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Developpement des tubes de malpighi adultes obtenus par transplantation de disques imaginaux chez Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae)
Int. J. Insect Morphol. & Embryol., Vol. 11, No. 3/4, pp. 161 to 171, 1982 Printed in Great Britain.
00~,,- Jo ,050161 - 11 $03.00/0 9 1982 Pergamon Press Ltd.
DEVELOPPEMENT DES TUBES DE MALPIGHI ADULTES OBTENUS PAR TRANSPLANTATION DE DISQUES IMAGINAUX CHEZ GALLERIA MELLONELLA L. (LEPIDOPTERA : PYRALIDAE) BERNARD LE GARFF et ROGER BARBIER Laboratoire de Zoologie Fondamentale et de Biologie du D,~veloppement, U.E.R. des Sciences de la Vie et de l'Environnement, Avenue du G6nbral Leclerc, 35042 Rennes Cedex, France
(Accepted 25 January 1982) Abstract--The role of larval mitoses, which insure the growth of the imaginal disks, and
the role of the pupal endomitoses, which insure the differentiation and the development of adult malpighian cells, have been controlled by transplantations of imaginal disks in Galleria mellonella L. (Lepidoptera : Pyralidae). The limit of the larval- pupal period, which allows complete development of adult malpighian tubules, has been determined precisely. The supernumerary malpighian tubules formed from implanted imaginal disks participate in the refinement of the internal medium of the receiver. But, non-removal of the excretion products modifies the metabolism of the malpighian tubules and consistently induces the formation of intranuclear crystals. Index descriptors (in addition to those in title): Organogenesis, metamorphosis,
endomitosis, ultrastructure, intranuclear crystals.
INTRODUCTION LA MORPHOLOGIE du syst~me malpighien des L6pidopt~res a 6t6 d6crite par de nombreux auteurs. Pour les larves, il existe un sch6ma constant (Metalnikov, 1908; Bordas, 1911): les tubes, au nombre de 6, sont dispos6s de facon sym6trique en 2 groupes lat6raux de 3 J 616ments. Les 3 tubes de chaque c6t6 confluent en un canal collecteur qui d6bouche dans le tube digestif entre l'intestin moyen et l'intestin post6rieur. Les parties distales des tubes constituent avec le rectum une zone crypton6phridi6e. Pour les adultes, la disposition est tr6s semblable (Bordas, 1919), mais d6pourvue de zone crypton6phridi6e. Bien que le syst6me malpighien des nymphes n'ait pratiquement pas 6t6 6tudi6, les auteurs admettent que le syst6me larvaire,/t peine remani6, persiste/l la m6tamorphose. Nous avons v6rifi6 cette persistance chez une cinquantaine d'esp~ces (Le Garff, 1976) et precis6 les remaniements qui l'accompagnent chez Vanessa io (Le G a r f f et Barbier, 1981). Dans le cas particulier de l'adulte de Galleria mellonella, un syst6me n+oform6 de morphologie exceptionnelle " a p p a r a W ' (Cholodkovsky, 1887), bien que le syst6me malpighien de la larve soit de type classique (Metalnikov, 1908). Le syst6me imaginal de Galleria est constitu6 de tubes nombreux et ramifies dispos6s en 2 touffes sym+triques lat6rales qui d6bouchent dans l'intestin. Lors de la nymphose, les 2 canaux collecteurs larvaires persistent (Le Garff, 1972) tandis que les tubes larvaires d6g6n+rent puis, disparaissent. Deux disques imaginaux, situ6s chacun sur un canal collecteur, formeront les 2 syst~mes lat6raux de l'adulte. La mise en place des disques imaginaux au cours de la vie larvaire, puis leur transformation pendant la nymphose, ont 6t6 6tudi6es 161
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BEANARD LE GARFF et ROGER BARBIER
a n t ~ r i e u r e m e n t (Le G a r f f et Allegret, 1973; Le G a r f f , 1974): 2 p~riodes, m i t o t i q u e puis e n d o m i t o t i q u e , se succ~dent. Les cycles mitotiques des disques i m a g i n a u x malpighiens o n t le m~me r y t h m e (un seul par intermue) que les cycles m i t o t i q u e s de l ' 6 p i d e r m e (Barbier, 1971), mais se p r o d u i s e n t plus tard: p o u r le dernier stade, n o u s avons observ6 les premieres mitoses apr~s la " m o n t 6 e " , et les derni6res h la m u e n y m p h a l e (r6sultats n o n publi6s). Le n o m b r e des cellules des disques double/~ chaque stade larvaire et atteint ainsi le n o m b r e d6finitif des 616ments malpighiens de l'adulte. D6s le d6but de la n y m p h o s e , les cellules des disques ne se m u l t i p l i e n t plus mais effectuent des e n d o m i t o s e s ; leur croissance et leur diff6renciation assurent l'organog6n6se des tubes de Malpighi de l ' a d u l t e . Dans ce n o u v e a u travail, n o u s a v o n s qoulu pr6ciser les modalit6s du d 6 v e l o p p e m e n t du disque i m a g i n a l par la technique des t r a n s p l a n t a t i o n s , tout en contr61ant l ' 6 v o l u t i o n m o r p h o l o g i q u e , cytologique et u l t r a s t r u c t u r a l e des tubes issus de l ' i m p l a n t . Nous a v o n s recherch~ les r61es respectifs de l ' i m p l a n t et du receveur, lors du d 6 v e l o p p e m e n t des disques implant6s, par divers protocoles e x p 6 r i m e n t a u x dans le b u t de r6pondre aux questions suivantes: - - L o r s de t r a n s p l a n t a t i o n s synchrones, le receveur permet-il le d 6 v e l o p p e m e n t d ' u n syst6me m a l p i g h i e n suppl6mentaire, ou mOme de plusieurs? - - S i oui, existe-t-il u n e identit6 ou u n e h o m o l o g i e entre les caract6res qualitatifs et q u a n t i t a t i f s des syst6mes issus des i m p l a n t s et des syst~mes n o r m a u x ? Y a-t-il c o n c u r r e n c e de d 6 v e l o p p e m e n t entre les tubes de Malpighi suppl6mentaires et ceux du receveur? - - U n e diff6rence entre les n o m b r e s de cycles mitotiques des disques du d o n n e u r et du receveur, r~sultant de t r a n s p l a n t a t i o n s a s y n c h r o n e s , emp~che-t-elle le d 6 v e l o p p e m e n t des i m p l a n t s et dans quelles limites?
