~rilite secondaire (VIE) a et6 retenu pour son comportement particulier dans la comparaison des m~thodes et dose apr~s chromatofocalisation.

E-talon international Le premier standard international de r~f6rence pour immunoessai hLH 68/40 (1 er IRP 68/40) a ~t~ fourni par le National Institute for Biological Standards and Control (Londres).

Dosages radio-immunologiques Trois trousses ont ete utilisees : LH K-PR (Cis bio international, Gif-sur-Yvette), technique radio-immunologique par competition (RIA) utilisant un antiserum obtenu chez le lapin; - LH COATRIA (bioMerieux, Marcy-I'l~toile), technique immunoradiometrique du type <>(Irma) utilisant deux anticorps monoclonaux anticonformationnels dont chacun est dirige contre un epitope particulier de hLH; -

Comparaison de trois trousses de dosage de l'hormone luteotrope - LH Irma (Immunotech, Luminy), dont le principe est identique & celui de la technique prec6dente. Les dosages des serums ont ete effectues conformement aux instructions foumies par les fabricants.

Dosage biologique in vitro Cette methode est basee sur la mesure de la testosterone produite par des cellules de Leydig de rat en culture, sous I'action stimulante de hLH. Elle a ete deveIoppee (Castanier, manuscrit en preparation) a. partir d'une methode dej& decrite [5].

Criteres de quafite La repetabilite a ete estimee en effectuant 10 fois le dosage de quatre melanges de serums au cours d'une m~me serie. La reproductibilite a ete obtenue en repetant le dosage en double de ces melanges de serums dans huit series differentes. Les tests de linearite ont ete realises & partir de dilutions successives d'un melange de serums ~. forte concentration en hLH dans le diluant respectif de chaque trousse ou dans un melange de serums humains faibles en hLH. L'exactitude a ete verifiee en procedant & des ajouts de quantites croissantes du 1er IRP 68/40 dans le diluant respectif de chaque trousse ou dans un melange de serums humains faibles en hLH. La specificite a ete evaluee vis-&-vis de hFSH, hTSH et de la sous-unite alpha des gonadotropines en procedant & des ajouts de corps purifies (UCB, Nanterre) dans un serum faible en hLH. La specificite vis-&-vis de hCG a ete testee sur un serum de femme enceinte.

Chromatofocalisation Une colonne de 1,6 x 90 cm d'Ultrogel AcA54 (IBF, Villeneuve-la-Garenne), equilibree & 4 °C avec du tampon phosphate 0,05 M, NaCI 0,9%, pH 7,4, a ete utilisee pour la preparation de I'echantillon avant chromatofocalisation : 9 ml de serum ont ete deposes, des fractions de 4 ml collectees et des aliquotes dosees. Les fractions contenant hLH ont ete ensuite regroupees et concentrees & I'aide d'un dispositif d'ultrafiltration Centriprep-10 (Amicon, ¢:pernon). La chromatofocalisation a ete realisee & I'aide d'un gradient de pH de 9,7 & 6,5 sur une colonne de 0,9 x 29 cm de Polybuffer Exchanger 94 (Pharmacia, StQuentin-en-Yvelines), prealablement equilibree par du tampon ethanolamine-HCI 0,025 M, pH 9,7 (EA), & 4°C. L'echantillon a ete depose puis Clue avec un debit de 15 ml/h, par du Polybuffer 96-HCI (Pharmacia), dilue au 1/9, pH 6,5 (PB96). Cent quinze fractions de 2 ml ont ete collectees. Le pH a ete enregistre directement en sortie de colonne & I'aide d'une electrode (Pharmacia-LKB 2195). Quand le pH a atteint 6,5, 40 ml d'une solution de PB96-NaCI 1M ont ete introduits dans la colonne pour eluer les molecules dont le pl est inferieur & 6,5 et 20 fractions supplementaires de 2 ml collectees. La reproductibilite de la chromatofocalisation a ete evaluee & partir de trois experiences effectuees avec hLH marquee par I'iode 125. Les quatre pics principaux du traceur ont ete elues dans les trois cas & des pH respectifs de 8,3, 7,9, 7,5 et 7,4, avec une variation de moins de 0,1 unite de pH et un coefficient de variation (CV)inferieur & 1%. Les aliquotes provenant des fractions collectees apres filtration sur gel ou chromatofocalisation ont ete

21

dosees & I'aide des trois trousses. Toutefois, pour ces dosages, les protocoles ont ere modifies afin d'eviter les problemes dus & la calibration et aux effets de matrice : des courbes d'etalonnage communes ont ere realisees & partir d'ajouts du 1er IRP 68/40 effectues soit dans le tampon de filtration sur gel soit dans un melange 1/1 des tampons de chromatofocalisation. Le traceur a ete depose dans le tube avant I'aliquote de la fraction &doser, pour les techniques Irma, de maniere a. beneficier d'un effet tampon et & eviter que I'anticorps adsorbe sur la paroi du tube ne soit expose & un pH eleve. Pour la technique RIA I'antiserum a ere depose apres la LH marquee. Les prises d'essai des echantillons ont ete doublees et les durees d'incubation allongees afin d'abaisser les limites de detection de chaque methode. L'influence du gradient de pH sur les resultats des dosages a ete etudiee & partir de 20 melanges graduels des deux tampons EA et PB96, dans lesquels avait ete ajoutee une quantite connue du 1er IRP 68/40.

