Der austausch und die abspaltung des γ-phosphates des adenosin-triphosphates durch sarkosomen und kleine grana des kaninchen-muskels

BIOGHIMICA ET BIOPHYSICAACTA

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D E R A U S T A U S C H U N D D I E A B S P A L T U N G DES y - P H O S P H A T E S D E S A D E N O S I N - T R I P H O S P H A T E S D U R C H SARKOSOMEN U N D K L E I N E G R A N A DES K A N I N C H E N - I ~ U S K E L S M. ULBRECHT

Institut [iir Physiologie im Max-Planck-[nstitut /i~r medizinischeForschung, Heidelberg (Deutschland) (Eingegangenam x9. Juli, t961)

SUMMARY

The exchange and the splitting of the y-phosphate of adenosine triphosphate by samosomes and small granules of rabbit muscle I. The rate of ATP-splitting in the sarcosomes and small granules of rabbit muscle is compared with that in the granules of other tissues. 2. Neither iv.,the small granules nor in the sarcosomes does a phosphate exchange between ATP and inorganic phosphate take place. In the presence of Mgz+, however, in both kinds of granules the phosphate exchange between ATP and ADP is 12 times as rapid as in the granules of other tissues. Without Mg'+ the rate of exchange is , still considerably higher than the maximum speed in other tissues. Only in the presence of Ca 2+ does the rate of exchange drop to the values similar to those known solar. 3- The exchange rate in sarcosomes is quantitatively identical with the exchange rate in the small granules of rabbit muscle under all conditions of activation, inhibition, and poisoning. 4. Neither in the sarcosomes nor in the small granules is a latent ATPase revealed by dinitrophenol. On the other hand, the ATPase activity of the sarcosomes and small granules increases by aging and heating. 5- In the presence of Mg2+ the ATPase activity of sarcosomes is 2.5 times as great as the ATPase a~tivity of the small gaanules. In the absence of Mg2+ and in the presence of Ca2. the ATPase activity of both kinds of granules is identical. 6. Both kinds of granules split ATP optimally and exchange phosphate optimally at pH 7-7- Exchange and splitting are more rapid at an ionic strength of 0.4 tz than at an ionic strength of o.z t*. 7" With rising concentration of free Mg2+ the ATPase activity and the phosphate exchange increase steeply. In an excess of Mg2+, however, the ATPase activity decreases, while the phosphate exchange does not decrease. 8. With Ca 2+ the ATPase is less activated than with Mg2+. The activation is preserved in an excess of Ca2+. On the other hand, the phosphate exchange continuously decreases with rising Ca"+ concentration up to the highest investigated values (IO-I M). In Ca2+-Mg2+ mixtures exchange and splitting are determined chiefly by the Ca2+ ions. Only when the Mg2+ proportion is very high, the influence of Mgz+ prevails. Hence, there is no summation of Ca~-+and Mg2+ activities.

1%ochim. Biophys. A.cta, 57 (I962) 455-474

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M. ULBRECHT

9. Phosphate exchange and ATP splitting increase with rising ATP concentration and decrease when ATP is present in excess. With a rising concentration of ADP, however, the phosphate exchange diminishes approximately linearly; the ATP splitting decreases only at the beginning, but remains constant if the A D P level is raised further. xo. By poisoning with salyrgan two different exchange mechanisms that are sensitive to salyrgan can be differentiated from at least one mechanism insensitive to salyrgan. Furthermore an exchange mechanism sensitive to oxarsan is found in addition to a second mechanism which can even be activivated by oxarsan. II. Similarly, the activity of the ATPase of the granules is partly sensitive, partly insensitive to poisons. The proportion of the sensitive to the insensitive part is quite different for salyrgan, oxarsan, protamin and ADP. From this fact it is deduced that several ATPases are involved in the total activity. With certainty more than two ATPases are involved. In addition to these ATPases there is also an ATPase, present in the small granules, that catalyses the ehergy-yielding "extrasplitting" during the activity of the Ca 2+ pump. IZ. There appears to be no general relation between the total activity of the ATP splitting and the total phosphate exchange. On the other hand, it is possible that some of the ATPases involved are connected with some of the exchange mechanisrns involved by an intermediate enzyme phosphorylation.

EINLEITUNG Die Frage, wie die ATP-Spaltung mit dem P-Austausch zwischen ADP und ATP in den kontraktilen Proteinen des Muskels verkniipft ist, (vergl. ULBRECHT1) machte es notwendig, auch die Verkniipfung dieser beiden Aktivitiiten in den Grana des Skelettmuskels systematisch zu untersuchen. Die Ergebnisse dieser Arbeit beruhen also nicht eigentlich auf Fragestellungen der Grana-Chemie. Die Ergebnisse m6gen f~ir zukiinftige Untersuchungen fiber diese Frage aber nfitzlich sein. Denn die Erg-.bnisse geben Auskunft fiber die drei Hauptreaktionen der ATPumsetzenden Enzyme in Muskel-Mitochondrien (Sarkosomen), ihren Gemischen mit den kleinen Grana des Skelettmuskels t, nd in den isolierten kleinen Grana. Die drei Hauptreaktionen sind (a) die ATP-Spaltung, (b) tier P-Austausch zwischen ATP und ADP und (c) der Austausch zwischen ATP und anorganischem Phosphat. Die Aktivitiit der Reaktionen wird angegeben in ihrer Abh~ingigkeit yon der Ionalitat der Suspensionen, (Mg~+-Konzentration, Ca2+-Konzentration, Proportion beider Erdalkalien in CaZ+-MgZ+-Mischungen, vom pH und einigen Variationen tier Ionenst/irke) ; die Aktivitiit wird ferner angegeben in ihrer Abhiingigkeit yon der Konzentration des ATP und des ADP. Schiesslich wird angegeben, wie die fraglichen Aktivit/iten yon der Konzentratlo,a einer Reihe yon Giften abh~ngen. Es wird beachtet, wie weit die angegebenen Abh~mgigkeiten yon der Art der Prliparation der Grana beeinflusst werden. Solch systematischer Vergleich tier Mitochondrien und kleinen Grana des gleichen Gewebes scheint bisher nicht zu existieren. Die Sarkosomen des SkelettMuskels sind bisher nur auf die Aktivit~it ihrer ATPase (Tabelle I, CHAPPELLUND P~Rn."2, AZZO,':E r~'-'~ CAR:.FOL. '3) und auf die Aktivit~t der oxydativen Restitution Biochim. Biophys. Acta, 57 (1962) 455-474

~'

~.

AKTIVIT~T

UND

DER

o.l" 0.02 *

nicht gemessen

6 Muskel: Ratte3, 4 . Muskel : TaubeZ, 4 . Muskel: T a u b ~ , 5

9. Muskel: K a n i n c h e n (diese Arbeit)

Fvisch

-~ M~..,,

o.6

o.o7 *t

0.33" 0.39 °

o.5

0. 3 o.48"

o.oo.ob*

UND

o.o7

__

o.2' o.o2 *

o.12

0.5 0.03 *

0.3 o.o7"

o,,,.~,,,.,,e.

+ DN P

o.6-o. 7

o,28 t*

0.68" 0. 5 t *

o.56

0.95 0.8 t *

0.3 o. t l *

+ ,v ~"~:~

°'5 --

o.47

o.o 7

bis 0.9

-. . . . . . .-~_

0-04

-,.o •. . . . . . .

.... ---

i,.~..

. . . . . . .4P,crung

o%>,,, ....

.4TPase.Aktivitiit in p M o l p / m i n # n g Eiweiss

..........................