MATERIEL
ET
TECHNIQUES
Choix des animaux
Les chenilles de Galleria sont ~lev~es sur cire purifis et pollen, ~t 30~ ~t l'obscurit~. Elles sont pr~levs d'une part ~tla fin de l'avant-dernier stade, et d'autre part/~ la fin du dernier, lorsqu'elles cessent de s'alimenter. Ce moment, qui correspond ~ un changement d'etat physiologique important, est facilement d~celable car il coincide avec un changement de comportement: les chenillesquitrent la nourriture puis vagabondent vers le haut du bocal d'~levage ~tla recherche d'un site favorable ~ la construction du cocon de nymphose; c'est ce que nous appellerons la "mont6e". Pour travailler sur des lots homog/mes, compte tenu des variations de poids individuelles ou dues au sexe, un contrfle pond&al est toujours effectu6 sur les larves. Mode op~ratoire
Apr~s ancsth~sie ~ l'~ther et dissection rapide des donneurs, les canaux collecteurs portant chacun un disque imaginal sont d~barrass6s des tubes de Malpighi larvaires. Ils sont ensuite pr~lev6set introduits dans une autre chenille ~galementanesth~si~e. Les implants sont introduits dans l'organisme du receveur par une petite incision lat6rale du 5~me segment abdominal. L'incision est ensuite recouverte par un carr~ de papier pour limiter l'h6morragie lors du r6veil de la chenille. Toutes les chenilles op6r6es sont isol6es, celles de l'avant-dernier stade ~tant aliment~es normalement. Des chenilles du dernier stade, isol6es ~t la "mont6e" mais n'ayant subi aucune op6rati0n, constituent les t6moins vrais. D'autres chenilles, d'~,ge identique, ayant subi une incision non suivie d'implantation, repr~sentent les t~moins exp6rimentaux. Les protocoles exp6rimentaux r~alis6s comprennent plusieurs s6ries d'exp~riences comportant chacune au moins 12 essais. Chaque protocole sera expos~ avec les r~sultats correspondants. M(thodes d'analyse des r~sultats
Apr/~s dissection des receveurs (nymphes d'hges diff~rents et adultes), nous avons mont~ c6te h c6te, sur une m~me lame, les tubes issus des implants et ceux du receveur. Les preparations sont alors fix~es au Dubosq - Brasil et color+es par la r~action nucl~ale de Feulgen, compl~t~epar une coloration cytoplasmique au vert-lumi~re. Ainsi nous avons pu contrfler les d6veloppements respectifs en ~liminant toute source d'erreur dans la comparaison des r6sultats exp6rimentaux.