R d s u l t a t s

Fid6fit6 Les caracteristiques de la r~p6tabilite et de la reproductibilite des trois methodes sont respectivement indiquees dans les tableau I et II. Ces resultats permettent d'etablir que les deux trousses Irma font preuve d'une fidelite satisfaisante avec des CV qui ne d6passent pas 7% dans le domaine des concentrations superieures & 1 UI/I. La fidelite de la technique RIA est moins bonne que celle des Irma dans le domaine des faibles concentrations; elle devient equivalente au-del& de 5 UI/I.

Limites de d6tection Elles ont et6 calculees en se pla£ant dans le-cas oQ le blanc est inconnu, mais defid61it~ connue [19]. Les limites de detection quantitatives ont ete evaluees pour un CV de 10%. Les r~sultats sont pr6sent~s (en UI/I) dans le tableau III. Les deux trousses Irma ont une limite de detection pros de deux fois plus faible que la technique RIA.

Tests de linearit6 (dilutions) La droite correspondant & I'ajustement lineaire entre quantites attendues et quantites dosees a ete calculee dans chaque cas (fig t A et 1B). Dilutions dans le diluant de la trousse : bioMerieux : Y = (1,10 + 0,01)X + (0,18 + 0,43)*; - Cis : Y = (0,89 _+0,02)X + (0,97 + 0,76)*; - Immunotech : Y = (1,04 _+0,02)X + (0,08 _+0,37). Dilutions dans le melange de serums humains : bioM~rieux : Y = (1,13 + 0,03)X- (2,31 + 0,94)*; - Cis : Y = (0,95 + 0,12)X + (9,75 + 3,37)#; - Immunotech : Y = (1,15 +_0,02)X + (0,20 + 0,38)*.

G Gervasi et al

22

Tableau I. Rep6tabilite des differentes techniques de dosage

Tableau III. Limites de detection des diff6rentes technique de

de hLH (n = 10).

dosage de hLH 6tudiees (en UI/I).

1

Melange de serums 2 3 4

D'apr#s D'apres la r@#tabilite la reproductibilit#

bioM6rieux COATRIA Moyenne (UI/I) s (UI/I) CV (%)

0,62 0,11 17,7

5,30 0,27 5,1

11,80 0,35 3,0

20,40 0,48 2,4

bioMerieux COATRIA Lc Ld Lq

0,26 0,51 1,55

0,49 0,98 2,96

CIS K-PR Moyenne (UI/I) s (UI/I) CV (%)

2,16 0,26 12,0

9,16 0,17 1,9

23,56 0,50 2,1

40,70 2,06 5,1

ClS K-PR Lc Ld Lq

0,40 0,79 2,40

m

Immunotech Irma Moyenne (UI/I) s (UI/I) CV (%)

0,51 0,10 19,6

5,06 0,15 3,0

12,42 0,47 3,8

22,24 0,32 1,4

Immunotech Irma Lc Ld Lq

0,23 0,47 1,41

0,33 0,65 1,97

Lc : limitecritiquede decision; Ld : limitede detection qualitative; Lq : limitede detection quantitative,pour un CV de 10%. Tableau II. Reproductibilite des differentes techniques de

dosage de hLH (n = 8). A

60

M#lange de s#rums 1 2 3 4 W

bioM&rieux COATRIA Moyenne (UI/I) s (UI/I) CV (%)

~ 4o

1,28 0,21 16,4

5,41 0,32 5,9

19,41 56,69 1,11 1,40 5,7 2,5 20

CIS K-PR Moyenne (UI/I) s (UI/I) CV (%) Immunotech Irma Moyenne (UI/I) s (UI/I) CV (%)

-

8,80 0,56 6,4

32,55 1,85 5,7

54,04 2,57 4,8

5,11 0,28 5,5

16,60 0,88 5,3

37,14 1,71 4,6

'

t5

'

I

25

ao

hLH

0,99 0,14 14,1

La reproductibilite aux taux faibles de la trousse RIA n'a pu ~tre calculee car le melange 1 contenait hCG qui interfere dans cette Fa6thode.

UI/L

4~

I

~o

60

I

70

ATTENDUE

B . ...""

