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Corrélation entre la morphologie et le contenu lipidique des corticosurrénales du cobaye, du rat et du boeuf
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J. ULTRASTRUCTURERESEARCH 44, 113--133 (1973)
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Correlation entre la morphologie et le contenu lipidique des corticosurr~nales du cobaye, du rat et du boeuf* JANOS FRUHLING1'2, GEORGES SAND 3, WILLY PENASSE1, FRAN~OISE PECHEUX2 et ALBERT CLAUDE1
aLaboratoire de Cytologie et de Cancdrologie Expdrimentale, 2Laboratoire des Radio-Isotopes, Institut J. Bordet, 31nstitut de Recherche Interdisciplinaire en Biologic Humaine et Nucldaire, Facultd de M~decine, Universitk Libre de Bruxelles, Bruxelles, Belgique Refu le 27 decembre 1972, et revisO le 21 mars 1973 Le volume occup~ par les liposomes, les mitochondries et le rdticulum endoplasmique a 6t6 d6termin6 dans la corticosurr6nale du cobaye, du rat et du boeuf par une m6thode st6rdologique. Les rdsultats obtenus au niveau de la zone fascicul6e ont 6t6 confrontds avec les quantit6s de cholest6rol (libre et est6rifi6), de triglyc6rides et de phospholipides des cortex isolds et avec les donn6es de la littdrature concernant l'importance de l'anabolisme du cholest6rol dans les corticosurr6nales des trois mammif6res 6tudi6s. Les corticosurr6nales dans lesquelles la synth6se du cholest6rol est r6duite (rat, cobaye) accumulent du cholest6rol est6rifi6 et des triglycdrides dans des liposomes. Par contre, les glandes surr6naliennes disposant d'une synth+se de cholestdrol endog6ne importante (boeuf) ne contiennent que des quantit6s r6duites de cholest6rol est6rifi6 et de triglyc6rides; le nombre de liposomes est petit. Les quantit6s de cholestdrol libre et de phospholipides sont semblables dans les glandes examindes. Les corticosurrdnales d ' u n g r a n d n o m b r e de mammif6res (primates, carnivores, la majorit6 des rongeurs) sont riches en liposomes; cependant, les r u m i n a n t s (boeuf, m o u t o n , ch~vre) et certains r o n g e u r s h i b e r n a n t s (le h a m s t e r p a r exemple) en sont p r a t i q u e m e n t d 6 p o u r v u s (4, 34). Les liposomes o u gouttelettes lipidiques (20) de la corticosurrdnale a p p a r a i s s e n t c o m m e des organites subcellulaires d61imit6s et distincts des autres 616ments cytoplasmiques (18). Ils sont constitu6s en m a j e u r e partie de lipides et de mdlanges lipidiques, solubles dans les liposolvants et pr6sentent une osmiophilie variable; lorsque la pr6servation chimique et l'int6grit6 m o r p h o l o g i q u e des l i p o s o m e s sont as* Ce travail a ~t6 partiellement r6alis6 avec le soutien du Minist~re de la Politique scientifique dans le cadre de l'Association Euratom - - Universit6 Libre de Bruxelles - - Universit6 de Pise, du Fonds Canc6rologique de la Caisse G6n6rale d'Epargne et de Retraite et de la Fondation R. et J. Hoguet.
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sur6es, leur densit6 est uniforme. Ces organites peuvent atre isol6s par centrifugation diff6rentielle et caract6ris6s ensuite comme une population morphologiquement et chimiquement distincte (30). L'abondance de liposomes et de lipides dans la corticosurr6nale est connue depuis longtemps, mais la relation entre ces deux observations n'est pas enti6rement 6tablie (9). L'analyse des lipides et des liposomes dans les glandes surr6nales ~ l'6chelle de la microscopie optique a 6t6 r6alis6e ~t l'aide de nombreuses mdthodes cytochimiques dans diff6rents 6tats exp6rimentaux (4, 8, 16). Ces 6tudes ont permis de montrer des variations de la quantit6 de liposomes sans les d6finir chimiquement avec pr6cision. Ndanmoins, la pr6sence de cholest6rol dans les liposomes 6tait quasi certaine, celle des triglyc6rides et des phospholipides, probable. Toutefois les analyses chimiques publi6es (7, 8, 15, 25) ont 6t6 r6alis6es sur les glandes compl6tes (cortico- et m6dullosurr6nale) et non pas sur la fraction liposomiale isol6e. L'apport morphologique de la microscopie 61ectronique ~ ce sujet 6tait limits jusqu'il y a quelques ann6es par l'utilisation de liposolvants 6nergiques lors de la pr6paration des tissus pour l'examen (20). Nous avons d6montr6 pr6c6demment que la raise en 6vidence et la caract6risation morphologique des liposomes intacts sont possibles/t l'6chelle ultrastructurale dans la corticosurr6nale du rat, apr6s pr6servation optimale et contrSlde des lipides et du cholest6rol en particulier, au cours de la pr6paration du tissu pour l'examen au microscope 61ectronique (10, 12). D'autre part, nous avons r6alis6 les analyses morphologiques et biochimiques de la fraction subcellulaire liposomiale obtenue par centrifugation diff6rentielle du tissu corticosurr6nalien du rat (30). Le but du pr6sent travail est de d6terminer ~t l'6chelle de la microscopie 61ectronique la quantit6 de liposomes dans la corticosurr6nale du rat et du cobaye d'une part [groupe I dans la classification de Verne (34)] et dans celle du boeuf d'autre part [groupe II]. Nous confronterons ensuite ces r6sultats avec les r6sultats des dosages des lipides dans les cortex et/ou dans les liposomes isol6s. La comparaison de ces donndes avec la morphologie et la quantit6 des mitochondries et du r~ticulum endoplasmique dans les corticosurr6nales des trois mammif6res 6tudi6s nous conduira ~t discuter le m6tabolisme du cholest6rol dans cette glande endocrine. Une partie du travail a 6t6 exposde lors de la r6union annuelle de la Socidt6 Fran9aise de Microscopie Electronique (Caen, 1971) (13). MATERIEL ET METHODES Les techniques de pr6paration du materiel pour la microscopie 61ectronique (fixation, d~shydratation et inclusion) et de la centrifugation diff~rentielle ainsi que de l'isolement des fractions subcellulaires ont ~t~ expos6es en d~tail dans nos publications ant~rieures (12, 14, 3O).
LIPIDES ET LIPOSOMES CORTICOSURRENALIENS
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I. ANIMAUX
A. Cobaye : nous avons utilis6 de jeunes cobayes m~les, fig6s de deux mois, pesant 250 gr environ. Leur alimentation a consist6 en une provende adapt6e au cobaye; ils ont regu de l'eau ad libitum. Ils ont 6t6 sacrifi6s entre 9 et 10 heures du matin par d6capitation et une saign6e imm6diate des carotides. B. Rats : des rats mgtles (Sprague-Dawley) figds de deux mois et d e m i / t quatre mois et pesant de 180/t 350 gr ont 6t6 retenus pour les exp6riences. Ils ont regu comme nourriture une provende et de l'eau ad libitum. Ils ont 6t6 sacrifids par ddcapitation entre 9 et 10 heures du matin. C. Boeufs : les surrdnales proviennent de boeufs abattus entre 9 et 11 heures dans un abattoir local, un examen v6t6rinaire pr6alable excluant les animaux qui ont subi un traitement hormonal 6ventuel. La fixation pour l'6tude morphologique a suivi imm6diatement le pr616vement de l'organe, environ 20 minutes apr+s l'abattage et la saign6e. En vue d'une analyse chimique, les glandes ont 6t6 transport6es au laboratoire dans une solution physiologique 0 °, enddans l'heure.
II. MICROSCOPIE ELECTRONIQUE A. Fixateurs 1. a.
b. C.
2. a.
b. e.
3.
glutaralddhyde 2,5% en tampon phosphate 0,1 M, p H 7,4; temps de fixation : 2 heures; lavage au tampon phosphate 0,15 M, p H 7,4; 6 × 5 minutes; posffixation : OsO~ 1% tampon phosphate 0,13 M, p H 7,4; temps de fixation : 1 heure; fixateur ald6hydique complexe (2•); glutarald6hyde 2,5%, paraformalddhyde 2%, CaC12 0,05 % en tampon cacodylate 0,1 M, p H 7,2; temps de fixation : 2 heures; lavage au tampon cacodylate 0,05 M, p H 7,2 contenant 0,05% de CaCI~; 3 × 10 minutes; posffixation : OsO4 1%, CaCI~ 0,05 % en tampon cacodylate 0,1 M, p H 7,2, temps de fixation : 1 heure; OsO~ 4% (ou 5%) dans l'eau bidistillde, p H 6,0, selon Claude (6), temps de fixation : 3 heures et demie.
B. Ddshydratation et inclusion
Dans le cadre des 6tudes comparatives de pr6servation morphologique et chimique des lipides (12), les trois techniques suivantes de d6shydratation et d'inclusion des pi6ces fix6es sont retenues : 1) m6thode classique de Luft (23), comprenant l'6thanol 100% et l'oxyde de propyl+ne; 2) m6thode originale d'Idelman (19) oia l'agent d6shydratant (et liposolvant) est l'6thanol (30 et 70%); les pi6ces passent ensuite dans deux bains d'un m61ange 6thanol 7 0 % - E p o n complet (1 : 1, v/v) et enfin dans l'Epon eomplet pur; 3) idem 2), l'6thanol 70% 6tant remplac6 par l'6thanol 80% (a) ou l'6thanol 90% (b) (12).
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C. Examen au microscope dlectronique L ' e x a m e n des coupes semi-fines (dpaisseur : 1 ~) color~es au bleu de toluidine permet la localisation et le choix des rdgions ~t examiner. Les coupes ¢¢ gris argent4 >>sont obtenues ~t l'aide de (~ l'ultrotome >)LKB m u n i d ' u n couteau de diamant. Elles sont contrast~es au p l o m b seul (26) ou an citrate de p l o m b prSc~d6 d'ac6tate d'uranyle. Les micrographies Sont r4alis4es au microscope Philips E M 200, ~t une tension d'accdl~ration de 40 ou 60 kV III. ANALYSE MORPHOMI~TRIQUE L'analyse est r6alis6e selon la m4thode de Weibel et coll. (35) de comptage diff6rentiel par points sur une grille. La distance entre deux po!nts de la grille est choisie sensiblement 5gale au diamStre moyen des liposomes et des mitochondries au grossissement faiblel Le pourcentage de volume appartenant au r4ticulum endoplasmique est d6termin4 sur des micrographies ~ m o y e n et fort grossissement. L'analyse morphomdtrique est r6alis5e sur des pisces fix6es, d4shydrat6es et inclues dans des conditions techniques identiques. Des micrographies de coupes n o n s4ri4es provenant de plusieurs blocs par zone et par animal sont analysSes au cours de 5 exp4riences pour le rat, 3 pour le boeuf et 2 pour le cobaye. Le n o m b r e total de points compt6s est de l'0rdre de dix mille par zone et par animal. La fraction volumStrique des organites est exprimSe en pourcentage du volume cellulaire total aprSs soustraction des points couvrant l'espace extracellulaire du parenchyme. Pour chaque valeur l'Scart type. est ddtermin5 selon le procdd4 de Nussdorfer (24). IV. CENTRIFUGATIONDIFFERENTIELLE
N o u s avons isol6 la fraction liposomiale p a r centrifugation diff4rentielle (30) apr6s 41imination successive des fractions (( n o y a u x et d6bris cellulaires >>, (( mitochondries >> et (~ interm4diaire >>. Les liposomes sont pr61ev6s sous la forme d ' u n e pellicule superficielle apr6s centrifugation du surnageant de la fraction interm6diaire d u r a n t 90 minutes ~ 100,000g. V. DOSAGESCHIMIQUES
1. Cholestdrol. Le cholest6rol (total et libre) est d4termin4 selon la m6thode de Sperry et W e b b (33) apr6s extraction au m41ange 6thanol absolu-ac6tone (1 : 1, v/v). Le cholest6rol estdrifi6 est estim6 par diff6rence. FIGS. 1 et 2. Corticosurr6nale du cobaye. FIG. 1. Zone fasciculde externe, vue g4ndrale. Les cellules contiennent un grand hombre de liposomes (L), en majorit4 sphdriques, de taille peu variable. L'image du contenu est homogSne et peu contrast4 dans les Conditions de fixation et de coloration utilis6es, mais il n'y a ni dissolution, ni vacuolisation. my : figures my61iniques h l'int6rieur de liposomes, m : mitochondries. Le r6ticulum endoplasmique, tr6s dispers6 (re) occupe un volume restreint. C : capillaire; flSche : 41~ment d ' u n histiocyte p&icapillaire s6parant deux groupes cellulaires. Fixateur ald6hydique complexe; d~shydratation et inclusion selon Idelman (19);coloration : citrate de plomb, x 4 900. FIG. 2. Zone fascicul4e intel:ne; vue g6n6rale. Pr6sence de nombreux liposomes (L). Les fl~ches indiquent !es membranes limitant deux liposomes voisins en contact direct. L c : rares liposomes confluents. N : noyaux; m : mitochondries; re : r6ticulum endoplasmique, plus ~ab0ndant que dans la zone fascicul4e externe. Fixat.eur : glutarald6hyde 2,5 %; d6shydratation et inclusion selon Idelman; coloration : citrate de plomb, x 4 700.
