Dernières mises au point concernant la conservation des concentrés de plaquettes à 4 °C

Transfus Clin Biol2000 ; 7 : 457-61 0 2000 Editions scientifiques et medicales Elsevier SAS. Tous droits rbserv&

PrCparation

des produits

sanguins

Mise au point

Dernihes mises uu point concernunt la conservution c/es concentrbs de plaguettes ii 4 “C F. Beaujean EFS k-de-France,

site Mondor,

5 I, avenue

du Markhal-de-Lame-de-Tassigny,

940 IO Crkteil,

France

activation plaquettaire I concentrb plaquettaire I conservation h 4 “C Summay Storage of platelet concentrates at 4 “C Under current blood-bankingpractices, platelet concentrates(PC) can bestoredfor 5 days from 20” to 24 “C. The storagelife is essentially limited becausestorage to 22 “C leadsto an increasein the risk of bacterial contamination and to unacceptablelesionsof platelets. Therefore,there is considerable interest in developing methodsto improve storage conditions. In the past, platelet storage at 4 “C hasbeenextensively studied. The advantagesof the refrigerated temperature included an inhibition of the growth of bacterial contaminants and a reduction of metabolic rates which reducethe deleterious effects observed with the storage of platelets at room temperature. Unfortunately, a rapid lossof in vitro functional activity and in vivo viability was observedat 4 “C. This report summarizes storagelesionsof PC at 4 “C, and evaluatesthe effectsof a new solution (thrombosol)made up of secondmessengereffecters. Thrombosolprovides a protective effect against in vitro platelet storagelesionsand cold-induced activation. Treatedplatelets storedat 4 “C displayed significantly greater recovery of in vitro activity than did control platelets storedat 22 “C. This is a strong basis that supplementation of platelet concentrates with thrombosolmight allow the storage of PC at 4 “C. 0 2000 Editions scientifiqueset medicalesElsevier SAS liquid cold storage / platelet activation / platelet concentrate

Introduction La methode optimale actuelle pour conserver les concentres plaquettaires et maintenir leurs proprietes fonctionnelles, consiste a les garder a une temperature de 22 “C en agitation constante. Cependant, la phase de conservation est limitee a cinq jours, essentiellement a cause de l’incidence des complications

bacteriennes post-transfusionnelles. En effet, les conditions de conservation sont favorables a la multiplication d’un nombre important d’especes bacteriennes malgre le developpement des techniques de prelevement et de filtration en systeme ~10s. Les don&es de la litterature indiquent une frequence variant de 0,02 a 0,25 % d’incidents infectieux lies a une contamination bacterienne des produits

F.Beaujean

458

plaquettaires [l, 21. Le degre de contamination semble plus important dans les preparations de melanges de concentres de plaquettes standard que dans les concentres de plaquettes d’apherese. Par ailleurs, differentes etudes soulignent l’importance de la duree de conservation sur l’incidence de contamination. Celles-ci sont plus frequentes dans les concentres plaquettaires conserves cinq jours que dans ceux conserves quatre jours ou moins. Par ailleurs, la conservation a 22 “C n’evite pas l’apparition des lesions fonctionnelles plaquettaires qui aboutissent a une diminution de l’efficacite posttransfusionnelle 131.Pour preserver au mieux la qualite des suspensions plaquettaires, il convient alors de prendre en compte et de contrbler un certain nombre de parametres : la concentration plaquettaire, le volume et la nature du milieu de resuspension, la permeabilite gazeuse des poches de recueil, la surveillance de la temperature. De nombreuses questions restent done liees a la conservation a 22 “C, et il apparait indispensable de reflechir a de nouvelles strategies susceptibles d’ameliorer la qualite fonctionnelle des plaquettes conservees et/au de diminuer le risque bacterien. Des publications recentes montrent que la conservation a 4 “C peut rep&enter, aujourd’hui, une alternative possible a Ctudier [41. L’objet de cette mise au point est de decrire les donnees disponibles concernant les effets deleteres du refroidissement et les progres effectues ces dern&es annees pour les prevenir. Effet

