- Email: [email protected]
Connexions cortex–paroi chez la cellule apicale de Sphacelaria
C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie / Life Sciences 323 (2000) 727–733 © 2000 Académie des sciences/Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés S0764446900001657/FLA
Biologie et pathologie végétales / Plant biology and pathology
Connexions cortex–paroi chez la cellule apicale de Sphacelaria Aicha Ouichoua, Georges Ducreuxa* a
Laboratoire de morphogenèse végétale expérimentale, université de Paris-Sud XI. Bât. 360, 91405 Orsay cedex, France
Reçu le 10 février 2000 ; accepté le 17 avril 2000 Présenté par Bernard Kloarec
Abstract – Cell cortex and cell wall connections in the apical cell of Sphacelaria. The apical cell of Sphacelaria (Fucophyceae) exhibits a permanent polarized organization throughout asymmetric divisions. The apex organization was studied by immunolocalization of tubulin, vitronectin, a-actinin and β1 integrin. Microfilaments were stained directly by fluorescein phalloidin. The apex was highly organized around a patch of microfilaments densely packed at the tip, where vitronectin-like and a-actininlike proteins colocalized. In the same area, an actin-dependent targeted secretion of sulfated polysaccharides was shown. The permanent localization of these components throughout cell elongation suggests that a cortical site involving transmembrane connections between the cytoskeleton and the extracellular matrix is required for cell polarity. A model of the organization of the tip is proposed. © 2000 Académie des sciences/Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS cell polarity / cytoskeleton / cell wall / cortical site / Phaeophyceae / Sphacelaria Résumé – La cellule apicale de Sphacelaria présente une organisation polarisée permanente à travers des divisions asymétriques répétées ; son apex joue un rôle déterminant dans le maintien de l’axe de polarité et dans l’élongation cellulaire. L’organisation de cette région a été précisée par des études d’immunolocalisation à l’aide d’anticorps monoclonaux dirigés contre les tubulines, l’α-actinine, la vitronectine et la β1 intégrine. Les microfilaments, marqués directement avec la fluorescéine phalloïdine, forment un dôme apical sous-membranaire centré autour d’une plaque d’actine sommitale qui coïncide avec la localisation de protéines homologues à l’α-actinine et à la vitronectine. De plus, la coloration des polysaccharides sulfatés, par le bleu de toluidine O, montre que leur transport est directionnel vers la paroi distale et s’effectue selon un processus dépendant des microfilaments. La distribution de ces composants pendant la phase d’élongation suggère l’existence d’un site cortical distal qui serait impliqué dans la polarité de la cellule apicale. Un modèle d’organisation de ce site est proposé. © 2000 Académie des sciences/Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS polarité / micofilaments / paroi / site cortical / Phaeophyceae / Sphacelaria MF(s) = Microfilaments ; RGD = Arg-Gly-Asp.
* Correspondance et tirés à part : [email protected]
727
A. Ouichou, G. Ducreux / C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie / Life Sciences 323 (2000) 727–733
Abridged version Cell polarity and asymmetrical mitosis are dependent on cytoplasmic and cortical cytoskeleton in many animal or vegetal cells involved in morphogenetic events. Recent investigations have shown, mainly in animal systems, that spatial organization of polarized cells and subsequent location of division planes, are related to the positioning of a cortical site. Connections between cortical cytoskeleton and extracellular matrix, through transmembrane bridges and RGD binding peptides, involve proteins such as α-actinin or vitronectin. Up to now, few investigations have been made in plant cells except in fucoïd zygotes where the fixation of polarity axis and first asymmetric mitosis are related to a specific cortical site. We report here on new investigations on the apical cell of Sphacelaria. This cell is characterized by repetitive asymmetrical mitosis and involved in cell elongation through wall synthesis at the apex. During interphase, cytoplasmic bundles of microtubules are
1. Introduction Plusieurs études menées sur la division asymétrique chez différents organismes animaux ou végétaux montrent que la définition du plan de division est corrélée à l’établissement d’un site cortical qui détermine l’orientation du fuseau mitotique. C’est le cas par exemple de la réorientation du fuseau mitotique de la cellule P1 chez C. elegans [1, 2], de l’apparition du site de bourgeonnement chez S. cerevisiae [3, 4] ou des zygotes des Fucales [5]. Les études sur le cytosquelette cortical ont été privilégiées dans les systèmes cellulaires qui présentent une organisation polarisée mettant en œuvre des connexions entre le cytosquelette et la matrice pariétale. Chez les végétaux, de nouveaux schémas sont apparus pour rendre compte de la structure et des fonctions du cytosquelette cortical qui pourraient intervenir dans la signalisation cellulaire [6, 7]. L’émergence du concept de l’information de position a orienté alors les recherches vers l’exploration du cortex [8–13]. La majorité des protéines pariétales identifiées auparavant était considérée comme spécifique aux plantes, mais récemment, des protéines de la paroi et de la membrane végétales ont révélé des motifs protéiques homologues à certaines protéines de la matrice extracellulaire de la cellule animale [14]. Des peptides qui contiennent le motif Arg-Gly-Asp (RGD), habituellement impliqués dans l’adhésion focale chez la cellule animale par l’intermédiaire d’intégrines appropriées, peuvent aussi intervenir dans les connexions paroi–membrane chez les plantes [15]. La vitronectine a été plus particulièrement étudiée [16, 17]. C’est une glycoprotéine présentant une grande diversité de poids moléculaire [18] ; son extrémité
728
nucleated by the distal centrosome converging to the distal part where actin microfilaments are also abundant and densely packed. Immunolabelling with human anti-vitronectin and rabbit anti-α-actinin has shown that vitronectin-like and α-actinin-like proteins are synthesized in the perinuclear distal cytoplasm, migrate to the apex and colocalize with the same cortical site as actin. Staining with toluidine blue O, a specific dye for sulfated polysaccharides, has shown the incorporation of these wall components into the same distal area through actin control since the migration of sulfated polysaccharides is inhibited by cytochalasin B. These convergent observations allow a model for the cortical site at the tip of the apical cell to be proposed. Organization of this cortical site is compared with similar systems in polarized animal cells. Discussion emphasizes homologies with the development of the fucoïd zygote and the involvement of the distal site in the maintaining of meristematic characteristics of the Sphacelaria apical cell.
N-terminale possède la séquence RGD commune aux protéines d’adhésion de la matrice extracellulaire [19, 20]. Des arguments tendent à prouver que le cytosquelette participe à la construction des complexes de stabilisation de la polarité dans l’embryogenèse végétale [15, 21–23]. Chez les algues filamenteuses, les événements liés à l’établissement de la polarité cellulaire ont permis d’étudier la dynamique du cytosquelette et son rôle comme générateur de l’organisation spatiale de la cellule [24]. Dans cette optique, une attention toute particulière a été portée aux cellules apicales dont la fonction méristématique est une caractéristique directement liée au programme morphogénétique [25]. Des travaux ont été consacrés aux réorganisations structurales corrélées aux divisions asymétriques et répétitives de la cellule apicale de Sphacelaria [26, 27]. Pendant l’interphase, le cytosquelette, fortement polarisé, établit un continuum entre la paroi distale, le complexe noyau centrosome et la paroi proximale, l’ensemble étant stabilisé par des connexions latérales. Le cytosquelette microtubulaire subit un effondrement transitoire au moment de l’entrée en mitose, et se reconstitue à la fin de la division pour retrouver l’architecture initiale. La reconstruction de ce réseau coïncide avec le rétablissement des connexions avec la région corticale de la cellule apicale, en particulier l’extrémité distale. Les résultats obtenus suggèrent l’existence d’une organisation complexe de cette partie distale, dont la structure reste stable au cours des divisions asymétriques [26, 27]. Considérant que cette stabilité pouvait être liée à l’existence de connexions entre le cytosquelette cortical et la paroi, nous avons cherché à identifier quelques-unes des
A. Ouichou, G. Ducreux / C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie / Life Sciences 323 (2000) 727–733
protéines impliquées. Le but de cet article est de décrire les composants du site cortical distal et d’analyser expérimentalement les connexions paroi–membrane en relation avec le cytosquelette et en liaison avec la croissance apicale.