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2. Phospholipides. Technique de Ames et Dubin (2) apr6s extraction au chloroformem6thanol (2 : 1, v/v). 3. Triglyc6rides. D6termination apr~s extraction/t l'6ther isopropylique selon la m6thode de Laurell (22). RESULTATS I. CONSIDERATIONSMORPHOLOGIQUES
A . M o t T h o l o g i e des liposomes
Les liposomes apparaissent dans les cellules des corficosurr~nales des trois esp~ces 6tudi6es c o m m e des corps ronds de diam~tre variable : en moyenne, 1 # (de 0,8 ~t 1,25 #) atteignant rarement 2#, chez le rat; 2 ~i 3,8/~, d6passant parfois 4/~, chez le cobaye; les rares liposomes chez le boeuf, de 0,7/t 1,1 #. Le c o n t o u r est r6gulier apr~s fixation ald6hydique (Figs. 1, 2 et 4 ) e t plus o u moins cr~nel6 apr~s fixation osmi6e (Fig. 3). L'image du contenu est homog~ne et la perm6abilit6 aux 61ectrons variable, selon l'6paisseur des coupes, le fixateur (les densit~s sont plus 61ev~es avec un fixateur osmi6) et le colorant utilis6s. La densit6 peut varier d ' u n e zone du cortex ~ l'autre [chez le cobaye, apr~s fixation ald~hydique (31)], mais elle est constante ~t l'int6rieur de chaque zone. L'image homog~ne du contenu n ' a 6t6 obtenue que par l'emploi de techniques de d6shydratafion et d'inclusion assurant une pr6servation des lipides (12, 19). Les vacuoles (20, 32) (Fig. 5), observ6es l o r s q u ' o n utilise la m6thode habituelle de preparation du tissu c o m p r e n a n t l'6thanol absolu et l'oxyde de propyl~ne, ne sont que les cons6quences d ' u n e dissolution partielle, souvent importante des constituants des liposomes (12). Les liposomes sont d61imit~s, aussi bien chez le rat que chez le cobaye, par une m e m b r a n e (Fig. 6, fl~che) ou par un interface lipides/cytoplasme dont l'~paisseur est d'environ 70-80 A et dont la structure paraR homog~ne lorsqu'une r6solution extreme n'est pas recherch6e. L'existence de cette m e m b r a n e a 6t6 signal6e chez le FIaS. 3 et 4. Corficosurr6nale du rat. FIG. 3. Zone fascicul6e externe. Cette couche est, chez le rat, la plus riche en liposomes (L); la perm6abilit6 aux 61ectrons (dans les conditions techniques utilis6es) est nettement inf6rieure h celle observde darts la zone correspondante chez le cobaye (Fig. 1). Les liposomes ont un contenu homog~ne et tr6s dense. N : noyaux; Nu : nucldole; G : appareil de Golgi; rn : mitochondries de taille et de forme semblables; re : plages de r6ticulum endoplasmique; C : capillaires. Fixateur : OsO¢ darts l'eau bidistill6e selon Claude (6); d6shydratation et inclusion selon Idelman; coloration : citrate de pl0mb. X4 800. FIG. 4. Zone fascicul6e interne. Diminution nette du nombre de liposomes (L); comparer avec la zone fascicul6e externe chez le rat (Fig. 3) et avec la zone fascicul6e interne chez le cobaye (Fig. 2). N : noyau; Nu : nucl6ole; rn : mitochondries, g6n6ralement plus grandes et de tailles plus variables que dans la zone fascicul6e externe; m et fl6che : agglom6ration de grains mitochondriaux; G : appareil de Golgi; re : r6ticulum endoplasmique; Ly : nombreux lysosomes; C : capillaires; H : d6tail d'un 616ment histiocytaire en position p6ricapillaire. Fixateur : glutarald6hyde 2,5 %; tampon hosphate 0,1 M; d~shydratation et inclusion selon Idelman modifi6 (•2); coloration : citrate de lomb. x 4 700.
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rat apr~s dissolution partielle des liposomes dans le tissu corticosurr6nalien fix6 in toto (27) et clairement raise en 6vidence dans la fraction liposomiale isol6e (30). En outre, on peut distinguer une couche plus large et de densit6 61ev6e/t la p6riph6rie des liposomes apr~s fixation osmi6e et coloration par l'ac6tate d'uranyle (Fig. 8, fl~che). B. Morphologie du rdticulum endoplasmique et des mitochondries 1. Le r6ticulum endoplasmique est morphologiquement semblable dans la zone fascicul6e du boeuf et la zone fascicul6e (interne et externe) du rat et du cobaye. I1 est form6 d'616ments tubulaires (Figs. 9-11) de diam~tre transversal de 350/~ 700 A et de longueur variable; les membranes ont une 6paisseur d'environ 70 A et une structure classique. Les 616ments du r6ticulum endoplasmique, rang6s en faisceaux ou, plus souvent, s'infiltrant entre les autres organites cellulaires, forment par des Connexions un r6seau tridimensionnel complexe et volum6triquement important. Chez ces trois animaux, au niveau de la zone fascicul6e, le r6ticulum endoplasmique granulaire n e forme pas un organite morphologiquement distinct. Tout au plus peut-on observer quelques courtes citernes de r6ticulum endoplasmique couvertes de ribosomes sur les deux surfaces externes des membranes (Fig. 6, rg). En g6ndral, l'organisation du r6ticulum endoplasmique est mixte, c'est-~t-dire que les membranes couvertes de ribosomes sont situ6es entre des sections de membranes lisses, sans interruption de la continuit6 (Figs. 9-11, fl~ches); les deux formes classiques du rdticulum endoplasmique constituent ainsi une entit6 morphologique. 2. Les mitochondries des cellules de la zone fascicul6e chez les trois esp~ces pr6sentent des diff6rences morphologiques intdressantes h signaler : (a) cobaye : la structure des mitochondries est d6taill6e dans un travailiind6pendant (31): rappe!lons ici les caract6ristiques essentielles : forme souvent irr6guli~re, matrice abondante, crStes lamellaires souvent agglom6r6es (Figs. 6 et 11) visibles en coupes longitudinale (Figs. 6 et 11, l) et frontale (Figs. 6 et 11, f); grains mitochondriaux quasi inexistants. (b) rat (Fig. 8) : les mitochondries sont sph6riques, cylindriques ou rarement irr6guli~res; le diam~tre varie entre 0,6 et 1,7/z; tr6s fr6quemment, il est compris entre
FI6. 5. Corticosurr6nale du boeuf. D6tail de la zone fascicul6e (partie moyenne). Hormis quelques liposomes (partiellement vid6s) (L), la plus grande partie du volume cellulaire est occup6 par les mitochondries (m) et le r6ticulum endoplasmique; ce dernier est fr6quemment rassembl6 en plages plus ou moins 6tendues (re). h : mitochondries allong6es ayant la forme d'halt~res; N: noyau; G : appareil de G01gi; me : membrane plasmatique. Celle-ci semble 8tre h certains endroits (fl6ches)plus complexe et plus 6paisse. Np : neff p6riphdrique et cellule de Schwann (S), rarement observ6 dans la corticosurr6nale. Fixation : OsO4 5 % dans l'eau bidistill6e selon Claude (6); d6shydratation et inclusion classique (emploi d'alcool 100 % :et d'oxyde de propyl6ne, ce qui explique la dissolution des lipides des liposomes), coloration : ac6tate d'ui'anyle et citrate de plomb, x 5 900.
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0,8 et 1 #. La matrice est f o r t e m e n t r6duite. Les crates (10) sont, c o m m e chez le boeuf, des variantes m o r p h o l o g i q u e s de la forme de base t u b u l a i r e ; saccules p6riph6riques, saccules centraux port6s par les 614ments tubulaires et tubules simples (Fig. 8, t). Les grains m i t o c h o n d r i a u x sont plus n o m b r e u x que chez les deux autres esp~ces. Les mitochondries c o n t i e n n e n t en outre des inclusions d ' o r g a n i s a t i o n paracristalline caract6ristiques (••); (c) boeuf • les m i t o c h o n d r i e s sont le plus souvent sph6riques, r a r e m e n t cylindriques o u sous forme d'halt6res (Fig. 5, h); le diam6tre varie en g6n4ral entre 0,5 et 1,5 #. La matrice est n e t t e m e n t m o i n s a b o n d a n t e que chez le cobaye. Les crates, p o u r la p l u p a r t t u b u l a i r e s (1), pr6sentent 6galement des variantes m o r p h o l o g i q u e s (Fig. 7) c o m m e des saccules p6riph4riques (s), des saccules centraux (sc) et des t u b u l e s droits (t). O n observe aussi quelques crStes !amellaires, soit en coupe longitudinale (i) o u frontal e (f). Les grains m i t o c h o n d r i a u x sont rares.
C. L i p o s o m e s en rapport avec le rOticulum endoplasmique et les mitochondries
Les liposomes des cellules corticosurr6naliennes des trois esp6ces sont en 6troite relation avec le r4ticulum e n d o p l a s m i q u e et les mitochondries; par ailleurs ces deux organites occupent en g6n4ral la plus grande partie de l'espace cellulaire entre les liposomes (voir T a b l e a u II). Les liposomes sont f r 4 q u e m m e n t entour6s de plusieurs c i t e r n e s d u r6ticulum e n d o p l a s m i q u e lisse (Figs 6 et 8, rl et fl6che), qui f o r m e n t u n e
FIGS. 6/~ 8. Mitochondries. FIG. 6. Corticosurrdnale de cobaye. D6tail d'une cellule de la zone fascicul4e interne. Les mitochondries (in) souvent de forme irr6guli6re ont une matrice abondante et des crates lamellaires r4unies en faisceaux; vue en coupe longitudinale(l) 0u frontale (f); L : liposome; Fl6ches : membrane liposomiale distincte; rl : r4ticulum endoplasmique lisse; rg : 414ment du r6ticulum endoplasmique granulaire; r : ribosomes et polysomes parfois en contact avec un liposome. Conditions techniques : voir Fig. 2. × 26 000. FIG. 7. Corticosurr6nale du boeuf. Zone fascicul6e interne. Mitochondries de forme g6ndralement sph6rique, de taille variable (m). La matrice est abondante dans quelques mitochondries (m); crates tubulaires droites (t) ou sacculaires; ces demi6res sont, soit p6riph4riques avec un p6doncule court (s) ou centrales (so); st : saccule central (( ports >>par un 614ment tubulaire rectiligne; pr4sence de crates lamellaires (comme chez le cobaye) en coupe longitudinale (1) ou frontale (f); rl : r6ticulum endoplasmique lisse tubulaire; r : polysomes; L : liposome dissout partiellement. Fixateur : glutarald6hyde 2,5 %, tampon phosphate 0,1 M; ddshydratation et inclusion classique; coloration : acdtate d'uranyle et citrate de plomb, x 26 000. FIG. 8. Corticosurr6nale du rat. Zone fascicul6e exteme. D4tail de deux cellules, s6par4es par les membranes cellulaires (me) comprenant deux desmos0mes (d). N : d6tails des noyaux; L : liposomes contour cr~nel6; fl6che simple : la mince zone p6riph6rique des liposomes est plus contrast6e apr6s coloration ~ l'ac6tate d'uranyle; r : ribosomes libres, parfoisen contact avec les liposomes et les mitochondries (ml); rl et fl6che : creme du r6ticulum endoplasmique lisse entourant les liposomes et/ou les mitochondries avec contact net entre les deux organites. Les crates sont tubulaires (t), ou sacculaires, p6riph6iSques (s) ou sacculaires centrales, port6es par des 616ments tubulaires rectilignes (st et fl6che). A remarquer le contact 6troit entre la mitochondrie mlet le liposome L1. Fixateur : OsO~ 4 % dans I'eau bidistill4e; d6shydratation et inclusion selon Idelman; coloration : ac6tate d'uranyle et citrate de plomb, x 22 500.