D~veloppement des Tubes de Malpighi Adultes Obtenus par Tra'figpl~mtationde D~squesImaginaux
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Pour ~valuer le d6veloppement obtenu dans chaque cas, nous avons cumul~ les longueurs des tubes de Malpighi provenant de chaque disque, les assimilant ainsi ~t un tube unique. Ces mesures sont effectu6es au curvim~tre sur les photographies des pr6parations prises au microscope photonique. D'autre part nous avons mesur~ le diam~tre des tubes et la taille de leurs cellules. Enfin, pour comparer l'ultrastructure des cellules malpighiennes obtenues dans les divers cas, nous avons fixb des pi~ces par le glutarald~hyde ~ 2.507o(0.1 M), puis par l'osmium ~t2070(0. l M) tamponn~ par le phosphate de sodium. Les pi~ces sont ensuite incluses et orient6es dans l'6pon-araldite. Des coupes semi-fines, color~espar le bleu de toluidine, ont 6t~ examinees au microscopephotonique. Des coupes fines, recueillies sur des grilles, ont bt~ contrast6es par l'ac6tate d'uranyle et le citrate de plomb avaut d'etre observ~esau microscope~lectronique transmission Philips E.M.200. RESULTATS Avant d'exposer les r6sultats des diverses exp6riences, soulignons que la longueur totale de chaque syst6me lat6ral adulte issu du d6veloppement d ' u n disque imaginal est de l'ordre de 25 mm pour les t6moins vrais, mfiles et femelles. D'autre part, le d6veloppement de l'appareil malpighien des t6moins exp6rimentaux, dont deul le t~gument a 6t6 incis6, est semblable/l celui des t6moins vrais. On peut donc consid6rer que les effets de l'h6morragie et des autres cons6quences du choc op6ratoire sont n6gligeables. Les principaux protocoles exp6rimentaux et leurs r6sultats sont r+sum6s dans le Tableau 1.
1. Implantations synchrones (A) Implantation d'un deul disque. Le donneur et le receveur ayant le m~me ftge, au moment de l'implantation, l'op~ration provoque le d6veloppement d ' u n syst6me malpighien suppl6mentaire pour chaque disque implant6. Ce syst6me malpighien suppl6mentaire pr6sente, en plus de caract~res normaux et fondamentaux, certains caract~res particuliers. (i) Caractdres communs aux tubes issus des des implants, des receveurs et des t~moins. (a) Morphologie: Le syst+me malpighien suppl6mentaire se d6veloppe exactement en m~me temps que ceux du receveur selon la chronologie 6tablie pour le cas normal (Le Garff, 1974), mais il reste ind6pendant de ceux-ci et ne sera jamais en communication avec le tube digestif. La longueur totale du syst6me obtenu se r6v~le normale (25 mm environ). Quatre/t cinq jours apr~s la mue nymphale, le syst6me provenant de l'implant a, comme le syst6me normal, termin6 sa croissance en longueur; son ~talement dans la nymphe est alors maximal et favorable au contr61e: Le diam~tre des tubes issus de l'implant, ainsi que celui des tubes du receveur, restent identiques/t celui des t6moins (40 - 60/am); la taille des cellules, bien que variable, conserve 6galement le m~me ordre de grandeur (25 /am de largeur et 50 lam de longueur). Les tubes de Malpighi issus des implants produisent, comme ceux des t6moins, un liquide contenant des granulations de couleur rose p~le. (b) Ultrastructure: L'ultrastructure des tubes de Malpighi issus des implants est compar6e/l celle des tubes des receveurs et des t6moins pr61ev6s sur des nymphes de m~me w ( 4 - 5 jours). Le cytoplasme apical des cellules malpighiennes renferme d'abondants ribosomes libres et de nombreuses mitochondries qui p6n6trent dans les microviUosit6s (Fig. 1A). Entre celles-ci des expansions cytoplasmiques tendent h envahir la lumi6re des tubes. Elles renferment une substance homog6ne finement grenue of~ seules quelques rares mitochondries sont pr6sentes. Le cytoplasme basal est fortement " d 6 c o u p 6 " par de nombreux replis de la membrane plasmique (Fig. 1A). Celle-ci pr6sente des h6midesmosomes au contact de la lame basale. Les mitochondries du cytoplasme infranucl6aire sont grosses mais poss6dent une matrice tr6s r6duite. Le reticulum
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BERNARD LE GARFF et ROGER BARBIER TABLEAU 1 I
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Resume des protocoles experimentaux et des resultats. Abrdviations utilisdes: A.D.M.L.: Avant-derni~re mue larvaire; Av.D.St.L.: Avant-dernier stade larvaire; D: Donneur; D.M.L.: Derni6re mue larvaire; D.St.L.: Dernier stade larvaire; L.: Longueur totale des tubes de Malpighi des t6moins (25 mm); M.: Moment de la "mont6e"; M.C.I.: Masse cellulaire inorganis~e; M.I.: Mue imaginale; M.Ny.: Mue nymphale; n.St.L.: n. stades larvaires; Ny.: Nymphe; P.C.: Population cellulaire et croissance cellulaire; PrNy.: Pr6nymphe; R." Receveur; T.M.: Tubes de Malpighi. Symboles utilis~s: carr6 noir ( i ) : Disque imaginal transplantS; fl~che noire (~): D~veloppement du disque imaginal; tiret6 noir ( . . . . ): Attente de d~veloppement du disque; fl6che blanche (~); Transplantation de disque imaginal; 6toile noire (~-): Cycle mitotique; signe XXXX: Cycles endomitofiques.