LEBER-

* Die W e r t e v o n AZZONE VND CARAFOLI sind y o n d e n A u t o r e n n i c h t ~tuf x m g Mitochondrien-Eiweiss bezogen. Die A u t o r e n finden a b e r die gleichen A k t i v i t l i t s - P r o p o r t i o n e n zwischen frischen L e b e r - M i t o c h o n d r i e n u n t e r D N P , ohne Mg'~+ u n d m i t Mgz+. wie SLATER, dessert UmsAtze k o r r e k t auf i m g Eiweiss u m g e r e c h n e t werden k 6 n n e n . U n t e r d e r A n n a h m e , d a s s n i c h t n u r die relativen sondern a u c h die absoluten Umsi~tze d u r c h LeberMitochondrien yon SLATER einerseits u n d AZZONE UND CARAFOLI ~ndererseits fibereinstimmen, sind d a n n die ~elativen A n g a b e n d e r italienischen A u t o r e n Ifir die iibrigen yon ihnen u n t e r s u c h t e n M i t o c h o n d r i e n - A r t e n d u r c h Vergleich mit den Angaben fiir L e b e r - M i t o c h o n d r i e n in/*Mol P/,nin/mg Eiweiss u m g e r e c h n e t . ** Nach d e m gleichen Prinzip sind die A n g a b e n yon CHAPPELL UND PERRY fiir die ATPase-Aktivit~.t des T a u b e n - B r u s t m u s k e l s b e r e c h n e t : diese A u t ~ r e n h a b e n in e i n e r ersten Arbeit o . 2 8 / t M o l P / m i n / m g Eiweiss in Anwesenheit und Abweqenheit yon D N P a n g e g e b e n . I n der 2. Arbei~ init verbesserter E x t r a k t i o n s - L 6 s u n g finden sie, dass die Aktivit~.t d e r A T P a s e u n t e r D N P yon der Qualitiit d e r E x t r a k t i o n ~ - L O s u n g nicht abhitngt, dass a b e r die Aktivitiit o h n e D N P mit s t e i g e n d e r Qualit~tt d e r E x t r a k t i o n s - L O s u n ~ bis auf x/4 des D N P - W e r t e s a b n i m m t . Infolgedessen ist in der Tabelle die Aktivit~it u n t e r D N P aus der ersteit A r b e i t e n t n o m m e n u n d die A k t i v i t a t ohne D N P zu 25 % dieses XVertes a n g e s e t z t .

o.o 7

_.

o.o3

Nicht gemessen

G r 6 s s e r als bei L e b e r - a n d tterz-Mitochondrien

5. U t e r u s : Rattee, 7

0.05 0.03 *

G r 6 s s e r als bei l.eber-Mitochondrien

3. H e r z : R a t t e 3,4,tz,it 4. H e r z : Taube~, 4

o,,,,...,,e.

T e m p e r a t u r ,°o°, p H 7.0

IIERKUNFT

PHOSPHORYLIF~RUNG VON

VERSCHIEDENER

o.oz o.o 7"

caT,.-,,.1~,,j

O.rydative Phospho'vJ/lierung

I

OXYDATIVEN

TABELLE

MUSKEL-MITOCI-IONDRIEN

ATI*ASE

Erhalten Erhalten

DER

L L e b e r : Rattc~-5, t3-2° 2. L e b e r : TaubeS, a

VERGLEICH

./~

~"

~_q

=.~

.~

~n -q

.~

TABELLE

11

0.03 o.o4

0.o7 o.o6

0-35 0.35

ATPa~ : Uterus der Ratte:nd I. S a r k o s o m e n 2. K l e i n e G r a n a

S k e l e t t - M u s k e l K a n i n c h e n (dlese Arbeit) 3. S a r k o s o m e n 4- K l e i n e G r a n a

P h o s p h a t - A u s t a u s c h zwischen A T P u n d AD3~P Skelett-Muskel K a n i n c h e n (diese Arbeit) 5. S a r k o s o m e n 6. K l e i n e G r a n a

Ohnt MgZ+ 1

Fris~h

+ DNP

2.6 2.5

0.07 0.06

2.6

~2.5

N

0.6-0.7 o.25-o.3

l,I

o.6 0.25

o.56

o. 1 a

0.0 4

+ Mg 2~ IV

1.0 4

Ohne Mg t+ Ill

0.5

11

+ Mg'-+

--

--

~ 0.07 o.o6

0.03 .

Ohne Mg t+ V

.

2.6

~2.5

N

bis 0.9 bis 0.4

0.5

VI

.

+ Mg-'*

AItemng

J

}

Mischung

Mischung

o.o3 .

0.5

+ M g *+ VIII

8o % yon I I

2 o o % y o n II

Eewarmung Ohne M g s+ VII

Aktivitia vm~ ATPa.~e und Phosphal-Austausch in idffol P/rain/rag Eiweiss

T e m p e r a t u r 20 °, p H 7.0

VERGLEICH DER ATPASE- UND PHOSPHAT-AUSTAUSCH-AKTIVIT~,T Vt3N SARKOSOMEN UNO KLEINEN MUSKEL-GRANA VERSCHIEDENER HERKUNFT •

P-AUSTAUSCH UND ATPASE VON SARKOSOMEN UND GRANA

~59

des ATP (Tabelle I, AZZ0NE UND CARAFOLI4,.CHAPPELL UND PE_.nRY5) untersucht. Die ATP-Spaltung (aber nicht der Phosphat-Austausch) durch Sarkosomen einerseits und kleine Grana andererseits ist bisher durch WA-KID trNO NEEDHAM (Tabelle I) nur fiir den Uterus vergleichend untersuchtS, 7. ERGEBNISSE UND DISKUSSION Yergleich der Aktivitiit der ATP-umsazenden Reaktionen der Sarkosomen nnd kleinen Grana miteinander und mit den Grana anderer Herkunfl Es ist durch AZZONE UNI) CARAFOL# gezeigt, dass die Sarkosomen des SkelettMuskels eine ungew6hnlich hohe Aktivit~it der oxydativen Restitution des ATP besitzen. Ffir die kleinen Grana des quergestreiften Muskels steht fest8-11, dass sie durch die ATP-induzierte Prod-aktion des Erschlaffungsfaktors und durch ihre F~ihig keit, den Caa+-Spiegel im Muskel durch eine ATP-getriebene Calcium-Pumpe zu beeinflnssen12, die entscheidende Rolle bei der Regulierung yon Kontraktion und Erschlaffung spielen. Wie weit unter den kleineu Grana auch Microsomen der iiblichen Funktionen vorhanden sind, ist noch nicht festgestellt. Trotz dieser funktioneHen Unterschiede zwischen Sarkosomen und kleinen Grana ist die Aktivit~it des Phosphat-Austausches beider Grana-Arten (bezogen auf I mg Grana-Protein) unter allen untersuchten Bedingungen dieser Arbeit quantitativ gleich (Tabelle II, Zeile 5 und 6 und Fig. 3a und b, Fig. 4, Fig. 7). Auch die ATPase-Aktivit~it in Abwesenheit yon Mg2+ und in Anwesenheit yon Ca 2+ ist fiir Sarkosomen und kleine Grana gleich gross (Tabelle II, Reihe 3 und 4, Fig. 3a und b). Ein Unterschied zwischen den ATPase-Aktivit~iten der beiden Grana-Arten besteht nur im Umfang der Aktivierbarkeit durch Mg2+. Die Spaltungs-Geschwindigkeit durch die maximal Mg2+-aktivierte ATPase der Sarkosomen ist in Abwesenheit yon Giften unter allen Umst~inden etwa 2. 5 mal so gross wie die Spaltungs-Geschwindigkeit durch Mg2+-aktivierte kleine Grana (Tabelie II, Reihe 3 und 4, Fig. 3a, 4 und 7), solange keine Substanzen zugegen sind, die besondere funktionelle Leistungen der Grana hervorrufen. Die ATPase-Aktivit~it der Mg2+-aktivierten Sarkosomen wird ausserdem durch gewisse Gifte anders und stiirker beeinflusst als die ATPase-Aktivit~it der kleinen Grana (vergl. Fig. 7). ' Est ist in dieser Arbeit nicht gelungen, durch DNP Zusatz eine "latente" ATPase weder der Sarkosomen noch der kleinen Grana manifest zu machen--unabh~ingig davon, ob Mgz+, Ca .'+ oder gar kein Erdalkali zugesetzt ist (Tabelle II, Reihe 3 und 4, Columne I-IV). Dagegen erhSht sich ausschliesslich nach Mg2+-Zusatz die ATPaseAktivitiit durch "Alterung" fiber 3-4 Tage auf 15o % (Tabelle II, Reihe 3 und 4. vergl. Columne I I m i t VI) und durch zweistiindige Erw~irmung auf 4 °0 (Tabelle !I, Reihe 3 und 4, Columne VIH), sowie durch I5-stfindige Vorbehand!ung der Grana mit o.6 M KC1-L/Ssung auf das Doppelte. Diese Befunde ergeben sich sowohl nach Isolierung der Sarkosomen und kleinen Grana in o.I M KC1, in PERRY-I,6sung5 (O.I M KC1, o,oo5 M MgCI~, o.ooi M ATP, o.ooi M EDTA, 0.05 M Tris-Puffer) wie auch in 0.25 M Rohrzucker-Lfsung. Extraktion und Isolierung in den angegebenen Salz-L6sungen ergeben aus z g Muskel ~ 7 mg Protein der Sarkosomen und ~ 14 mg Protein der kleinen Grana; in o.z5 M Rohrzucker-LSsung ist die Ausbeute betr~ichtlich geringer. Die Sarkosomen yon Ratten-Herz und die Mitochondden -con Ratten-Leber Biochim. Biopkys. Acta, 57 (1962) 455-474

