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Des mutants très sensibles
_RECHERCHE
I
ENCEPHALQPATHIES$POl\Jc;IFQRtv'lES ..
Quand Ie prion se metamorphose
Anticoagulant
Des chercheurs de Sanofi ontsynthetise chimiquement une nouvelle molecule susceptible de remplacer avantageusement l'heparlne, I'anticoagulantIe plusutilise au monde. Oix lois plusactive et depourvue d'effets secondaires, la nouvelle molecule estaussi beaucoup pluspelile que "h!lparine. Ainsi, elle presente une affinite avec I'antithrombine (I'inhibiteur de l'un des lacteurs de coagulation sanguine les plus importants), bien plusimportante que I'haparine elte-mems. Reduile austrict minimum, la molecule est, en outre, beaucoup moins toxique. (Nature [1999] 398, 417-422)
D
S
induirait ensuite la transformation de ses voisines normales, selon un mecanisme encore rnysterieux (1). L'equipe de John Collinge, de l'Imperial College School of Medicine a Londres, vient cependant de reussir a observer in vitro la metamorphose d'une proteine prion recombinante, produite par genie genetique dans Escherichia coli (2). La simple reduction du pH du milieu (de 8 a 4) provoque en effet la cassure d'un pont disulfure de la proteine. Celle-ci passe alors d'une structure majoritairement composee d'helices ex (comme la PrP sauvage), a une forme beaucoup plus riche en feuillets R, proche de la PrPsc. En outre, alors que In vivo, Ie prion se trouve sous la suraccumulation de PrPsc forme d'aqreqats particulierernent provoque habituellement un agrega t tres difficile a erudier, difficiles it etudier; les chercheurs parviennent ici a obtenir des concentrations devees de cette proteine partiellement resistante aux proteases, Une particularite qui devrait permettre d'etudier la structure
elon une hypothese desorrnais largement adrnise, l'apparition des encephalopathies spongiformes serait due a la transformation d'une proteine soluble, la proteine prion (PrP), en une forme insoluble resistante aux proteases (PrPsc). Seule, et par simple contact avec ses voisines, cette PrPsc
Des mutants tres sensibles
es chercheurs de l'universite Stanford (Californie) et de la firme pharmaceutique Rosetta Inpharmatics, a Kirkland (Washington D.C.), viennent de mettre au point une nouvelle technique pour identifier les cibles de medicaments potentiels. Une nouvelle occasion, pour /a levure Saccharomyces cerevisiae, de faire preuve de son interet en recherche pharmaceutique. L'objectif des chercheurs etalt de creer une collection de levures mutantes, utilisables pour tester de nouvelles substances, en tirant parti du phenomena de « dosage genique » selon lequel Ie niveau d'expression d'une protelne est proportionnel au nombre de copies va/ides du gene correspondant (deux, en temps normal). Pour commencer, les chercheurs ont cree differentes souches mutantes ne possedant, pour un gene pris au hasard, qu'un unique allele fonctionnel, Ie deuxiems etant inactive par I'insertion d'une courte sequence d'ADN (une sorte de code barre rnoleculalre) qui permettra au passage d'identifier Ie mutant par PCR. Selon les chercheurs, ce type de mutation devrait se traduire par une sensiblllte accrue aux substances ayant pour cible la proteine correspondant au gene ainsi aftecte, via une nette diminution de son taux d'expression. Pour verifier la validite de leur hypothese, les chercheurs ont compare la croissance de mutants cultives sur un milieu contenant un medicament dont la cible est connue, avec celie de la souche sauvage cultivee dans les memes conditions. Et ca marche : Ie suivi des populations par PCR revele que seules les souches dont Ie gene cible est mute ne se developpent pas normalement. Mieux, cette technique donne egalement des resultats convaincants dans la determination de la cible de medicaments potentiels. Pour cela, differents mutants sont cultlves sur un milieu contenant la substance dont on cherche a determiner la cib/e. Par rapport au criblage haut debit de medicaments candidats in vitro, elle presente I'avantage de permettre la selection des substances actives sans avoir a determiner a I'avance sur quelle proteine on souhaite agir. En outre, comme il s'agit d'un test in vivo, seules les substances capables de traverser la paroi cellulaire et qui ne sont pas rnetabolisees trop rapidement sont selectionnees, (G. Giavever et al. [1999] Nat. Genet. 21, 278-283). •
a
C.L. 10 BIOFUTUR 189 • Mai 1999
tridimensionnelle de la PrPsc par RMN, avec a la clef la possibilite d'obtenir des anticorps specifiques, pour ameliorer les tests de diagnostic existants (fondes sur des anticorps non specifiques) (voir Biofutur 183, p. 13). Dominique Dormont, du CEA de Fontenay-aux-Roses, ernet toutefois quelques reserves : « Ces resultats ont ete obtenus avec une proteine recombinante, produite non pas par un animal, mais par une bacterie. La finition de la proteine etudiee ici n'est done sans doute pas la meme que celie de la proteine a l' origine de la maladie ». Prochaine etape, donc : voir si cette PrPsc recombinante generee in vitro provoque in vivo l'apparition de la maladie, chez la souris. En outre, il faudra verifier que des variations de pH similaires provoquent la transformation de la proteine naturelle.