endoplasmique granulaire, 6galement abondant, se dilate en v~sicules ofi s'accumulent des mat6riaux ayant 2 aspects tr~s diff~rents. Les premiers, les plus abondants, constituent des concr6tions ayant la forme de sph~rites qui restent envelopp~s par le reticulum granulaire. Ils sont form,s par des d~p6ts concentriques de couches sombres et de couches claires altern6es (Fig. I B, C). Les seconds mat~riaux, moins abondants, s'accumulent dans des v~sicules plus petites, souvent localis~es dans les r6gions infranucl6aires, entour~es par des digitations du noyau. Ils ont un aspect granuleux tr~s dispers~ et h6t6rog~ne, de sorte que les v~sicules apparaissent claires aux 61ectrons (Fig. 1D). Elles migrent vers le cytoplasme apical off on
D~veloppement des Tubes de Malpighi Adultes Obtenus par Transplantation de Disques Imaginaux
Tubes de Malpighi adultes obtenus par implantation de disques imaginaux chez Galleria mellonella. FIG. 1. A. Aspect d'ensemble de l'~pith~lium malpighien; contre la lame basale (lb), les replis de la membrane plasmique constituent de profondes invaginations (in). Les noyaux (n) pr~sentent une r~partition homog~ne des areas chromatiques (ch); le cytoplasme p~rinuclbaire contient un abondant reticulum granulaire (rg); la r~gion apicale est bord6e de microvillositbs {mv) contenant des mitochondries (m). La lumi~re (1) des tubes renferme des v~sicules claires (v). B. Des sph6rites (s) apparaissent dans certaines r~gions du cytoplasme infranuc|~aire. C. Les sph~rites (s) se forment dans des dilatations du r~ticulum granulaire (rg). D. Des vbsicules/t contenu granuleux (vg) proviennent du r~ticulum puis migrent vers les microvillosit6s (mv).
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les retrouve/t la base des microvillosit~s et m~me/l l'int6rieur de celles-ci. (ii) CaractOres particuliers aux tubes issus des implants. Apr6s le 5e jour de la vie nymphale, le syst6me surnum~raire s'entoure d'une enveloppe form6e de tissus provenant du donneur, comme l'atteste la chromatine sexuelle femelle dans les cas favorables off le donneur et le receveur sont de sexes diff6rents. L'enveloppe est constitute par la proliferation des trach~es apport~es avec l'implant et contient, comme dans un filet, le syst6me malpighien obtenu. C'est pourquoi il est pr6f6rable d'effectuer les dissections des receveurs avant le 6e jour de la vie nymphale, soit 8/t 9 jours apr~s l'implantation des disques. La base du syst+me, qui ne communique pas avec l'intestin du receveur, s'est obtur6e et les tubes fonctionnent sans 6vacuation. Le liquide form6 s'accumule dans la lumi6re de la zone de confluence des tubes, provoquant ainsi une v6ritable ampoule par dilatation de la base du syst6me. De plus, au del/~ du 5e jour, l'enveloppe qui appara~t comprime l'ampoule et la surpression qui en r6sulte favorise son 6clatement lors de la dissection. L'observation de l'ultrastructure des cellules issues des disques implant6s, permet de mettre en 6vidence la formation r6guli6re de cristaux intranucl6aires (Fig. 2A et B). Ils ont la forme d'un cube dont le c6t6 peut d6passer 1 txm et sont constitu6s d'une trame fibrogranuleuse pourvue d'une p6riodicit6 de 22 nm entre les fibres. Les cristaux sont toujours localis6s entre les nucl6oles ou tout pros d'eux, ce qui permet de les rep~rer plus facilement lorsqu'ils sont incompl6tement form6s. Bien que tr6s rare, leur pr6sence dans le cytoplasme a cependant 6t~ constat6e. Par ailleurs, soulignons que nous n'avons jamais trouv6 de cristaux intranucl6aires ni dans les tubes de Malpighi des receveurs ni dans ceux des t6moins. De plus ces cristaux n'ont jamais 6t6 observ+s dans les disques imaginaux des donneurs. (B) Implantation de plusieurs disques. Lorsque 2 disques imaginaux d'une chenille du dernier stade ~ la " m o n t 6 e " , sont implant6s dans une chenille de meme age, la longueur totale des tubes issus de chaque implant mesure environ 25 mm, soit la longueur d'un syst6me lat6ral provenant d'un disque t6moin. De mOme, lorsque quatre disques pr61ev6s sur 2 chenilles du dernier stade /l la " m o a t ~ e " sont implant+s dans une chenille de m~me ftge, chaque implant produit un syst6me malpighien dont la longueur reste identique /t celle observ6e chez les t~moins (25 mm). D'autre part, comme dans le cas d ' u n seul implant, le diam~tre des tubes ainsi que les dimensions cellulaires et les aspects cytologiques sont rest6s conformes/l ceux des t6moins. 2. Implantations asynchrones Ce second type d'op6rations permet, d'une part, de pr6ciser le r61e de la population cellulaire pr6sente dans le disque implant6, et d'autre part, de d6terminer les limites de la p6riode compatible avec un d6veloppement normal. (A) Receveurs n "ayant pas d~pass~ le moment de la "'montde". (i) Implant plus jeune que le receveur. Les disques imaginaux de chenilles de la fin de l'avant-dernier stade ont un cycle mitotique de retard lorsqu'ils sont implant6s dans des chenilles de la fin du dernier stade. Malgr~ cette difference, chaque implant donne toujours un syst~me malpighien. Chaque syst6me ainsi obtenu poss6de des tubes dont le diam6tre est normal, et dont les cellules ont une taille identique/~ celles des t6moins. Toutefois la longueur totale des tube de chaque syst6me est r6duite de moiti6 par rapport/t celle des receveurs et des t6moins, et n'atteint que 12 mm environ.
