Der Alkaloidgehalt und der Alkaloidtyp auxotropher UV-Mutanten des Mutterkorns (Claviceps purpurea [FR.] TUL.) bei parasitischer Kultur auf Roggen

Flora, Abt. A, Bd. 157, S. 517-523 (1967) Forschungsinstitut fiir Natur-Arzneimittel, Prag

Der Alkaloidgehalt und der Alkaloidtyp auxotropher UV-Mutanten des Mutterkorns (Claviceps purpurea [FR.] TUL.) hei parasitischer Kultur auf Roggen Von KARIN STRNADOVJ.. (Eingegangen am 23. August 1966)

Durch UV-Bestrahlung induzierte auxotrophe Mutanten des Mutterkorns [Claviceps purpurea (FR.) TuL.] wurden unmittelbar aus der Suspension der behandelten Konidien in saprophytische Kulturen isoliert (STRNADOVJ.. 1964a, 1964 b). Bei der weiteren Untersuchung der biologischen Eigenschaften der Aminosaure-abhangigen Mutanten wurde deshalb einerseits ihre Fahigkeit zu parasitischem Wachstum auf Roggen verfolgt, andererseits die Produktion von Alkaloiden bei der parasitischen Kultur. Die Ergebnisse dieses Arbeitsabschnittes sind Gegenstand der folgenden Mitteilung. Material und Methoden Eine Aufstellung der verfolgten auxotrophen Mutanten des Mutterkorns und die Methoden der Induktion, der Isolierung und des Nachweises einer Mutation sind in den vorangegangenen Mitteilungen enthalten (STRNADOVA 1964a, 1964b). Fiir das Beimpfen des Roggens wurden die Sporen von ungefahr drei Wochen alten, auf komplettem Nahrboden in Reagenzglasern gezogenen Mutantenkulturen verwendet. Je nach der Intensitat der Sporulation der betreffenden Mutanten wurde der Inhalt von 3 bis 5 Reagenzglasern in 2 Liter Wasser durchpassiert. Mit der so entstandenen Suspension wurde unter Benutzung von Impftafelchen oder Injektionsnadeln ein Roggenbestand von 2 m2 Flache kiinstlich beimpft. Der Gesamtalkaloidgehalt der Sklerotien wurde kolorimetrisch ermittelt (HECHT, RuMPEL 1955), der Alkaloidtyp mit Hilfe der Papierchromatographie (MACEK, CERNY, SEMONSKY 1954) und der Diinnschichtchromatographie (PROCHAZKA, KAvKA, PRUCHA, PITRA 1966).

Ergebnisse und Diskussion

Das parasitische Wachstum auf Roggen: Im Hinblick auf die friiher festgestellte Abhangigkeit der Keimung, des Wachstums und der Sporulation auxotropher Mutanten des Mutterkorns von dem Vorhandensein unentbehrlicher Stoffe im Nahrsubstrat (STRNADOVJ.. 1966) wurde auch bei der Verfolgung des parasitischen Wachstums der Aminosaure-abhangigen Auxotrophen das freie Vorkommen der erforderlichen Aminosamen in der Wirtspflanze beachtet. Durch chromatographische