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T a b l e a u I. Volume occupd par "les liposomes clans les zones de la corticosurrdnale des mammif~res dtudidsa Zone
Cobaye
Rat
Z Glom6rulaire Z Fasciculde externe Z Fascicul~e interne Z Rdticul~e
3,7 28,3 19,6 4,4
10,3 12,9 4,9 4,1
(_+2,1) ( _+3,1) (_+3,4) (_+2,9)
Boeuf (_+1,7) ( _+1,9) (__.0,5) (+0,8)
0,6 0,35 0,35 0,6
(+0,3) (_+0,2) (_+0,2) (-+0,3)
a R6sultats exprim6s en % du volume total des cellules du parenchyme. Entre parenth6ses l'6cart type. v 6 r i t a b l e c o r b e i l l e a u t o u r de ceux-ci. O n o b s e r v e aussi u n c o n t a c t n e t e n t r e l i p o s o m e s et. m i t o c h o n d r i e s
(Fig. 8, L1 et m 0 ainsi q u ' e n t r e l i p o s o m e s et r i b o s o m e s o u p o l y -
s o m e s (Figs. 6 et 8, r). II, VOLUME CELLULAIREOCCLrPE PAR LES LIPOSOMES,LES MITOCHONDRIES ET LE RETICULUMENDOPLASMIQUE
A. Fraction du volume cellulaire occupde par les liposomes clans les diffdrentes zones de la corticosurrdnale du cobaye, du rat et du boeuf (voir, T a b l e a u I) Remarquons
q u e c h e z le b o e u f , les r6gions e x t e r n e et i n t e r n e de la z o n e fascicul6e
n e p e u v e n t ~tre distingu6es de m a n i b r e h i s t o l o g i q u e o u c y t o l o g i q u e . A l ' e x a m e n des chiffres pr6sent6s, o n p e u t c o n s t a t e r q u e : 1. la q u a n f i t 6 de l i p o s o m e s est faible d a n s t o u t e s les z o n e s de la c o r t i c o s u r r 6 n a l e de b o e u f ; v o i r aussi Fig. 5; FiGs. 9 g 11. Le r6ticulum endoplasmique. F~G. 9. Corticosurr6nale du boeuf. Zone fascicul6e interne. Le r6ticulum endoplasmique est constitu6 par des cremes et par de longs 616ments tubulaires, en grande majorit6 lisses, souvent parall6les (rl) ou se prdsentant en couples obliques ou transversales. F16ches : un ou quelques ribosomes espac6s fix6s stir les membranes du rdticulum endoplasmique. Double fl6che : s6quence courte, mais r6guli6re de ribosomes fix6s; r : ribosomes libres; m : mitochondries ~t cr6tes sacculaires p6riphdriques (s) ou port6es par un 616ment tubulaire (st). Fixateur : glutarald6hyde 2,5 %, tampon phosphate 0,1 M; d6shydratation et inclusion classique; coloration selon Reynolds. x 38 200. FIG. 10. Corticosurr6nale du rat. Zone fascicul6e interne. Le r6ticulum endoplasmique est constitu6 par des 616ments tubfllaires (rl); le plus souvent lisses, pr6sentant des anastomoses (an); fl6ches : rares ribosomes isol6s fix6s sur les membranes. F : face de formation de l'appareil de Golgi; r : ribosomes libres; L : liposome en coupe tangentielle; m : mitochondrie contenant une inclusion paracristalline (pc). Fixateur : glutarald6hyde 2,5 %, tampon phosphate 0,1 M; d6shydratation et inclusion selon Idelman, modifi6 (•2); coloration : citrate de plomb. × 37 000. FIG. 11. Corticosurr6nale du cobaye. Zone fasciculde interne. Les 616ments tubulaires du rdticulum endoplasmique sont visualis6s en coupe longitudinale (rl), oblique (o) ou transversale (t). Fl6che simple : quelques ribosomes isol6s fix6s aux citernes du r6ticulum endoplasmique. Double fl6che : sdquence :r6guli6re et courte de ribosomes attach6s au r6ticulum endoplasmique; r : ribosomes et polysomes libres; Ly : lysosome; m : mitochondries. Leurs cr6tes lamellaires bien visibles sont rdunies en faisceaux, vus en coupe longitudinale (l) et frontale (f). Conditions techniques : voir Fig. 2 et Fig. 6. x 32 000.
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FR/JHLING ET AL.
Tableau II. Volume oecupd par les mitochondries et par le rdticulum endoplasmique dans la zone fascicul~e externe et interne de la corticosurrOnale des mammifOres dtudi~s ~ Zone
Organite
Cobaye
Rat
Fascicul6e externe
Mitochondries R6ticulum endoplasmique Mitochondries R6ticulum endoplasmique
25,4 26,5 27,7 40,7
26,3 45,4 23,7 54,9
Fascicul6e interne
( ± 5,3) (_+5,0) (_+8,2) ( _+7,3)
Boeuf ( _+1,5) (+_4,4) (±4,0) ( ± 0,9)
34,6 55,3 34,6 55,3
( ± 8,9) (_+11,7) (_+8,9) ( _+1 !,7)
a R6sultats exprim6s en % du volume total des cellules des pai~ties de la zone. Entre parentheses les valeurs de l'6cart type.
2. le cobaye poss6de la zone fascicul6e externe et interne--la masse la plus importante du cortex - - la plus riche en inclusions lipidiques; voir aussi Figs. 1 et 2. La variation entre les deux parties de la zone est plus prononc6e chez le rat (Figs. 3 et 4) que chez le cobaye. Pour l'ensemble de la zone fascicul6e, le rapport des fractions du volume occup6 par les liposomes chez le cobaye, le rat et le boeuf est de 3 : 1:0,04; 3. dans la zone glom6rulaire - - qui constitue une unit6 morphologique ~ part - le rapport des volumes occup6s par les liposomes est invers6 : environ 3 : 1, en faveur du rat. Remarquons cependant que les cellules internes de la zone glom6rulaire chez le cobaye sont plus riches en liposomes et que les cellules p6riph6riques sont presque d6pourvues de ceux-ci; 4. chez le cobaye, la zone rdticulde se distingue nettement de la zone fascicul6e par une diminution du nombre et du volume occup6 par les liposomes. Chez le rat, par contre, le volume de liposomes est sensiblement 6gal dans les zones fascicul6e interne et r6ticul6e. 5. L'6cart type est assez important dans les zones glom6rulaire et r6ticul6e du cobaye. Ceci provient de la pr6sence de deux types de cellules dans ces zones : les unes sont ddpourvues de liposomes, les autres en contiennent autant que les cellules de la zone fasciculde (31). B. Volume occupd par les mitochondries et le rdticulum endoplasmique dans les cellules de Ia zone faseiculSe externe et interne chez les trois espkces 8tudides, (voir, Tableau II) Ces r6sultats compl6tent les mesures pr6sent6es au Tableau I (volume occup6 p a r les liposomes) et permettent les constatations suivantes : 1. Chez le rat et le cobaye : (a) le volume occup6 par les mitochondries est identique dans les deux parties de la zone fascicul6e; (b) il y a une relation inverse entre la fraction du volume cellulaire occup6 par le r6ticulum endoplasmique et les lipo-
LIPIDES ET LIPOSOMESCORTICOSURRI~NALIENS
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Tableau III. Contenu en lipides des corticosurrdnales des mammifOres dtudids ~ Lipide Cholest6rol
Esterifi6 Libre Total
Triglyc6rides Phospholipides
Cobaye
Rat
Boeuf
7,4 0,5 7,9
4,02 0,58 4,6
0,01 0,23 0,24
4,03 2,65
1,4 2,65
0,05 3,3
Exprim6 en mg/100 mg poids humide de cortex.
somes; (c) la somme des volumes relatifs occupds par les organites consid6r6s (liposomes, mitochondries, r6ticulum endoplasmique) est similaire et stable (81-85 % du volume total); 2. Chez le boeuf : (a) les mitochondries occupent un volume significativement supdrieur ~t celui mesur6 chez les deux autres animaux examin6s; il est quasi 6gal 5 la somme des volumes occup6s par les mitochondries et les liposomes chez le rat; (b) le r6ticulum endoplasmique, bien d6velopp6 dans toute la zone fascicul6e, occupe un volume similaire/t celui mesur6 dans la zone fascicul6e interne, chez le rat (off les liposomes n'occupent que 4,9 % du volume de cette pattie de zone).
III. DOSAGES DES LIPIDES DANS LE CORTEX ET DANS LES LIPOSOMES
A. R~sultats des dosages du cholest~rol (total, est~rifid et libre), des triglyckrides et des phospholipides obtenus au niveau des cortex isolks (voir, Tableau III) Soulignons que chez le rat, le cortex isol6 par microdissection comprend les zones interm6diaire (couche mince), fascicul6e externe et fascicul6e interne compl&ement, ainsi que 40/t 60 % des zones glom6rulaire et r6ticul6e (30). Vu l'6paisseur relative des zones chez le cobaye (31), la composition (morphologique) du cortex isol6 doit &re superposable ~t celle du rat. Enfin chez le boeuf compte tenu de la taille de l'organe, les pertes lors de la pr6paration du cortex isol6 peuvent 8tre consid6r6es comme n6gligeables. En conclusion, les dosages des lipides sont repr6sentatifs en premiere approximation, pour le rat et le cobaye, de la composition des deux parties de la zone fascicul6e et, de la totalit6 de la corticosurr6nale pour le boeuf. I1 ressort du Tableau III que : 1. (a) le cobaye et le rat disposent de quantit6s importantes de cholest6rol; la quantit6 de cholest6rol total (exprim6e en mg/100 mg cortex) chez le cobaye est 1,72 × plus 61ev6e que chez le rat; le mSme rapport pour le cholest6rol libre et est6rifi6 est respectivement 0,9 : 1 et 1,84 : 1. 9 - 731827 J. Ultrastructure Research
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FRUHLING ET AL.
(b) la quantit6 de cholestdrol total de la corticosurr6nale du boeuf est tr6s inf6rieure/~ celle que l'on trouve chez les deux autres esp6ces (1/19 du cholest6rol du cortex du rat); la forme libre pr6domine, (moins de 5 % du cholestdrol total sous forme est6rifi6e); le rapport des quantit6s pour la forme libre entre le rat et le boeuf est de 1:0,4. Les diffdrences dans les quantitds de cholest6rol total proviennent donc des diffdrences importantes dans les quantit6s de cholest6rol est6rifi6. 2. Triglycdrides : leur quantit6 exprimde en mg/100 mg cortex au niveau du cortex isol6 du cobaye est 2,9 × plus 61evde que chez le rat; le cortex de ce dernier contient par contre 28 × plus de triglyc6rides que le boeuf; 3. Phospholipides : les r6sultats sont du m~me ordre de grandeur; il en d6coule que les cortex surrdnaliens des trois esp6ces contiennent des quantit6s presque identiques de phospholipides (les r6sultats sont exprim6s en mg/100 mg de tissu).