2. Matériel et méthodes 2.1. Conditions de culture
Sphacelaria sp. (gracieusement fournie par les Drs L. Provasoli, Haskins Laboratories, New Haven, CN, EtatsUnis, et Loiseaux De Goer, Station biologique, Roscoff, France) est cultivée axéniquement à 12 °C sous une photopériode de 12h/12h et une intensité de lumière de 0,8 mmol m–2 s–1. Une aération stérile est assurée grâce à une pompe (Rena 301) pendant les 6 jours précédant l’expérimentation. Les filaments possédant des cellules initiales en croissance active, sont utilisés pour les marquages. Le milieu de culture est constitué de l’eau de mer naturelle, autoclavée à 120 °C pendant 1 h, contenant 2 % (v/v) du milieu Provasoli (ESP : Erd. Schreiber Provasoli) [28]. 2.2. Préparation des cellules
Après un rinçage dans un tampon A contenant : 60 mM Pipes, 25 mM Hepes, 10 mM EGTA, 2 mM MgCl2, pH 7,4 [29], les filaments de Sphacelaria sont fixés une heure dans un mélange de paraformaldéhyde (4 %) et de glutaraldéhyde (0,1 %) dans le tampon A. Après trois rinçages dans le tampon A, les parois sont digérées pendant 4 h dans une solution enzymatique contenant 1 % de cellulase R 10, 0,5 % de macérozyme Onozuka (Yakult Pharmaceutical Co., Tokyo, Japon), 50 mM de trisodium citrate, 2 % d’alginates lyases préparés à partir d’extraits d’Aplysia vaccaria [30] et un mélange d’inhibiteurs de protéases (1 mM PMSF, 1 mM bis-benzimidine et 20 µg mL–1 leupeptine). À la fin de la digestion, une agitation ménagée facilite la libération des cellules apicales. Une première filtration avec un tamis de 100 µm élimine les filaments non digérés, puis une série de trois centrifugations à 85 g dans le tampon A permet la purification des cellules apicales. Les membranes sont perméabilisées pendant 2 min avec le Triton X-100 à 0,5 %. Après deux rinçages dans le tampon A, les cellules sont transférées dans le PBS (130 mM NaCl, 2mM KCl, 8mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, pH 7,4). Le passage dans 0,25 mg mL -1 de NaBH4 réduit la fluorescence due au glutaraldéhyde avant un dernier rinçage dans le PBSI [PBS, 10 mM EGTA, 2mM MgCl2, 0,3 % de sérum albumine de bœuf (BSA), pH 7,4]. Afin de préciser les connexions transmembranaires entre le cytoplasme cortical et la paroi, des coupes de 10 µm sont effectuées avec un ultramicrotome à congélation après la fixation aldéhydique des filaments.
2.3. Immunofluorescence 2.3.1. α-Actinine, β1-intégrine et vitronectine
L’anticorps monoclonal α-actinine dilué au 1:250 (clone EA-53, Sigma), l’anti-β1-intégrine dilué au 1:250 (clone DF5, ICN), l’anti-vitronectine dilué au 1:200 (clone VT-2, Sigma) sont préparés dans le tampon PBSI. Les marquages sont réalisés pendant une heure sur les cellules apicales, avec paroi, sans paroi, sur les enveloppes pariétales séparées des cellules apicales après une digestion courte (la digestion commence au niveau l’apex et permet ainsi la libération des cellules avant la dégradation avancée de la paroi), et enfin sur des coupes de 10 mm des filaments de Sphacelaria. Après trois rinçages dans le PBSI, les préparations sont incubées dans la fluorescéine isothiocyanate (FITC) conjuguée à l’anti-souris IgG (Pasteur) diluée au 1:100 dans le tampon PBSI. 2.3.2. Microtubules
Les coupes des filaments, fixées sur des lames gélatinées, sont incubées dans un mélange d’anti-α et anti-βtubuline (Amersham) dilué au 1:500 dans le PBSI pendant 1 h à la température ambiante. Après trois rinçages dans le PBSI, les préparations sont incubées dans la fluorescéine isothiocyanate (FITC) conjuguée à l’IgG anti-souris (Pasteur) dilué au 1:100 dans PBSI, 0,3 % BSA. Après trois rinçages dans le PBSI, les coupes sont montées dans le Citifluor (Citifluor Ltd, Londres, Royaume-Uni). 2.4. Coloration des microfilaments
Des modifications sont apportées au protocole de base de la préparation des cellules. La composition du tampon est différente : 100 mM Pipes, 10 mM EGTA, 10 mM MgSO4 7H2O, 5 % DMSO, 0,8 M mannitol et 3 % NaCl (tampon B). Les filaments sont stabilisés pendant 30 min dans 0,3 mM de m-Maleimidobenzoyl-Nhydroxysuccinimide ester (MBS) dans le tampon B, la solution de fixation est à 0,4 % en paraformaldéhyde. Les cellules purifiées après la digestion enzymatique sont incubées une heure dans 0,33 mM de fluorescéine phalloïdine (Molecular Probes), puis sont rincées dans le PBSI. Le 1, 4 diazabicyclo-(2, 2, 2) octan (DABCO) à 2 % est ajouté à la suspension cellulaire pour réduire le blanchiment. La cytochalasine B, inhibiteur de la polymérisation de l’actine, est utilisée à 50 mg mL–1 sur des cellules vivantes. Les préparations sont montées dans une goutte de Citifluor (Citifluor Ltd, Londres, Royaume-Uni). L’ensemble des observations est réalisé en microscopie confocale à balayage Biorad Lasersharp MRC 600 [31]. 2.5. Coloration des polysaccharides sulfatés
Les filaments de Sphacelaria sont incubés pendant 15 min dans le bleu de toluidine O à 0,1 % préparé dans l’eau de mer à pH 1,5. Ils sont rincés 3 × 5 min dans l’éthanol absolu. Les vésicules contenant les polysaccharides sulfatés sont colorées en bleu en lumière naturelle [12].
729
A. Ouichou, G. Ducreux / C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie / Life Sciences 323 (2000) 727–733
Figure 1. Organisation prémitotique de la cellule apicale chez Sphacelaria. A. Coupe tangentielle de la région distale montrant les faisceaux de microtubules, polymérisés à partir du centrosome distal (flèche), qui semblent converger vers l’apex. B. Les MFs sont localisés au niveau des deux extrémités de la cellule. C. Sur une coupe axiale, un site cortical distal riche en actine est mis en évidence. D. et E. Colocalisation de la vitronectine (D) et l’α-actinine (E) au niveau de l’apex (flèches). F. Mise en évidence de vésicules cytoplasmiques contenant une protéine homologue à la sous-unité β1 de l’intégrine autour du noyau. N : noyau ou son emplacement, barre : 10 µm.