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KARl;\; STRNADOYA

Analysen (HoLTZ, MtLLER 1925, KAWATANI, KATAYANAGI, KIYOOKA 1951, GROGER, MoTHES 1956) und mikrobiologische Teste (REBER, McVICAR 1953) konnten in Extrakten aus Roggenpflanzen von den insgesamt fiir die untersuchten Mutterkornmutanten erforderlichen Aminosauren in freier Form Leucin, Glycin, Serin, Methionin und Lysin festgestellt werden. Cystin und Cystein wurden in den Wirtspflanzen nicht gefunden. Die Ergebnisse der parasitischen Kultur beweisen, daB die Entwicklung der einzelnen Mutantentypen nicht unbedingt an die Anwesenheit der geforderten Aminosauren in der Roggenpflanze gebunden ist. Auf Roggen gediehen Mutanten mit alternativer Abhangigkeit von Cystin, Cystein oder Methionin, mit einer Abhangigkeit nur von Methionin und nur von Lysin, und auch Mutanten, die fur ihr Wachstum Arginin verlangen. Dagegen wuchsen die von Leucin, Glycin und Serin abhangigen Mutanten auf Roggen nicht einmal nach unmittelbarer Infektion der Bliiten mit Hilfe der Injektionsnadel an. Das AusmaB der Infektion und die ihr entsprechenden Parzellenertrage waren bei den einzelnen Mutanten wahrscheinlich in hohem MaBe durch die Intensitat ihrer Sporulation bedingt. Die stark sporulierenden, von schwefelhaltigen Aminosauren abhangigen Mutanten kamen an Infektionsintensitat dem zur Kontrolle verwendeten prototrophen Mutterkornstamm gleich. Bei den Arginin-abhangigen, sehr schwach sporulierenden Mutanten wurde der Roggen nur sehr gering infiziert. Die so entstandenen Sklerotien unterschieden sich in ihren morphologischen Eigenschaften, in Form und Far be, nicht von den en des prototrophen Stammes. Vor der Untersuchung des Alkaloidgehaltes der einzelnen Sklerotien wurde die W ahrung des auxotrophen Charakters durch das Abimpfen eines Teiles von ihnen auf komplette Agarnahrbiiden und die Priifung der daraus gebildeten Kulturen festgestellt. Bei den von schwefelhaltigen Aminosauren abhangigen Mutanten blieb der auxotrophe Charakter und der Typ der Abhangigkeit im Ver!auf der parasitischen Kultur auf Roggen bis auf vereinzelte Ausnahmen erhalten. Die Lysin- und vor allem Arginin-abhangigen Mutanten wiesen eine starke Neigung zur Reversion auf: Der urspriinglich auxotrophe Charakter der zur Infektion des Roggens verwendeten Kulturen blieb nur in AusnahmeHillen erhalten. Der Alkaloidgehalt der Sklerotien: Von schwefelhaltigen Aminosauren und von Lysin abhangige Mutanten wiesen einen Gesamtalkoloidgehalt auf, der nicht bemerkenswert von dem des parallel untersuchten prototrophen Stammes abwich. Die Revertanten dieser Mutanten, welche erst im Verlaufe des parasitischen Wachstums auf Roggen entstanden, hatten ungefahr den gleichen Alkaloidgehalt wie die auxotrophen Mutanten. Bei wiederholten Passagen tiber Roggen in den folgenden Jahren veranderte sich der Alkaloidgehalt nicht (Tabelle 1). Die Sklerotien der Mutanten mit Argininabhangigkeit, welche im Verlaufe der parasitischen Kultur den auxotrophen Charakter bewahrten, hatten einen wesentlich geringeren Gesamtalkaloidgehalt als der prototrophe Kontrollstamm. Die Revertan-

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ten dieser Mutanten- ob sie nun schon im Verlauf der ersten, oder erst wahrend der zweiten Passage tiber Roggen entstanden - hatten dagegen in vielen Fallen einen bedeutend hoheren Gesamtalkaloidgehalt als der Kontrollstamm (Tabellen 2, 3). Bei manchen Sklerotien dieser Revertanten wurde ein Gesamtalkaloidgehalt von mehr als 1% festgestellt. Das ist ein beim Mutterkorn tiberraschend hoher Wert.

Tabelle 1: Der Gesamtalkaloidgehalt der Sklerotien von Mutterkornmutanten mit Abhangigkeit von schwefelhaltigen Aminosauren und von Lysin und der Gesamtalkaloidgehalt der Sklerotien von Revertanten, welche im Verlaufe der parasitischen Kultur dieser Mutanten auf Roggen entstanden (r = Reversion). Kult.Nr.

36 163 234 288 344 338 426 490 562 589 !)08 (),')2 1}75 712 753 786 954

Anspruch

Cystin Cystein }[ethionin

~)83

364 281 459 G09 (j21 707 784

J[ethionin

1963

1964

1. Passage

2. Passage

1. Passage (Wiederholung)

0,420 0,300 0,290 r 0,200 0,230 0,210 r 0,330 0,241 0,300 0,232 r 0,305 0,280 0,280 0,320 0,260 0,310 0,440 0,360 r

0,366 0,122

0,415 0,270 0,165 0,300 0,155

0,320

0,267

0,190 r 0,100 r 0,160 0,190

0,468 0,225

7G8 778

Lysin

0,215 r 0,300

PLA/4

Kontrolle

0,120-0,360

36

Flora, Abt. A, Bd. 157

0,232 0,200 0,267 0,298 0,291 0,205 0,322 0,245 0,305 0,274 0,368

0,195 0,205 r 0,180 0,210 0,390 0,245 0,460 0,255 0,315 0,225

0,210 0,246 0,285 0,250 0,136 0,182 0,279

0,129-0,376

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KARIN STRNADOVA

Tabelle 2: Ergebnisse der Auxotrophieteste und der Bestimmung des Gesamtalkaloidgehaltes bei Sklerotien von Mutanten mit urspriinglicher Argininabhangigkeit

1. Passage (1964)

2. Passage (1965)

Kult.Nr.