46o

bl. ULBRECHT

unterscheiden sich von den Sarkosomen dieser Arbeit in folgenden Punkten: (a) In den Ratten-Mitochondrien wird "latente" ATPase nicht nut durch Alterung sondern auch durch DNP manifest (Tabelle I, Reihe I und 3). (b) Auf beiden Wegen ergibt sich der gleiche Betrag an "latenter" ATPase, w~ihrend in Kaninchen-Sarkosomen ein "latente" ATPase ausschliesslich durch Alterung in Erscheinung tritt (Tabelle I, vergl. Reihe I u n d 3 mit Reihe 9). (c) Der Anteil der "latenten" ATPase an der Gesamt-ATPase-Ak.tivit~it ist in den Mitochondrien yon Ratten-Herz und Ratten-Leber viel gr6sser als der Anteil, der sich fi!r Kaninchen-Sarkosomen aus der Aktivierung durch Alterung ergibt (Tabelle I, Reihe I, Eolumne I I und VI, Reihe 9, Columne .~I und VI). Die Sarkosomen von Herz- und Skelett-Muskel der Taube zeigen ebenso wie ' die Sarkosomen dieser Arbeit keine "latente" ATPase, falls der Suspension kein Mg2+ zugesetzt ist (Tabelle I, vergl. Reihe 4 und 7 mit Reihe 9). Unter Mg2+ wird dagegen durch DNP die ATPase-Aktixft~it der Tauben-Sarkosomen deutlich erh6ht (Tabelle I, vergl. Reihe 4 und 7 mit Reihe 9). In den Sarkosomen des Skelett-Muskels der Ratte wird die ATP-Hydrolyse durch DNP nicht nur unter Mg2+ sondern auch in ErdalkaliAbweseuheit erh6ht (Tabelle I, Reihe 6, vergl. Colunme I mit I I I und I I m i t IV). Die ATPase-Aktivit/it von Sarkosomen des Ratten-Uterus ~ r d ebenso wie die ATPase-Aktivit~t der Sarkosomen aus Kaninchen-Muskulatur unter Mg2+ durch DNP nicht erh6ht (Tabelle I, P~eihe 5). Die Uterus-Sarkosomen der Ratte unterscheiden ~ich dagegen yon den Sarkosomen der Kaninchen-Muskulatar dadureh, dass (a) weder in Abwesenheit noch in Anwesenheit yon Mg2+ ein Alterungs-Effekt auftritt (Tabelle I, Reihe 5, vergl. Columne I mit V und I I m i t VI) und (b) dadmch, dass ohne Mg2+-Zusatz die ATP Spaltung durch DNP nicht unerheblich beschleunigt wird (Tabelle I, Reihe 5). Der Vergleich der ATPase-Aktivit/it der verschiedenen Mitochondrien und Sarkosomen zeigt, dass DNP-Zusatz, Alterung (TabeUe I und II) und durch Erw~irmen beschleur~igte Alterung (Tabelle II) zu durchaus verschiedenen Werten der "latenten" ATPase iiihren k6nnen. Die starke oxydative ATP-Restitution und der geringe Anteil der"latenten" ATPase an der Gesamt-ATPase in den Mitoehondrien und Sarkosomen de~ Taube (Tabelle II, Reihe 2, 4 und 7) sprechen iemer dafiir, dass die Menge der "la~enten" ATPase kein sehr verbindliches Urteil fiber die Aktivit~t der oxydativen Phosphorylierung gestattet. Das Fehlen eines DNP-Effektes auf die ATPase-Aktivit~it der Sarkosomen des Kaninchen-Muskels mag hiermit zusamraenh~ngen. Die ATPase.Aktivit~t der kleinen Grana dieser Arbeit kann nut mit der ATPaseAktivit~it der kleinen Grana des Uterus verglichen werden (Tabelle II, Reihe z). Beide Artender kleinen Grana haben ohne Mg'~:+-Zusatzdie gleiche ATPase-Aktivit~it ; beide Artender Grana werden mit I,nd ohne Mg2+ durch DNP nicht aktiviert, aber die kleinen Uterus-Grann werden durch Mg~+ viel st~irker aktiviert als die kleinen Grana des Kaninchen-M-askels (Tabelle II, vergl. Reihe 2 mit 4). Die Aktivit~t des Phosphat-Austausches der Sarkosomen und der kleinen Grana des Ka~finchen-Muskels unterscheidet sich yon der allein bekannten Austansch Aktivit~it der fragmentierten Leber-Mitochondden21-2~: (a) dadurch, dass weder die Sarkosomen noch die kleine Grana des Kaninchen-Muskels Phosphat zwischen ATP und anorganischem Phosphat anstauschen, und (b) dadurch, dass der Phosphat-Austansch zwischen ATP und ADP in den Muskel-Grana ausserovdentlich viel gr6sser ist als in fragmentierten Leber-Mi~ochond.den"-~-2s. Unter big ~+ ist die Austauschrato mit Biochim. Biophys. Acta, 57 (t962) 455-474

P-AUSTAU$CH UND ATPASE VON SARKOSOMEN UND GRAS.rA

"46I

2. 5/zMo1 P/mg Grana-Eiw./min (Tabelle II, Reihe 5 und 6, Columne II) Io-5o real so hoch wie die Austauschrate der Fragmente yon Leber-Mitochondrien. Ohne Mg2+ ist sie mit o.35/LMol P/m'g Grana-Eiweiss/min (Tabelle II, Reihe 5 und 6, Columne I) noch 7 mal so gross wie die LEHNINGER'schenWerte fiir fragrnentierte Mitochondrien23. Infolge ihrer GrSsse ist die Austauschrate aller Kaninchen-Grana auch um ein Vielfadies hSher als deren Spaltungsrate (vergl. Tabelle II, Reihe 5 und 6 mit 3 vnd 4)Nur unter Ca2+ sinkt die Austauschrate auf Werte, die der SpMtungsrate iihnlich sind (vergl. Fig. 3b)" " "Die Hemmung der Austauschrate durch Mg2+-Mangel oder CaZ*-Zusatz stimmt qualitativ fiberein mit den Beobachtungen yon KmLLEYZ*,~5--nicht aber yon LEttNINGER2a an fragmentierten Leber-Mitochondrien. Die vielen Verschiedenheiten in den funktional verwandten Sarkosomen und Mitoehondrien verschiedener Herkunft einerseits und die ausgesprochenen ~hnlichkeiten zwischen den funktional sehr verschiedenen Sarkosomen und kleinen Grana des Kaninchen-Muskel andererseits, !egen folgencten Schluss nahe: Dm ATPaseAktivit~it und die Aktivit/it des Phosphat-Austauaches beruhen in den Sarkosomen, in den Mitoehondrien und in den kleinen Grana auf dem Zusammenwirken mehrerer ATPasen und mehrerer Austausch-blechanismen. Die beteiligten Enzyme k6nnen dann in den Sarkosomen und kleinen Grana im Einzelnen durchaus verschieden sein, ohne dass man es am Gesamat-Umsatz mer!~t; andererseits k6nnen in Sarkosomen und Mitochondrien die gleichen Enzyme in so verschiedener Proportion vorhanden sein, dass der Gesamt-Umsatz verschieden ist. Die detaillierte Analyse der Wirkungs-Bedingungen in den folgenden drei Absehnitten wird zeigen, dass in den granul~iren Elementen des Kaninchen-Muskels auf jeden Fall mehr als eine ATPase und mehr als ein Austausch-Mechanismus vorhanden sind. Die A bhangigkeit

des Phosphat-A

ustausches

and der A T P-Spaltung

yon der Ionalitiit

Bei neutraler Reaktion sind die ATP-Spaltung und der Phosphat-Austausch zwischen ATP und ADP bei einer Ionenstiirke yon 0. 4 t~ gr~3ser als bei einer lonenst~irke yon o.x t~ (Tabelle III). Da dies fiir grosse wie fiir kleine Grana gilt, warden Phosphat-Austausch und ATP-Spaltung immer bei 0. 4 t~ gemessen. Die scharfen pH-Optima sowohl des Phosphat-Austausches wie auch der ATPSpaltung liegen im unfraktionierten Gemisch yon Sarkosomen und kleinen Grana bei pH 7 . 7 , Die Schiirfe der Optima zeigt, dass Austausch und ~TP-Spaltung in SarkoTABELLE II[ A~,HANGIGKEIT DER Mg2+-AKTIVIERTENGRANA-ATPASEUND DES .~Ig2+-AKTIV1ERTEN

PHOSPHAT-AUSTAUSCHESZWISCHENATe UND AD32p VON DER IONENST,~I~KE Temperatur 2o°, Histidin-Puffer 0.02, pH 7.0. lonenstlir~,, in /iMol mg Elw. >: mitt

Sarkosomen Kleine Gran~ Mischung

0.52 6.z x o.-7

o.o8 ll

lonenstdtke = o,4 ,u

in ILMol mg Eiw. × rain

in it:llol mg Eiw. × mia

in ltMol mg Eiw. × rain

~.6

o.63 0.-'5 0.39

-,.6 2.5 z.4

Biochim. Bioph'ys..Jcta,

57 (t962) 455-474

462

M. ULBRECHT

somen und kleinen Grana in gleicher Weise vom pH abh~ngen. Die pH-Abhangigkeit der Spaltung ist gr6sser als die pH-Abhgngigkeit des Phosphat-Austausches (Fig. I). Die Spaltungs-Geschwindigkeit betr~igt am Optimum etwa das 6-fache der SpaltungsGeschwindigkeit bei pH 6; die Austausch-Geschwindigkeit ist dagegen bei pH 7.7 nur 3 mal so ga'oss wie die Austausch-Geschwindigkeit bei pH 6 (Fig. I). tF,U a P

20.