3. Résultats L’apex de la cellule apicale de Sphacelaria est la zone privilégiée de la croissance et de la synthèse pariétale. Les immunomarquages du cytosquelette microtubulaire de la cellule en interphase montrent que de nombreux faisceaux sont nucléés à partir du centrosome distal et convergent vers l’apex où ils contribuent probablement à la fixation de l’axe de polarité (figure 1.A). Au même endroit, on observe un réseau d’actine sous forme d’un dôme sous-membranaire (figure 1.B) souvent réduit à un site particulièrement fluorescent et dense (figure 1.C, flèche). La recherche d’autres protéines a permis de préciser les relations entre le cytosquelette cortical et la matrice pariétale. L’utilisation d’un anticorps monoclonal dirigé contre la vitronectine humaine permet de visualiser des vésicules contenant une protéine homologue à la vitronectine. Ces vésicules sont produites en abondance et de façon polarisée dans le cytoplasme distal à proximité du noyau, puis
730
transportées en direction de l’apex (figure 2.A, B) où elles sont incorporées au niveau de la membrane et de la paroi au sommet de la cellule (figure 2.A, D). Certaines cellules montrent une localisation de la vitronectine réduite à un point sommital (figure 1.D), qui coïncide avec la configuration de l’actine sur la figure 1.C. Afin de vérifier si la localisation de la vitronectine à l’apex de la cellule ne correspondait pas à un artefact résultant du traitement enzymatique, sa présence au niveau de la paroi a été confirmée par le marquage de l’enveloppe pariétale séparée de la cellule (figure 2.C), d’une section longitudinale de la cellule (figure 2.D) et enfin d’une section transversale sommitale (figure 2.E). L’immunomarquage des cellules apicales avec un anticorps dirigé contre l’α-actinine de lapin permet de localiser une protéine homologue associée à la membrane, d’abord dans le cytoplasme puis au niveau de l’apex, au même endroit que l’actine et la vitronectine (figure 1.E). Ce résultat conforte l’hypothèse de l’existence d’un complexe protéique en liaison avec le cytosquelette. L’α-actinine est une protéine de type acting binding protein (ABP), connue pour connecter le réseau d’actine cortical à la matrice extracellulaire en se liant à un récepteur transmembranaire, une intégrine. Un anticorps monoclonal dirigé contre la sous-unité β1 de l’intégrine du blé révèle effectivement l’existence d’une protéine homologue dans le cytoplasme (figure 1.F), mais sa présence au niveau de la membrane n’est pas établie. Des colorations par le bleu de toluidine O, spécifique des polysaccharides sulfatés, ont été également réalisées. La distribution des vésicules marquées est similaire à celle des vésicules contenant la vitronectine, à savoir une production à proximité du noyau (figure 3.A), puis un transport directionnel vers l’apex, où elles sont incorporées (figure 3.B). Ce transport est contrôlé par l’actine puisque la cytochalasine B empêche la migration des vésicules qui s’accumulent dans le cytoplasme à proximité du noyau, leur aspect devenant dense et compact (figure 3.C). Ce résultat confirme l’implication de l’actine dans l’activité sécrétrice de la cellule et dans la construction du site distal chez la cellule apicale.
4. Discussion Notre étude avait pour objectif de préciser les relations existant entre le cytosquelette et la paroi au niveau de l’apex. Les résultats obtenus montrent l’existence : a) de protéines homologues de la vitronectine, de l’α-actinine et de la β1-intégrine, connues pour être impliquées dans des liaisons entre le cytosquelette cortical et la matrice pariétale dans les cellules animales, b) d’une structure cytosquelettique complexe associant un site dense d’actine et vraisemblablement un centre organisateur des microtubules. De plus, des traitements à la cytochalasine B ont permis de mettre en évidence dans certains cas un faisceau axial de microtubules assurant une solide liaison entre la zone de convergence des microtubules et le centrosome distal. Il est possible d’établir un schéma cohérent de l’organisation de la partie distale de la cellule
A. Ouichou, G. Ducreux / C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie / Life Sciences 323 (2000) 727–733
Figure 2. Identification et localisation de la vitronectine au cours de l’élongation cellulaire. A. Dès la fin de la télophase, les vésicules contenant la vitronectine sont produites, majoritairement, dans le cytoplasme périnucléaire distal. B. Migration vers l’apex. C–E. Incorporation dans la paroi, d’une enveloppe pariétale isolée (les lignes discontinues matérialisent la paroi difficilement visible pour cause de contraste) (C), d’une section longitudinale de la cellule (D) et d’une section transversale sommitale (E). N : noyau de la cellule apicale N’, noyau de la future cellule sous-apicale), barre : 10 µm.
apicale de Sphacelaria (figure 4). Le modèle proposé montre le continuum qui existe du noyau à la paroi (ou l’inverse), néanmoins, il reste encore hypothétique car le
Figure 3. Distribution des polysaccharides sulfatés dans la cellule apicale de Sphacelaria en croissance. A. Transport des polysaccharides sulfatés vers l’apex au niveau de la zone de croissance. B. Mise en place dans la partie distale de la cellule. C. Accumulation des vésicules dans le cytoplasme chez les cellules traitées avec 50 mg mL–1 de cytochalasine B. Noter que le point d’attache au niveau de l’apex (A) disparaît lorsque l’actine est dépolymérisée (C). N : noyau, barre : 15 µm.
type de connexions directes ou indirectes pouvant lier les différents composants ne peut pas être précisé complètement par immunolocalisation. Une approche moléculaire faisant intervenir des mutants de protéines intermédiaires est à envisager pour compléter ce schéma. L’existence d’un site cortical complexe et de liaisons structurales avec le centrosome a été mise en évidence chez différents types de cellules où la fixation de la polarité est critique pour la poursuite du programme morphogénétique. Chez C. elegans [1, 32], S. cerevisiae [4] et le zygote des Fucales [23, 33], ce site cortical est impliqué dans le contrôle du mouvement des centrosomes, par l’intermédiaire d’un mécanisme dépendant de l’actine, pour la détermination du plan de division. Chez la cellule apicale de Sphacelaria, cette structure distale se mettrait en place, en fin de télophase, dès la fin de la rotation des centrosomes. Elle favoriserait la sécrétion asymétrique de polysaccharides sulfatés mais aussi de protéines pariétales (vitronectine par exemple). L’incorporation de cette protéine au niveau de la membrane puis de la paroi suggère l’existence d’une succession d’événements, impliquant le complexe cytosquelette–membrane plasmique–paroi, qui dirige la protéine du cytoplasme vers un site spécifique. Il est évident que ce cheminement nécessite la construction de ponts protéiques qui servent de liens entre les protéines de la matrice extracellulaire et le cytosquelette cortical
731
A. Ouichou, G. Ducreux / C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie / Life Sciences 323 (2000) 727–733
Figure 4. Modèle proposé pour rendre compte des interactions entre le cytosquelette cortical et le complexe transmembraire dans la région distale et axiale de la cellule apicale de Sphacelaria. Les MFs ) délimitent un site cortical sous membranaire qui impliquerait ( des intégrines ( ) et l’α-actinine ( ) dans les liaisons entre le cytosquelette microtubulaire ( ) et la membrane ( ). La vitronectine ( ) participe au verrouillage avec la paroi ( ). Les polysaccharides sulfatés ( ) sont transportés et transférés par l’intermédiaire des MFs. Le centre organisateur secondaire des microtubu) participerait à la construction du site cortical et au renforles ( ). N : noyau ; ? : cement des liaisons avec le centrosome ( relations non définies).
[15]. Un anticorps monoclonal, dirigé contre la vitronectine humaine, reconnaît chez Sphacelaria un polypeptide d’environ 69 kD (résultat non montré). La spécificité de la réaction immunologique a été confirmée par l’utilisation d’un peptide compétiteur contenant le motif RGD. De même, la sous-unité β1 de l’intégrine est détectée dans le cytoplasme, avec un poids moléculaire avoisinant 100 kDa. La β1 intégrine correspond souvent à la sous-unité des récepteurs de la vitronectine quand celle-ci est impliquée dans un rôle d’adhésion [34]. En revanche son rapport direct avec la vitronectine au niveau du site distal reste à déterminer. Les récents travaux réalisés sur les zygotes des Fucales [11, 12, 35, 36] ont décrit des événements similaires liés à la polarisation au niveau de la paroi. La ségrégation du
Références [1] Hyman A.A., Centrosome movement in the early divisions of Caenorhabditis elegans: a cortical site determining centrosome position, J. Cell Biol. 109 (1989) 1185–1193. [2] Hill D.P., Strome S., Brief cytochalasin-induced disruption of MFs during critical interval in 1-cell C. elegans embryos alters the partitioning of developmental instructions to the 2-cell embryo, Development 108 (1) (1990) 159–172. [3] Jacobs C.W., Adams A.E.M., Szaniszlo P.J., Pringle J.R., Functions of microtubules in the Saccharomyces cerevisiae cell cycle, J. Cell Biol. 107 (1988) 1409–1426.