B. Analyse des Iiposomes isolds Chez le rat (30), l'analyse nous a montr6 que cet organite contient 75 % du cholest6rol total du cortex, 83 % du cholest6rol est6rifi6 et 37 % du cholest6rol libre; 30 % des triglyc6rides et 10 % des phospholipides sont accumulds dans les liposomes. Enfin, aprbs soustraction des diff6rentes contaminations, 2,5 % des prot6ines de la corticosurr6nale ont 6t6 mis en 6vidence dans la fraction liposomiale. Chez le cobaye, sans tenir compte des 6changes possibles entre les fractions (29), 61% du cholest6rol total (70 % du cholest6rof estdrifi6) sont localis6s au niveau des liposomes, 70 % des triglyc6rides et 7 % des phospholipides sont retrouv6s dans la m~me fraction. IV. CYTOCHIMIE
La digitonine a 6t6 utilis6e pour l'identification au niveau de la microscopie 61ectronique de certains lipides intracellulaires. Ce probl~me a 6t6 expos6 ant6rieurement (14). En r6sum6, mentionnons que la pr6sence de 0,2 % de digitonine dans le fixateur a permis la mise en 6vidence de formations caract6ristiques complexes, 6voquant notamment la pr6sence de cholest6rol libre et des phospholipides au niveau des liposomes et des mitochondries. DISCUSSION Avant d'aborder la discussion, rappelons que les r6sultats morphom6triques et chimiques pr6sentds et confront6s ont 6t6 obtenus ~ partir des r6gions externe et interne de la zone fascicul6e corticosurr6nalienne du rat, du cobaye et du boeuf. Cette zone constitue toutefois la masse la plus importante du cortex chez les trois esp6ces examin6es et les cortex isol6s ayant subi les analyses chimiques comprennent la zone fascicul6e complete ainsi qu'une fraction des zones glom6rulaire et r6ticul~e (30).
LIPIDES ET LIPOSOMES CORTICOSURRENALIENS
129
Une comparaison des volumes occup6s par les liposomes (Tableau I) et des compositions lipidiques (Tableau III) des cortex chez les trois esp6ces montre par ailleurs un parall6tisme dans les variations de ces param~tres uniquement dans la zone fascicu16e. La zone glom6rulaire constitue une units morphologique et m6tabolique distincte par son r61e darts l'61aboration des min6ralocorticoides; en outre une 6ventuelle fonction germinative de cette couche rend toute corr61ation entre la morphologie et la composition chimique (du point de vue de la st6roidogdn6se) d61icate. Enfin, la zone rdticul6e pr6sente aussi des caract6ristiques morphologiques (la taille et la forme des mitochondries, l'aspect de leurs crates) et de la distribution des organites (liposomes peu nombreux, rdticulum endoplasmique lisse abondant) qui peuvent atre associds/t une fonction m6tabolique distincte. Nos r6sultats, exprimant la fraction volumdtrique cellulaire occup6e par les organites dans'la zone fascicul6e externe de la corticosurr6nale du rat, concordent avec ceux publids par Nussdorfer (24). Les dosages de cholest6rol et des autres lipides sont compatibles avec ceux publi6s par diffdrents auteurs (7, 8, 17, 25). Notons cependant des diff6rences marqudes entre nos r6sultats et certains pr6sent6s par Ostwald (25) quant aux quantitds de triglycdrides et de cholest6rol total chez le cobaye et le rat mftle non trait6s. Ces divergences peuvent s'expliquer, d'une part par la variabilit6 du contenu des surrdnales en cholestdrol (nos r6sultats sont des valeurs moyennes d'une quinzaine d'expdriences) et, d'autre part parce que nos dosages ont 6t6 rdalis6s sur les cortex isol6s, apr6s 61imination par micro-dissection de la m6dullosurrdnale et de la capsule. Or cette derni6re est souvent fiche en triglyc6rides par l'adh6rence de tissu adipeux. Signalons 6galement que pour le cobaye, 16 % du cholest6rol dos6 apr6s pr6cipitation /t la digitonine, correspondent au 5~-cholestane-3fl-ol, comme l'ont ddmontr6 Werbin et coll. (37). Le rapport des volumes cellulaires occup6s par les liposomes dans les corticosurr6nales des trois animaux examines (Tableau I) est le suivant; c o b a y e : r a t : b o e u f = 3 : 1:0,04; le Tableau III nous permet d'6tablir le m~me rapport pour le cholest6rol total (cobaye : rat : boeuf - 1,7 : 1 : 0,05) et pour les triglyc6rides (cobaye : rat : boeuf = 2,9:1:0,035). L'analogie entre ces rapports est assez frappante et nous suggbre que la prdsence des liposomes darts la zone fascicul6e est proportionnelle aux quantitds de cholesterol et de triglyc6rides dans cette partie du parenchyme. Le rapport du cholest6rol est6rifi6/cholestdrol libre dans les glandes est grand chez le rat et le cobaye; il est clair que l'abondance de liposomes dolt 6tre l'expression de la richesse en cholest6rol est6rifi6. Ce fait est confirms par les dosages des lipides dans les liposomes isol6s (30) : une quantit6 importante est stock6e dans les liposomes; une petite partie est associ6e aux autres composants cellulaires. Le cholest6rol libre est par contre surtout associ6 ~t d'autres organites que les liposomes dans les cortex des trois esp6ces, (30).
130
FRUEILING ET AL.
Une relation entre ces constatations et les donnaes de la littarature concernant le matabolisme du cholestarol dans la corticosurranale des animaux analysas peut &re envisagae. En effet, la corticosurranale du cobaye peut synthatiser le cholestarol, mais pas au delft de 40 % de son contenu total (36); la synthase est nagligeable dans le cortex du rat (5); par contre, la synth~se est importante dans le cortex du boeuf (15). I1 est admis que dans la corticosurranale du rat et du cobaye, le cholestarol estarifi6 provient du cholestarol plasmatique par passage dans les cellules sous forme libre ofa il est ensuite transform6 en cholestarol est~rifi6 (3, 12, 15, 28). Ce dernier construe une raserve hydrolysable pour l'alimentation d'un compartiment de cholestarol libre ~t renouvellement rapide (15, 28). Ces considarations nous suggbrent la conclusion suivante :dans la zone fasciculde des cortex surranaliens dont la synth~se endog~ne du cholestarol est faible ou nulle, celui-ci est concentr6 dans des gouttelettes lipidiques (liposomes) sous forme de cholestdrol estarifia. Le nombre (et 6ventuellement la taille) des liposomes est proportionnel ~t la quantit6 de cholestarol et de triglycarides prasente dans la glande des animaux. Quant au parallalisme entre les quantitas de cholestarol et de triglycarides, on peut raisonnablement supposer que ces derniers participeraient ~ l'estarification du cholestarol. Cette hypoth~se n'exclut pas d'autres utilisations des triglycarides par la cellule, notamment comme source d'anergie ou comme prdcurseur d'acdtyl-CoA (3). Tandis que le nombre de liposomes est en 6troite corralation avec la composition lipidique de la zone fasciculae, les deux autres organites volumatriquement prapondarants - - le raticulum endoplasmique et les mitochondries - - ont un comportement diffarent. Le raticulum endoplasmique ne prasente pas de variations morphologiques en fonction des quantitas de lipides ou des caract&istiques du matabolisme du cholestarol dans les corticosurranales 6tudiaes. La construction des 61ements du r&iculum endoplasmique, l'organisation des citernes et les rapports avec les autres organites sont strictement identiques sur le plan morphologique chez les 3 esp~ces. Par contre, il existe une relation inverse entre les volumes occupas par le raticulum endoplasmique et par les liposomes (composas essentiellement de cholestarol estarifia et de triglycarides). Ces observations peuvent atre associaes ~t la capacita pour la cellule de synthatiser le cholestarol : lorsque la synth~se endogane est importante, le volume occupa par le raticulum endoplasmique est plus grand que lorsque la synthbse endog~ne est raduite. Les diffarences morphologiques des mitochondries et de leurs crates en particulier, dans la zone fasciculae des trois espaces (Fig. 6 ~t 8) peuvent &re considaraes comme indapendantes de la composition lipidique des cortex et de l'anabolisme endogane du cholestarol : chez le cobaye, riche en cholestarol et en triglycarides, la matrice mitochondriale est abondante et les crates sont en majorita lamellaires; chez le rat, dont
LIPIDES ET LIPOSOMES CORTICOSURRENALIENS
131
la composition lipidique et le m6tabolisme du cholest6rol sont fort semblables, la matrice est peu d6velopp6e et les crates sont quasi exclusivement tubulaires et sacculaires. Enfin chez le boeuf, les mitochondries sont assez similaires ~t celles du rat, alors que le m6tabolisme du cholestarol est diff6rent de celui du rat. Le volume occup6 par cet organite est plus grand chez le boeuf; ce fait pourrait atre mis en rapport avec l'importance de la synth6se du cholest6rol endoggne et la mise en 6vidence de petites quantit6s de cholest6rol est6rifi6 et de triglyc6rides. Les r6sultats des dosages chimiques et des analyses volum6triques confront6s avec les donn6es de la litt6rature quant ~t la capacit6 de synth~se endog6ne de cholest6rol dans la zone fasciculde des corticosurranales examin6es (cobaye, rat, boeuf) nous permettent les conclusions suivantes : 1. chez les animaux dont la corticosurr6nale a une capacit6 de synth6se endog6ne du cholest6rol limitde, la glande accumule une quantit6 importante de cholestdrol est6rifi6 et de triglyc6rides dans de nombreux liposomes. Les mitochondries et le raticulum endoplasmique sont moins abondants que dans les cellules corticosurranaliennes synthEtisant une grande partie du cholesterol. Les crates mitochondriales sont aussi bien lamellaires que tubulaires. Ce genre de corticosurrdnales correspond au type I de la classification 6tablie d'apr~s des observations en microscopie optique (34); 2. chez les animaux dont la corticosurranale a une capacit6 de synth6se endogane du cholestaroi 6levEe, les liposomes sont peut fraquents et les quantitEs de cholestErol estErifi6 et de triglycarides sont minimes. Les mitochondries et le rEticulum endoplasmique occupent un volume significativement sup6rieur ~ celui occupE par ces organites dans les cellules corticosurrEnaliennes de la catagorie prEcadente Ces glandes sont du type II dans la classification de Verne et Hebert (34). 3. l'61aboration et la sacrEtion des hormones stEro~diennes ainsi que la saquence des hydroxylations sont indEpendantes des facteurs traitEs dans cet article (quantit6 de liposomes, richesse en cholestarol et en triglycErides); en effet, ~t cet 6gard, le cobaye et le boeuf prEsentent de grandes similitudes, tandis que le rat constitue biochimiquement une classe diffErente par l'absence de la reaction d'hydroxylation en position 17 du cholestarol (28). Enfin, nous ne pouvons expliquer la s~crEtion de staro~des par une disparition rapide des liposomes sous l'effet de I'ACTH (27);/t notre avis, il s'agirait plutot d'une consommation des reserves (essentiellement du cholesterol estErifia) sous l'effet de l'hormone corticotrope. Ce probl~me devrait &re revu dans des conditions optimales de praservation morphologique des liposomes ainsi que des analyses chimiques des fractions subcellulaires isolEes dans les mames conditions expErimentales.
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SUMMARY The intracellular volume occupied by the liposomes, the mitochondria, and the endoplasmic reticulum has been determined in the zona fasciculata of guinea pig, rat, and beef adrenal cortex, by stereological analysis. These results were compared with the determined quantities of free and esterified cholesterol, triglycerides, and phospholipids in isolated adrenal cortex and with the capacity of cholesterol synthesis in the adrenal cortex of the three species studied. We conclude from these results that in the fasciculata cells of adrenals where the endogeneous synthesis of cholesterol remains small (guinea pig, rat), one finds a great number of liposomes which contain large amounts of esterified cholesterol and triglycerides. In contrast there are few liposomes in the adrenal glands which have an important endogeneous synthesis of cholesterol; the quantities of esterified cholesterol and triglycerides are very low. The quantities of free cholesterol and phospholipids are similar in the three species. Les auteurs remercient Mme M. Franck-Simonet et Mr J. Rummens pour la pr6paration des coupes fines, ainsi que Mr J. Verheyden pour le travail photographique.