60

Les 6toiles indiquent que la pente est significativement diff6rente de 1 pour un seuil de P < 0,05. Le diese indique que I'ordonn6e & I'origine est significativement differente de 0 pour un seuil de P < 0,05. Cette etude montre une bonne concordance entre valeurs theoriques et valeurs dos~es

8o

40

•

Y"

5 ,c 20

quand les dilutions sont effectuees A I'aide des diluants respectifs de chaque trousse avec, toutefois, une petite erreur relative pour bioM~rieux et Cis. Quand elles sont effectuees dans un m61ange de s6rums, il apparaft dans la technique RIA une erreur absolue importante. Cette erreur peut 6tre surestim6e et l'erreur relative sous-estim6e par le fait que le calcul d'une regression classique est largement influence par les points correspondant aux fortes concentrations. Neanmoins

C." 0

10

20

30

hLH U I / L

40

50

60

70

ATTENDUE

Fig 1. Dilutions d'un melange de serums dans le diluant respectif de chaque trousse (A) ou un melange de serums humains faibles en hLH (B). A bioMerieux;0 Cis; O Immunotech. A : A : 1,10x+0,18; 0 : 0,89x+0,97; O : 1,04x+0,08 B :/~ : 1,13x-2,31; © : 0,95x+9,75; O : 1.15x+0,20... Y = x.

Comparaison de trois trousses de dosage de I'hormone lut~otrope

comme le montre la figure 1B, les dilutions ne sont pas lineaires et revelent la susceptibilite de la technique RIA aux effets de matrice; cet effet est d'autant plus marque que I'on approche des faibles concentrations.

Exactitude La droite correspondant & I'ajustement lineaire entre quantites theoriques et quantites dosees a ete calculee dans chaque cas (fig 2A et 2B). Surcharges dans le dituant de la trousse : bioM6rieux : Y = (1,70 + 0,03)X - (2,06 + 1,05)*; Cis : Y = (1,25 + 0,10)X -(0,10 + 0,39)*; - Immunotech : Y = (0,97 + 0,01)X + (0,14 + 0,35). Surcharges dans le melange de serums humains : - bioMerieux : Y= (1,61 + 0,01)X- (0,27 + 0,40)*; Cis : Y = (1,38 + 0,04)X - (0,51 + 1,49)*; - Immunotech : Y = (0,98 _+0,01)X + (0,24 + 0,40). -

23

Les etoiles ont la m~me signification que cidessus. II apparaft une erreur relative importante dans le sens de la surestimation, pour les techniques bioMerieux et Cis bio international; I'exactitude de la technique Immunotech est excellente. Toutefois, des resultats obtenus au cours d'une autre experience d'exactitude (1988, donnees personnelles non communiquees) effectu~e & partir d'une ampoule diff~rente du 1er IRP 68/40 montraient une bonne exactitude pour la trousse bioMerieux (0,96X + 0,15) et une sous-estimation pour la trousse Immunotech (0,68X - 0,99). II est int~ressant de remarquer que malgre les 6carts importants enregistres dans ces deux series d'experiences, le rapport des pentes des regressions calculees pour bioMerieux et Immunotech se situent dans chacun de ces cas aux environs de 1,5.

-

A

La reaction croisee avec hFSH est inferieure & 1% (en mole) pour la technique RIA, inf6rieure & 0,1% pour les Irma. L'absence de reaction croisee notable avec hCG a pu 6tre verifiee pour les deux techniques Irma sur un serum contenant 250 000 UI/I de hCG (Delfia, Pharmacia). En revanche, la technique RIA presente une reaction croisee de I'ordre de 100% avec hCG. Les specificites vis-&-vis de hTSH et de la sous-unite alpha des gonadotropines n'ont pu ~tre correctement evaluees en raison d'une contamination non negligeable en hLH des ,,corps purs,> utilises; ces reactions croisees sont largement inferieures & 3% pour les trois techniques.

$40

120

IO0 m o a

80

.I40-

20"

20 hLH UI/L

40 AJOUTEE

60 (ler

80

Comparaison des m6thodes

IRP 68/40)

%40"

B

%20

100

ca

Specificit6

80

60

_5 40

20

20 hLH U I / L

40 AJOUTEE

60 (leP

IRP

80

68/40)

Fig 2. Exactitude; dosage du 1er IRP 68/40 ajoute au diluant respectif de chaque trousse (A) ou & un melange de serums humains (B). /~ bioM6rieux; ~ Cis; © Immunotech.