~G

. J s

~

8

9pH

Fig. r. Die Abh~.ngigkeit des Phosph~t-Austausches und der ATP-Spaltung vom pH (uufraktionierte Grana). Kurve L A'IP-Spaltung ohne ADP-Zusatz (5" xo-s M ATP, 5" Io-3 M MgCli); Kurve 2, P-Austauscl. !5" Io-~ M ATP, 5" xo-S M ADP, 6. Io -3 M MgC]2). Tn~-M~.Le'~ns~Lure-Puffer,]onen-

st&rke o.4/,, Temperatur 20°. Die Spaltungs-Geschwindigkeit des ATP hiingt ftir jede ATP-Konzentration in anderer Art -'on der zugesetzten Mg*+-Konzentration ab (Fig. 2). Ffir jede ATPKonzentration ist die Aktivierung maximal, wenn die Molaritiit des zugesetzten Mg + ebenso grossist wie die Molaritiit des zugesetzten ATP. Die Gipfel aller dieser Maxima liegen gleich hoch, wenn die ATP-Konzentration gr6sser ist als I. xo-3 M. Die sehr viel geringere Aktivierung durch Ca~+-Zusatz ist fiir alle ATP-Konzentrationcn maximal, sobald die Konzentration des zugesetzten Ca 2+ 3.I0-3 M fiberschreitet. Dagegen wliehst aer absolute Betrag der maximalen Aktivierung mit der ATP-Konzentration bis die zugesetzte ATP-Konzentration > 4" I 0 ~ M i s t (Fig. z). Diese Verschiedenheit der Ca 2+- und Mg2+-Aktivierung ist kein Argument dafiir, dass zwischen einer Ca .'+- und einer Mg2+-aktivierten ATPase unterschieden werden muss. Denn diese Verschiedenheit beruht zu einem wesentlichen Teil auf dem verschiedenen Umfang der Komplex-Bildung des ATP mit Mg2+ einerseits und Ca ~'+ andererseits. Wenn als Abszisse nicht die zugesetzte Konzentration an Erdalkali benutzt wird, sondern die freie Erdalkali-Konzentration, die sich aus den KomplexKonstante_n des Ca-ATP und des Mg-ATP ergibt -~, so entstehen die Kurve~ der Fig. 2a. In diesen Kurven reduzieren sich die Unterschiede zwischen Ca 2+- und Mg~+Aktivierung auf drei Punkte (a) Die Mg2+-aktivierte Spaltung ffillt im 13berschuss an freiem Mg2+ wieder ab, im Ca2+-~berschuss bleibt die Spaltung dagegen konstant. (b) Der Bedart der Spaltung an freien Erdalkali-Ionen ist bei Mg*+-Aktivierung viel kleiner als bei Ca°-+-Aktivierung. (c) Der ATP Bedarf der Mg2+-aktivierten Spaltung Biochim. Biophys. Acta, 57 (196z) 455-474

P-AUSTAUSCH

UND

ATPAsE

VON

SARKOSOMEN

UND

GRANA

463

Fig. z und 2a. Die Abhgngigkelt der ATP-Spaltung yon der Erdalkali-Konzentration und yon der ATP-Konzentration. Sarkosomen -~ kleine Grana, nicht fraktioniert. Ausgezogene Kurven Nr. I-8, Aktivierung durch Mg~+; gestrichelte Kurven Nr. la-8a, Aktivierung durch Ca ~+. Temperatur zo °, Ionenst~rke o.4 #, Histidin-Puffero.oz M , p H 7.o.

,< - - X , 2 • ~o-3 ~ ! A T P zugesetzt ( K u r v e n 2 u 2~) ; A - - A , 3" l o - = M A T P zugesetzt ( K u r v e n 3 u 3~) ;

V--V, ~O~O~ • --A, V--~', m--m,

4" ~o-~ ~r 5" xo-~ M 6. IO-a M 7" ~o-a M 8- xo-'a M

ATP ATP ATP ATP ATP

zugesetzt zugesetzt zugesetzt zugesetzt zugesetzt

( K u r v e n 4 u 4 a) ; (Kurven 5 u 5a); (Kurven 6 u 6a) ; ( K u r v e n 7 u 7a) ; (Kurven'8 u 8~).

_- .--|- ~-~-'-°a-'Y-~--x~2. . . . . . . . ~/.'-_ . . . . . . . . fd'--.~- . . . . ---~--'------;-.. ~ . . . . . . . . . . . fo-. . . . . . . .

I Fig. -~ Abszisse, Konzentrat!en de~ zugegebenen Erdalkali.

.N,IP

to.s

to.

Io-J

io ~

Fig. ~a. Abszisse, K o n z e n t r a t i o n des freien E r d ~ k a ~ .

Biochim. Biophys. Acta, 57 {z96z) 455-474

464

"M. ULBRECHT

ist geringer als der B e d a r f d e r CaS+-aktivierten Spaltung. Diese Unterschie(le schliessen nicllt aus, dass Ca ~+ u n d Mg ~÷ die gleiche A T P a s e beeinflussen. Der Abfall der Mg~*+-aktivierten S p a l t u n g i m Mg~+-0berschuss b e r u h t m i t Sicherheit im W e s e n t l i c h e n a u f d e m Mg2+-Uberschuss u n d n i c h t darauf, dass die K o n z e n t r a t i o n an freiem A T P d u r c h die M g - A T P - K o m p l e x - B i l d u n g a u f u n t e r o p t i m a l e W e r t e erniedrigt wird, wenn die zugesetzte Mg2+-Konzentration zu h o c h ist. D e n n die gleiche K o n z e n t r a t i o n a n freiem A T P fiihrt zu h o h e r Spaltungs-Gesch':Andigkeit w e n n wenig freies Mg 2+ a n w e s e n d ist u n d zu geringer S p a l t u n g s - G e s c h w i n d i g k e i t ' w e n n viel freies Mg ~+ v o r h a n d e n ist (vergl. Tabelle IV). TABELLE IV D I E H E b I M U N G D E R A T P - . s P A L T U N G D U R C H U B E R O P T I b l A L E K O N Z E N T P A T I O N AN F R E I E M Mg2+ B E I K O N S T A N T E R K O N Z E N T R A T I O N AN F R E I E M ATP

Temperatur 2o °, Ionenst~rke o. 4 #, Hisfidin-Puffer o.o2 ?¢I, pH 7.o. Konzentratima an freiem ,4TP

Kon:entralion an freiem Mg~÷

Spalluingsratc IzMol P mg Eiw. × rain

0.95" ~o~ M o.95" ~o-i .~1 x.x • to -4 M LO" ~o"-4 M

5.~ • ~o-a M 4.~. zo-a AI 3-~" ~o-a 3I .'.x. xo-~ M

o.e7 o.3I 0.34 o.38

I , I " IO - 3 2 ) I

0.44

1 . 0 " IO - 4 2)I

Die K u r v e n der Fig. 33 u n d b zeigen, dass die Geschwindigkeiten des P h o s p h a t A u s t a u s c h e s d u r c h S a r k o s o m e n u n d kleine G r a n a i m m e r gleich sind, unabh~ingig davon, ob der A u s t a u s c h d u r c h Mg 2+ a u s s e r o r d e n t l i c h s t a r k a k t i v i e r t oder d u r c h Ca 2+ g e h e m m t wird. A u c h die Geschwindigkeiten der A T P - S p a l t u n g d u t c h S a r k o s o m e n u n d kieine G r a n a sind gleich sowohl bei Ca~+-Aktivierung wie in A b w e s e n h e i t v o n pMotP

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Fig. 3. Phosphat-Austausch und ATP-Spaltung der Sarkosomen, kleinen Grana und der uniraktionierten Mischung in Abhiingigkeit von tier ErdMkali-Konzentration. ~, Aktivierung durch blg2+, b, Aktivierung durch Ca~+. Erkl~irung der Symbole und Hurven in der Abbildung. Hisfidin-Puffer o.o2 M, pH 7.o, lonenst~irke o. 4/~, Temperatur 2o °. ATP-Spaltungs-Kurven rait .5" xo-3 M ATP. P-Austausch-Kurven mit 5" xo-a M ATP + 5" lo-a M ADP. B i o c h i m . B i o p h y s . Acta.