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Correlation entre la morphologie et le contenu lipidique des corticosurr~nales du cobaye, du rat et du boeuf* JANOS FRUHLING1'2, GEORGES SAND 3, WILLY PENASSE1, FRAN~OISE PECHEUX2 et ALBERT CLAUDE1
aLaboratoire de Cytologie et de Cancdrologie Expdrimentale, 2Laboratoire des Radio-Isotopes, Institut J. Bordet, 31nstitut de Recherche Interdisciplinaire en Biologic Humaine et Nucldaire, Facultd de M~decine, Universitk Libre de Bruxelles, Bruxelles, Belgique Refu le 27 decembre 1972, et revisO le 21 mars 1973 Le volume occup~ par les liposomes, les mitochondries et le rdticulum endoplasmique a 6t6 d6termin6 dans la corticosurr6nale du cobaye, du rat et du boeuf par une m6thode st6rdologique. Les rdsultats obtenus au niveau de la zone fascicul6e ont 6t6 confrontds avec les quantit6s de cholest6rol (libre et est6rifi6), de triglyc6rides et de phospholipides des cortex isolds et avec les donn6es de la littdrature concernant l'importance de l'anabolisme du cholest6rol dans les corticosurr6nales des trois mammif6res 6tudi6s. Les corticosurr6nales dans lesquelles la synth6se du cholest6rol est r6duite (rat, cobaye) accumulent du cholest6rol est6rifi6 et des triglycdrides dans des liposomes. Par contre, les glandes surr6naliennes disposant d'une synth+se de cholestdrol endog6ne importante (boeuf) ne contiennent que des quantit6s r6duites de cholest6rol est6rifi6 et de triglyc6rides; le nombre de liposomes est petit. Les quantit6s de cholestdrol libre et de phospholipides sont semblables dans les glandes examindes. Les corticosurrdnales d ' u n g r a n d n o m b r e de mammif6res (primates, carnivores, la majorit6 des rongeurs) sont riches en liposomes; cependant, les r u m i n a n t s (boeuf, m o u t o n , ch~vre) et certains r o n g e u r s h i b e r n a n t s (le h a m s t e r p a r exemple) en sont p r a t i q u e m e n t d 6 p o u r v u s (4, 34). Les liposomes o u gouttelettes lipidiques (20) de la corticosurrdnale a p p a r a i s s e n t c o m m e des organites subcellulaires d61imit6s et distincts des autres 616ments cytoplasmiques (18). Ils sont constitu6s en m a j e u r e partie de lipides et de mdlanges lipidiques, solubles dans les liposolvants et pr6sentent une osmiophilie variable; lorsque la pr6servation chimique et l'int6grit6 m o r p h o l o g i q u e des l i p o s o m e s sont as* Ce travail a ~t6 partiellement r6alis6 avec le soutien du Minist~re de la Politique scientifique dans le cadre de l'Association Euratom - - Universit6 Libre de Bruxelles - - Universit6 de Pise, du Fonds Canc6rologique de la Caisse G6n6rale d'Epargne et de Retraite et de la Fondation R. et J. Hoguet.
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sur6es, leur densit6 est uniforme. Ces organites peuvent atre isol6s par centrifugation diff6rentielle et caract6ris6s ensuite comme une population morphologiquement et chimiquement distincte (30). L'abondance de liposomes et de lipides dans la corticosurr6nale est connue depuis longtemps, mais la relation entre ces deux observations n'est pas enti6rement 6tablie (9). L'analyse des lipides et des liposomes dans les glandes surr6nales ~ l'6chelle de la microscopie optique a 6t6 r6alis6e ~t l'aide de nombreuses mdthodes cytochimiques dans diff6rents 6tats exp6rimentaux (4, 8, 16). Ces 6tudes ont permis de montrer des variations de la quantit6 de liposomes sans les d6finir chimiquement avec pr6cision. Ndanmoins, la pr6sence de cholest6rol dans les liposomes 6tait quasi certaine, celle des triglyc6rides et des phospholipides, probable. Toutefois les analyses chimiques publi6es (7, 8, 15, 25) ont 6t6 r6alis6es sur les glandes compl6tes (cortico- et m6dullosurr6nale) et non pas sur la fraction liposomiale isol6e. L'apport morphologique de la microscopie 61ectronique ~ ce sujet 6tait limits jusqu'il y a quelques ann6es par l'utilisation de liposolvants 6nergiques lors de la pr6paration des tissus pour l'examen (20). Nous avons d6montr6 pr6c6demment que la raise en 6vidence et la caract6risation morphologique des liposomes intacts sont possibles/t l'6chelle ultrastructurale dans la corticosurr6nale du rat, apr6s pr6servation optimale et contrSlde des lipides et du cholest6rol en particulier, au cours de la pr6paration du tissu pour l'examen au microscope 61ectronique (10, 12). D'autre part, nous avons r6alis6 les analyses morphologiques et biochimiques de la fraction subcellulaire liposomiale obtenue par centrifugation diff6rentielle du tissu corticosurr6nalien du rat (30). Le but du pr6sent travail est de d6terminer ~t l'6chelle de la microscopie 61ectronique la quantit6 de liposomes dans la corticosurr6nale du rat et du cobaye d'une part [groupe I dans la classification de Verne (34)] et dans celle du boeuf d'autre part [groupe II]. Nous confronterons ensuite ces r6sultats avec les r6sultats des dosages des lipides dans les cortex et/ou dans les liposomes isol6s. La comparaison de ces donndes avec la morphologie et la quantit6 des mitochondries et du r~ticulum endoplasmique dans les corticosurr6nales des trois mammif6res 6tudi6s nous conduira ~t discuter le m6tabolisme du cholest6rol dans cette glande endocrine. Une partie du travail a 6t6 exposde lors de la r6union annuelle de la Socidt6 Fran9aise de Microscopie Electronique (Caen, 1971) (13). MATERIEL ET METHODES Les techniques de pr6paration du materiel pour la microscopie 61ectronique (fixation, d~shydratation et inclusion) et de la centrifugation diff~rentielle ainsi que de l'isolement des fractions subcellulaires ont ~t~ expos6es en d~tail dans nos publications ant~rieures (12, 14, 3O).
LIPIDES ET LIPOSOMES CORTICOSURRENALIENS
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I. ANIMAUX
A. Cobaye : nous avons utilis6 de jeunes cobayes m~les, fig6s de deux mois, pesant 250 gr environ. Leur alimentation a consist6 en une provende adapt6e au cobaye; ils ont regu de l'eau ad libitum. Ils ont 6t6 sacrifi6s entre 9 et 10 heures du matin par d6capitation et une saign6e imm6diate des carotides. B. Rats : des rats mgtles (Sprague-Dawley) figds de deux mois et d e m i / t quatre mois et pesant de 180/t 350 gr ont 6t6 retenus pour les exp6riences. Ils ont regu comme nourriture une provende et de l'eau ad libitum. Ils ont 6t6 sacrifids par ddcapitation entre 9 et 10 heures du matin. C. Boeufs : les surrdnales proviennent de boeufs abattus entre 9 et 11 heures dans un abattoir local, un examen v6t6rinaire pr6alable excluant les animaux qui ont subi un traitement hormonal 6ventuel. La fixation pour l'6tude morphologique a suivi imm6diatement le pr616vement de l'organe, environ 20 minutes apr+s l'abattage et la saign6e. En vue d'une analyse chimique, les glandes ont 6t6 transport6es au laboratoire dans une solution physiologique 0 °, enddans l'heure.
II. MICROSCOPIE ELECTRONIQUE A. Fixateurs 1. a.
b. C.
2. a.
b. e.
3.
glutaralddhyde 2,5% en tampon phosphate 0,1 M, p H 7,4; temps de fixation : 2 heures; lavage au tampon phosphate 0,15 M, p H 7,4; 6 × 5 minutes; posffixation : OsO~ 1% tampon phosphate 0,13 M, p H 7,4; temps de fixation : 1 heure; fixateur ald6hydique complexe (2•); glutarald6hyde 2,5%, paraformalddhyde 2%, CaC12 0,05 % en tampon cacodylate 0,1 M, p H 7,2; temps de fixation : 2 heures; lavage au tampon cacodylate 0,05 M, p H 7,2 contenant 0,05% de CaCI~; 3 × 10 minutes; posffixation : OsO4 1%, CaCI~ 0,05 % en tampon cacodylate 0,1 M, p H 7,2, temps de fixation : 1 heure; OsO~ 4% (ou 5%) dans l'eau bidistillde, p H 6,0, selon Claude (6), temps de fixation : 3 heures et demie.
B. Ddshydratation et inclusion
Dans le cadre des 6tudes comparatives de pr6servation morphologique et chimique des lipides (12), les trois techniques suivantes de d6shydratation et d'inclusion des pi6ces fix6es sont retenues : 1) m6thode classique de Luft (23), comprenant l'6thanol 100% et l'oxyde de propyl+ne; 2) m6thode originale d'Idelman (19) oia l'agent d6shydratant (et liposolvant) est l'6thanol (30 et 70%); les pi6ces passent ensuite dans deux bains d'un m61ange 6thanol 7 0 % - E p o n complet (1 : 1, v/v) et enfin dans l'Epon eomplet pur; 3) idem 2), l'6thanol 70% 6tant remplac6 par l'6thanol 80% (a) ou l'6thanol 90% (b) (12).
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C. Examen au microscope dlectronique L ' e x a m e n des coupes semi-fines (dpaisseur : 1 ~) color~es au bleu de toluidine permet la localisation et le choix des rdgions ~t examiner. Les coupes ¢¢ gris argent4 >>sont obtenues ~t l'aide de (~ l'ultrotome >)LKB m u n i d ' u n couteau de diamant. Elles sont contrast~es au p l o m b seul (26) ou an citrate de p l o m b prSc~d6 d'ac6tate d'uranyle. Les micrographies Sont r4alis4es au microscope Philips E M 200, ~t une tension d'accdl~ration de 40 ou 60 kV III. ANALYSE MORPHOMI~TRIQUE L'analyse est r6alis6e selon la m4thode de Weibel et coll. (35) de comptage diff6rentiel par points sur une grille. La distance entre deux po!nts de la grille est choisie sensiblement 5gale au diamStre moyen des liposomes et des mitochondries au grossissement faiblel Le pourcentage de volume appartenant au r4ticulum endoplasmique est d6termin4 sur des micrographies ~ m o y e n et fort grossissement. L'analyse morphomdtrique est r6alis5e sur des pisces fix6es, d4shydrat6es et inclues dans des conditions techniques identiques. Des micrographies de coupes n o n s4ri4es provenant de plusieurs blocs par zone et par animal sont analysSes au cours de 5 exp4riences pour le rat, 3 pour le boeuf et 2 pour le cobaye. Le n o m b r e total de points compt6s est de l'0rdre de dix mille par zone et par animal. La fraction volumStrique des organites est exprimSe en pourcentage du volume cellulaire total aprSs soustraction des points couvrant l'espace extracellulaire du parenchyme. Pour chaque valeur l'Scart type. est ddtermin5 selon le procdd4 de Nussdorfer (24). IV. CENTRIFUGATIONDIFFERENTIELLE
N o u s avons isol6 la fraction liposomiale p a r centrifugation diff4rentielle (30) apr6s 41imination successive des fractions (( n o y a u x et d6bris cellulaires >>, (( mitochondries >> et (~ interm4diaire >>. Les liposomes sont pr61ev6s sous la forme d ' u n e pellicule superficielle apr6s centrifugation du surnageant de la fraction interm6diaire d u r a n t 90 minutes ~ 100,000g. V. DOSAGESCHIMIQUES
1. Cholestdrol. Le cholest6rol (total et libre) est d4termin4 selon la m6thode de Sperry et W e b b (33) apr6s extraction au m41ange 6thanol absolu-ac6tone (1 : 1, v/v). Le cholest6rol estdrifi6 est estim6 par diff6rence. FIGS. 1 et 2. Corticosurr6nale du cobaye. FIG. 1. Zone fasciculde externe, vue g4ndrale. Les cellules contiennent un grand hombre de liposomes (L), en majorit4 sphdriques, de taille peu variable. L'image du contenu est homogSne et peu contrast4 dans les Conditions de fixation et de coloration utilis6es, mais il n'y a ni dissolution, ni vacuolisation. my : figures my61iniques h l'int6rieur de liposomes, m : mitochondries. Le r6ticulum endoplasmique, tr6s dispers6 (re) occupe un volume restreint. C : capillaire; flSche : 41~ment d ' u n histiocyte p&icapillaire s6parant deux groupes cellulaires. Fixateur ald6hydique complexe; d~shydratation et inclusion selon Idelman (19);coloration : citrate de plomb, x 4 900. FIG. 2. Zone fascicul4e intel:ne; vue g6n6rale. Pr6sence de nombreux liposomes (L). Les fl~ches indiquent !es membranes limitant deux liposomes voisins en contact direct. L c : rares liposomes confluents. N : noyaux; m : mitochondries; re : r6ticulum endoplasmique, plus ~ab0ndant que dans la zone fascicul4e externe. Fixat.eur : glutarald6hyde 2,5 %; d6shydratation et inclusion selon Idelman; coloration : citrate de plomb, x 4 700.