D6veloppement des Tubes de Malpighi Adultes Obtenus par Transplantation de Disques lmaginaux
F16. 2. A. Des cristaux intranuclhaires (cr) caract6risent les cellules malpighiennes provenant des implants. Ils sont toujours associ6s aux nucl6oles (nu). B. Un autre cristal (cr), vu a un plus fort grossissement, situ4 prbs du nucl6ole (nu) et de l'enveloppe nucl4aire (en).
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BERNARD LE GARFF el ROGER BARBIER
(ii) Implant plus ~gd gue le receveur. Les disques imaginaux de chenilles en fin de dernier stade ont un cycle mitotique d'avance par rapport aux receveurs lorsqu'ils sont implant6s dans des larves en fin d'avant-dernier stade. Chaque implant produit cette fois un syst~me en tous points identique h ceux du receveur et des t+moins (longueur totale, diam6tre des tubes, et dimensions cellulaires). Malgr6 un s6jour dans l'organisme receveur correspondant ~t un stade larvaire suppl6mentaire, le disque imaginal implant6 ne semble pas avoir augment6 sa population cellulaire au delh de la normale. I1 n'a pas fait de cycle mitotique suppl6mentaire au moment oth le receveur effectuait son dernier cycle normal. Malgr6 cette p6riode d'attente, le disque reste capable d'assurer une diff+renciation imaginale normale. (B) Receveurs ayant ddpassd le moment de la "'mont~e". Dans les 4 s~ries exp6rimentales suivantes, les disques imaginaux sont toujours pr61ev6s sur des larves de la fin du dernier static au moment de la " m o n t 6 e " , mais sont implant6s darts des receveurs plus fig6s et d'~ge croissant. Le contr61e, effectu6 sur des nymphes de 5 jours, donne les r6sultats suivants: - - L o r s q u e les receveurs sont des chenilles en pr~nymphose, environ deux jours apr6s la " m o n t ~ e " , on obtient encore des syst6mes malpighiens suppl6mentaires mais dont la longueur est d6j~ inf6rieure h la normale. De plus, les tubes pr+sentent un aspect atypique et la coloration rose de leur contenu devient plus intense. - - L o r s q u e les receveurs sont des nymphes qui viennent de muer (non encore pigment6es), les disques imaginaux produisent des syst6mes malpighiens tr6s incomplets et atypiques. Ils sont accompagn6s d'une masse cellulaire inorganisbe de teinte rose vif. - - L o r s q u e les receveurs sont des nymphes de 10 hr on observe des ph6nom6nes identiques fi ceux d6crits pr6c6demment mais plus accentu6s: seulement quelques tubes de Malpighi atypiques Se sont form6s tandis que la masse inorganis6e est devenue plus grande, sa coloration plus intense tendant vers le rouge. - - L o r s q u e les receveurs sont des nymphes de 30 hr, aucun tube de Malpighi ne se forme tandis que la masse cellulaire, encore plus importante, devient rouge vif.
DISCUSSION
ET C O N C L U S I O N
Les rSsultats expSrimentaux confirment que les territoires cellulaires 8tudiSs antSrieurement chez la chenille (Le Garff, 1972) sont effectivement les disques imaginaux du systSme malpighien du papillon, et que les tubes larvaires ne sont pas remaniSs chez Galleria, comme dans le cas g6n6ral des L6pidoptSres, puisqu'ils sont enlev6s avant la transplantation du disque. Nos rSsultats concernent aussi les r61es respectifs de l'implant et du receveur, ainsi que leurs limites, dans le d~veloppement des tubes de l'adulte. Ils permettent aussi des observations originales sur le fonctionnement malpighien du papillon. Les disques imaginaux de larves de dernier stade ~t la " m o n t S e " implantSs dans des chenilles de m~me ~tge donnent autant de syst~mes malpighiens supplSmentaires dont la taille est identique ~ celle des tubes des receveurs et des tSmoins. Le d~veloppement des disques du donneur et celui des disques du receveur sont parfaitement synchrones. Le milieu interne du receveur contr61e donc le d~veloppement des disques implant,s. De plus, ceux-ci ont effectu8 leur dernier cycle mitotique larvaire puisqu'ils ont produit autant de cellules malpighiennes que les disques des t6moins. D'autre part, il n'y a pas de
D~veloppementdes Tubes de Malpigbi AdultesObtenus par Transplantationde Disques Imaginaux