57 (t962) 455-474

P-AUSTAUSCH UND ATPASE vON SARKOSOMEN UND GRANA

465

Erdalkaii-Zustttzen. Nur unter Mg2+ ist die Geschwindigkeit der ATP-Spaltung durch Sarkosomen etwa 2.5 mal so gross wie die Geschwindigkeit der ATP-Spaltung durch kleine Grana. Doch ist auch hier die Form der Kurve und die Lage des Optimum fiir beide Grana-Arten gleich. Es ist interessant, dass der Austausch einerseits und die Spaltung andererseits v o n d e r Erdalkali-Konzentration in vSllig verschiedener Weise abhtingen. (a) Mit wachsender Konzentration and Ca2+-Ionen wird die Spaltung bis zu 3" it.-'-' M C~t~ gef6rdert, w~ihrend der Austausch gehemmt wird, und ausserdem die Hemmung des Phosphat-Austausches bm zu einer Ko~.zentration des zugesetzten Ca"~+ _->6. zo-ZM welter zunimmt. '~b) Die Aktivierung des Phosphat-Austausches durch Mg24- nimmt im Gegensatz zur Aktivierung der ATP-Spaltung auch im Mg2+-~berschuss nicht wieder ab. u ~ot p

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Fig. 4. Abh~tngigkeityon Phos bhat-Austauschund ATP-Spaltung von der Ca2+-Mg~-+-ProportionKurve [, Phosphat-Austausch gefunden (5" [o-3 M ATP, 5"xo-a M ADP); Kurven za, b, c, ATP-Spaltung (5" [o-a M ATF), Kurve 3, Phosphat-Austausch berechnet als Summe des Mg2+aktivierten (vergl. Fig. 3a) und des CaZ+-aktivierten (vergl. Fig. 3b) Phosphat-AustauschesSymbole in der Abbildung. Histidin-Puffer o.oz 31, pH 7.0, Ionensttirke 0.4 p, Temperatur 2o°~vVennder Phosphat-Austausch und die ATP-Spaltung in Ca¢+-MgZ+-Mischungen untersucht werden (Fig. 4), wird deutlich, dass Ca ~+ und Mg2+ nicht einfach auf zwei verschiedene Enzym-Systeme wirken. Denn in diesem Falle mtissten sich die Ca 2+und Mg2+-Wirkungen auf Austausch und Spaltung arithmetisch addieren. Fig. 4 zeigt, dass sie das nicht tun. Die Abbildung gibt Austausch und Spaltung in einem Ca~+-Mg2+-Mischungs-Diagramm als Funktion der Ca2+-Mg2+-Proportion. Die Gesamt-Konzentration der Erdalkalien ist 6. io -z M, die Proportion der Mischung ist yon reinem Ca2+ bis zu reinem Mg~+ variiert (Fig. 4). Der Vergleich der Kurve I mit Kurve 3 zeigt, dass das Zusammenwirken yon Caz,~ und Mgz+ Geschwindigkeiten des Phosphat-Austausches wie der ATP-Spaltung ergibt, die mit additivem Verhalten vSllig unvereinbar sind. Die Kurven I und 2a-c der Fig. 4 zeigen, dass bis zu einer Mg2+-Ca2+-Mischung grSsser als I: I Austausch und vor allem Spaltung vor~Hegend yon den anwesenden Ca2+-Ionen beherrscht werden; Biochim. Biophys. Acta, 57 (I96Z) 455-474

466

M, ULBRECHT

erst wenn die Mischung etwa zu z/3 aus Mg 3+ besteht, setzt sich der Mg3+-Einfluss deutlich durch. Die beiden Erdalkali-Ionen interferieren also in ihrer Wirk, samkeit s t a t t sich Zil addieren. Sie wirken also offenbar aft dem gleichen System oder den gleichen Systemen.

Die Abhiingigkeit des Phosphat-Austausches und der A TP-Spaltung yon der Konzentration des A T P und des A D P Die Austauschrate der unfraktionierten Grana-Mischung h~ingt unter StandardBodilagungen in iihnlieher Weise yon der Konzentration des zugesetzten A T P ab wie die Spaltungsrate (Fig. 5). Wie die Spaltung h a t aueh tier P-Austauseh sein O p t i m u m , wenn zugesetztes Mg*+ und zugesetztes A T P gleich sind. U n d ebenso wie die Spaltung fallt aueh der Austauseh im ATP-13bersehuss wieder ab (Fig, 5, K u r v e I u n d 2). pNotp

FMotP Min.m~,,£1w.

t.0 ..4. . . . . e....I e--'e"" ?

-e ,;

~;

$ ;o • IO~IH ATP

Fig. 5. Abhtingigkeit von Phosphat-Austausch und ATP-Spaltung von der ATP-Konzentration in Anwesenheit yon 5" Io-3 M ADP. Sarkosomen + kleine Grana, unfraktioniert. Kurve x, ATP-Spaltung; Kurve 2, Phosphat-Austausch; Kurve 3, hypothetische Enzym-Phosphorylierung. 6. IO-3 M MgC1z, Histidin-Puffer 0.02 M, pH 7.0, Ionenstttrke 0. 4 it, Temperatur 20°.

~"°'--o- ....

e- ....

e-- J-e

x to'~N ADP

Fig, 6. Abh~ngigkeit von Phosphat-Austausch und ATP-Spaltm.'g yon tier ADP-Konzentration bei konstanter ATP-Xonzentration yon 5" IO-S M (unfraktionierte Grana). Kurve x, ATP-Spaltung; Kurve 2, Phosphat-Austausch; Kurve 3, hypothetlsche Enzym-Phosphorylierung. 6.10 -s M MgCI2, Histidin-Puffer 0.02 M, pH 7.0, Ionenstttrke o, 4 p, Temperatur 20°.

In Fig. 6 wird die H e m m u n g des Phosphat-Austausches und der ATP-Spaltung unter Standard-Mg2*-Konzentration (6.xo -3 M) und Standard-ATP-Konzentration (5" IO-a M) in Abhttngigkeit yon tier A D P - K o n z e n t r a t i o n verglichen. Die Geschwindigkeit der ATP-Spaltung ist halbiert, sobald die A D P - K o n z e n t r a t i o n 5 . i o - 3 M erreicht, und bleibt dann bis zu einer A D P - K o n z e n t r a t i o n yon xo -3 M konstant. Die Geschwindigkeit des Phosphat-Austausches fiillt dagegen bis lO -3 M A D P gradlinig ab; sie ist erst in lO -3 M ADP-L6sung halbiert. Diese Unterschiede in der A D P H e m m u n g yon Phosphat-Austausch und ATP-Spaltung sind yon grundstttzlicher Bedeutung.

Biockim. Biophys. ,4eta, 57 (I9621 455-474

, P-AUSTAUSCHUND ATPASE VON SARKOSOMEN UND GRANA

467

Der Ein[luss yon Giflen a u f den Phosphat-Austausch u n d die A T P - S p a l t u n g

Versuche mit Giften zeigen sehr klar, dass tats~ichlich sowohl in Sarkosomen wie auch in kleinen Grana mehr als ein Austausch-Mechanismus und mehr ~ s eine ATP-ase vorhandan sind. Ftir die Vergiftung der ATP-umsetzenden Grana-Fermente durch Salyrgan* ist nicht die Konzentration des zugesetzten Salyrgans sondern die Proportion der Salyrgan-Menge zur Menge des anwesendel, Eiweisses massgeblich1. Infolgedessen wird die angegebene Proportion als unabh~ngige Variable der Salyrgan-Versuche verwendet (Fig. 7 und 8). u..M~p Ntn.mg Ei~.

I .~0~

A ustousch •

o.a

0.4

A TP- ase

• Sarkosomen

x ~ x ~teine

Grana

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t.o

~u Mol Sa/,vr~gon/m 9

Eiw

Fig. 7. Salyrgan-Vergiftung des Phosphat-Austttusches uud der ATP-Spaltung yon .qarkosomen und kleinen Grana. Symbo!ein der Abbildung. 6. Io-~ 31 MgClz, Histidin Puffer 0.02 M, pH 7.0, loneust~rke 0.4 It, Temperatur 2o°. P-Austausch in Gegeuwart yon 5" I°-~ M ATP + 5" z°-ZM ADP, ATP-Spaltung in 5" zo-a .'~d ATP. .