Anspruch

Gesamtalkaloidgehalt% 1 Sklerotium

Anspruch

Gesamtalkaloidgehalt% 10 Sklerotien, Durchschnittswerte

588 a b c 736 a b c d e

Reversion Reversion Reversion

0,495 0,426 0,440 0,886 1,205 1,238 1,859 0,148 0,921 0,859 0,029 0,667 0,866 0,727 0,130

Reversion Reversion Reversion Reversion Reversion Reversion Reversion Reversion Reversion Reversion Reversion Reversion Reversion Reversion

0,662 0,468 0,429 0,695 0,594 0,784 0,588 0,516 0,554 0,667 0,706 0,698 0,535 0,642

0,500 0,765 0,410 0,081 0,070

Reversion Reversion Reversion Reversion Reversion

0,901 0,852 0,649 0,707 0,808

Reversion

0,602

g h 755 a b c

d

Reversion Reversion Reversion Reversion Arginin Reversion Reversion Arginin Reversion Reversion Reversion Arginin Reversion Reversion

777 a b 943 a b c

Reversion Arginin Arginin

984

Reversion

Tabelle 3. Der Gesamtalkaloidgehalt von zehn stichprobenweise ausgewahlten RevertantenSklerotien, welche bei der 1. Passage der Mutanten mit Argininabhangigkeit auf Roggen entstanden SklerotiumNr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Gesamtalkaloidgehalt % 588