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concurrence de d6veloppement entre eux, ni entre eux et ceux du receveur, m~me lorsque 4 disques sont implant,s simultan~ment. Rappelons par ailleurs que des trach6es larvaires, apport~es lors de l'opbration, peuvent prolifbrer et, en fin de vie nymphale, enfermer les tubes dans un r~seau qui les comprime. L'amplitude de d6veloppement des tubes adultes d~pend directement du nombre de cycles mitotiques effectu6s par le disque imaginal au cours de la vie larvaire: Lorsque des disques imaginaux sont implant6s avec un cycle mitotique de retard par rapport ~ ceux du receveur, ils r~pondent n6anmoins au milieu interne de celui-ci en donnant chacun un syst~me malpighien. De plus, le d6veloppement des disques implant6s et celui des disques du receveur restent synchrones, et les dimensions cellulaires restent identiques ~ celles des t6moins. Par contre, la longueur totale des tubes est r6duite de moiti6. Ce d6ficit de d~veloppement r~sulte de la r~duction de moiti~ de la population cellulaire des disques, due, elle-m~me, au fait que le retard d'un cycle mitotique a 6t~ conserv6. Cependant, les cellules des disques implant6s ont effectu6 le m6canisme normal de polyplol'disation comme l'indiquent les dimensions cellulaires des tubes de Malpighi obtenus. Ces r~sultats compl6tent ceux obtenus par carences protidiques (Le Garff, 1977), grace auxquelles nous avons bgalement produit un systbme malpighien rbduit, mais par diminution de la taille des cellules des tubes et non par diminution de leur nombre, l'activit6 endomitotique ayant seule 6t6 r6duite lors de la morphogen6se imaginale. Lorsque des disques imaginaux sont implant6s avec un cycle mitotique d'avance par rapport aux disques du receveur, il est logique de penser qu'ils vont effectuer un cycle mitotique surnum6raire lorsque ceux du receveur vont r6aliser leur dernier cycle normal. On peut s'attendre ~ obtenir un doublement de la taille du syst~me par rapport ~ la normale. I1 n'en est rien puisque leur d6veloppement reste identique ~ celui des t6moins. Ceci implique pratiquement une limite maximale de d~veloppement des tubes de Malpighi de l'adulte. Ces exp6riences apportent, en outre, les 2 r6sultats suivants: d'une part, l'~tat hormonal du receveur lorsqu'il atteint la fin du dernier stade larvaire, est sans action sur l'activit~ mitotique des ceUules des disques implant6s. La " m a t u r a t i o n " de leurs cellules, d~j~ acquise peu apr~s l'implantation, semble les emp~cher de r6pondre aux conditions hormonales qui provoquent pourtant le dernier cycle mitotique des disques du receveur. L'importance de la " m a t u r a t i o n " a 6t6 soulign6e pour le d6veloppement postembryonnaire de l'~piderme de Pieris brassicae (Mauchamp, 1980). D'autre part, bien que les disques du donneur aient d6j~ termin~ leur croissance normale, ils ne se diff~rencient pas mais restent en attente dans le receveur pendant le dernier stade larvaire. L'organogen6se de l'appareil malpighien provenant de l'implant ne d6butera qu'en d6but de nymphose, en m~me temps que celle de l'appareil malpighien du receveur, lorsque les conditions hormonales se seront modifi~es et permettront l'activit6 endomitotique des cellules des disques imaginaux. Les p~riodes mitotique et endomitotique des disques imaginaux malpighiens correspondent respectivement aux pics d'ecdyst6rone qui s'6tablissent vers la 152e hr du dernier stade larvaire et vers la 24e hr du stade nymphal (Sehnal et al., 1981). Le degr~ de d6veloppement des implants est conditionn6 par l'fige du receveur: Lorsque les disques imaginaux provenant de larves /~ la " m o n t 6 e " sont implant6s dans des receveurs plus ftg~s, les tubes se d6veloppent incompl6tement tandis que se forme une masse cellulaire inorganis6e. La longueur des tubes ainsi obtenus est inversement proportionnelle ~ l'~ge du receveur au moment de l'implantation. Au contraire, le volume de la masse cellulaire form6e est proportionnel ~ l'fige du receveur. Enfin, lorsque les
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disques sont implant6s plus tardivement encore (dans des nymphes de plus de 20 hr), l'6tat physiologique du receveur ne leur permet plus aucun d~veloppement. Par contre, une masse cellulaire inorganis6e reste toujours pr~sente. Celle-ci r~sulte du d~veloppement aberrant d'une partie ou m~me de la totalit~ du disque imaginal. La " m o n t 6 e " qui pr6c~de le filage du cocon correspond donc, pour le receveur, h u n moment critique au del~t duquel l'implantation des disques imaginaux ne peut aboutir ~t un syst~me malpighien complet: non seulement le disque implant~ n'a pas fait le dernier cycle mitotique qui suit normalement la mont6e, mais il a aussi 6vit6 une partie plus ou moins grande, selon les cas exp~rimentaux, de la p6riode qui induit