Fig. 7 zeigt, dass der Mg*+-aktivierte Phosphat-Austausch der Sarkosomen und der kleinen Grana schon bei einer sehr niedrigen Salywgan-Eiweiss-.-Droportion etwa zur Httlfte vergiftet ist. Durch weitere Erh6hung der Salyrgan-Eiweiss-Proportion steigt die Vergiftung nicht wesentlich weiter an. Also besitzen sowohl die Sarkosomen wie die kleinen Grana mindestens zwei Mechanismen fiir den Mg2+-akti~ferten Phosphat-Austausch. Der eine ist hochgradig Salyrgan-empfindlich,der andere ist innex'halb des untersuchten Salyrgan-Bereiches unempfindlich. Der Salyrgan-unempfindliche Mechanismus bedarf offenbar des Mg2+, um aktiv zu werden. Denn in Abwesenheit yon Mg2+ ist der Phosphat-Austausch durch Salyrgan vollstttndig oder fast vollsttindig vergiftbar (Fig. S). Auf der anderen Seite beginnt die Vergiftung des Phosphat-Austausches in Abwesenheit yon NIg2+ erst mit einer wesentlich hrhere, Salyrgan-Protein-Proportion als in Anwesenheit yon Mg~+ (Fig. 8, • Salyrgan = Mersalyl = o-E(3-hydroxymercuri-',-methoxypropyl~-carbamyl]-phenoxy-Essigs~ure. Biochim. Biophys. Acta, 57 (z96z) 455-474

468

~. ULBRECItT

vergl. K u r v e z m i t K u r v e 2). Die Folgerungen aus diesen Unterschieden werden im n~ichsten Abschnitt gezogen. Auch auf die ATPasen der Grana ~ r k t Salyrgan ~ihnlich und ~ihnlich kompliziert wie.auf.dieAustausch-Mechanismen. In Mg~+-Gegenwart wird die sehr aktive ATPase der Sarkosomen zun~ichst noch ein wenig aktiver, die schw~ichere ATPase der kleinen Grana dagegen nicht. Bei weiterer E r h f h u n g tier Salyrgan-Protein-Proportion werden dann aber beide ATPasen bis auf die gleiche Salyrgan-unempfindliche RestAktivit~it vergiftet (Fig. 7). Die gleiche gegen Salyrgan unempfindliche Rest-Aktivit~it der A T P - S p a l t u n g findet sich auch bei Aktivierung dutch Ca ~+ (Tabelle V, Columne II). Diese Salyrganresistente ATPase schient in ~ihnlichem U m f a n g der Erdalkali-Aktivierung zu bediirfen wie der Salyrgan-unempfindliche Austausch. Denn in v611iger Abwesenheit von Erdalkali findet sich nur ein minimaler Rest yon Salyrgan-unempfindlicher ATP-Spaltung (Fig. 8, Tabelle V, Columne II). Schliesslich ist noch ein spezifischer Einfluss des Mg a+ auf den Salyrgan-empfindlichen Anteil der ATPase bemerkenswert: W e n n kein Erdalkali oder nur Ca 2+ anwesend ist, unterbleibt (a) die Aktivierung der A T P Spaltung durch sehr kleine v,~P 4,... ~j~ ... z.4

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6

# tO x IO'~M Oxorsan

Fig. 8. Salyrgan-Vergiftung des PhosphatFig. 9. Abh~ingigkeit des Phosph~t-Austausches Austausches und der ATP-Spaltung in An- und der ATP-Spaltung yon tier Oxarsan-Konwesenheit und Abwesenheit yon Mgz+ und zentration. SymboleinderAbbildung.6. xo-SM Ca~+ (uniraktioPierte Grana}. Symbole in der MgCII, Tempemtur 2o°, IonenstRrke o.4 p, Abbildung. a, Hauptzeichnung Kurve x und 2 : Histidin-Puffer o.o2 M pH 7.o, P-Austausch Phosphat-Austausch~ punktierte Kurve, hypo- in Anwesenheit yon 5. zo-aM ATP + 5. zo-~M thetische Phosphoryl~erung in Gegenwart yon ADP, ATP-Spaltung ohne ADP. Mg~+. b, Einsatz: Spaltungskurven. HistidinPuffer o.o2 M pH 7.0, IonenstRrke o.4 p, Temperatur 2o°, Austausch in Anwesenheit yon 5" zo-e M ATP + 5" zo'4 M ADP, ATP-Spaltung ohne ADP. B i o c h i m . Bioph~,s. Actao 57 (I962) 455-,I.74

469

P-AUSTAUSCH UND ATPAsE VON SARKOSOMEN UND GRANA TABELLE V DER SALYRGAN-RESISTENTE ANTEIL VON ATP-sPALTUNG UND PHOSPHAT-AUSTAUSCH

Temperatur 2o °, [onenstArke o. 4/L, Histidinpuffer o.oz M, pH 7.o. Die Zahlen in den Kl~mmern bedeuten die Anzahl der Versuche. ATP-Spaltung Vov SalyrganVergiflung

Phosphat-Auslausch

Nach SalyrganVergiflung

Vor SalyrganVergiflung

tl,~,~nl P mg Eiw. x rain

i. 2. 345. 6.

Grana-Mischung ohne Erdalk. Sarkosomen + Mg2+ Misehung + Mgz+ Kleine Grana + Mg~+ Mischung + Ca2+ Kleine Grana* in Gegenwart yon Oxalat und Mg2+

0.06 0.63 0-39 o-23 o.13

(4) (3) (5) (3) (4)

o.o 7

0.006 0.06 o.o8 0.06 o.o6

Nach SalyrganVergiltung

in pMol P mg Eiw. x mi~

(4) (3) (5) (3) (4)

0.38 3.25 2-31 3.17

(2) (I) (3) (i)

~ o 1.2 x.38 x.32

',~) (i) (3) (i)

o.o 7

" Nach HASSELBACH UND MAKINOSE 12, f~ii die Deutung vergL p. I6. TABELLE VI EINFLU~S VON OLEXNS~URE, PROTAMIN UND TRYPSIN-VERDAUUNG AUF Mg2+-AKTIVIERTE ATFASE UND Mg2+-AKTIVIERTEN PhOSPHAT-AUSTAUSCH DER GRANA-MISCHUNGEN DES KANINCHEN-MUSKELS j ~

r~

Temperatur 2o °, Ionensti~rke o.4 p, Histidin-Puffer o.o2 M, pH 7.o, 5" Io-3M A 6. Io -a M MgCIv ATP-Spaltung in ,uMol P mg Eiw. x rain I n A bwesenheit von 5 "1o-~ M A D P

I. Normal 2. 2o min Trypsi a-Verdauung 3.5" xo-5 M Oleins~iure 4. Protamin o.o5. lO-3 ~i,quiv./g o.x- io -3 ~i,quiv./g o.i6.1o -3 ~quiv./g o. 5. to -a Aquiv./g

Eiw. Eiw. Eiw. Eiw.

0.4 0.4 o. 4 o.32 0.26 o.23 o.z3

Phosphat-Austausch in t*Mol P mg Elm. x mitt In A nwesenhcit vor~ 5 "to-3 M A D P

2.4 2.4 x.2 ~-.4 2.4 2..~

~ S a l y r g a n - P r o t e i n - P r o p o r t i o n e n u n d ist (b) die S a l y r g a n - V e r g i f t u n g b e r e i t s m i t einer S a l y r g a n - P r o t e i n - P r o p o r t i o n vollst~indig, die 3 × kleiner ist als in A n w e s e n h e i t y o n Mg 2+. A u c h u n t e r d e m S H - R e a g e n z O x a r s a n * w e r d e n zwei v e r s c h i e d e n e A u s t a u s c h M e c h a n i s m e n d e u t l i c h (Fig. 9). D e n n d e r G e s a m t - A u s t a u s c h f~llt bei s e h r k l e i n e n O x a r s a n - K o n z e n t r a t i o n e n steil a b u n d wlichst bei w e i t e r e r E r h 6 h u n g d e r O x a r s a n K o n z e n t r a t i o n w i e d e r a u f d e n A u s g a n g s w e r t (Fig. 9). Die S p a l t u n g s - G e s c h w i n d i g k e i t h i i n g t d a g e g e n y o n d e r O x a r s a n - K o n z e n t r a t i o n in e n t g e g e n g e s e t z t e r Weise a b : * Oxaxsan ~ Mapharsen = 3-amino-4-hydroxyphenyl-arsinoxide. B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 57