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2. Phospholipides. Technique de Ames et Dubin (2) apr6s extraction au chloroformem6thanol (2 : 1, v/v). 3. Triglyc6rides. D6termination apr~s extraction/t l'6ther isopropylique selon la m6thode de Laurell (22). RESULTATS I. CONSIDERATIONSMORPHOLOGIQUES
A . M o t T h o l o g i e des liposomes
Les liposomes apparaissent dans les cellules des corficosurr~nales des trois esp~ces 6tudi6es c o m m e des corps ronds de diam~tre variable : en moyenne, 1 # (de 0,8 ~t 1,25 #) atteignant rarement 2#, chez le rat; 2 ~i 3,8/~, d6passant parfois 4/~, chez le cobaye; les rares liposomes chez le boeuf, de 0,7/t 1,1 #. Le c o n t o u r est r6gulier apr~s fixation ald6hydique (Figs. 1, 2 et 4 ) e t plus o u moins cr~nel6 apr~s fixation osmi6e (Fig. 3). L'image du contenu est homog~ne et la perm6abilit6 aux 61ectrons variable, selon l'6paisseur des coupes, le fixateur (les densit~s sont plus 61ev~es avec un fixateur osmi6) et le colorant utilis6s. La densit6 peut varier d ' u n e zone du cortex ~ l'autre [chez le cobaye, apr~s fixation ald~hydique (31)], mais elle est constante ~t l'int6rieur de chaque zone. L'image homog~ne du contenu n ' a 6t6 obtenue que par l'emploi de techniques de d6shydratafion et d'inclusion assurant une pr6servation des lipides (12, 19). Les vacuoles (20, 32) (Fig. 5), observ6es l o r s q u ' o n utilise la m6thode habituelle de preparation du tissu c o m p r e n a n t l'6thanol absolu et l'oxyde de propyl~ne, ne sont que les cons6quences d ' u n e dissolution partielle, souvent importante des constituants des liposomes (12). Les liposomes sont d61imit~s, aussi bien chez le rat que chez le cobaye, par une m e m b r a n e (Fig. 6, fl~che) ou par un interface lipides/cytoplasme dont l'~paisseur est d'environ 70-80 A et dont la structure paraR homog~ne lorsqu'une r6solution extreme n'est pas recherch6e. L'existence de cette m e m b r a n e a 6t6 signal6e chez le FIaS. 3 et 4. Corficosurr6nale du rat. FIG. 3. Zone fascicul6e externe. Cette couche est, chez le rat, la plus riche en liposomes (L); la perm6abilit6 aux 61ectrons (dans les conditions techniques utilis6es) est nettement inf6rieure h celle observde darts la zone correspondante chez le cobaye (Fig. 1). Les liposomes ont un contenu homog~ne et tr6s dense. N : noyaux; Nu : nucldole; G : appareil de Golgi; rn : mitochondries de taille et de forme semblables; re : plages de r6ticulum endoplasmique; C : capillaires. Fixateur : OsO¢ darts l'eau bidistill6e selon Claude (6); d6shydratation et inclusion selon Idelman; coloration : citrate de pl0mb. X4 800. FIG. 4. Zone fascicul6e interne. Diminution nette du nombre de liposomes (L); comparer avec la zone fascicul6e externe chez le rat (Fig. 3) et avec la zone fascicul6e interne chez le cobaye (Fig. 2). N : noyau; Nu : nucl6ole; rn : mitochondries, g6n6ralement plus grandes et de tailles plus variables que dans la zone fascicul6e externe; m et fl6che : agglom6ration de grains mitochondriaux; G : appareil de Golgi; re : r6ticulum endoplasmique; Ly : nombreux lysosomes; C : capillaires; H : d6tail d'un 616ment histiocytaire en position p6ricapillaire. Fixateur : glutarald6hyde 2,5 %; tampon hosphate 0,1 M; d~shydratation et inclusion selon Idelman modifi6 (•2); coloration : citrate de lomb. x 4 700.
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rat apr~s dissolution partielle des liposomes dans le tissu corticosurr6nalien fix6 in toto (27) et clairement raise en 6vidence dans la fraction liposomiale isol6e (30). En outre, on peut distinguer une couche plus large et de densit6 61ev6e/t la p6riph6rie des liposomes apr~s fixation osmi6e et coloration par l'ac6tate d'uranyle (Fig. 8, fl~che). B. Morphologie du rdticulum endoplasmique et des mitochondries 1. Le r6ticulum endoplasmique est morphologiquement semblable dans la zone fascicul6e du boeuf et la zone fascicul6e (interne et externe) du rat et du cobaye. I1 est form6 d'616ments tubulaires (Figs. 9-11) de diam~tre transversal de 350/~ 700 A et de longueur variable; les membranes ont une 6paisseur d'environ 70 A et une structure classique. Les 616ments du r6ticulum endoplasmique, rang6s en faisceaux ou, plus souvent, s'infiltrant entre les autres organites cellulaires, forment par des Connexions un r6seau tridimensionnel complexe et volum6triquement important. Chez ces trois animaux, au niveau de la zone fascicul6e, le r6ticulum endoplasmique granulaire n e forme pas un organite morphologiquement distinct. Tout au plus peut-on observer quelques courtes citernes de r6ticulum endoplasmique couvertes de ribosomes sur les deux surfaces externes des membranes (Fig. 6, rg). En g6ndral, l'organisation du r6ticulum endoplasmique est mixte, c'est-~t-dire que les membranes couvertes de ribosomes sont situ6es entre des sections de membranes lisses, sans interruption de la continuit6 (Figs. 9-11, fl~ches); les deux formes classiques du rdticulum endoplasmique constituent ainsi une entit6 morphologique. 2. Les mitochondries des cellules de la zone fascicul6e chez les trois esp~ces pr6sentent des diff6rences morphologiques intdressantes h signaler : (a) cobaye : la structure des mitochondries est d6taill6e dans un travailiind6pendant (31): rappe!lons ici les caract6ristiques essentielles : forme souvent irr6guli~re, matrice abondante, crStes lamellaires souvent agglom6r6es (Figs. 6 et 11) visibles en coupes longitudinale (Figs. 6 et 11, l) et frontale (Figs. 6 et 11, f); grains mitochondriaux quasi inexistants. (b) rat (Fig. 8) : les mitochondries sont sph6riques, cylindriques ou rarement irr6guli~res; le diam~tre varie entre 0,6 et 1,7/z; tr6s fr6quemment, il est compris entre
FI6. 5. Corticosurr6nale du boeuf. D6tail de la zone fascicul6e (partie moyenne). Hormis quelques liposomes (partiellement vid6s) (L), la plus grande partie du volume cellulaire est occup6 par les mitochondries (m) et le r6ticulum endoplasmique; ce dernier est fr6quemment rassembl6 en plages plus ou moins 6tendues (re). h : mitochondries allong6es ayant la forme d'halt~res; N: noyau; G : appareil de G01gi; me : membrane plasmatique. Celle-ci semble 8tre h certains endroits (fl6ches)plus complexe et plus 6paisse. Np : neff p6riphdrique et cellule de Schwann (S), rarement observ6 dans la corticosurr6nale. Fixation : OsO4 5 % dans l'eau bidistill6e selon Claude (6); d6shydratation et inclusion classique (emploi d'alcool 100 % :et d'oxyde de propyl6ne, ce qui explique la dissolution des lipides des liposomes), coloration : ac6tate d'ui'anyle et citrate de plomb, x 5 900.
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0,8 et 1 #. La matrice est f o r t e m e n t r6duite. Les crates (10) sont, c o m m e chez le boeuf, des variantes m o r p h o l o g i q u e s de la forme de base t u b u l a i r e ; saccules p6riph6riques, saccules centraux port6s par les 614ments tubulaires et tubules simples (Fig. 8, t). Les grains m i t o c h o n d r i a u x sont plus n o m b r e u x que chez les deux autres esp~ces. Les mitochondries c o n t i e n n e n t en outre des inclusions d ' o r g a n i s a t i o n paracristalline caract6ristiques (••); (c) boeuf • les m i t o c h o n d r i e s sont le plus souvent sph6riques, r a r e m e n t cylindriques o u sous forme d'halt6res (Fig. 5, h); le diam6tre varie en g6n4ral entre 0,5 et 1,5 #. La matrice est n e t t e m e n t m o i n s a b o n d a n t e que chez le cobaye. Les crates, p o u r la p l u p a r t t u b u l a i r e s (1), pr6sentent 6galement des variantes m o r p h o l o g i q u e s (Fig. 7) c o m m e des saccules p6riph4riques (s), des saccules centraux (sc) et des t u b u l e s droits (t). O n observe aussi quelques crStes !amellaires, soit en coupe longitudinale (i) o u frontal e (f). Les grains m i t o c h o n d r i a u x sont rares.
C. L i p o s o m e s en rapport avec le rOticulum endoplasmique et les mitochondries
Les liposomes des cellules corticosurr6naliennes des trois esp6ces sont en 6troite relation avec le r4ticulum e n d o p l a s m i q u e et les mitochondries; par ailleurs ces deux organites occupent en g6n4ral la plus grande partie de l'espace cellulaire entre les liposomes (voir T a b l e a u II). Les liposomes sont f r 4 q u e m m e n t entour6s de plusieurs c i t e r n e s d u r6ticulum e n d o p l a s m i q u e lisse (Figs 6 et 8, rl et fl6che), qui f o r m e n t u n e
FIGS. 6/~ 8. Mitochondries. FIG. 6. Corticosurrdnale de cobaye. D6tail d'une cellule de la zone fascicul4e interne. Les mitochondries (in) souvent de forme irr6guli6re ont une matrice abondante et des crates lamellaires r4unies en faisceaux; vue en coupe longitudinale(l) 0u frontale (f); L : liposome; Fl6ches : membrane liposomiale distincte; rl : r4ticulum endoplasmique lisse; rg : 414ment du r6ticulum endoplasmique granulaire; r : ribosomes et polysomes parfois en contact avec un liposome. Conditions techniques : voir Fig. 2. × 26 000. FIG. 7. Corticosurr6nale du boeuf. Zone fascicul6e interne. Mitochondries de forme g6ndralement sph6rique, de taille variable (m). La matrice est abondante dans quelques mitochondries (m); crates tubulaires droites (t) ou sacculaires; ces demi6res sont, soit p6riph4riques avec un p6doncule court (s) ou centrales (so); st : saccule central (( ports >>par un 614ment tubulaire rectiligne; pr4sence de crates lamellaires (comme chez le cobaye) en coupe longitudinale (1) ou frontale (f); rl : r6ticulum endoplasmique lisse tubulaire; r : polysomes; L : liposome dissout partiellement. Fixateur : glutarald6hyde 2,5 %, tampon phosphate 0,1 M; ddshydratation et inclusion classique; coloration : acdtate d'uranyle et citrate de plomb, x 26 000. FIG. 8. Corticosurr6nale du rat. Zone fascicul6e exteme. D4tail de deux cellules, s6par4es par les membranes cellulaires (me) comprenant deux desmos0mes (d). N : d6tails des noyaux; L : liposomes contour cr~nel6; fl6che simple : la mince zone p6riph6rique des liposomes est plus contrast6e apr6s coloration ~ l'ac6tate d'uranyle; r : ribosomes libres, parfoisen contact avec les liposomes et les mitochondries (ml); rl et fl6che : creme du r6ticulum endoplasmique lisse entourant les liposomes et/ou les mitochondries avec contact net entre les deux organites. Les crates sont tubulaires (t), ou sacculaires, p6riph6iSques (s) ou sacculaires centrales, port6es par des 616ments tubulaires rectilignes (st et fl6che). A remarquer le contact 6troit entre la mitochondrie mlet le liposome L1. Fixateur : OsO~ 4 % dans I'eau bidistill4e; d6shydratation et inclusion selon Idelman; coloration : ac6tate d'uranyle et citrate de plomb, x 22 500.