du refroidissement

la conservation

quettes conservees pendant la meme duke a 22 “C, m@mesi le rendement 24 heures apres transfusion semblait mieux preserve. Cependant, in vivo, Valeri [7] a demontre que ces plaquettes, conservees a + 4 “C jusqu’a 72 heures, etaient capables de corriger immediatement l’allongement du temps de saignement induit par l’ingestion d’aspirine chez des volontaires sains. Ces plaquettes a duke de vie raccourcie semblent @treactivees par la conservation a 4 “C et presenter alors de meilleures fonctions hemostatiques. Changements

morphologiques

Lorsque les plaquettes sont conservees a des temperatures inferieures a 22 “C, elles perdent rapidement leur forme disco’ide et deviennent spheriques. Ce changement de forme est d’autant plus rapide et important que la temperature de conservation est basse.Dans une publication recente, Holme et al. 181 correlent le changement de forme, la temperature de conservation et la duke d’exposition des suspensions plaquettaires a cette temperature. A partir de ces trois parametres, ils en deduisent une equation qui permet d’indiquer qu’une perte approximative de 20 % des formes discoi’des est observee quand les plaquettes sont conservees a 18 “C pendant 24 heures ou plus, a 16 “C pendant 16 heures ou plus, h 12 “C pendant dix heures ou plus, enfin a 4 “C pendant six heures ou plus. Les changements morphologiques lies au refroidissement entrainent une depolymerisation des microtubules et une reorganisation des microfilaments. Ce phenomene est rever-

sur

des concentrks

Tableau diffbrentes

I. Durbe de vie des concentrbs temperatures.

Auteurs

Gme7vation

plaquettaires Eficacitb

clinique

Differentes etudes montrent que la viabilite posttransfusionnelle des plaquettes conservees est mieux preservee a 22 “C qu’a des temperatures inferieures. Une etude recente de Moroff et al. [5] demontre qu’une duree d’exposition de 17 heures des concentres plaquettaires a 16 “C et a 12 “C diminue d’une faqon significative la survie apres transfusion (tableau I). Des publications anciennes [6] avaient deja souligne la survie raccourcie des plaquettes conservees a 4 “C comparee a celle des pla-

plaquettaires

conservks

Rendement posttransfusionnel Survie (jours) ci24h (a/o)

Murphy et 18h-4T(15) al. (1969)[61 18h - 22“C (11)

42+3 55+3

‘3,9

Slkhteret al, (1976)

40f5 40_+3

7,9 * 0,2

72h4”C(8) 72 h - 22 “C

(11)

Moroff et al. 17h - 12 “C (4) 17h-22”C(4) 0994) 111 17h-l6T(4) 17h-22”C(4)

A

37,6 47,8 42‘7 49,2

*13* 0,l 5 0,2

l,o f 0,l

f 13,8 f 11,5

2,0 k 0,3 6,s rk 1,4

f 3,8 L+ 3,0

3,5 IL 1,2 66 f 0,3

* R&Rats exprimksende&vie ; nombred’expkimentations entreparenthkies.

Conservation

des concentres

sible apres rechauffement si le temps d’exposition au froid est inferieur a 18 heures. Le passage de la forme disco’ide B la forme spherique s’accompagne d’une emission de pseudopodes qui aboutit a l’augmentation de la surface membranaire. Des microvesicules a activite procoagulante sont form&es et lib&es dans le milieu de suspension. Bode et al. [91 ont montre que le refroidissement a 4 “C pendant cinq jours entraine 45 % de plus de microvesicules, avec une perte plus importante de GpIb membranaire, compare aux plaquettes conservees a 22 “C. 11 a et6 montre que ces fragments membranaires liberes sont particulierement riches en glycoproteines de surface GpIb et GpIIb. On sait que l’etude morphologique plaquettaire est un test bien correle avec la viabilite in vivo. Les variations de forme observees refletent la diminution de survie des plaquettes conservkes a 4 “C. Modifications