732
matériel pariétal survient très tôt dans le développement. La vitronectine [10] et les polysaccharides sulfatés [12] sont incorporés dans la paroi au niveau du site présomptif de la germination du rhizoïde, par l’intermédiaire de ponts transmembranaires [37]. L’accumulation d’actine au même site coïncide avec le transport de ces composants. Chez Sphacelaria, des événements de même ordre ont lieu au cours de la phase d’élongation de la cellule apicale. La présence d’actine étroitement associée à l’interface membrane plasmique–paroi à l’extrémité distale de la cellule apicale [28] indique le rôle fondamental du cytosquelette cortical dans la construction du site distal en rapport avec la stabilité de la polarité cellulaire [38]. Chez Sphacelaria, sur des coupes optiques axiales au niveau de l’apex, l’assemblage des microfilaments sous forme d’une plaque sommitale serait associé à une étape où l’ancrage est fortement sollicité entre le cytosquelette et la paroi dans la mise en place de la polarité cellulaire et/ou de sa fixation. De plus le marquage des MFs in vivo montre un arrangement circulaire non détecté sur les cellules fixées, qui délimiterait la zone d’élongation cellulaire (non montré). Des configurations comparables ont été également observées chez le zygote de Pelvetia [36]. Le mécanisme par lequel la plaque d’actine se construit est inconnu. Il a été suggéré que des protéines, probablement liant l’actine, présentes au préalable au niveau du rhizoïde avant l’apparition de cette structure, seraient nécessaires à l’assemblage de l’actine en plaque [35]. Nos résultats chez Sphacelaria appuient cette hypothèse, l’α-actinine montre une configuration en plaque qui coïncide avec la présence d’actine au sommet de la cellule apicale. Par ailleurs, la distribution de la vitronectine focalisée au niveau de la paroi distale et dans certains cas sous forme d’un point sommital confirmerait une étroite relation entre ces trois éléments et évoquerait l’existence d’un complexe d’adhésion paroi–membrane similaire à celui des zygotes des Fucales [33]. Plusieurs données manquent pour préciser la signification fonctionnelle de cet édifice. La paroi constituerait à ce niveau un site d’information de position pour l’établissement de la polarité cellulaire et le maintien de la caractéristique méristématique de la cellule apicale.
Remerciements. Les auteurs tiennent à remercier J.-C. Callen pour ses critiques et suggestions, D. Froger pour les clichés photographiques.
[4] Hyman A.A., Stearns T., Spindle positioning and cell polarity, Cell Division 9 (1992) 469–471. [5] Shaw S., Quatrano R., The role of targeted secretion in the establishment of cell polarity and the orientation of the division plane in Fucus zygotes, Development 122 (1996) 2623–2630. [6] Ryu J.H., Takagi S., Nagai R., Stationary organization of the actin cytoskeleton in Vallisneria: the role of stable MFs at the end walls, J. Cell Sci. 108 (4) (1995) 1531–1539. [7] Sonobe S., Cell model systems in plant cytoskeleton studies, Int. Rev. Cyt. 175 (1997) 1–27. [8] Knox J.P., The extracellular matrix in higher plants 4. Developmentally regulated proteoglycans and glycoproteins of the plant cell surface, FASEB 9 (11) (1995) 1004–1012.
A. Ouichou, G. Ducreux / C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie / Life Sciences 323 (2000) 727–733 [9] Berger F., Haseloff J., Schiefelbein J., Dolan L., Positional information in root epidermis is defined during embryogenesis and acts in domains with strict boundaries, Curr. Biol. 8 (8) (1998) 421–430. [10] Wagner V.T., Brian L., Quatrano R.S., Role of vitronectin-like molecule in embryo adhesion of the brown alga Fucus, PNAS 89 (1992) 3644–3648. [11] Brownlee C., Berger F., Extracellular matrix and pattern in plant embryos: on the lookout for developmental information, Trends Genet. 11 (9) (1995) 344–348. [12] Shaw S., Quatrano R., Polar localization of a dihydropyridine receptor on living Fucus zygotes, J. Cell Sci. 109 (2) (1996) 335–342. [13] Sumper M., Hullman A., Biochemistry of the extracellular matrix of Volvox, Int. Rev. Cytol. 180 (1998) 51–85. [14] Lord E.M., Sanders L.C., Roles for the extracellular matrix in plant development and pollination: a special case of cell movement in plants, Dev. Biol. 153 (1992) 16–28. [15] Wyatt S.E., Carpita N.C., The plant cytoskeleton-cell-wall continuum, Trends Cell Biol. 3 (1993) 413–417. [16] Akiyama S.K., Nagata K., Yamada K.M., Cell surface receptors for extracellular matrix components, Biochim. Biophys. Acta 1031 (1990) 91–110. [17] Nakashima N., Miyazaki K., Ishikawa M., Yatohgo T., Ogawa H., Uchibori H., Matsumoto I., Seno N., Hayashi M., Vitronectin diversity in evolution but uniformity in ligand binding and size of the core polypeptide, Biochim. Biophys. Acta 1120 (1) (1992) 1–10. [18] Kitagaki-Ogawa H., Yatohgo T., Izumi M., Hayashi M., Kashiwagi H., Matsumoto I., Seno N., Diversities in animal vitronectins. Differences in molecular weight, immunoreactivity and carbohydrate chains, Biochim. Biophys. 1033 (1) (1990) 49–56. [19] Schindler M., Meiners S., Cheresh D.A., RGD-dependent linkage between plant cell wall and plasma membrane: consequences for growth, J. Cell Biol. 108 (5) (1989) 1955–1965. [20] Ryu J.H., Mizumo K., Takagi S., Nagai R., Extracellular components implicated in the stationary organization of the actin cytoskeleton in mesophyll cells of Vallisneria, Plant Cell Physiol. 38 (4) (1997) 420–432. [21] Carpita N., McCann M., Griffing L.R., The plant extracellular matrix: news from the cell’s frontier, Plant Cell 8 (9) (1996) 1451–1463. [22] Quatrano R.S., Brian L., Aldridge J., Schultz T., Polar axis fixation in Fucus zygotes: components of the cytoskeleton and extracellular matrix, Dev. Suppl. 1 (1991) 11–16.
[23] Goodner B., Quatrano R.S., Fucus embryogenesis a model to study the establishment of the polarity, Plant Cell 5 (1993) 1471–1481. [24] Menzel D., The role of the cytoskeleton in polarity and morphogenesis of algal cells, Curr. Opin. Cell Biol. 8 (1996) 38–42. [25] Katsaros C., Apical cells of brown algae with particular reference to Sphacelariales, Dictyotales and Fucales, Phycol. Res. 43 (1995) 43–59. [26] Katsaros C., Immunofluorescence study of microtubule organization in some polarized cell types of selected brown algae, Bot. Acta 105 (1992) 400–406. [27] Rusig A.M., Le Guyader H., Ducreux G., Microtubules organization in the apical cell of Sphacelaria (Phaeophyceae) and its related protoplast, Hydrobiologia 260–261 (1993) 167–172. [28] Loiseaux S., Rozier C., Culture axénique de Pylaiella littoralis (L) Kjellm. (Phéophycées), Rev. Algol. N. S. 13 (1978) 333–340. [29] Motomura T., Immunofluorescence microscopy of fertilization and parthenogenesis in Laminaria angustata (Phaeophyta), J. Phycol. 27 (1991) 248–257. [30] Nakada H.T., Sweany P.C., Alginic acid degradation dy eliminases from abalone hepatopancreas, J. Biol. Chem. 242 (1967) 845–851. [31] Laurent M., Jouhannin G., Le Guyader H., Fleury A., Confocal scanning optical microscopy and three-dimensional imaging, Biol. Cell 76 (1992) 113–124. [32] Cheng N.N., Kirby C.M., Kemphues K.J., Control of cleavage spindle orientation in Caenorhabditis elegans the role of the genes par-2 and par-3, Genetics 139 (1995) 549–559. [33] Kropf D.L., Cytosqueletal control of cell polarity in plant zygote, Dev. Biol. 165 (1994) 361–371. [34] Delannet M., Martin F., Bossy B., Cheresh D.A., Reichardt L.F., Duband J.L., Specific roles of the alpha V beta 1, alpha V beta 3 and alpha V beta 5 integrins in avian neural crest cell adhesion and migration on vitronectin, Development 120 (9) (1994) 2687–2702. [35] Fowler J.F., Quatrano R.S., Plant cell morphogenesis: plasma membrane interactions with the cytoskeleton and cell wall, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 13 (1997) 697–743. [36] Allessa L., Kropf D.L., F-actin marks the rhizoid pole in living Pelvetia compressa zygotes, Development 126 (1999) 201–209. [37] Kropf D.L., Coffman H.R., Kloareg B., Glenn P., Allen W., Cell wall and rhizoïd polarity in Pelvetia embryos, Dev. Biol. 160 (1993) 303–314. [38] Kropf D.L., Bisgrove S.R., Hable W.E., Cytoskeletal control of polar growth in plant cells, Curr. Opin. Cell Biol. 10 (1998) 117–122.