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FRUHLING ET AL;
T a b l e a u I. Volume occupd par "les liposomes clans les zones de la corticosurrdnale des mammif~res dtudidsa Zone
Cobaye
Rat
Z Glom6rulaire Z Fasciculde externe Z Fascicul~e interne Z Rdticul~e
3,7 28,3 19,6 4,4
10,3 12,9 4,9 4,1
(_+2,1) ( _+3,1) (_+3,4) (_+2,9)
Boeuf (_+1,7) ( _+1,9) (__.0,5) (+0,8)
0,6 0,35 0,35 0,6
(+0,3) (_+0,2) (_+0,2) (-+0,3)
a R6sultats exprim6s en % du volume total des cellules du parenchyme. Entre parenth6ses l'6cart type. v 6 r i t a b l e c o r b e i l l e a u t o u r de ceux-ci. O n o b s e r v e aussi u n c o n t a c t n e t e n t r e l i p o s o m e s et. m i t o c h o n d r i e s
(Fig. 8, L1 et m 0 ainsi q u ' e n t r e l i p o s o m e s et r i b o s o m e s o u p o l y -
s o m e s (Figs. 6 et 8, r). II, VOLUME CELLULAIREOCCLrPE PAR LES LIPOSOMES,LES MITOCHONDRIES ET LE RETICULUMENDOPLASMIQUE
A. Fraction du volume cellulaire occupde par les liposomes clans les diffdrentes zones de la corticosurrdnale du cobaye, du rat et du boeuf (voir, T a b l e a u I) Remarquons
q u e c h e z le b o e u f , les r6gions e x t e r n e et i n t e r n e de la z o n e fascicul6e
n e p e u v e n t ~tre distingu6es de m a n i b r e h i s t o l o g i q u e o u c y t o l o g i q u e . A l ' e x a m e n des chiffres pr6sent6s, o n p e u t c o n s t a t e r q u e : 1. la q u a n f i t 6 de l i p o s o m e s est faible d a n s t o u t e s les z o n e s de la c o r t i c o s u r r 6 n a l e de b o e u f ; v o i r aussi Fig. 5; FiGs. 9 g 11. Le r6ticulum endoplasmique. F~G. 9. Corticosurr6nale du boeuf. Zone fascicul6e interne. Le r6ticulum endoplasmique est constitu6 par des cremes et par de longs 616ments tubulaires, en grande majorit6 lisses, souvent parall6les (rl) ou se prdsentant en couples obliques ou transversales. F16ches : un ou quelques ribosomes espac6s fix6s stir les membranes du rdticulum endoplasmique. Double fl6che : s6quence courte, mais r6guli6re de ribosomes fix6s; r : ribosomes libres; m : mitochondries ~t cr6tes sacculaires p6riphdriques (s) ou port6es par un 616ment tubulaire (st). Fixateur : glutarald6hyde 2,5 %, tampon phosphate 0,1 M; d6shydratation et inclusion classique; coloration selon Reynolds. x 38 200. FIG. 10. Corticosurr6nale du rat. Zone fascicul6e interne. Le r6ticulum endoplasmique est constitu6 par des 616ments tubfllaires (rl); le plus souvent lisses, pr6sentant des anastomoses (an); fl6ches : rares ribosomes isol6s fix6s sur les membranes. F : face de formation de l'appareil de Golgi; r : ribosomes libres; L : liposome en coupe tangentielle; m : mitochondrie contenant une inclusion paracristalline (pc). Fixateur : glutarald6hyde 2,5 %, tampon phosphate 0,1 M; d6shydratation et inclusion selon Idelman, modifi6 (•2); coloration : citrate de plomb. × 37 000. FIG. 11. Corticosurr6nale du cobaye. Zone fasciculde interne. Les 616ments tubulaires du rdticulum endoplasmique sont visualis6s en coupe longitudinale (rl), oblique (o) ou transversale (t). Fl6che simple : quelques ribosomes isol6s fix6s aux citernes du r6ticulum endoplasmique. Double fl6che : sdquence :r6guli6re et courte de ribosomes attach6s au r6ticulum endoplasmique; r : ribosomes et polysomes libres; Ly : lysosome; m : mitochondries. Leurs cr6tes lamellaires bien visibles sont rdunies en faisceaux, vus en coupe longitudinale (l) et frontale (f). Conditions techniques : voir Fig. 2 et Fig. 6. x 32 000.
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Tableau II. Volume oecupd par les mitochondries et par le rdticulum endoplasmique dans la zone fascicul~e externe et interne de la corticosurrOnale des mammifOres dtudi~s ~ Zone
Organite
Cobaye
Rat
Fascicul6e externe
Mitochondries R6ticulum endoplasmique Mitochondries R6ticulum endoplasmique
25,4 26,5 27,7 40,7
26,3 45,4 23,7 54,9
Fascicul6e interne
( ± 5,3) (_+5,0) (_+8,2) ( _+7,3)
Boeuf ( _+1,5) (+_4,4) (±4,0) ( ± 0,9)
34,6 55,3 34,6 55,3
( ± 8,9) (_+11,7) (_+8,9) ( _+1 !,7)
a R6sultats exprim6s en % du volume total des cellules des pai~ties de la zone. Entre parentheses les valeurs de l'6cart type.
2. le cobaye poss6de la zone fascicul6e externe et interne--la masse la plus importante du cortex - - la plus riche en inclusions lipidiques; voir aussi Figs. 1 et 2. La variation entre les deux parties de la zone est plus prononc6e chez le rat (Figs. 3 et 4) que chez le cobaye. Pour l'ensemble de la zone fascicul6e, le rapport des fractions du volume occup6 par les liposomes chez le cobaye, le rat et le boeuf est de 3 : 1:0,04; 3. dans la zone glom6rulaire - - qui constitue une unit6 morphologique ~ part - le rapport des volumes occup6s par les liposomes est invers6 : environ 3 : 1, en faveur du rat. Remarquons cependant que les cellules internes de la zone glom6rulaire chez le cobaye sont plus riches en liposomes et que les cellules p6riph6riques sont presque d6pourvues de ceux-ci; 4. chez le cobaye, la zone rdticulde se distingue nettement de la zone fascicul6e par une diminution du nombre et du volume occup6 par les liposomes. Chez le rat, par contre, le volume de liposomes est sensiblement 6gal dans les zones fascicul6e interne et r6ticul6e. 5. L'6cart type est assez important dans les zones glom6rulaire et r6ticul6e du cobaye. Ceci provient de la pr6sence de deux types de cellules dans ces zones : les unes sont ddpourvues de liposomes, les autres en contiennent autant que les cellules de la zone fasciculde (31). B. Volume occupd par les mitochondries et le rdticulum endoplasmique dans les cellules de Ia zone faseiculSe externe et interne chez les trois espkces 8tudides, (voir, Tableau II) Ces r6sultats compl6tent les mesures pr6sent6es au Tableau I (volume occup6 p a r les liposomes) et permettent les constatations suivantes : 1. Chez le rat et le cobaye : (a) le volume occup6 par les mitochondries est identique dans les deux parties de la zone fascicul6e; (b) il y a une relation inverse entre la fraction du volume cellulaire occup6 par le r6ticulum endoplasmique et les lipo-
LIPIDES ET LIPOSOMESCORTICOSURRI~NALIENS
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Tableau III. Contenu en lipides des corticosurrdnales des mammifOres dtudids ~ Lipide Cholest6rol
Esterifi6 Libre Total
Triglyc6rides Phospholipides
Cobaye
Rat
Boeuf
7,4 0,5 7,9
4,02 0,58 4,6
0,01 0,23 0,24
4,03 2,65
1,4 2,65
0,05 3,3
Exprim6 en mg/100 mg poids humide de cortex.
somes; (c) la somme des volumes relatifs occupds par les organites consid6r6s (liposomes, mitochondries, r6ticulum endoplasmique) est similaire et stable (81-85 % du volume total); 2. Chez le boeuf : (a) les mitochondries occupent un volume significativement supdrieur ~t celui mesur6 chez les deux autres animaux examin6s; il est quasi 6gal 5 la somme des volumes occup6s par les mitochondries et les liposomes chez le rat; (b) le r6ticulum endoplasmique, bien d6velopp6 dans toute la zone fascicul6e, occupe un volume similaire/t celui mesur6 dans la zone fascicul6e interne, chez le rat (off les liposomes n'occupent que 4,9 % du volume de cette pattie de zone).
III. DOSAGES DES LIPIDES DANS LE CORTEX ET DANS LES LIPOSOMES
A. R~sultats des dosages du cholest~rol (total, est~rifid et libre), des triglyckrides et des phospholipides obtenus au niveau des cortex isolks (voir, Tableau III) Soulignons que chez le rat, le cortex isol6 par microdissection comprend les zones interm6diaire (couche mince), fascicul6e externe et fascicul6e interne compl&ement, ainsi que 40/t 60 % des zones glom6rulaire et r6ticul6e (30). Vu l'6paisseur relative des zones chez le cobaye (31), la composition (morphologique) du cortex isol6 doit &re superposable ~t celle du rat. Enfin chez le boeuf compte tenu de la taille de l'organe, les pertes lors de la pr6paration du cortex isol6 peuvent 8tre consid6r6es comme n6gligeables. En conclusion, les dosages des lipides sont repr6sentatifs en premiere approximation, pour le rat et le cobaye, de la composition des deux parties de la zone fascicul6e et, de la totalit6 de la corticosurr6nale pour le boeuf. I1 ressort du Tableau III que : 1. (a) le cobaye et le rat disposent de quantit6s importantes de cholest6rol; la quantit6 de cholest6rol total (exprim6e en mg/100 mg cortex) chez le cobaye est 1,72 × plus 61ev6e que chez le rat; le mSme rapport pour le cholest6rol libre et est6rifi6 est respectivement 0,9 : 1 et 1,84 : 1. 9 - 731827 J. Ultrastructure Research
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(b) la quantit6 de cholestdrol total de la corticosurr6nale du boeuf est tr6s inf6rieure/~ celle que l'on trouve chez les deux autres esp6ces (1/19 du cholest6rol du cortex du rat); la forme libre pr6domine, (moins de 5 % du cholestdrol total sous forme est6rifi6e); le rapport des quantit6s pour la forme libre entre le rat et le boeuf est de 1:0,4. Les diffdrences dans les quantitds de cholest6rol total proviennent donc des diffdrences importantes dans les quantit6s de cholest6rol est6rifi6. 2. Triglycdrides : leur quantit6 exprimde en mg/100 mg cortex au niveau du cortex isol6 du cobaye est 2,9 × plus 61evde que chez le rat; le cortex de ce dernier contient par contre 28 × plus de triglyc6rides que le boeuf; 3. Phospholipides : les r6sultats sont du m~me ordre de grandeur; il en d6coule que les cortex surrdnaliens des trois esp6ces contiennent des quantit6s presque identiques de phospholipides (les r6sultats sont exprim6s en mg/100 mg de tissu).