fonctionnelles

Les plaquettes soumises au refroidissement agregent spontanement quand elles sont rechauffees et agitees. Apres rechauffement, sans agitation, une desagregation se produit generalement. Mais ces plaquettes sont plus facilement agregables que normalement par differents agonistes comme l’ADP, le collagene ou l’adrenaline, et semblent sensibles a la stimulation par la thrombine. En revanche, ces plaquettes ont une Sponse diminu6e B la ristocktine, due a la perte de la glycoproteine Ib. L’agregation plaquettaire necessite la presence de faibles quantites de fibrinogene qui se fixe, apres activation des seconds messagers, sur son recepteur, le complexe glycoproteine IIb/IIIa. Quand les plaquettes sont refroidies 8 + 4 “C, la fixation du fibrinogene sur la membrane plaquettaire est observee dans un delai tres rapide (20 minutes) sansintervention d’inducteurs comme l’ADP. Les recepteurs plaquettaires specifiques (GpIIb.IIIa) sont spontanement disponibles au niveau de la membrane plaquettaire, et le fibrinogene va se lier a ces recepteurs a la demande. II existe done, pendant le refroidissement, un evenement critique majeur qui est l’activation des plaquettes permettant l’expression du complexe GpIIb/IIIa a la membrane plaquettaire. En addition aux modifications deja citees, les plaquettes conservees a + 4 “C, durant quelques heures, expriment la selectine I’ de facon importante et irreversible. L’expression de la selectine I’ sur la mem-

de plaquettes

459

A 4” C

brane plasmique confirme l’etat d’activation plaquettaire. Elle est correlee avec la diminution de reponse au choc hypotonique observe apres refroidissement. Pour certains auteurs, l’augmentation d’expression de selectine I’ reflete la diminution de viabilite in vivo. Cependant, cette association reste encore a confirmer. Enfin, il existe une augmentation du metabolisme des nuclkotides adenyliques et une degradation accrue de l’adenine vers sesmetabolites. Au total, on peut retenir des differentes etudes publiees les faits suivants : le refroidissement a 4 “C induit rapidement une activation plaquettaire qui entraine des modifications morphologiques et fonctionnelles sous-tendues par des processus metaboliques. Ces plaquettes sont efficaces sur le plan hemostatique, mais presentent une survie fortement diminuee par rapport aux plaquettes venant d’@tre p&levees ou a celles conservees pendant la meme duke a 22 “C et en agitation. Par quels mecanismes le refroidissement peut-il entrainer l’ensemble des alterations cellulaires observees ? Les hypotheses qui sont avancees temoignent d’une atteinte primaire de la membrane plaquettaire d’autant plus irreversible que le temps de conservation a 4 “C est important. Plusieurs phenom&es sont constates : changement d’etat des phospholipides membranaires avec passagede l’etat fluide B l’etat de gel, rupture du reseau circulaire des microtubules, assemblagerapide des filaments d’actine ou taux eleve du calcium du cytosol. Conservation Prhention

des plaquettes des effets

2 4 “C.

d&5tQres

Des publications recentes montrent qu’il est possible de prevenir les phenomenes d’activation plaquettaire observes apres conservation a 4 “C. Lequipe de Connor 1101a developpe une solution, le thrombosol (tableau II) contenant un melange de substances inhibitrices de l’activation plaquettaire in vitro. Les differents constituants en sont : - l’amiloride, inhibiteur des echanges membranaires Na+H+, qui bloque la mobilisation intra-cytoplasmique du calcium ; - l’adenosine, stimulant la formation d’adenosine monophosphate (AMP) et de guanosine monophosphate (GMP) cycliques, deuxiemes messagers qui

F. Beaujean

460 Tableau

II. Composition

Cmstitmmis

du thrombosol

(d’apres

[I I]).