733
Biologie et pathologie végétales / Plant biology and pathology
Connexions cortex–paroi chez la cellule apicale de Sphacelaria Aicha Ouichoua, Georges Ducreuxa* a
Laboratoire de morphogenèse végétale expérimentale, université de Paris-Sud XI. Bât. 360, 91405 Orsay cedex, France
Reçu le 10 février 2000 ; accepté le 17 avril 2000 Présenté par Bernard Kloarec
Abstract – Cell cortex and cell wall connections in the apical cell of Sphacelaria. The apical cell of Sphacelaria (Fucophyceae) exhibits a permanent polarized organization throughout asymmetric divisions. The apex organization was studied by immunolocalization of tubulin, vitronectin, a-actinin and β1 integrin. Microfilaments were stained directly by fluorescein phalloidin. The apex was highly organized around a patch of microfilaments densely packed at the tip, where vitronectin-like and a-actininlike proteins colocalized. In the same area, an actin-dependent targeted secretion of sulfated polysaccharides was shown. The permanent localization of these components throughout cell elongation suggests that a cortical site involving transmembrane connections between the cytoskeleton and the extracellular matrix is required for cell polarity. A model of the organization of the tip is proposed. © 2000 Académie des sciences/Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS cell polarity / cytoskeleton / cell wall / cortical site / Phaeophyceae / Sphacelaria Résumé – La cellule apicale de Sphacelaria présente une organisation polarisée permanente à travers des divisions asymétriques répétées ; son apex joue un rôle déterminant dans le maintien de l’axe de polarité et dans l’élongation cellulaire. L’organisation de cette région a été précisée par des études d’immunolocalisation à l’aide d’anticorps monoclonaux dirigés contre les tubulines, l’α-actinine, la vitronectine et la β1 intégrine. Les microfilaments, marqués directement avec la fluorescéine phalloïdine, forment un dôme apical sous-membranaire centré autour d’une plaque d’actine sommitale qui coïncide avec la localisation de protéines homologues à l’α-actinine et à la vitronectine. De plus, la coloration des polysaccharides sulfatés, par le bleu de toluidine O, montre que leur transport est directionnel vers la paroi distale et s’effectue selon un processus dépendant des microfilaments. La distribution de ces composants pendant la phase d’élongation suggère l’existence d’un site cortical distal qui serait impliqué dans la polarité de la cellule apicale. Un modèle d’organisation de ce site est proposé. © 2000 Académie des sciences/Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS polarité / micofilaments / paroi / site cortical / Phaeophyceae / Sphacelaria MF(s) = Microfilaments ; RGD = Arg-Gly-Asp.
* Correspondance et tirés à part : [email protected]
727
A. Ouichou, G. Ducreux / C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie / Life Sciences 323 (2000) 727–733
Abridged version Cell polarity and asymmetrical mitosis are dependent on cytoplasmic and cortical cytoskeleton in many animal or vegetal cells involved in morphogenetic events. Recent investigations have shown, mainly in animal systems, that spatial organization of polarized cells and subsequent location of division planes, are related to the positioning of a cortical site. Connections between cortical cytoskeleton and extracellular matrix, through transmembrane bridges and RGD binding peptides, involve proteins such as α-actinin or vitronectin. Up to now, few investigations have been made in plant cells except in fucoïd zygotes where the fixation of polarity axis and first asymmetric mitosis are related to a specific cortical site. We report here on new investigations on the apical cell of Sphacelaria. This cell is characterized by repetitive asymmetrical mitosis and involved in cell elongation through wall synthesis at the apex. During interphase, cytoplasmic bundles of microtubules are
1. Introduction Plusieurs études menées sur la division asymétrique chez différents organismes animaux ou végétaux montrent que la définition du plan de division est corrélée à l’établissement d’un site cortical qui détermine l’orientation du fuseau mitotique. C’est le cas par exemple de la réorientation du fuseau mitotique de la cellule P1 chez C. elegans [1, 2], de l’apparition du site de bourgeonnement chez S. cerevisiae [3, 4] ou des zygotes des Fucales [5]. Les études sur le cytosquelette cortical ont été privilégiées dans les systèmes cellulaires qui présentent une organisation polarisée mettant en œuvre des connexions entre le cytosquelette et la matrice pariétale. Chez les végétaux, de nouveaux schémas sont apparus pour rendre compte de la structure et des fonctions du cytosquelette cortical qui pourraient intervenir dans la signalisation cellulaire [6, 7]. L’émergence du concept de l’information de position a orienté alors les recherches vers l’exploration du cortex [8–13]. La majorité des protéines pariétales identifiées auparavant était considérée comme spécifique aux plantes, mais récemment, des protéines de la paroi et de la membrane végétales ont révélé des motifs protéiques homologues à certaines protéines de la matrice extracellulaire de la cellule animale [14]. Des peptides qui contiennent le motif Arg-Gly-Asp (RGD), habituellement impliqués dans l’adhésion focale chez la cellule animale par l’intermédiaire d’intégrines appropriées, peuvent aussi intervenir dans les connexions paroi–membrane chez les plantes [15]. La vitronectine a été plus particulièrement étudiée [16, 17]. C’est une glycoprotéine présentant une grande diversité de poids moléculaire [18] ; son extrémité
728
nucleated by the distal centrosome converging to the distal part where actin microfilaments are also abundant and densely packed. Immunolabelling with human anti-vitronectin and rabbit anti-α-actinin has shown that vitronectin-like and α-actinin-like proteins are synthesized in the perinuclear distal cytoplasm, migrate to the apex and colocalize with the same cortical site as actin. Staining with toluidine blue O, a specific dye for sulfated polysaccharides, has shown the incorporation of these wall components into the same distal area through actin control since the migration of sulfated polysaccharides is inhibited by cytochalasin B. These convergent observations allow a model for the cortical site at the tip of the apical cell to be proposed. Organization of this cortical site is compared with similar systems in polarized animal cells. Discussion emphasizes homologies with the development of the fucoïd zygote and the involvement of the distal site in the maintaining of meristematic characteristics of the Sphacelaria apical cell.
N-terminale possède la séquence RGD commune aux protéines d’adhésion de la matrice extracellulaire [19, 20]. Des arguments tendent à prouver que le cytosquelette participe à la construction des complexes de stabilisation de la polarité dans l’embryogenèse végétale [15, 21–23]. Chez les algues filamenteuses, les événements liés à l’établissement de la polarité cellulaire ont permis d’étudier la dynamique du cytosquelette et son rôle comme générateur de l’organisation spatiale de la cellule [24]. Dans cette optique, une attention toute particulière a été portée aux cellules apicales dont la fonction méristématique est une caractéristique directement liée au programme morphogénétique [25]. Des travaux ont été consacrés aux réorganisations structurales corrélées aux divisions asymétriques et répétitives de la cellule apicale de Sphacelaria [26, 27]. Pendant l’interphase, le cytosquelette, fortement polarisé, établit un continuum entre la paroi distale, le complexe noyau centrosome et la paroi proximale, l’ensemble étant stabilisé par des connexions latérales. Le cytosquelette microtubulaire subit un effondrement transitoire au moment de l’entrée en mitose, et se reconstitue à la fin de la division pour retrouver l’architecture initiale. La reconstruction de ce réseau coïncide avec le rétablissement des connexions avec la région corticale de la cellule apicale, en particulier l’extrémité distale. Les résultats obtenus suggèrent l’existence d’une organisation complexe de cette partie distale, dont la structure reste stable au cours des divisions asymétriques [26, 27]. Considérant que cette stabilité pouvait être liée à l’existence de connexions entre le cytosquelette cortical et la paroi, nous avons cherché à identifier quelques-unes des
A. Ouichou, G. Ducreux / C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie / Life Sciences 323 (2000) 727–733
protéines impliquées. Le but de cet article est de décrire les composants du site cortical distal et d’analyser expérimentalement les connexions paroi–membrane en relation avec le cytosquelette et en liaison avec la croissance apicale.