B. Analyse des Iiposomes isolds Chez le rat (30), l'analyse nous a montr6 que cet organite contient 75 % du cholest6rol total du cortex, 83 % du cholest6rol est6rifi6 et 37 % du cholest6rol libre; 30 % des triglyc6rides et 10 % des phospholipides sont accumulds dans les liposomes. Enfin, aprbs soustraction des diff6rentes contaminations, 2,5 % des prot6ines de la corticosurr6nale ont 6t6 mis en 6vidence dans la fraction liposomiale. Chez le cobaye, sans tenir compte des 6changes possibles entre les fractions (29), 61% du cholest6rol total (70 % du cholest6rof estdrifi6) sont localis6s au niveau des liposomes, 70 % des triglyc6rides et 7 % des phospholipides sont retrouv6s dans la m~me fraction. IV. CYTOCHIMIE
La digitonine a 6t6 utilis6e pour l'identification au niveau de la microscopie 61ectronique de certains lipides intracellulaires. Ce probl~me a 6t6 expos6 ant6rieurement (14). En r6sum6, mentionnons que la pr6sence de 0,2 % de digitonine dans le fixateur a permis la mise en 6vidence de formations caract6ristiques complexes, 6voquant notamment la pr6sence de cholest6rol libre et des phospholipides au niveau des liposomes et des mitochondries. DISCUSSION Avant d'aborder la discussion, rappelons que les r6sultats morphom6triques et chimiques pr6sentds et confront6s ont 6t6 obtenus ~ partir des r6gions externe et interne de la zone fascicul6e corticosurr6nalienne du rat, du cobaye et du boeuf. Cette zone constitue toutefois la masse la plus importante du cortex chez les trois esp6ces examin6es et les cortex isol6s ayant subi les analyses chimiques comprennent la zone fascicul6e complete ainsi qu'une fraction des zones glom6rulaire et r6ticul~e (30).
LIPIDES ET LIPOSOMES CORTICOSURRENALIENS
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Une comparaison des volumes occup6s par les liposomes (Tableau I) et des compositions lipidiques (Tableau III) des cortex chez les trois esp6ces montre par ailleurs un parall6tisme dans les variations de ces param~tres uniquement dans la zone fascicu16e. La zone glom6rulaire constitue une units morphologique et m6tabolique distincte par son r61e darts l'61aboration des min6ralocorticoides; en outre une 6ventuelle fonction germinative de cette couche rend toute corr61ation entre la morphologie et la composition chimique (du point de vue de la st6roidogdn6se) d61icate. Enfin, la zone rdticul6e pr6sente aussi des caract6ristiques morphologiques (la taille et la forme des mitochondries, l'aspect de leurs crates) et de la distribution des organites (liposomes peu nombreux, rdticulum endoplasmique lisse abondant) qui peuvent atre associds/t une fonction m6tabolique distincte. Nos r6sultats, exprimant la fraction volumdtrique cellulaire occup6e par les organites dans'la zone fascicul6e externe de la corticosurr6nale du rat, concordent avec ceux publids par Nussdorfer (24). Les dosages de cholest6rol et des autres lipides sont compatibles avec ceux publi6s par diffdrents auteurs (7, 8, 17, 25). Notons cependant des diff6rences marqudes entre nos r6sultats et certains pr6sent6s par Ostwald (25) quant aux quantitds de triglycdrides et de cholest6rol total chez le cobaye et le rat mftle non trait6s. Ces divergences peuvent s'expliquer, d'une part par la variabilit6 du contenu des surrdnales en cholestdrol (nos r6sultats sont des valeurs moyennes d'une quinzaine d'expdriences) et, d'autre part parce que nos dosages ont 6t6 rdalis6s sur les cortex isol6s, apr6s 61imination par micro-dissection de la m6dullosurrdnale et de la capsule. Or cette derni6re est souvent fiche en triglyc6rides par l'adh6rence de tissu adipeux. Signalons 6galement que pour le cobaye, 16 % du cholest6rol dos6 apr6s pr6cipitation /t la digitonine, correspondent au 5~-cholestane-3fl-ol, comme l'ont ddmontr6 Werbin et coll. (37). Le rapport des volumes cellulaires occup6s par les liposomes dans les corticosurr6nales des trois animaux examines (Tableau I) est le suivant; c o b a y e : r a t : b o e u f = 3 : 1:0,04; le Tableau III nous permet d'6tablir le m~me rapport pour le cholest6rol total (cobaye : rat : boeuf - 1,7 : 1 : 0,05) et pour les triglyc6rides (cobaye : rat : boeuf = 2,9:1:0,035). L'analogie entre ces rapports est assez frappante et nous suggbre que la prdsence des liposomes darts la zone fascicul6e est proportionnelle aux quantitds de cholesterol et de triglyc6rides dans cette partie du parenchyme. Le rapport du cholest6rol est6rifi6/cholestdrol libre dans les glandes est grand chez le rat et le cobaye; il est clair que l'abondance de liposomes dolt 6tre l'expression de la richesse en cholest6rol est6rifi6. Ce fait est confirms par les dosages des lipides dans les liposomes isol6s (30) : une quantit6 importante est stock6e dans les liposomes; une petite partie est associ6e aux autres composants cellulaires. Le cholest6rol libre est par contre surtout associ6 ~t d'autres organites que les liposomes dans les cortex des trois esp6ces, (30).
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FRUEILING ET AL.
Une relation entre ces constatations et les donnaes de la littarature concernant le matabolisme du cholestarol dans la corticosurranale des animaux analysas peut &re envisagae. En effet, la corticosurranale du cobaye peut synthatiser le cholestarol, mais pas au delft de 40 % de son contenu total (36); la synthase est nagligeable dans le cortex du rat (5); par contre, la synth~se est importante dans le cortex du boeuf (15). I1 est admis que dans la corticosurranale du rat et du cobaye, le cholestarol estarifi6 provient du cholestarol plasmatique par passage dans les cellules sous forme libre ofa il est ensuite transform6 en cholestarol est~rifi6 (3, 12, 15, 28). Ce dernier construe une raserve hydrolysable pour l'alimentation d'un compartiment de cholestarol libre ~t renouvellement rapide (15, 28). Ces considarations nous suggbrent la conclusion suivante :dans la zone fasciculde des cortex surranaliens dont la synth~se endog~ne du cholestarol est faible ou nulle, celui-ci est concentr6 dans des gouttelettes lipidiques (liposomes) sous forme de cholestdrol estarifia. Le nombre (et 6ventuellement la taille) des liposomes est proportionnel ~t la quantit6 de cholestarol et de triglycarides prasente dans la glande des animaux. Quant au parallalisme entre les quantitas de cholestarol et de triglycarides, on peut raisonnablement supposer que ces derniers participeraient ~ l'estarification du cholestarol. Cette hypoth~se n'exclut pas d'autres utilisations des triglycarides par la cellule, notamment comme source d'anergie ou comme prdcurseur d'acdtyl-CoA (3). Tandis que le nombre de liposomes est en 6troite corralation avec la composition lipidique de la zone fasciculae, les deux autres organites volumatriquement prapondarants - - le raticulum endoplasmique et les mitochondries - - ont un comportement diffarent. Le raticulum endoplasmique ne prasente pas de variations morphologiques en fonction des quantitas de lipides ou des caract&istiques du matabolisme du cholestarol dans les corticosurranales 6tudiaes. La construction des 61ements du r&iculum endoplasmique, l'organisation des citernes et les rapports avec les autres organites sont strictement identiques sur le plan morphologique chez les 3 esp~ces. Par contre, il existe une relation inverse entre les volumes occupas par le raticulum endoplasmique et par les liposomes (composas essentiellement de cholestarol estarifia et de triglycarides). Ces observations peuvent atre associaes ~t la capacita pour la cellule de synthatiser le cholestarol : lorsque la synth~se endogane est importante, le volume occupa par le raticulum endoplasmique est plus grand que lorsque la synthbse endog~ne est raduite. Les diffarences morphologiques des mitochondries et de leurs crates en particulier, dans la zone fasciculae des trois espaces (Fig. 6 ~t 8) peuvent &re considaraes comme indapendantes de la composition lipidique des cortex et de l'anabolisme endogane du cholestarol : chez le cobaye, riche en cholestarol et en triglycarides, la matrice mitochondriale est abondante et les crates sont en majorita lamellaires; chez le rat, dont
LIPIDES ET LIPOSOMES CORTICOSURRENALIENS
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la composition lipidique et le m6tabolisme du cholest6rol sont fort semblables, la matrice est peu d6velopp6e et les crates sont quasi exclusivement tubulaires et sacculaires. Enfin chez le boeuf, les mitochondries sont assez similaires ~t celles du rat, alors que le m6tabolisme du cholestarol est diff6rent de celui du rat. Le volume occup6 par cet organite est plus grand chez le boeuf; ce fait pourrait atre mis en rapport avec l'importance de la synth6se du cholest6rol endoggne et la mise en 6vidence de petites quantit6s de cholest6rol est6rifi6 et de triglyc6rides. Les r6sultats des dosages chimiques et des analyses volum6triques confront6s avec les donn6es de la litt6rature quant ~t la capacit6 de synth~se endog6ne de cholest6rol dans la zone fasciculde des corticosurranales examin6es (cobaye, rat, boeuf) nous permettent les conclusions suivantes : 1. chez les animaux dont la corticosurr6nale a une capacit6 de synth6se endog6ne du cholest6rol limitde, la glande accumule une quantit6 importante de cholestdrol est6rifi6 et de triglyc6rides dans de nombreux liposomes. Les mitochondries et le raticulum endoplasmique sont moins abondants que dans les cellules corticosurranaliennes synthEtisant une grande partie du cholesterol. Les crates mitochondriales sont aussi bien lamellaires que tubulaires. Ce genre de corticosurrdnales correspond au type I de la classification 6tablie d'apr~s des observations en microscopie optique (34); 2. chez les animaux dont la corticosurranale a une capacit6 de synth6se endogane du cholestaroi 6levEe, les liposomes sont peut fraquents et les quantitEs de cholestErol estErifi6 et de triglycarides sont minimes. Les mitochondries et le rEticulum endoplasmique occupent un volume significativement sup6rieur ~ celui occupE par ces organites dans les cellules corticosurrEnaliennes de la catagorie prEcadente Ces glandes sont du type II dans la classification de Verne et Hebert (34). 3. l'61aboration et la sacrEtion des hormones stEro~diennes ainsi que la saquence des hydroxylations sont indEpendantes des facteurs traitEs dans cet article (quantit6 de liposomes, richesse en cholestarol et en triglycErides); en effet, ~t cet 6gard, le cobaye et le boeuf prEsentent de grandes similitudes, tandis que le rat constitue biochimiquement une classe diffErente par l'absence de la reaction d'hydroxylation en position 17 du cholestarol (28). Enfin, nous ne pouvons expliquer la s~crEtion de staro~des par une disparition rapide des liposomes sous l'effet de I'ACTH (27);/t notre avis, il s'agirait plutot d'une consommation des reserves (essentiellement du cholesterol estErifia) sous l'effet de l'hormone corticotrope. Ce probl~me devrait &re revu dans des conditions optimales de praservation morphologique des liposomes ainsi que des analyses chimiques des fractions subcellulaires isolEes dans les mames conditions expErimentales.
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SUMMARY The intracellular volume occupied by the liposomes, the mitochondria, and the endoplasmic reticulum has been determined in the zona fasciculata of guinea pig, rat, and beef adrenal cortex, by stereological analysis. These results were compared with the determined quantities of free and esterified cholesterol, triglycerides, and phospholipids in isolated adrenal cortex and with the capacity of cholesterol synthesis in the adrenal cortex of the three species studied. We conclude from these results that in the fasciculata cells of adrenals where the endogeneous synthesis of cholesterol remains small (guinea pig, rat), one finds a great number of liposomes which contain large amounts of esterified cholesterol and triglycerides. In contrast there are few liposomes in the adrenal glands which have an important endogeneous synthesis of cholesterol; the quantities of esterified cholesterol and triglycerides are very low. The quantities of free cholesterol and phospholipids are similar in the three species. Les auteurs remercient Mme M. Franck-Simonet et Mr J. Rummens pour la pr6paration des coupes fines, ainsi que Mr J. Verheyden pour le travail photographique.
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