C.L.
(1)8.B. Prusiner etal.[1991] Science 252, 1515. (2) G.8. Jackson etat. [1999] Science 283, 1935-1937.
GENOME
Un interrupteur genique demasque ?
S
elon leur nature, nos cellules n'expriment qu'une infime partie de notre genome, adaptee a leur fonction. Chez les mammiferes, la transcription du reste du genome est generalernenr bloquee par la fixation de groupements methyles sur des nucleotides bien specifiques : les cytosines precedant une guanine (CpG). Dans quelques cas cependant, au cours du developpement ernbryonnaire ou dans certains cancers notamment, une dernethylation des genes survient. Pour la premiere fois, des chercheurs de l'universite McGill, a Montreal (Canada), viennent de doner Ie gene d'une enzyme vraisemblablement capable d'exciser les groupements merhyles presents sur les CpG de I'ADN. S'appuyant sur Ie fait que, selon toute vraisemblance, une enzyme capable de dernethyler les CpG doit d'abord savoir les reconnaitre et s'y fixer, les scientifiques se sont, dans un premier temps, mis en quere d'une telle enzyme. Or, en analysant les ARN messagers de tous les genes exprirnes par une lignee de cellules humaines (HeLa), les chercheurs ont deniche une nouvelle proreine de 262 acides amines qui possede un domaine similaire au site de fixation d'une proteine connue
pour se fixer specifiquernent aux CpG merhyles, la MeCP2. In vitro, la nouvelle proteine presente bien une activite demerhylase : elle est capable, entre autres, de rendre un plasmide methyle sensible a une enzyme de restriction normalement inactive en presence de groupements methyles. Reste toutefois a determiner son acrivite in vivo. Curieusement, si to us les tissus sains etudies expriment bien Ie gene decouvert par les Canadiens, I'activite demethylase correspondante n'a ere observee que dans une lignee de cellules pulmonaires cancereuses. « Les chercheurs devront done, par exemple, etudier in vivo les effets de l'inactivation du gene de cette enzyme sur la vague de demetbylation massive obseruee au debut du deueloppement embryonnaire -. souligne Agnes Yeivin, de l'Institur Pasteur, a Paris. Quant aux applications eventuelles de la decouverte de cette demethylase (si die est confirmee), elles sont surtout scientifiques. « On peut en effet difficilement imaginer jouer sur l'actiuite d'une enzyme dont le role est aussi general", estime-t-elle. (S.K. Bhattacharya et at. [1999] Nature 397, 579-583).
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Quand Ie prion se metamorphose
Anticoagulant
Des chercheurs de Sanofi ontsynthetise chimiquement une nouvelle molecule susceptible de remplacer avantageusement l'heparlne, I'anticoagulantIe plusutilise au monde. Oix lois plusactive et depourvue d'effets secondaires, la nouvelle molecule estaussi beaucoup pluspelile que "h!lparine. Ainsi, elle presente une affinite avec I'antithrombine (I'inhibiteur de l'un des lacteurs de coagulation sanguine les plus importants), bien plusimportante que I'haparine elte-mems. Reduile austrict minimum, la molecule est, en outre, beaucoup moins toxique. (Nature [1999] 398, 417-422)
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induirait ensuite la transformation de ses voisines normales, selon un mecanisme encore rnysterieux (1). L'equipe de John Collinge, de l'Imperial College School of Medicine a Londres, vient cependant de reussir a observer in vitro la metamorphose d'une proteine prion recombinante, produite par genie genetique dans Escherichia coli (2). La simple reduction du pH du milieu (de 8 a 4) provoque en effet la cassure d'un pont disulfure de la proteine. Celle-ci passe alors d'une structure majoritairement composee d'helices ex (comme la PrP sauvage), a une forme beaucoup plus riche en feuillets R, proche de la PrPsc. En outre, alors que In vivo, Ie prion se trouve sous la suraccumulation de PrPsc forme d'aqreqats particulierernent provoque habituellement un agrega t tres difficile a erudier, difficiles it etudier; les chercheurs parviennent ici a obtenir des concentrations devees de cette proteine partiellement resistante aux proteases, Une particularite qui devrait permettre d'etudier la structure
elon une hypothese desorrnais largement adrnise, l'apparition des encephalopathies spongiformes serait due a la transformation d'une proteine soluble, la proteine prion (PrP), en une forme insoluble resistante aux proteases (PrPsc). Seule, et par simple contact avec ses voisines, cette PrPsc
Des mutants tres sensibles