2. Matériel et méthodes 2.1. Conditions de culture
Sphacelaria sp. (gracieusement fournie par les Drs L. Provasoli, Haskins Laboratories, New Haven, CN, EtatsUnis, et Loiseaux De Goer, Station biologique, Roscoff, France) est cultivée axéniquement à 12 °C sous une photopériode de 12h/12h et une intensité de lumière de 0,8 mmol m–2 s–1. Une aération stérile est assurée grâce à une pompe (Rena 301) pendant les 6 jours précédant l’expérimentation. Les filaments possédant des cellules initiales en croissance active, sont utilisés pour les marquages. Le milieu de culture est constitué de l’eau de mer naturelle, autoclavée à 120 °C pendant 1 h, contenant 2 % (v/v) du milieu Provasoli (ESP : Erd. Schreiber Provasoli) [28]. 2.2. Préparation des cellules
Après un rinçage dans un tampon A contenant : 60 mM Pipes, 25 mM Hepes, 10 mM EGTA, 2 mM MgCl2, pH 7,4 [29], les filaments de Sphacelaria sont fixés une heure dans un mélange de paraformaldéhyde (4 %) et de glutaraldéhyde (0,1 %) dans le tampon A. Après trois rinçages dans le tampon A, les parois sont digérées pendant 4 h dans une solution enzymatique contenant 1 % de cellulase R 10, 0,5 % de macérozyme Onozuka (Yakult Pharmaceutical Co., Tokyo, Japon), 50 mM de trisodium citrate, 2 % d’alginates lyases préparés à partir d’extraits d’Aplysia vaccaria [30] et un mélange d’inhibiteurs de protéases (1 mM PMSF, 1 mM bis-benzimidine et 20 µg mL–1 leupeptine). À la fin de la digestion, une agitation ménagée facilite la libération des cellules apicales. Une première filtration avec un tamis de 100 µm élimine les filaments non digérés, puis une série de trois centrifugations à 85 g dans le tampon A permet la purification des cellules apicales. Les membranes sont perméabilisées pendant 2 min avec le Triton X-100 à 0,5 %. Après deux rinçages dans le tampon A, les cellules sont transférées dans le PBS (130 mM NaCl, 2mM KCl, 8mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, pH 7,4). Le passage dans 0,25 mg mL -1 de NaBH4 réduit la fluorescence due au glutaraldéhyde avant un dernier rinçage dans le PBSI [PBS, 10 mM EGTA, 2mM MgCl2, 0,3 % de sérum albumine de bœuf (BSA), pH 7,4]. Afin de préciser les connexions transmembranaires entre le cytoplasme cortical et la paroi, des coupes de 10 µm sont effectuées avec un ultramicrotome à congélation après la fixation aldéhydique des filaments.
2.3. Immunofluorescence 2.3.1. α-Actinine, β1-intégrine et vitronectine
L’anticorps monoclonal α-actinine dilué au 1:250 (clone EA-53, Sigma), l’anti-β1-intégrine dilué au 1:250 (clone DF5, ICN), l’anti-vitronectine dilué au 1:200 (clone VT-2, Sigma) sont préparés dans le tampon PBSI. Les marquages sont réalisés pendant une heure sur les cellules apicales, avec paroi, sans paroi, sur les enveloppes pariétales séparées des cellules apicales après une digestion courte (la digestion commence au niveau l’apex et permet ainsi la libération des cellules avant la dégradation avancée de la paroi), et enfin sur des coupes de 10 mm des filaments de Sphacelaria. Après trois rinçages dans le PBSI, les préparations sont incubées dans la fluorescéine isothiocyanate (FITC) conjuguée à l’anti-souris IgG (Pasteur) diluée au 1:100 dans le tampon PBSI. 2.3.2. Microtubules
Les coupes des filaments, fixées sur des lames gélatinées, sont incubées dans un mélange d’anti-α et anti-βtubuline (Amersham) dilué au 1:500 dans le PBSI pendant 1 h à la température ambiante. Après trois rinçages dans le PBSI, les préparations sont incubées dans la fluorescéine isothiocyanate (FITC) conjuguée à l’IgG anti-souris (Pasteur) dilué au 1:100 dans PBSI, 0,3 % BSA. Après trois rinçages dans le PBSI, les coupes sont montées dans le Citifluor (Citifluor Ltd, Londres, Royaume-Uni). 2.4. Coloration des microfilaments
Des modifications sont apportées au protocole de base de la préparation des cellules. La composition du tampon est différente : 100 mM Pipes, 10 mM EGTA, 10 mM MgSO4 7H2O, 5 % DMSO, 0,8 M mannitol et 3 % NaCl (tampon B). Les filaments sont stabilisés pendant 30 min dans 0,3 mM de m-Maleimidobenzoyl-Nhydroxysuccinimide ester (MBS) dans le tampon B, la solution de fixation est à 0,4 % en paraformaldéhyde. Les cellules purifiées après la digestion enzymatique sont incubées une heure dans 0,33 mM de fluorescéine phalloïdine (Molecular Probes), puis sont rincées dans le PBSI. Le 1, 4 diazabicyclo-(2, 2, 2) octan (DABCO) à 2 % est ajouté à la suspension cellulaire pour réduire le blanchiment. La cytochalasine B, inhibiteur de la polymérisation de l’actine, est utilisée à 50 mg mL–1 sur des cellules vivantes. Les préparations sont montées dans une goutte de Citifluor (Citifluor Ltd, Londres, Royaume-Uni). L’ensemble des observations est réalisé en microscopie confocale à balayage Biorad Lasersharp MRC 600 [31]. 2.5. Coloration des polysaccharides sulfatés
Les filaments de Sphacelaria sont incubés pendant 15 min dans le bleu de toluidine O à 0,1 % préparé dans l’eau de mer à pH 1,5. Ils sont rincés 3 × 5 min dans l’éthanol absolu. Les vésicules contenant les polysaccharides sulfatés sont colorées en bleu en lumière naturelle [12].
729
A. Ouichou, G. Ducreux / C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie / Life Sciences 323 (2000) 727–733
Figure 1. Organisation prémitotique de la cellule apicale chez Sphacelaria. A. Coupe tangentielle de la région distale montrant les faisceaux de microtubules, polymérisés à partir du centrosome distal (flèche), qui semblent converger vers l’apex. B. Les MFs sont localisés au niveau des deux extrémités de la cellule. C. Sur une coupe axiale, un site cortical distal riche en actine est mis en évidence. D. et E. Colocalisation de la vitronectine (D) et l’α-actinine (E) au niveau de l’apex (flèches). F. Mise en évidence de vésicules cytoplasmiques contenant une protéine homologue à la sous-unité β1 de l’intégrine autour du noyau. N : noyau ou son emplacement, barre : 10 µm.
3. Résultats L’apex de la cellule apicale de Sphacelaria est la zone privilégiée de la croissance et de la synthèse pariétale. Les immunomarquages du cytosquelette microtubulaire de la cellule en interphase montrent que de nombreux faisceaux sont nucléés à partir du centrosome distal et convergent vers l’apex où ils contribuent probablement à la fixation de l’axe de polarité (figure 1.A). Au même endroit, on observe un réseau d’actine sous forme d’un dôme sous-membranaire (figure 1.B) souvent réduit à un site particulièrement fluorescent et dense (figure 1.C, flèche). La recherche d’autres protéines a permis de préciser les relations entre le cytosquelette cortical et la matrice pariétale. L’utilisation d’un anticorps monoclonal dirigé contre la vitronectine humaine permet de visualiser des vésicules contenant une protéine homologue à la vitronectine. Ces vésicules sont produites en abondance et de façon polarisée dans le cytoplasme distal à proximité du noyau, puis
730
transportées en direction de l’apex (figure 2.A, B) où elles sont incorporées au niveau de la membrane et de la paroi au sommet de la cellule (figure 2.A, D). Certaines cellules montrent une localisation de la vitronectine réduite à un point sommital (figure 1.D), qui coïncide avec la configuration de l’actine sur la figure 1.C. Afin de vérifier si la localisation de la vitronectine à l’apex de la cellule ne correspondait pas à un artefact résultant du traitement enzymatique, sa présence au niveau de la paroi a été confirmée par le marquage de l’enveloppe pariétale séparée de la cellule (figure 2.C), d’une section longitudinale de la cellule (figure 2.D) et enfin d’une section transversale sommitale (figure 2.E). L’immunomarquage des cellules apicales avec un anticorps dirigé contre l’α-actinine de lapin permet de localiser une protéine homologue associée à la membrane, d’abord dans le cytoplasme puis au niveau de l’apex, au même endroit que l’actine et la vitronectine (figure 1.E). Ce résultat conforte l’hypothèse de l’existence d’un complexe protéique en liaison avec le cytosquelette. L’α-actinine est une protéine de type acting binding protein (ABP), connue pour connecter le réseau d’actine cortical à la matrice extracellulaire en se liant à un récepteur transmembranaire, une intégrine. Un anticorps monoclonal dirigé contre la sous-unité β1 de l’intégrine du blé révèle effectivement l’existence d’une protéine homologue dans le cytoplasme (figure 1.F), mais sa présence au niveau de la membrane n’est pas établie. Des colorations par le bleu de toluidine O, spécifique des polysaccharides sulfatés, ont été également réalisées. La distribution des vésicules marquées est similaire à celle des vésicules contenant la vitronectine, à savoir une production à proximité du noyau (figure 3.A), puis un transport directionnel vers l’apex, où elles sont incorporées (figure 3.B). Ce transport est contrôlé par l’actine puisque la cytochalasine B empêche la migration des vésicules qui s’accumulent dans le cytoplasme à proximité du noyau, leur aspect devenant dense et compact (figure 3.C). Ce résultat confirme l’implication de l’actine dans l’activité sécrétrice de la cellule et dans la construction du site distal chez la cellule apicale.