Cent cinquante-cinq echantillons seriques ont ete doses par ces techniques et les resultats compares, deux & deux, & I'aide de la methode des rapports [20]. Cette derni~re est basee sur une representation graphique oe sont reportes : en abscisse les concentrations mesurees par la methode X, en ordonnee les rapports des concentrations mesurees par la methode Y sur les concentrations mesurees par X, ainsi que les enveloppes qui correspondent aux limites, deftnies pour un niveau de confiance de 95%, & I'interieur desquelles doivent se trouver les rapports quand on compare X & elle-m~me. Cette methode permet de materialiser la part de variabilite qui incombe & X dans sa comparaison avec Y. La comparaison de bioM6rieux & Immunotech, choisie arbitrairement comme r0ference (fig 3A) fait apparaftre deux groupes distincts de rapports, r6partis sur toute l'etendue des concentrations. Le premier, environ 80% des rapports, est distri-

24

G Gervasi et al

bu@ autour de 1 et se situe & I'int@rieur des limites de variabilit@ de ia technique Immunotech. Ce groupe correspond & des serums pour lesquels les concentrations de hLH, mesur@es par les deux techniques, peuvent @tre consid@rees comme @quivalentes. Le second, environ 20% des rapports, est distribu@ largement au-del& de la limite sup@rieure de variabilite de la technique Immunotech. Dans ce cas les taux mesur@s par bioM@rieux sont significativement sup@rieurs A ceux mesures par Immunotech. Cette difference peut aller jusqu'A une non reconnaissance de hLH (< Lq) par Immunotech, comme cela a @te obtenu chez deux sujets VIE (sterilit@ secondaire) et HAN (menopause), alors que pour ces serums, bioMerieux, Cis bio international et le dosage bioIogique in vitro mesuraient des taux importants, report@s dans le tableau IV. Une vingtaine d'autres pr@h~vements provenant de la patiente VIE, @chelonn@s sur plusieurs mois et correspondant & diff@rents stades du cycle menstruel ont tous presente ces particularit@s (donn@es non communiqu@es). La comparaison de Cis A bioM@rieux (fig 3B) montre que les rapports sont majoritairement distribues au-del& de la limite superieure de variabilit@ de bioM@rieux et que la distribution n'est pas homogene en fonction du niveau. En effet, les rapports ont tendance & augmenter au-dessous de 5 UI/I ce qui, compte tenu des r@sultats obtenus au cours des @preuves de dilution, pourrait s'expliquer par la susceptibilite plus importante de la technique RIA aux effets de matrice dans le domaine des faibles concentrations. Aucun rapport aberrant n'a pu @tre mis en evidence quand le s@rum ne contenait pas hCG. La patiente VIE ayant regu des ampoules de hCG Pregnyl (Organon) quelques jours avant le test LHRH, les rapports aberrants bioM@rieux / Cis et bioM@rieux / dosage biologique s'expliquent par la pr@sence d'un taux de hCG de 27 UI/I (Delfia Pharmacia), constant A tousles temps du test, qui est reconnue par la technique RIA et par le dosage biologique (tableau IV). La comparaison de Cis & Immunotech (fig 3C) repr@sente un cumul des remarques faites dans les deux paragraphes pr@c@dents. Les rapports sont largement distribu@s au-dessus de la limite superieure de variabilite de la technique Immunotech; ils ont tendance & augmenter au-dessous de 5 UI/I. Deux groupes peuvent @tre mis en @vidence, I'un autour d'un niveau correspondant A un rapport moyen de 1,5, I'autre au-delA de 2,5. Les taux mesur@s par Cis pour les s@rums de VIE et HAN, report@s dans le tableau IV, sont tr@s @lev@s. Les r@gressions lin@aires calcul@es selon York [31] ont donn@ les r@sultats suivants :

COMPARAISON DE LA METHODE BIOMERIEUX A LA METHODE IMMUNOTECH

A !

=

O~

2

.°

.

:.. 0 5

1

5

2

.i~" "

t0

20

hLH U I / L

.

,do 2d0

50

(IMMUNOTECH)

COHPARAISON OE LA METHODE C I S - O R I S A LA METHODE BIOMERIEUX

B 5

4

3J

~" "..=. •""

.';4,," i,.

• " "- -

."

"

P

0.5 05

t

,--fT2

~

,5

hLH U%/L

2~

i

i

m

5~ ,do 2do

(BIOMERIEUX)

COMPARAISON OE LA METHOOE CIS-ORIS A LA METHOOE IMMUNOTECH

C

"

.* • •

• " •

="

•

a;=i ° •" . "

; ,-

"

•

•

•"

•

"...'=°,

"..'¢ . .

"

• . "..'. •.

°o.5

-T

~

~

,5

hLH UI/L

2~

.

5~

,do

2do

(IMMUNOTECH]

Fig 3. Comparaison des trois trousses de dosage de hLH & I'aide de la m@thode des rapports. Les courbes representent les limites th@oriques qui englobent 95% des points Iorsque I'on compare la technique port@e en abscisse a. elle-m@me. Pour faciliter I'observation, I'@chelledes concentrations en X a ere choisie Iogarithmique.