(x962) 455-474

47°

M. ULBRECHT

Zun~chst eine geringfiigige Aktivierung und mit h6heren Oxarsan-Konzentrationen eine betr~chtliche, abet unvollst~-~dige Vergiftung. Eine vSllig unabh~ngige Beeinflussung von Phosphat-Austausch einerse~ts und ATP-Spaltung andererseits erhiilt man bei Vergiftung der Grana mit Protamin und 01s~ure (vergl. Tabelle VI). In Gegenwart yon 5" IO-5 M Oleat wird die ATP-Spaltung weder in Anwesenheit noch in Abwesenheit yon ADP ge~indert, w~hrend der Austausch auf ungef~ihr die H~lfte sinkt. Durch Protamin dagegen wird der Austausch bis zu einer Proportion yon o.I6-IO -3 ,~quiv./g Eiweiss iiberhaupt nicht beeinflusst, wRhrend die Spaltung auf 6o % des Ausgangswertes abs;nkt. Da diese Rest-Spaltung yon 6o % auch durch Verdreifachung der Protamin-Menge/mg Einweiss nicht weiter emiedfig~ werrlen kann, enthalten die Grana offenbar mindestens eine Protaminempfindliche ATPase im Betrage yon 4o% der Gesamt-Aktivit~t und mindestens eine Protamin-resistente ATPase im Betrage von 60 % der Gesamt-Aktivit~t. ~ber die MindestzaM der A TPasen und A ustausch-Mechanismen und iiber die Beziehung des Phosphat-Austausches zur ATP-Spaltung in Sarkosomen und kleinen Grana

Der konkurrierende Einfluss der Ca~+- und Mg2+-Ionen im C#+-Mgi+-Mischungs diagramm (Fig. 4) spricht daftir, dass Ca~+ und Mg~+--mindestens teilweise--die gleichen Mechanismen beeinflussen. Dagegen miissen sowohl in den Sarkosomen wie in den kleinen Grana mindestens je zwei Systeme verschiedener Gift-Empfindlichkeit unterschieden werden. Beide Arten der Grana enthalten mindestens je einen Salyrgan-empfindlichen und einea Salyrgan-unempfindlichen Meehanismus des Phosphat-Austausches. Es ist aber kaum mOglich, mit diesen beiden Mechanismen auszukommen. Denn in Anwesenheit yon Mg2+ beginnt die Salyrgan-Vergiftung des Austausches mit viel kleineren SalyrganEiweiss-Proportionen als in MgZ+-Abwesenheit (vergl. Fig. 8). Da es sehr unwahrscheinlich ist, dass Mgz+-Zusatz die Salya'gan-Empfindlichkeit des fraglichen Mechanismus erh6ht, erscheint es richtig, zwei Sa!yrgan-empfindliche Austausch-Mechanismen anzunehmen; der eine wird nur in MgZ+-Gegenwart aktiv und ist sehr Salyrganempfindlich; der andere ist mit und ohne Mg~+ aktiv und ist weniger Salyrganempfindlich. Zu diesen beiden Mechanismen k~ime mindestens noch ein Salyrganunempfindlicher Mechanismus hinzu, der nut unter Mgl+-Zusatz aktiv wird (Fig. 8). Diese I3berlegungen gelten sowohl ftir die Sarkosomen wie fiir die kleinen Grana. Auch die Abh~ngigkeit des Phosphat Austausches yon der Oxarsan-Konzentration im Gemisch von Sarkosomen und kleinen Grana spricht fiir mindestens zwei Mechanismen: einen, der Oxarsan-empfindlich ist und einen zweiten, der durch Oxarsan-Konzentrationen bis IO-2 M sogar aktiviert wird (Fig. 9). Denn es ist unwahrscheinlich, dass durch sehr kleine Oxarsan-Konzentrationen eine Vergiftung eines einheitlichen Austausch-Mechanismus stattfindet, die durch weitere Erh6hung der Oxarsan-Konzentration wieder aufgehoben wird (Fig. 9)Auch die Zahl der Grana-ATPasen erh6ht sich dutch die Erfahrungen tiber die Salyrgan-Ve~giftbarkeit auf mindestens je zwei ,,ersc,hiedene ATPasen in den Sarkosomen und in den kleinen Grana. Doeh kommt man hier mit je einer Salyrgan-empfindlichen und einer Salyrgan-unempfindlichen ATPase aus. Zu diesem Zweck muss man annehmen, dass beide Grana-Arten eine Salyrgat~-unempfindliche ATPase enthalten, die ohne Erdalkali-Zusatz fast inaktiv ist und durch Cal+ und Mgt+ in gleiehem Umfang aktiviert wird (vergl. Einsatz der Fig. 8, Kurve I mit 2 und ferner Tabelle V), Biochim. 13~ophys.Acta. 57 (I9621 455-474

P-AUSTAUSCH UND ATPASE VO• SARKOSOMEN UND GRANA

47I

Daneben miissten beide Grana-Arten mi,ndestens je eine Salyrgan-empfindliche ATPase enthalten, die durch Ca 2+ kaum und durch Mg2+ stark aktiviert wird (Fig. 8). ZusAtzlich muss allerdings angenommen werden, dass die Salyrgan-Empfindlichkeff. dieser ATPase durch Mg2+ (aber nictit durch Ca2+) vermindert wird (vergl. Fig. 8, Einsatz). Die ATPase-Aktivitiit der Grana ist aber nich~ nur teils empfindlich und tells unempfindlich gegen Salyrgan sorldern auch gegen Ptotamin (TabeileVI), ADP (Fig. 6) und wahrscheinlich auch Oxarsan (Fig. 9)- Die Proportion des empfindlichen zu dem unempfindlichen oder ,sehr wenig empfindlichen (Oxarsan !) Anteil der Aktivitiit ist fiir die vier Inhibitoren verschieden. Die Proportion betr~tgt fNr Salyrgan 85 °/o : 15 %, fiir Protamir, 4 o % : 6 o % , ffir ADP 5o'),0:5O°,o und f~ir Oxarsan 7 4 % : 2 6 % . Auch der Mechanismus der Hemmung ist fiir mindestens 3 dieser Inhibitoren ganz verschieden m. Beide Tatsachen zusammen sprechen fiir die Beteiligung einer ganzen Reihe yon ATPasen an der gemessenen Gesamt-Aktivit~it der ATP-Spaltung und machen auf ]eden Fall unm6glich, mit nur zwei ATPasen auszukommen. Ausserdem scheinen mindestens die kleinen Grana ATPasen zu enthalten, die unter den Bedingungen dieser Arbeit iiberhaupt nicht aktiv werden. ~tASSELBACH UND MAKINOSE12 haben gezeigt, dass die ATPase-Aktivitiit der Mg2+-aktivierten ATPase der kle~nert Grana nicht nur durch Salyrgan sondern aach durch Zusatz von Oxalat auf den mlnimalen Betrag yon ~ 0.07 tzMol/mg Gran,~ Eiw./min herabgesetzt wird, und dass diese Rest-Aktivitiit praktisch Salyrgan-unempfindlich ist. Diese Oxalat-unempfindliche Mg2+-aktivierte ATPase scheint mit unserer Salylganunempfindlichen Mg*+-aktiviertl~ NFPase in den kleinen Grana identisch zu sein (vergl. Tabelle V). Durch kleine Ca~+-Zusatze aber steigt die unter Oxalat in Mg z+ Gegenwart vorhandene ATPase-Aktivitiit auf das 7-8-fache, d.h. auf das Doppelte dcr maximalen Aktivitiit, die durch Mg2+ in Abwesenheit yon Oxalat erzeugt werden kann 12. Diese HASSELBACWsche "Ex*.ra-Spaltung" verschwindet ~ e d e r , sobald das zugesetzte Calcium in den Grana ge3lreichert ist. Die "Extra-Spaltung" tritt nicht auf, wenn dem Ansatz vorher Salyrga~ zugesetzt wurdO 2. Diese Salyrgan-empfindliche "Extra-Spaltung" setzt die Anwesenheit yon Ca -°+ und Mg~+ nebeneinander voraus (im Verhaltnis I : 3 o ffir maximale Aktivierungz7 und verhiilt sich damit v611ig anders wie die in dieser Arbeit in Abwesenheit yon Oxalat beobachteten ATPasen, deren Aktivit~it unter Mg2~ dur~ :t CaZ+-Gaben nicht erh6ht sondern erniedrigt wird" (Fig. 4) 4. Die Nicht-Identitiit der ATPase der "Extra-Spaltung" mit den ATPasen dieser Arbeit geht auch daraus hervor, dass die hier behandelten ATPasen gegen eine OleatKonzentration v611ig unernpfindlich sind (Tabelle VI) uncl ebenso gegen einen Grad der Trypsin-Verdauung (Tabelle VI), die beide die Ca-Pumpe der HASSELBACH'schen Grana und die damit verbundene "Extra-Spaltung" v611ig aufheben ~. Es wird vielfach angenommen, dass die ATP-Spaltung ,rod der P-Austausch zwischen ATP und A D P durch folgende zwei Gleichungen miteinander verkniipft sind: ATP + Enzym--~ ~ P-Enzym + ADP----~Enzym + Pt + XDP (I) (Austausch)