les endomitoses. Des exp6riences compl~mentaires, actuellement en cours, sont n~cessaires pour comprendre cette perturbation croissante de l'organogen~se. Des r6implantations des masses cellulaires obtenues, en milieu favorable, permettront de v6rifier si elles sont encore capables de donner des tubes de Malpighi, m~me atypiques, ce qui serait comparable aux cas de transd~termination d~crits par Hadorn (1966) pour la drosophile. D'autre part, l'augmentation de la coloration des masses cellulaires semble provenir de la concentration de la substance qui colore les tubes t~moins en rose pgtle et dont la nature reste h pr,~ciser. Dans t o u s l e s cas o~ l'on obtient des tubes imaginaux h morphologie normale, les aspects cytologique et ultrastructural sont 6galement rest~s conformes aux t~moins. Des sph~rites sont observ6s dans les cellules issus des implants comme dans celles des t6moins. Ceci prouve que m~me lorsque les tubes proviennent de disques implant,s, ils sont fonctionnels et participent ~ l'~puration de l'h~molymphe du receveur. Des urosph~rites tout ~t fair semblables ont ~t~ signal6s dans les cellules malpighiennes de Achetadomestica (Berkaloff, I961). D'autre part, les tubes issus des implants n'~tant plus connect6s ~ l'appareil digestif, leur contenu ne peut s'~vacuer et s'accumule tandis que des cristaux intranucl~aires se forment de facon r6guli~re. Leur presence semble li6e au fonctionnement anormal du syst~me malpighien implant6, car nous n'en avons jamais observ6 dans les tubes adultes des receveurs ni dans ceux des t~moins. De plus, les cristaux intranucl6aires n'ont pu ~tre apport6s avec les disques implant,s car ceux des larves t6moins en sont toujours d~pourvus. Des cristaux comparables, de nature prot~ique, ont 6t~ observes dans diverses cellules, notamment darts celles de l'intestin moyen de Tenebrio molitor (Thomas, 1972; Thomas et Gouranton, 1973) et de Gyrinus marinus (Gouranton et Thomas, 1976). Chez Galleria, comme dans les cas pr~cit~s, les cristaux intranucl~aires ont une taille inversement proportionnelle &celle des nucl~oles pros desquels ils se forment. Leur origine semble ~tre 6galement extranucl~aire car leur presence a ~t~ observ6e dans le cytoplasme. La possibilit6 de provoquer exp~rimentalement la formation de cristaux intranucl~aires chez Galleria peut constituer un module exp6rimental favorable pour aider & r6soudre le probl~me de leur signification dans les cas off ils sont signal6s comme spontan6s et permanents. Remerciements--Nous remercions M a d a m e Allo et Monsieur D~delot pour leur collaboration technique.
BIBL1OGRAPHIE BARBIER, R. 1971. Recherches sur la morphog6n~se t~gumentaire d ' u n insecte holom~tabole: Galleria mellonella L. (L~pidopt~res Pyralidae). Th~se d'Etat, Rennes, C . N . R . S . n o AO 5630. BERKALOF~, A. 1961. Contribution ~t l'6tude des tubes de Malpighi et de l'excr~tion chez les insectes. Observation au microscope ~lectronique. Th~se Sc. Nat. Masson. Paris.
D~veloppement des Tubes de Malpighi Adultes Obtenus par Transplantation de Disques Imaginaux
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00~,,- Jo ,050161 - 11 $03.00/0 9 1982 Pergamon Press Ltd.
DEVELOPPEMENT DES TUBES DE MALPIGHI ADULTES OBTENUS PAR TRANSPLANTATION DE DISQUES IMAGINAUX CHEZ GALLERIA MELLONELLA L. (LEPIDOPTERA : PYRALIDAE) BERNARD LE GARFF et ROGER BARBIER Laboratoire de Zoologie Fondamentale et de Biologie du D,~veloppement, U.E.R. des Sciences de la Vie et de l'Environnement, Avenue du G6nbral Leclerc, 35042 Rennes Cedex, France
(Accepted 25 January 1982) Abstract--The role of larval mitoses, which insure the growth of the imaginal disks, and
the role of the pupal endomitoses, which insure the differentiation and the development of adult malpighian cells, have been controlled by transplantations of imaginal disks in Galleria mellonella L. (Lepidoptera : Pyralidae). The limit of the larval- pupal period, which allows complete development of adult malpighian tubules, has been determined precisely. The supernumerary malpighian tubules formed from implanted imaginal disks participate in the refinement of the internal medium of the receiver. But, non-removal of the excretion products modifies the metabolism of the malpighian tubules and consistently induces the formation of intranuclear crystals. Index descriptors (in addition to those in title): Organogenesis, metamorphosis,
endomitosis, ultrastructure, intranuclear crystals.