Commtrations finales

Amiloride

025 mM

Adrsnosine

D,l mM

Nitriate desodium

SW

Dip+damole

40pM

Ticlopidine

0,75mM

QLlinacrine

02 @f

possedent la propriete d’inhiber in vivo l’activation plaquettaire ; - le nitriate de sodium, stimulant la production d/AMP et de GMP cycliques ; - le dipyridamole, introduit dans le melange comme inhibiteur des phosphodiesterases et done contribuant a l’accumulation d’AMP cyclique dans la plaquette ; - la quinacrine, inhibiteur de la phopholipase A2 et done de la cascade de reactions donnant naissance au thromboxane A2 ; - le ticlopidine, agent anti-thrombotique et antiagregant plaquettaire. 11a ete montre qu’il stabilisait la membrane plaquettaire. Le thrombosol, ajoute au concentre plaquettaire, protege celui-ci contre les effets du refroidissement pendant plusieurs jours. Connor et al, en 1996, comparent les resultats obtenus avec les concentres plaquettaires conserves a 22 “C et constatent, dans le produit contenant le thrombosol (tab2eatlIII) : - l’absence de lyse cellulaire, avec une recuperation quantitative in vitro du nombre de plaquettes, identique a celle du controle ; - une reponse aux agents agregants deux fois et demie superieure avec l’adenosine diphosphate (ADP), et identique avec le collagene comparee au controle ; - une reponse au choc hypotonique de 70 % de la reponse initiale ; - une amplitude de changement morphologique apres adjonction d’ADP de 60 % ; - des taux identiques de GpIb et de selectine P membranaires. D’autres observations [ill mettent en evidence une bonne preservation de la reponse a la ristocetine

et a la thrombine, ainsi que des taux intracellulaires eleves d’AMP cyclique. Les analyses metaboliques montrent une bonne stabilite du pH av.ec des valeurs de 7,l apres conservation de neuf jdurs a 4 “C. Rivera et al., en 1999, montrent egalement que la consommation de glucose plasmatique, le taux de lactate et de lactate deshydrogenase dans le surnageant, restent significativement diminues compares a ceux rapport& dans les plaquettes conservees a 22 “C. Currie et al., en 1997 [121, etudient la multiplication bacterienne de staphylocoques do&, ajoutes intentionnellement dans des concentres plaquettaires conserves a 22 “C et a 4 “C en thrombosol. Les resultats montrent, a 22 “C, une expansion rapide des germes pouvant atteindre plus d’un million de colonies par millitre apres trois jours. A l’oppose, aucune augmentation de la charge bacterienne n’est observee apres conservation a 4 “C. Parallelement, cette publication met en evidence, dans les concentres plaquettaires conserves a 4 “C, des dosages tres bas des cytokines telles que l’interleukine-6, l’interleukine-1 p et le facteur de n&rose tumorale (TNFa). Au total, l’adjonction de thrombosol permet de conserver a 4 “C les concentres plaquettaires en maintenant leur qualite fonctionnelle pendant au minimum cinq jours. Lorsque la duree de conservation est prolongee a neuf jours, les resultats obtenus a 4 “C sont meilleurs que ceux obtenus a 22 “C. Par ailleurs, la diminution de la temperature de conserTableau Ill. Conservation cinq jours (&apt-&s [IO]

des concentrks et [I I]).

plaquettaires

Consewution

Testsfonctionnels

d 4 ‘C avec

fhrombosol

pendant

Conservation d 22 “C avec agitation

Rendement in vitro (o/o)

-95

-85

Agrkgation(%)ADP Collag&ne

=45 78

= 15 = 74

61

70

~$onseauchocosmotique Expression de sdectine P (%I PH

52 7,06 2 0,02

6,96 rt 0,09

Lactate(mM)

5,6 f 0,l

17,3 f 0,7

LDH (unit&/L)

267 f 12

335 f 20

Conservation

des concentrbs

vation empeche la proliferation de. germes pathogenes presents dans la preparation.

de plaquettes 2

3

Conclusion 4

En ce qui concerne la preparation des concentres plaquettaires, la maitrise des techniques de conservation reste un objectif prioritaire a atteindre. On a vu preddemment les problemes poses par la conservation a 22 “C. L’utilisation de nouvelles solutions, comme le thrombosol, permet a nouveau d’etudier la faisabilite de techniques de conservation a 4 “C. En terme de qualite fonctionnelle des suspensions plaquettaires, les resultats obtenus apres conservation de cinq a neuf jours sont tout a fait encourageants. 11 est necessaire aujourd’hui de mettre en place des etudes cliniques permettant de preciser la recirculation in vivo et la survie des plaquettes conservees avec le thrombosol, et de confirmer ainsi la qualite de la conservation a 4 “C.

5

6

7 B

9 IO

II

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