4. Discussion Notre étude avait pour objectif de préciser les relations existant entre le cytosquelette et la paroi au niveau de l’apex. Les résultats obtenus montrent l’existence : a) de protéines homologues de la vitronectine, de l’α-actinine et de la β1-intégrine, connues pour être impliquées dans des liaisons entre le cytosquelette cortical et la matrice pariétale dans les cellules animales, b) d’une structure cytosquelettique complexe associant un site dense d’actine et vraisemblablement un centre organisateur des microtubules. De plus, des traitements à la cytochalasine B ont permis de mettre en évidence dans certains cas un faisceau axial de microtubules assurant une solide liaison entre la zone de convergence des microtubules et le centrosome distal. Il est possible d’établir un schéma cohérent de l’organisation de la partie distale de la cellule
A. Ouichou, G. Ducreux / C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie / Life Sciences 323 (2000) 727–733
Figure 2. Identification et localisation de la vitronectine au cours de l’élongation cellulaire. A. Dès la fin de la télophase, les vésicules contenant la vitronectine sont produites, majoritairement, dans le cytoplasme périnucléaire distal. B. Migration vers l’apex. C–E. Incorporation dans la paroi, d’une enveloppe pariétale isolée (les lignes discontinues matérialisent la paroi difficilement visible pour cause de contraste) (C), d’une section longitudinale de la cellule (D) et d’une section transversale sommitale (E). N : noyau de la cellule apicale N’, noyau de la future cellule sous-apicale), barre : 10 µm.
apicale de Sphacelaria (figure 4). Le modèle proposé montre le continuum qui existe du noyau à la paroi (ou l’inverse), néanmoins, il reste encore hypothétique car le
Figure 3. Distribution des polysaccharides sulfatés dans la cellule apicale de Sphacelaria en croissance. A. Transport des polysaccharides sulfatés vers l’apex au niveau de la zone de croissance. B. Mise en place dans la partie distale de la cellule. C. Accumulation des vésicules dans le cytoplasme chez les cellules traitées avec 50 mg mL–1 de cytochalasine B. Noter que le point d’attache au niveau de l’apex (A) disparaît lorsque l’actine est dépolymérisée (C). N : noyau, barre : 15 µm.
type de connexions directes ou indirectes pouvant lier les différents composants ne peut pas être précisé complètement par immunolocalisation. Une approche moléculaire faisant intervenir des mutants de protéines intermédiaires est à envisager pour compléter ce schéma. L’existence d’un site cortical complexe et de liaisons structurales avec le centrosome a été mise en évidence chez différents types de cellules où la fixation de la polarité est critique pour la poursuite du programme morphogénétique. Chez C. elegans [1, 32], S. cerevisiae [4] et le zygote des Fucales [23, 33], ce site cortical est impliqué dans le contrôle du mouvement des centrosomes, par l’intermédiaire d’un mécanisme dépendant de l’actine, pour la détermination du plan de division. Chez la cellule apicale de Sphacelaria, cette structure distale se mettrait en place, en fin de télophase, dès la fin de la rotation des centrosomes. Elle favoriserait la sécrétion asymétrique de polysaccharides sulfatés mais aussi de protéines pariétales (vitronectine par exemple). L’incorporation de cette protéine au niveau de la membrane puis de la paroi suggère l’existence d’une succession d’événements, impliquant le complexe cytosquelette–membrane plasmique–paroi, qui dirige la protéine du cytoplasme vers un site spécifique. Il est évident que ce cheminement nécessite la construction de ponts protéiques qui servent de liens entre les protéines de la matrice extracellulaire et le cytosquelette cortical
731
A. Ouichou, G. Ducreux / C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie / Life Sciences 323 (2000) 727–733
Figure 4. Modèle proposé pour rendre compte des interactions entre le cytosquelette cortical et le complexe transmembraire dans la région distale et axiale de la cellule apicale de Sphacelaria. Les MFs ) délimitent un site cortical sous membranaire qui impliquerait ( des intégrines ( ) et l’α-actinine ( ) dans les liaisons entre le cytosquelette microtubulaire ( ) et la membrane ( ). La vitronectine ( ) participe au verrouillage avec la paroi ( ). Les polysaccharides sulfatés ( ) sont transportés et transférés par l’intermédiaire des MFs. Le centre organisateur secondaire des microtubu) participerait à la construction du site cortical et au renforles ( ). N : noyau ; ? : cement des liaisons avec le centrosome ( relations non définies).
[15]. Un anticorps monoclonal, dirigé contre la vitronectine humaine, reconnaît chez Sphacelaria un polypeptide d’environ 69 kD (résultat non montré). La spécificité de la réaction immunologique a été confirmée par l’utilisation d’un peptide compétiteur contenant le motif RGD. De même, la sous-unité β1 de l’intégrine est détectée dans le cytoplasme, avec un poids moléculaire avoisinant 100 kDa. La β1 intégrine correspond souvent à la sous-unité des récepteurs de la vitronectine quand celle-ci est impliquée dans un rôle d’adhésion [34]. En revanche son rapport direct avec la vitronectine au niveau du site distal reste à déterminer. Les récents travaux réalisés sur les zygotes des Fucales [11, 12, 35, 36] ont décrit des événements similaires liés à la polarisation au niveau de la paroi. La ségrégation du
Références [1] Hyman A.A., Centrosome movement in the early divisions of Caenorhabditis elegans: a cortical site determining centrosome position, J. Cell Biol. 109 (1989) 1185–1193. [2] Hill D.P., Strome S., Brief cytochalasin-induced disruption of MFs during critical interval in 1-cell C. elegans embryos alters the partitioning of developmental instructions to the 2-cell embryo, Development 108 (1) (1990) 159–172. [3] Jacobs C.W., Adams A.E.M., Szaniszlo P.J., Pringle J.R., Functions of microtubules in the Saccharomyces cerevisiae cell cycle, J. Cell Biol. 107 (1988) 1409–1426.