- bioM@rieux=(1,17 _+0,04)lmmunotech - (0,14 _+0,23)*; - Cis = (1,48 +_0,06)lmmunotech + (2,47 +_0,43)*#, - Cis = (1,31 _+0,03)bioM@rieux+ (2,54 + 0,26)*#. Ce mode de calcul, contrairement & la r@gression ,>, tient compte de la reproductibilit@ des techniques comparees. Les s@rums de

Comparaison de trois trousses de dosage de I'hormone luteotrope

25

Tableau IV. Concentrations de hLH (UI/I) mesur~es par les trois trousses et par le dosage biologique in vitro sur les serums de VIE (st~rilit~ secondiare) et HAN (menopause).

bioM#rieux COATRIA

CIS Immunotech Dosage K-PR Irma biologique =-

VIE test GnRH T 0 min T + 15 min T + 30 min T + 60 min T + 120 min

2,5 14,5 24,4 26,3 19,9

25,6 43,9 62,8 59,2 49,8

Ind Ind Ind Ind Ind

119 242 271 294 357

HAN

60,1

103,1

Ind

ND

S"

0.0

6!5

7 . 0I

6.i0

8.'5

I 9,0

I

g.5

I t0,0

pH DE LA FRACTION

Ind : ind~tectable; ND : non determine.

VIE et HAN n'ont pas et~ pris en compte dans ces calculs. Les etoiles et les dieses ont les m ~ m e s significations que celles donn~es plus haut. Ces resultats confirment que globalement les trois techniques mesurent des concentrations diff~rentes de hLH.

7~5

Fig 4. Influence du gradient de pH sur les r~sultats des dosages, ~tudi~e & partir de 20 m61anges graduels des deux tampons de chromatofocalisation clans lesquels a ~t6 ajoutee une quantit~ identique de 1er IRP 68/40./\ bioM~rieux; ~ Cis; © Immunotech. L'influence de NaCI 1M a 6t6 egalement etudi6 • bioM~rieux; • Cis; • Immunotech.

Chromatofocalisation 2

Les modifications decrites dans materiel et m6thodes ont permis d'abaisser d'un facteur 2 environ les limites de d~tection quantitatives de chacune des methodes ~tudi~es. Elles deviennent donc pour un C V de r~p~tabilit~ de 10% : bioM~rieux : Lq = 0,5 UI/I; Cis : Lq = 1,0 UI/I; - Immunotech : Lq = 0,5 UI/I.

Influence du gradient de pH sur les dosages Compte tenu de la repetabilite des trois techniques ~tudiees, les resultats obtenus (fig 4) montrent qu'il n'y a pas d'incidence du pH entre 9,2 et 6,5 sur les concentrations mesur6es directement sur les fractions. En revanche, les concentrations mesur6es apres I'elution saline (NaCI 1M) sont surestim6es, de l'ordre de 40%, par la techniqu e RIA et sous-estim6es, de I'ordre de 50%, par les Irma.

Etude du serum VIE (temps + 30 min du test & la LHRH) Le caractere & dominante acide (pl < 6,5) des isoformes de hLH de ce s~rum est tres bien mis en evidence par le pic important et sous-estime, mesure par bioM~rieux apr~s I'elution saline (fig 5). Un pic tr~s important est egalement mesure par Cis mais la presence de hCG, dont les isoformes ont un caractere acide, ainsi que celle de NaCI interferent dans ces mesures. La chromato-

== 5 1-

0

20

40

60 FRACTIONS

80

t00

t20

140

(2ml)

Fig 5. Chromatofocalisation, apres filtration sur gel et ultrafiltration, du s6rum du sujet VIE pr61ev~ au cours d'un test & GnRH au temps + 30 min. Des fractions de 2 ml ont 6t6 recueillies et les immunor6activites hLH mesurees & I'aide des trois trousses, selon le protocole d6crit dans materiel et methodes. - bioM~rieux; ..... Cis; ...... Immunotech.

focalisation permet egalement de caracteriser les nombreuses isoformes & caractere basique, au moins 12 de pH 9,6 & 7, qui sont contenues dans ce serum. Les profils obtenus avec bioMerieux et Cis, compte tenu de leur r~p6tabilite et de leur Lq respectives, peuvent 6tre consideres comme proches alors que la trousse Immunotech ne reconnaft aucune des formes caract6risees par les autres techniques.