(Spaltung)

* Die Aktivierung der Salyrgan-empfindlichen ATPase der "Extra-Spaltung" durch das zugesetzte Calcium beruht nicht auf einer Erniedrigung der Oxalat-Konzentration durch die

Ca2+-Ionen. Denn in der Suspension der Grana ist das Oxalat in 5o-5oo-fachem l~?ber~schussfiber das Calcium vorhanden 1~. Biochim. Biopkys. Acta, 57 (x962) 455-474

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M. U L B R E C H T

Da das P-Enzym einerseits durch Rfickreaktion ira Austausch und andererseits durch Spaltung verschwindet, erh~ilt man die Geschwindigkeit der hypothetischen Bildung des P-Enzyms dadurch, dass die Austauschrate und die Spaltungsrate addiert werden. Solche Kurven der Abh~ingigkeit der hypothetischen Enzym-Phosphorylierung von den Faktoren, die den ATP-Umsatz beeinflussen, sind auf einigen Abbildungen den Kurven des Austausches und der ATP-Spaltung beigefiigt. Im iibrigen liegen diese Phosphorylierungs-Kurven in Anwesenheit von Mg2+ immer den Austausch-Kurven sehr nahe, weil nnter Mg~+ der Austausch immer sehr gross und die ATP-Spaltufig vergleichsweise klein ist. Es zeigt sich, dass diese Kurven der hypothe*ischen EnzymPhosphorylierung immer qnantitativ, hiiufig auch qualitativ anders von dem beeinflussenden Faktor abh~ingen als die entsprechenden Kurven der Spaltungsrate. Diese Verschiedenheit bedeutet, dass der betreffende Faktor nicht nur die Phosphorylierungsrate, sondern dass er auch unabh~ingig v o n d e r Phosphorylierungsrate die Spaltungs-Geschwindigkeit modifiziert. Diese Feststellung llisst zunlichst often, ob der Einfluss auf die Spaltungsrate ein Einfluss auf die Zerfalls-Geschwindigkeit des hypothetischen P-Enz>a~,s ist oder ob der Spaltungs-Vorgang mit dem Austausch(Phosphorylierungs-) Vorgang fiberhaupt nichts zu tun hat. Ein genereUer Zusammenhang zwischen Austausch und Spaltung entsprechend Gleichung I wird dagegen sehr unwahrscheinlich, wenn folgende Ergebnisse berficksichtigt werden: I. Die Raten des P-Austausches durch Sarkosomen einerseits und kleine Grana anaererseit- ~timmen unter allen Bedingungen iiberein, die Raten der Mgl+-aktivierten Spaltung und damit auch der hy~othetischen Enzymphosphorylierung ( = Summe von Spaltung und-Austausch) sind dagegen in Sarkosomen einerseits und kleinen Grana andererseits immer und ausserdem in wechselndem Umfang verschieden. Es ist sehr unwahrscheinlich, dass diese Verschiedenheiten der hypothetischen EnzymPhosphorylierung dutch eine Verschiedenbeit der anschliessenden Spaltung des P-Enzyms immer gerade so ausgeglichen werden, dass sich fiir beide Grana-Arten genau die gleiche Austausch-Geschwindigkeit ergibt. 2. Durch Zusatz von 4" Io-S M ADP wird die Geschwindigkeit der hypothetisehen Enzym-Phosphorylierung ebenso wie die Geschwindigkeit des P-Anstausches um etwa 25 % und die ATP-Spaltung um 50 % des ursprfinglichen Wertes herabgesetzt (Fig. 6). Bei weiterer Steigerung der ADP-Konzentration fallen Au*stausch-Gcschwindigkeit und Phosphorylierungsrate gradlinig weiter ab, wiihrend die SpaltungsGeschwindigkeit konstant bleibt (Fig. 6). Konstanz der Zerfalls-Geschwindigkeit des h3q3othetischen P-Enzyms bei steil abfallender Bildungs-Geschwindigkeit und damit auch abnehmender Konzentration des P-Enzyms ist sehr unwahrseheinlich, besonders wenn man ,.t'eriicksichtigt, dass in ADP-L6sungen niedriger Konzentration (< 4" lO-S M) die Hemmung des P-Austausches yon einer starken Hemmung der ATP-Spaltung begleitet wird. Also ist mindestens ein Teil des P-Austausehes nicht mit der ATP-Spaltung nach Gleichung I verbunden. 3. Der Salyrgan-empfindliche MgZ+-aktivierte P-Austausch ist fast vollst~ndig vergiffet ehe die Vergiftung der Mg-ATPase tiberhaupt beginnt (vergl. die Knrven 2 von Fig. 8 und Einsatz Fig. 8). Mindestens dieser Austausch-Mechanismus hat also nichts mit der anschliessenden Spaltung eines P-Enzyms zu tun. Und sehliesslich vergiftet 5" 1o-5 M Oleat den Austausch und damit auch die hypothetisehe Bildung des P-Enzyms ungefiihr zur HAlite, w~ihrend die ATP-Spaltung v611ig unbeeinflusst Biochlm. Biopfiys. Acta, 57 (x962) 455-474

P-AUSTAUSCH IJND ATPAsE VOi'~ SARKOSOMEN UND GRANA

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oleibt. Also scheint auch der Oleat-empfindliche Austausch-Mechanismus nichts mit der ATP-Spaltung zu tun zu haben. Weniger Bedenken bestehen dagegen gegen eine Zuordnung der Salyrgan-unempfindlichen ATPase zu dem Salyrgan-unempfindlichen Austausch-Mechanismus in Mg2+-Gegenwart. Eine unmittelbare Beziehung zwischen der AktivitAt des Austausches und der ATPase im Sinne der Gleichung I mag also fiir den einen oder anderen der be,teiligten Austausch-Mechanismen und die eine oder andere ATPase gegeben sein. Dagegen ist eine solche Zuordnung sehr unwahrscheinlick ffir die Gesamt-AktivitAt des Ph~sphat-Austausches und die Gesamt-AktiviUit der ATPasen METHODIK Gewinnung von Sarkosomen, kleinen Grana und Grana-Mischungen Kaninchen-Muskulatur wird in Eis gekfihlt, im Fleischwolf zerkleinert, dann mii: Io-fachem Volumen o.i M KC1, 0.25 M Rohrzucker-L6sung oder Perry-L6sung 5 bei o ° im Starmix 2 min zerkleinert. Nach Abzentrifugierung des Hauptteiles der Fibrillen bei xooo x g (5 rain), wird die Grana-Suspension dutch Gaze gegeben und nochmals 5 min bei IOOO x g zentrifugiert. Sarkosomen Sie werden aus der Grana-Suspension bei 5ooo × g (Servall-Winkel-Zentrifuge 3o min) abzentrifugiert. Der Niederschlag wird in 2o-fachem ~volumen resuspendiert und erneut 3o min bei 5ooo × g zentfifugiert. Schliesslich werden die abzentrifugierten Sarkosomen iri o.i M KC1 homogenisiert. Kleine Grana Der Ltberstand fiber den abzentrifugierten Sarkosomen wird 6o min auf der Spinco-Ultrazentrifuge bei 2500o × g zentrifugiert. Der Niederschlag der abzentrifugierten kleinen Grana wird ebenso weiterbehandelt wie der Sarkosomen-Niederschlag. Die FraMion der kleinsten Partikel Sie wird aus dem 13berstand der kleinen Grana durch _*-stfindige Zentrifugation bei 45ooo × g gewonnen. Der Niederschlag wird wie der Niederschlag der Sarkosomen und kleinen Grana nachbehande!t. Es 1Asst sich nur eine sehr kleine Eiweiss-Menge isolieren. Orientierende Versuche zeigten, dass diese besonders k!einen Grana sich qualitativ gleiohartig verhalten wie die Sarkosomen und kleinen Grana, quantitativ liegen die Leistungen sowohl des P-Austausches wie der ATPase niedriger. Zentrifugiert man den Oberstand der kleinen Grana bei 80o0o × g start bei 45ooo x g, so vergr6ssert sich die geringe abzentrifugierbare Eiweiss-Menge kaum. Grana-Mischung. Sie ~fird erhal~en, indem Sarkosomen und kleine Grana zusammen I Stunde lang bei 45000 x g abzentrifugiert und in der oben beschriebenen Weise nachbehandelt werden. Ffir papierchromatografische Trennung, Bestimmung der Austausch-Rate, Phosphat-Bestimmung und Substanzen siehe voranstehende Arbeit 1. DANK Herrn Professor H. H. WEBER danke ich ffir viele Diskussionen, FrAulein I. REISS und FrAulein G. B6cKtt ffir fleissige und unermiidliche Hilfe bei der Durchffihrung der Experimente. Biochim. Biophys. Aaa, 57 (x962) 455-474

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