732
matériel pariétal survient très tôt dans le développement. La vitronectine [10] et les polysaccharides sulfatés [12] sont incorporés dans la paroi au niveau du site présomptif de la germination du rhizoïde, par l’intermédiaire de ponts transmembranaires [37]. L’accumulation d’actine au même site coïncide avec le transport de ces composants. Chez Sphacelaria, des événements de même ordre ont lieu au cours de la phase d’élongation de la cellule apicale. La présence d’actine étroitement associée à l’interface membrane plasmique–paroi à l’extrémité distale de la cellule apicale [28] indique le rôle fondamental du cytosquelette cortical dans la construction du site distal en rapport avec la stabilité de la polarité cellulaire [38]. Chez Sphacelaria, sur des coupes optiques axiales au niveau de l’apex, l’assemblage des microfilaments sous forme d’une plaque sommitale serait associé à une étape où l’ancrage est fortement sollicité entre le cytosquelette et la paroi dans la mise en place de la polarité cellulaire et/ou de sa fixation. De plus le marquage des MFs in vivo montre un arrangement circulaire non détecté sur les cellules fixées, qui délimiterait la zone d’élongation cellulaire (non montré). Des configurations comparables ont été également observées chez le zygote de Pelvetia [36]. Le mécanisme par lequel la plaque d’actine se construit est inconnu. Il a été suggéré que des protéines, probablement liant l’actine, présentes au préalable au niveau du rhizoïde avant l’apparition de cette structure, seraient nécessaires à l’assemblage de l’actine en plaque [35]. Nos résultats chez Sphacelaria appuient cette hypothèse, l’α-actinine montre une configuration en plaque qui coïncide avec la présence d’actine au sommet de la cellule apicale. Par ailleurs, la distribution de la vitronectine focalisée au niveau de la paroi distale et dans certains cas sous forme d’un point sommital confirmerait une étroite relation entre ces trois éléments et évoquerait l’existence d’un complexe d’adhésion paroi–membrane similaire à celui des zygotes des Fucales [33]. Plusieurs données manquent pour préciser la signification fonctionnelle de cet édifice. La paroi constituerait à ce niveau un site d’information de position pour l’établissement de la polarité cellulaire et le maintien de la caractéristique méristématique de la cellule apicale.
Remerciements. Les auteurs tiennent à remercier J.-C. Callen pour ses critiques et suggestions, D. Froger pour les clichés photographiques.
[4] Hyman A.A., Stearns T., Spindle positioning and cell polarity, Cell Division 9 (1992) 469–471. [5] Shaw S., Quatrano R., The role of targeted secretion in the establishment of cell polarity and the orientation of the division plane in Fucus zygotes, Development 122 (1996) 2623–2630. [6] Ryu J.H., Takagi S., Nagai R., Stationary organization of the actin cytoskeleton in Vallisneria: the role of stable MFs at the end walls, J. Cell Sci. 108 (4) (1995) 1531–1539. [7] Sonobe S., Cell model systems in plant cytoskeleton studies, Int. Rev. Cyt. 175 (1997) 1–27. [8] Knox J.P., The extracellular matrix in higher plants 4. Developmentally regulated proteoglycans and glycoproteins of the plant cell surface, FASEB 9 (11) (1995) 1004–1012.
A. Ouichou, G. Ducreux / C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie / Life Sciences 323 (2000) 727–733 [9] Berger F., Haseloff J., Schiefelbein J., Dolan L., Positional information in root epidermis is defined during embryogenesis and acts in domains with strict boundaries, Curr. Biol. 8 (8) (1998) 421–430. [10] Wagner V.T., Brian L., Quatrano R.S., Role of vitronectin-like molecule in embryo adhesion of the brown alga Fucus, PNAS 89 (1992) 3644–3648. [11] Brownlee C., Berger F., Extracellular matrix and pattern in plant embryos: on the lookout for developmental information, Trends Genet. 11 (9) (1995) 344–348. [12] Shaw S., Quatrano R., Polar localization of a dihydropyridine receptor on living Fucus zygotes, J. Cell Sci. 109 (2) (1996) 335–342. [13] Sumper M., Hullman A., Biochemistry of the extracellular matrix of Volvox, Int. Rev. Cytol. 180 (1998) 51–85. [14] Lord E.M., Sanders L.C., Roles for the extracellular matrix in plant development and pollination: a special case of cell movement in plants, Dev. Biol. 153 (1992) 16–28. [15] Wyatt S.E., Carpita N.C., The plant cytoskeleton-cell-wall continuum, Trends Cell Biol. 3 (1993) 413–417. [16] Akiyama S.K., Nagata K., Yamada K.M., Cell surface receptors for extracellular matrix components, Biochim. Biophys. Acta 1031 (1990) 91–110. [17] Nakashima N., Miyazaki K., Ishikawa M., Yatohgo T., Ogawa H., Uchibori H., Matsumoto I., Seno N., Hayashi M., Vitronectin diversity in evolution but uniformity in ligand binding and size of the core polypeptide, Biochim. Biophys. Acta 1120 (1) (1992) 1–10. [18] Kitagaki-Ogawa H., Yatohgo T., Izumi M., Hayashi M., Kashiwagi H., Matsumoto I., Seno N., Diversities in animal vitronectins. Differences in molecular weight, immunoreactivity and carbohydrate chains, Biochim. Biophys. 1033 (1) (1990) 49–56. [19] Schindler M., Meiners S., Cheresh D.A., RGD-dependent linkage between plant cell wall and plasma membrane: consequences for growth, J. Cell Biol. 108 (5) (1989) 1955–1965. [20] Ryu J.H., Mizumo K., Takagi S., Nagai R., Extracellular components implicated in the stationary organization of the actin cytoskeleton in mesophyll cells of Vallisneria, Plant Cell Physiol. 38 (4) (1997) 420–432. [21] Carpita N., McCann M., Griffing L.R., The plant extracellular matrix: news from the cell’s frontier, Plant Cell 8 (9) (1996) 1451–1463. [22] Quatrano R.S., Brian L., Aldridge J., Schultz T., Polar axis fixation in Fucus zygotes: components of the cytoskeleton and extracellular matrix, Dev. Suppl. 1 (1991) 11–16.
[23] Goodner B., Quatrano R.S., Fucus embryogenesis a model to study the establishment of the polarity, Plant Cell 5 (1993) 1471–1481. [24] Menzel D., The role of the cytoskeleton in polarity and morphogenesis of algal cells, Curr. Opin. Cell Biol. 8 (1996) 38–42. [25] Katsaros C., Apical cells of brown algae with particular reference to Sphacelariales, Dictyotales and Fucales, Phycol. Res. 43 (1995) 43–59. [26] Katsaros C., Immunofluorescence study of microtubule organization in some polarized cell types of selected brown algae, Bot. Acta 105 (1992) 400–406. [27] Rusig A.M., Le Guyader H., Ducreux G., Microtubules organization in the apical cell of Sphacelaria (Phaeophyceae) and its related protoplast, Hydrobiologia 260–261 (1993) 167–172. [28] Loiseaux S., Rozier C., Culture axénique de Pylaiella littoralis (L) Kjellm. (Phéophycées), Rev. Algol. N. S. 13 (1978) 333–340. [29] Motomura T., Immunofluorescence microscopy of fertilization and parthenogenesis in Laminaria angustata (Phaeophyta), J. Phycol. 27 (1991) 248–257. [30] Nakada H.T., Sweany P.C., Alginic acid degradation dy eliminases from abalone hepatopancreas, J. Biol. Chem. 242 (1967) 845–851. [31] Laurent M., Jouhannin G., Le Guyader H., Fleury A., Confocal scanning optical microscopy and three-dimensional imaging, Biol. Cell 76 (1992) 113–124. [32] Cheng N.N., Kirby C.M., Kemphues K.J., Control of cleavage spindle orientation in Caenorhabditis elegans the role of the genes par-2 and par-3, Genetics 139 (1995) 549–559. [33] Kropf D.L., Cytosqueletal control of cell polarity in plant zygote, Dev. Biol. 165 (1994) 361–371. [34] Delannet M., Martin F., Bossy B., Cheresh D.A., Reichardt L.F., Duband J.L., Specific roles of the alpha V beta 1, alpha V beta 3 and alpha V beta 5 integrins in avian neural crest cell adhesion and migration on vitronectin, Development 120 (9) (1994) 2687–2702. [35] Fowler J.F., Quatrano R.S., Plant cell morphogenesis: plasma membrane interactions with the cytoskeleton and cell wall, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 13 (1997) 697–743. [36] Allessa L., Kropf D.L., F-actin marks the rhizoid pole in living Pelvetia compressa zygotes, Development 126 (1999) 201–209. [37] Kropf D.L., Coffman H.R., Kloareg B., Glenn P., Allen W., Cell wall and rhizoïd polarity in Pelvetia embryos, Dev. Biol. 160 (1993) 303–314. [38] Kropf D.L., Bisgrove S.R., Hable W.E., Cytoskeletal control of polar growth in plant cells, Curr. Opin. Cell Biol. 10 (1998) 117–122.
733