D i s c u s s i o n

L'analyse detaill~e des differents criteres de qualit~ des methodes testees a mis en ~vidence une

26

G Gervasi et al

fois de plus les ameliorations apportees par les techniques Irma dans les domaines de la fidelite, de la specificite et de la limite de d~tection [2, 17, 26]. Elle demontre egalement I'influence des effets de matrice dans la technique RIA, particuli~rement au niveau des faibles concentrations. Ces elements permettent une meilleure compr6hension du defaut de linearite constate dans la comparaison des methodes Irma & la methode RIA pour les valeurs inferieures & 5 UI/I. Au-dessous de ce niveau une difference de reconnaissance des formes de hLH, notamment sous agoniste de GnRH [7, 12] ou sous pilule, reste toujours envisageable; la part revenant & chacun de ces deux effets n'a cependant jamais ete montree. Les resultats obtenus darts I'etude de I'exactitude sont difficilement interpretables car ils se sont reveles differents de ceux qui avaient ete trouves, avec une autre ampoule de 1er IRP 68/40, au cours d'une etude anterieure; cette contradiction pourrait mettre en cause I'homogeneite, la reprise ou les conditions de conservation de I'etalon international. Neanmoins, les rapports des concentrations dosees par bioMerieux et Immunotech sont restes & peu pres constants darts les deux etudes. Ces donnees viennent s'ajouter & de nombreuses autres dej& publiees [9, 26] qui mettent en evidence les problemes lies & la qualite des etalons internationaux et & I'homogeneit6 des calibrations, expliquant & eux seuls environ 75 & 80% des differences de niveau rencontrees. La comparaison de Cis & bioMerieux, compte tenu des remarques formulees sur la calibration et sur la mesure des taux faibles, n'a pas revele de desaccord majeur pouvant conduire & une interpretation clinique differente selon que I'on utilise I'une ou I'autre de ces deux trousses. La comparaison de bioMerieux & Immunotech et de Cis & Immunotech a mis e n evidence, pour chacune des deux comparaisons, un groupe qui repr~sente environ 20% des echantillons testes pour lequel des rapports anormalement eleves ont ete enregistres. Ces rapports eleves subsistent malgre I'utilisation d'un etalonnage commun (donnees personnelles non communiquees). L'appartenance & ce groupe qui comporte, entre autres, des serums provenant de sujets normaux des deux sexes n'a pu ~tre reli~e & un etat physiopathologique precis. Ce type de resultats a ete egalement decrit par d'autres equipes qui ont utilise des reactifs differents [2, 13]. Compte tenu de I'etendue importante des normes physiologiques proposees pour ces techniques, les taux de hLH mesures n'ont conduit que dans deux cas, HAN et VIE (tableau IV), & des interpretations cliniques opposees. L'examen du dossier de ces pa~Lentes et des autres param~tres tels que hFSH ~t. E2

confirmant une menopause pour HAN ainsi que la r6ponse positive du dosage biologique pour VIE sont en faveur de I'existence d'une secr6tion de hLH. D'autres prelevements effectues sur le sujet VIE ont tous montre les m~mes caracteristiques : taux de hLH significatifs en bioMerieux et Cis, activite biologique significative in vitro, taux indetectables en Immunotech. L'utilisation croisee des reactifs bioMerieux et Immunotech ainsi que le recours & un anticorps monoclonal anti-sousunite alpha (donnees personnelles non communiquees), ont permis d'etablir que I'anticorps marque & I'iode 125 fourni dans la trousse Immunotech est <> de la non reconnaissance de cette hLH, sans qu'il ait ete possible de verifier plus avant si c'est la liaison de cette hLH <> & I'anticorps adsorbe sur le tube qui induit une modification de configuration emp~chant le second anticorps de reconnaTtre son 6pitope ou si cet epitope est masque ou absent sur les formes circulantes. Les taux ont ete egalement trouves indetectables avec d'autres trousses : Enzymum-test-LH (Boehringer) [10], RIA-gnost-LH (Behring) et ELSA-LH (Cis-bio international) [17] utilisant toutes trois un syst~me , et des anticorps monoclonaux. Des etudes de cartographie, realisees & I'aide des anticorps monoclonaux fournis dans de nombreuses trousses (Carayon, projet en cours), permettront peut 6tre de mieux Iocaliser quels sont les epitopes de hLH qui sont reconnus par ces anticorps et de mieux cerner I'origine du probleme. Une explication possible des divergences enregistrees ci-dessus a ete recherchee dans la microheterogeneite des formes circulantes de hLH. Les nombreux s6rums que nous avons chromatographies se repartissent en trois classes : ceux pour lesquels les trois trousses font preuve d'un bon accord, ceux pour lesquels les rapports bioMerieux / Immunotech et Cis / Immunotech sont anormalement eleves et enfin, ceux dont hLH n'est pas reconnue par le systeme Immunotech dont nous avons choisi de reporter ici un chromatogramme. Les etapes successives de purification realisees : filtration sur gel, ultrafiltration et chromatofocalisation ont permis de s'affranchir de facteurs inferferents tels que les anticorps heterophiles ou le facteur rhumatofde ainsi que d'une partie importante des effets de matrice. Ces facteurs ne peuvent donc 6tre retenus pour expliquer les differences entre les concentrations mesurees par les trois trousses. Aucune des immunoreactivit~s enregistrees apres chromatofocalisation n'a permis d'etablir que ce serum comportait des isoformes de charge tr~s particulieres qui soient responsables des differences de