736

755

777

943

984

0,62 0,57 0,68 0,90 0,80 0,66 1,01 0,94 0,93 0,62

0,28 0,60 0,45 0,44 0,84 0,66 0,52 0,40 0,42 0,28

0,67 0,70 0,82 1,06 0,60 0,59 0,90 0,60 0,94 0,78

0,74 0,94 0,96 0,78 1,12 0,78 1,06 0,98 0,86 1,02

0,82 0,70 0,84 0,90 0,82 0,74 0,84 0,63 0,63 0,90

0,86 0,86 0,56 0,48 0,70 0,44 0,60 0,82 0,78 0,82

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Der Alkaloidtyp: Chromatographische Analysen ergaben, daB die angefiihrten Abweichungen im Gesamtalkaloidgehalt der untersuchten Mutanten von einer wesentlichen Veranderung des Alkaloidspektrums begleitet werden. Mutanten, die fur ihr Wachstum Cystin, Cystein oder Methionin, nur Methionin, oder nur Lysin brauchen, bewahrten den urspriinglichen Ergotamintyp des Mutterkornstammes PLA 4 mit vorwiegendem Ergotamingehalt und Spuren von Ergotoxin. Bei den von Arginin abhangigen Mutanten kames zu einer Umwandlung des urspriinglichen Ergotamintyps in einen Ergotoxintyp. Die diinnschichtchromatographische Alkaloidbestimmung zeigte, daB diese Kulturen nicht einmal Spuren von Ergotamin erzeugen. Aus der Gruppe der Ergotoxinalkaloide war in allen Fallen Ergokryptin stark vorherrschend. Ergokornin und Ergokristin traten nur in Spuren auf. Derselbe Ergotoxintyp wurde sowohl bei auxotrophen Mutanten als auch bei den aus ihnen entstandenen Revertanten festgestellt und blieb auch nach weiteren Passagen tiber Roggen unverandert erhalten. Die ganz wesentliche ErhOhung des Alkaloidgehaltes, die gleichzeitig mit der Reversion auftrat, war also nicht von einer weiteren Abwandlung des Alkaloidspektrums begleitet. Die Tatsache, daB der veranderte Alkaloidtyp, der urspriinglich an den Verlust der Fahigkeit einer Biosynthese des Arginins gebunden war, auch nach Reversion dieser Mutanten zum prototrophen Charakter erhalten blieb, beweist, daB diese Reversion nicht durch eine Riickmutation, sondern durch eine Suppressormutation zustande kam. Bisher gibt es nur sehr wenige Arbeiten, die sich mit Mutanten des Mutterkorns befassen. ABE und Mitarbeiter (ABE, YAMANO, Kozu, KusoMOTO 1950, 1953) erzielten bei Mutterkorn des Agroclavintyps durch Bestrahlung mit Radium und UVStrahlen Mutanten, deren Alkaloidtyp sich weder bei parasitischer noch bei saprophytischer Kultur veranderte. Eine dieser Mutanten, die zum Parasitismus nicht befahigt war, erzeugte in saprophytischen Kulturen viel mehr Agroclavin als der Ausgangsstamm. GROGER (1956, 1957) verwendete zur Infektion des Roggens Monokonidienkulturen, die von Konidien abstammten, welche UV-Strahlen und Rontgenstrahlen ausgesetzt worden waren. Sklerotien dieser Kulturen wurden auf ihren Alkaloidgehalt und auf den Alkaloidtyp untersucht. Bei einer von ihnen fand man einen erhohten Alkaloidgehalt. In einigen Fallen kames zu Verschiebungen im Verhaltnis der vorhandenen Alkaloide zueinander: Beim Ausgangsstamm herrschte Ergotamin vor, bei den nach Bestrahlung gewonnenen Kulturen erhohte sich der Ergokryptingehalt, der beim Ausgangsstamm auBerst gering war. TETENYI und MoLNAR (1962) behandelten mit Rontgenstrahlen und 6 °Co Mutterkornsklerotien unmittelbar. Der Gesamtalkaloidgehalt in den Sklerotien der auf vegetativem Wege gewonnenen Nachkommen war entweder der gleiche wie beim Kontrollstamm, hoher oder auch niedriger als dort. Gleichzeitig wurden auch Veranderungen im Alkaloidtyp festgestellt. Da aber die Moglichkeit einer Entstehung von Sklerotien durch Infektion des Fruchtknotens mit mehr als einer Konidie unberiicksichtigt blieb, ist es nicht aus36*

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KARIN STRNADOVA

geschlossen, daB die Autoren mit Mischsklerotien arbeiteten, was nicht ohne EinfluB auf die erzielten Ergebnisse bleiben konnte. - In allen angefiihrten Arbeiten fehlt die Charakterisierung der Mutanten. Abweichend von den Ergebnissen GROGERS muB die Veranderung in der Zusammensetzung des Alkaloidspektrums, welche bei auxotrophen Mutanten des Mutterkorns festgestellt wurde, als qualitative Umwandlung des Alkaloidtyps betrachtet werden, und zwar deshalb, wei! bei diesen Mutanten vorwiegend Ergokryptin ohne Spur von Ergotamin vorgefunden wurde. Dagegen besaB der prototrophe Ausgangsstamm nur Ergotamin, neben dem nur Spuren von Ergokornin und Ergokristin auftraten. Die vorliegende Arbeit mit auxotrophen Mutterkornmutanten, welche nicht nur beziiglich ihrer Abstammung definiert, sondern auch naher charakterisiert wurden, zeigt, daB die festgestellte Umwandlung des Alkaloidtyps an cine bestimmte Mutation gebnnden ist, im gegebenen Faile an die Verlustmutation mit Argininabhiingigkeit. Zusammenfassung Bei auxotrophen Mutanten des Mutterkorns, die von verschiedenen Aminosiiuren abhiingig waren, wurde einerseits die Fahigkeit, auf Roggen zu parasitieren, andererseits die Produktion von Alkaloiden bei parasitischer Kultur verfolgt. Die Fiihigkeit zum Wachstum auf Roggen blieb bei Mutanten mit alternativer Abhiingigkeit von Cystin, Cystein oder Methionin, nur von Methionin, von Lysin und von Arginin erhalten. Die von Leucin, Glycin und Serin abhiingigen Mutanten wuchsen auf Roggen nicht. Der auxotrophe Charakter blieb im Laufe der parasitischen Kultur bei Mutanten mit Abhiingigkeit von schwefelhaltigen Aminosiiuren bis auf einige Ausnahmen erhalten. Die Lysin- und insbesondere Arginin-abhiingigen Mutanten zeigten eine starke Neigung zur Reversion. Die von schwefelhaltigen Aminosiiuren und von Lysin abhiingigen Mutanten besaBen mehr oder weniger den gleichen Gesamtalkaloidgehalt wie der als Kontrolle verwendete prototrophe Mutterkornstamm. Die Mutanten mit Argininabhiingigkeit hatten einen bedeutend geringeren Alkaloidgehalt als der Kontrollstamm, wiihrend die aus ihnen in parasitischer Kultur entstandenen Revertanten im Gegensatz dazu einen gegeniiber der Kontrolle bedeutend erhiihten Gesamtalkaloidgehalt aufwiesen. Das Alkaloidspektrum der von schwefelhaltigen Aminosiiuren und von Lysin abhiingigen Mutanten glich dem des urspriinglichen Ergotaminstammes. Bei den Mutanten mit Argininabhiingigkeit trat durch die Mutation eine Umwandlung im Alkaloidtyp ein: Der urspriingliche Ergotamintyp verwandelte sich in einen Ergotoxintyp, bei dem Ergokryptin vorherrschte. Das neue Alkaloidspektrum wurde nicht nur bei den Auxotrophen mit niedrigem Alkaloidgehalt, sondern auch bei den Revertanten dieser Mutanten, die einen erhiihten Alkaloidgehalt besaBen, festgestellt.