es chercheurs de l'universite Stanford (Californie) et de la firme pharmaceutique Rosetta Inpharmatics, a Kirkland (Washington D.C.), viennent de mettre au point une nouvelle technique pour identifier les cibles de medicaments potentiels. Une nouvelle occasion, pour /a levure Saccharomyces cerevisiae, de faire preuve de son interet en recherche pharmaceutique. L'objectif des chercheurs etalt de creer une collection de levures mutantes, utilisables pour tester de nouvelles substances, en tirant parti du phenomena de « dosage genique » selon lequel Ie niveau d'expression d'une protelne est proportionnel au nombre de copies va/ides du gene correspondant (deux, en temps normal). Pour commencer, les chercheurs ont cree differentes souches mutantes ne possedant, pour un gene pris au hasard, qu'un unique allele fonctionnel, Ie deuxiems etant inactive par I'insertion d'une courte sequence d'ADN (une sorte de code barre rnoleculalre) qui permettra au passage d'identifier Ie mutant par PCR. Selon les chercheurs, ce type de mutation devrait se traduire par une sensiblllte accrue aux substances ayant pour cible la proteine correspondant au gene ainsi aftecte, via une nette diminution de son taux d'expression. Pour verifier la validite de leur hypothese, les chercheurs ont compare la croissance de mutants cultives sur un milieu contenant un medicament dont la cible est connue, avec celie de la souche sauvage cultivee dans les memes conditions. Et ca marche : Ie suivi des populations par PCR revele que seules les souches dont Ie gene cible est mute ne se developpent pas normalement. Mieux, cette technique donne egalement des resultats convaincants dans la determination de la cible de medicaments potentiels. Pour cela, differents mutants sont cultlves sur un milieu contenant la substance dont on cherche a determiner la cib/e. Par rapport au criblage haut debit de medicaments candidats in vitro, elle presente I'avantage de permettre la selection des substances actives sans avoir a determiner a I'avance sur quelle proteine on souhaite agir. En outre, comme il s'agit d'un test in vivo, seules les substances capables de traverser la paroi cellulaire et qui ne sont pas rnetabolisees trop rapidement sont selectionnees, (G. Giavever et al. [1999] Nat. Genet. 21, 278-283). •
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C.L. 10 BIOFUTUR 189 • Mai 1999
tridimensionnelle de la PrPsc par RMN, avec a la clef la possibilite d'obtenir des anticorps specifiques, pour ameliorer les tests de diagnostic existants (fondes sur des anticorps non specifiques) (voir Biofutur 183, p. 13). Dominique Dormont, du CEA de Fontenay-aux-Roses, ernet toutefois quelques reserves : « Ces resultats ont ete obtenus avec une proteine recombinante, produite non pas par un animal, mais par une bacterie. La finition de la proteine etudiee ici n'est done sans doute pas la meme que celie de la proteine a l' origine de la maladie ». Prochaine etape, donc : voir si cette PrPsc recombinante generee in vitro provoque in vivo l'apparition de la maladie, chez la souris. En outre, il faudra verifier que des variations de pH similaires provoquent la transformation de la proteine naturelle.
C.L.
(1)8.B. Prusiner etal.[1991] Science 252, 1515. (2) G.8. Jackson etat. [1999] Science 283, 1935-1937.
GENOME
Un interrupteur genique demasque ?
S
elon leur nature, nos cellules n'expriment qu'une infime partie de notre genome, adaptee a leur fonction. Chez les mammiferes, la transcription du reste du genome est generalernenr bloquee par la fixation de groupements methyles sur des nucleotides bien specifiques : les cytosines precedant une guanine (CpG). Dans quelques cas cependant, au cours du developpement ernbryonnaire ou dans certains cancers notamment, une dernethylation des genes survient. Pour la premiere fois, des chercheurs de l'universite McGill, a Montreal (Canada), viennent de doner Ie gene d'une enzyme vraisemblablement capable d'exciser les groupements merhyles presents sur les CpG de I'ADN. S'appuyant sur Ie fait que, selon toute vraisemblance, une enzyme capable de dernethyler les CpG doit d'abord savoir les reconnaitre et s'y fixer, les scientifiques se sont, dans un premier temps, mis en quere d'une telle enzyme. Or, en analysant les ARN messagers de tous les genes exprirnes par une lignee de cellules humaines (HeLa), les chercheurs ont deniche une nouvelle proreine de 262 acides amines qui possede un domaine similaire au site de fixation d'une proteine connue
pour se fixer specifiquernent aux CpG merhyles, la MeCP2. In vitro, la nouvelle proteine presente bien une activite demerhylase : elle est capable, entre autres, de rendre un plasmide methyle sensible a une enzyme de restriction normalement inactive en presence de groupements methyles. Reste toutefois a determiner son acrivite in vivo. Curieusement, si to us les tissus sains etudies expriment bien Ie gene decouvert par les Canadiens, I'activite demethylase correspondante n'a ere observee que dans une lignee de cellules pulmonaires cancereuses. « Les chercheurs devront done, par exemple, etudier in vivo les effets de l'inactivation du gene de cette enzyme sur la vague de demetbylation massive obseruee au debut du deueloppement embryonnaire -. souligne Agnes Yeivin, de l'Institur Pasteur, a Paris. Quant aux applications eventuelles de la decouverte de cette demethylase (si die est confirmee), elles sont surtout scientifiques. « On peut en effet difficilement imaginer jouer sur l'actiuite d'une enzyme dont le role est aussi general", estime-t-elle. (S.K. Bhattacharya et at. [1999] Nature 397, 579-583).
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