Comparaisonde trois trousses de dosage de I'hormoneluteotrope reconnaissance. Simplement dans le cas du sujet VIE, il existe une predominance des formes acides (fig 5) qui, compte tenu de I'&ge de la patiente, 44 ans, et du contexte d'infertilite secondaire peut etre rapproche de ce qui est rencontre & la perimenopause [16, 23]. Bien que tr~s selectif, ce procede de separation qui avait ete retenu parce qu'il permettait de caracteriser des isoformes possedant des activites biologiques differentes [6, 16], ne semble donc pas etre la methode requise pour expliquer les divergences constatees : en effet, il separe les isoformes de hLH en fonction de leur charge qui est essentiellement lice & la nature des groupements terminaux portes sur les ramifications oligosaccharidiques [11], mais il ne prend pas enti~rement en compte la structure et la composition de ces chafnes. L'utilisation conjointe de chromatographie d'affinite du type Concanavaline (Gervasi article en cours d'elaboration) n'a pas, non plus, permis de mettre en evidence sur ce serum un profil particulier qui pourrait expliquer ces differences. Ces donnees, concernant la diversite des sujets pour lesquels des resultats discordants sont obtenus, par ailleurs largement confirmees par la litterature [2, 13], orientent egalement les recherches sur I'origine de ces differences d'immunoreactivite vers une exploration plus detaillee de la chafne proteique de hLH. Une hypothese a dej& ete emise sur I'existence chez certains sujets de variants genetiques [13]; une autre, tout aussi interessante, pourrait mettre en cause un clivage de la chaTne beta [27], clivage qui a ete egalement decrit sur la chafne beta de hCG [15].

Conclusion Les concentrations de hLH mesurees & I'aide des trois trousses testees ne sont pas equivalentes : il serait donc illusoire de passer d'un systeme & un autre par I'emploi d'un simple facteur de conversion. Ceci rend imperatif I'etablissement de normes precises propres & chaque technique. Les differences de niveaux enregistrees sur environ 80% des echantillons doses peuvent s'expliquer par le cumul des problemes de calibration auxquels il faut ajouter, pour la technique RIA, I'influence nefaste des effets de la matrice serique. Les rapports bioMerieux / Immunotech et Cis / Immunotech aberrants, releves pour environ 20% des serums doses, qui pourraient etre attribues & une difference de reconnaissance des formes circulantes de hLH, ne s'expliquent pas par la composition en isoformes separees par chromatofocalisation. La cause et la portee physiologique de ces phenomenes qui ont pu etre mis en evidence, gr&ce & ,,l'hyperspecificite- de

27

certains systemes immunologiques, ouvrent de nouvelles perspectives de recherches qui apporteront sans doute des elements complementaires sur la structure et la physiologie, dej& complexe, de hLH. R~f~rences 1 Banfi G, Marinelli M, Murone M, Bonini P (1990) Discordant results for lutropin among immunoassays in two cases of male hypogonadism. Clin Chem 36, 1689-1690 2 Billon P, Lejeune H, Charrie A, Fleury MC, Pugeat M, Tourniaire J (1990) Comparaison d'une methode immunoradiometrique et d'une methode radioimmunologique de dosage de LH : apport des prelevements repetes darts I'analyse des discordances. Immunoanal Biol Spec 24, 41-46 3 Burstein S, Schaff-Blass E, Blass J, Rosenfield RL (1985) The changing ratio of bioactive to immunoreactive luteinizing hormone (LH) through puberty principally reflects changing LH radioimmunoassay dose-response characteristics J Clin Endocrinol Metab 61,508-513 4 Demers LM (1991) Monoclonal antibodies to lutropin : Are our immunoassays too specific ? Clin Chem 37, 311-312 5 Dufau ML, Mendelson CR, Catt KJ (1974) A highly sensitive in vitro bioassay for luteinizing hormone and chorionic gonadotropin testosterone production by dispersed Leydig cells. J Ctin Endocrinol Metab 39, 610-613 6 Dufau ML, Veldhuis JD (1987) Pathophysiological relationships between the biological and immunological activities of luteinizing hormone. Baillere's Clin Endocrinol Metab 1, 153-176 7 Ellis G, Holland FJ, Makela SK (1989) Comparison of luteinizing hormone (LH, lutropin) immunoreactivity in serum by RIA and time-resolved fluorescence. Findings in serum from normal children and those treated with LHRH analogs. Clin Chem 35, 1150 8 Gamier J (1984) I~tude comparative de I'hormone choriogonadotrope humaine et des autres hormones glycoproteiques Ann Endocrino145, 243-255 9 Garret PE (1989) The enigma of standardization for LH and FSH assays. J Dis Immunoassay 12, 18-20 10 Gervasi G, Pernot P, Castanier M, Scholler R (1989) Comparison of reference values for FSH and LH established using Enzimum-Test and COATRIA BioMerieux. In : LH/FSH Workshop report, Bal~ares, 1989, Boehringer, Mannheim 11 Hattori MA, Ozawa K, Wakabayashi K (1985) Sialic acid moiety is responsible for the charge heterogeneity and the biological potency of rat lutropin. Biochem Biophys Res Commun 127, 501-508 12 Lahlou N, Roger M, CHaussain JL, Feinstein MC, Sultan C, Toublanc JE, Schally AV, Scholler R (1987) Gonadotropin and alpha-subunit secretion during long term pituitary suppression by D-Trp6Luteinizing hormone-releasing hormone microcapsules as treatment of precocious puberty. J Clin Endocrinol Metab 65, 946-953 13 Petterson KS, Sederholm JR (1991) Individual differences in lutropin immunoreactivity revealed by monoclonal antibodies. Clin Chem 37, 333-340 14 Pierce JG (1988) Chapter 31 Gonadotropins : chemistry and biosynthesis. In - The physiology of