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Literatur ABE, M., YAMANO, T., Kozu, Y., KusuMOTo, M., 1950. Researches on Ergot Fungus. Part 19. Correlation of Sclerotinizability and Alkaloid-Productivity of Ergot Fungus with its Parasitic Capacity. Journ. Agr. Chern. Soc. Japan 24, 471-476. - - - - 1953. Researches on Ergot Fungus. Part 20. Isolation of a Mutant productive of Agroclavine rather excellently in Submerged Culture. J ourn. Agr. Chern. Soc. Japan 27, 18-23. GROGER, D., 1956. Qualitatsziichtung am Mutterkorn. Die Kulturpflanze 4, 226-238. - 1957. Zur Ziichtung des Mutterkorns. Abhandlungen der Dtsch. Akad. der Wissenschaften zu Berlin, 243-249. - MoTHES, U., 1956. Uber das Vorkommen von Aminosauren und Aminen im Mutterkorn. Die Pharmazie 11, 323-331. HECHT, M., RuMPEL, W., 1955. Ergebnisse der Bestimmungen von wasserliislichen und wasserunliislichen Alkaloiden in Einzelsklerotien von Kulturstammen von Claviceps purpurea (Fr.) Tul. Scientia Pharmaceutica 23, 273-278. HoLTz, F., MuLLER, H., 1925. Arch. exp. Pathol. Pharmakol. 106, 27. (Ref. GRtiGER, MoTHES 1956.) KAWATANI, T., KATAYANAGI, M., KIYOCKA, S., 1951. Free Amino Acids and Amines of Ergot II. Journ. Pharm. Soc. Japan 71, 389. MACEK, K., CERNY, A., SEMONSKY, M., 1954. Mutterkornalkaloide, I. Die Pharmazie 9, 388-399. PROCHAZKA, V., KAVKA, F., PRUCHA, M., PITRA, J., 1966. Kvalitativni a kvantitativni stanoveni alkaloidu z namele ergotoxinoveho kmene. Csl. farmacie 16, im Druck. REBER, E., McVICAR, R., 1953. The Nitrogen Composition of Cereal Grasses. III. Amino Acid Distribution in Field Clipings and growing Plants. Agronomy Journ. 46, 17-21. STRNADovA., K., 1964a. Methoden zur Isolierung und Ermittlung auxotropher Mutanten bei Claviceps purpurea (FR.) TuL. Zeitschrift fiir Pflanzenziichtung 61, 167-171. - 1964b. UV-Mutanten bei Claviceps purpurea (FR.) TUL. Planta Medica 12, 521-527. - 1966. Auxotrofni mutanty namele. Vorbereitetes Manuskript der Dissertation. TE:TENYI, P., MoLNAR, G., 1962. A gammasuganas hatasa az anyarozs (Claviceps purpurea Tul.) gombara. Herba Hungarica 1, 211-220. Fiir die Durchfiihrung der Analysen spreche ich Frau EvA KLEINEROVA meinen aufrichtigen Dank aus. Anschrift der Verfasserin: KARIN STRNADOVA, Forschungsinstitut fiir Natur-Arzneimittel, U Elektry 8, Prag 9 (CSSR).