28

G Gervasi et al reproduction, vol 1 (Knobil E, Neill J, eds). Raven

15

16

17 18

19

20

Press, New York, 1335-1348 Puisieux A, Bellet D, Troalen F, Razafindratsita A, Lhomme C, Bohuon C, Bidart J-M (1990) Occurence of fragmentation of free and combined forms of the Beta-subunit of human chorionic gonadotropin. Endocrinology 126, 687-694 Reader SCJ, Robertson WR, Diczfalusy E (1983) Microheterogeneity of luteinizing hormone in pituitary glands from women of pre- and postmenopausal age. Clin Endocrino119, 355-363 Roger M (1990) Le dosage des gonadotropines en 1990. Immunoanal Biol Sp#c 22, 59-65 Ryan RJ, Keutmann HT, Charlesworth MC, McCormick DJ, Milius RP, Calvo FO, Vutyavanich T (1987) Structure-function relationships of gonadotropins. Recent Prog Horm Res 43, 383-429 Scholler R (1977) 1 Exactitude, fidelite, limite de d~tection. In : ContrSle de qualit6 en hormonologie L St6roides urinaires, Paris-Fresnes, 23 juin 1976. SEPE, Paris, 31-77 Scholler R, Gervasi G, Avigdor R, Castanier M (1987) Comparaison de deux methodes de dosage. In : Colloque sur les actualites en immunoanalyse, Bordeaux 2-4 d#cembre 1987. Editions Bergeret,

Bordeaux, 225-233 21 Scholler R (1990) Antihormones naturelles. R61e des copules glucidiques dans I'activit~ des gonadotropines. In : Actualit#s gynecologiques (Netter A, Gorins A, ~ds). Masson, Paris, 145-153 22 Soos M, Siddle K (1983) Characterisation of monoclonal antibodies for human luteinising hormone, and mapping of antigenic determinants on the hormone. Clin Chim Acta 133, 263-274 23 Strollo F, Harlin J, Hernandez-Montes H, Robertson DM, Zaidi AA, Diczfalusy E (1981) Qualitative and

quantitative differences in the isoelectrofocusing profile of biologically actine lutropin in the blood of normally menstruating and post-menopausal women. Acta Endocrinol Copenh 97, 166-175 24 Suginami H, Koizumi Y, Nakajima A (1981) Measurements of human luteinizing hormone in plasma by in vitro bioassay and by conventional and improved radioimmunoassays. Endocrinol Jap 28, 87-94 25 Van Damme MP, Robertson DM, Diczfalusy E (1974) An improved in vitro bioassay method for measuring luteinizing hormone (LH) activity using mouse Leydig cell preparations. Acta Endocrinol Copenh 77, 655-671 26 Vermes I, Bonte HA, Sluijs GVD, Schoemaker J (1991) Interpretations of five monoclonal immunoassays of lutropin and follitropin : effects of normalization with WHO standard. Clin Chem 37, 415421 27 Ward DN, Glenn SD, Nahm HS, Wen T (1986) Characterization of cleavage products in selected human lutropin preparations. Int J Peptide Protein Res 27, 70-78 28 Weisshaar G, Hiyama J, Renwich AGC, Nimtz M (1991) NMR investigations of the N-linked oligosaccharides at individual glycosylation sites of human lutropin. Eur J Biochem 195, 257-268 29 Wheeler MJ, D'Souza A, Horn AN (1989) Evaluation of test kits for gonadotropins. Lancet ii, 616-617 30 Wilson CA, Leigh AJ, CHapman AJ (1990) Gonadotrophin glycosylation and function. J Endocrinol 125, 3-14 31 York D (1966) Least squares fitting of a straight line. Can J Phys 44, 1079-1086