INTRODUCTION LA MORPHOLOGIE du syst~me malpighien des L6pidopt~res a 6t6 d6crite par de nombreux auteurs. Pour les larves, il existe un sch6ma constant (Metalnikov, 1908; Bordas, 1911): les tubes, au nombre de 6, sont dispos6s de facon sym6trique en 2 groupes lat6raux de 3 J 616ments. Les 3 tubes de chaque c6t6 confluent en un canal collecteur qui d6bouche dans le tube digestif entre l'intestin moyen et l'intestin post6rieur. Les parties distales des tubes constituent avec le rectum une zone crypton6phridi6e. Pour les adultes, la disposition est tr6s semblable (Bordas, 1919), mais d6pourvue de zone crypton6phridi6e. Bien que le syst6me malpighien des nymphes n'ait pratiquement pas 6t6 6tudi6, les auteurs admettent que le syst6me larvaire,/t peine remani6, persiste/l la m6tamorphose. Nous avons v6rifi6 cette persistance chez une cinquantaine d'esp~ces (Le Garff, 1976) et precis6 les remaniements qui l'accompagnent chez Vanessa io (Le G a r f f et Barbier, 1981). Dans le cas particulier de l'adulte de Galleria mellonella, un syst6me n+oform6 de morphologie exceptionnelle " a p p a r a W ' (Cholodkovsky, 1887), bien que le syst6me malpighien de la larve soit de type classique (Metalnikov, 1908). Le syst6me imaginal de Galleria est constitu6 de tubes nombreux et ramifies dispos6s en 2 touffes sym+triques lat6rales qui d6bouchent dans l'intestin. Lors de la nymphose, les 2 canaux collecteurs larvaires persistent (Le Garff, 1972) tandis que les tubes larvaires d6g6n+rent puis, disparaissent. Deux disques imaginaux, situ6s chacun sur un canal collecteur, formeront les 2 syst~mes lat6raux de l'adulte. La mise en place des disques imaginaux au cours de la vie larvaire, puis leur transformation pendant la nymphose, ont 6t6 6tudi6es 161
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BEANARD LE GARFF et ROGER BARBIER
a n t ~ r i e u r e m e n t (Le G a r f f et Allegret, 1973; Le G a r f f , 1974): 2 p~riodes, m i t o t i q u e puis e n d o m i t o t i q u e , se succ~dent. Les cycles mitotiques des disques i m a g i n a u x malpighiens o n t le m~me r y t h m e (un seul par intermue) que les cycles m i t o t i q u e s de l ' 6 p i d e r m e (Barbier, 1971), mais se p r o d u i s e n t plus tard: p o u r le dernier stade, n o u s avons observ6 les premieres mitoses apr~s la " m o n t 6 e " , et les derni6res h la m u e n y m p h a l e (r6sultats n o n publi6s). Le n o m b r e des cellules des disques double/~ chaque stade larvaire et atteint ainsi le n o m b r e d6finitif des 616ments malpighiens de l'adulte. D6s le d6but de la n y m p h o s e , les cellules des disques ne se m u l t i p l i e n t plus mais effectuent des e n d o m i t o s e s ; leur croissance et leur diff6renciation assurent l'organog6n6se des tubes de Malpighi de l ' a d u l t e . Dans ce n o u v e a u travail, n o u s a v o n s qoulu pr6ciser les modalit6s du d 6 v e l o p p e m e n t du disque i m a g i n a l par la technique des t r a n s p l a n t a t i o n s , tout en contr61ant l ' 6 v o l u t i o n m o r p h o l o g i q u e , cytologique et u l t r a s t r u c t u r a l e des tubes issus de l ' i m p l a n t . Nous a v o n s recherch~ les r61es respectifs de l ' i m p l a n t et du receveur, lors du d 6 v e l o p p e m e n t des disques implant6s, par divers protocoles e x p 6 r i m e n t a u x dans le b u t de r6pondre aux questions suivantes: - - L o r s de t r a n s p l a n t a t i o n s synchrones, le receveur permet-il le d 6 v e l o p p e m e n t d ' u n syst6me m a l p i g h i e n suppl6mentaire, ou mOme de plusieurs? - - S i oui, existe-t-il u n e identit6 ou u n e h o m o l o g i e entre les caract6res qualitatifs et q u a n t i t a t i f s des syst6mes issus des i m p l a n t s et des syst~mes n o r m a u x ? Y a-t-il c o n c u r r e n c e de d 6 v e l o p p e m e n t entre les tubes de Malpighi suppl6mentaires et ceux du receveur? - - U n e diff6rence entre les n o m b r e s de cycles mitotiques des disques du d o n n e u r et du receveur, r~sultant de t r a n s p l a n t a t i o n s a s y n c h r o n e s , emp~che-t-elle le d 6 v e l o p p e m e n t des i m p l a n t s et dans quelles limites?
MATERIEL
ET
TECHNIQUES
Choix des animaux
Les chenilles de Galleria sont ~lev~es sur cire purifis et pollen, ~t 30~ ~t l'obscurit~. Elles sont pr~levs d'une part ~tla fin de l'avant-dernier stade, et d'autre part/~ la fin du dernier, lorsqu'elles cessent de s'alimenter. Ce moment, qui correspond ~ un changement d'etat physiologique important, est facilement d~celable car il coincide avec un changement de comportement: les chenillesquitrent la nourriture puis vagabondent vers le haut du bocal d'~levage ~tla recherche d'un site favorable ~ la construction du cocon de nymphose; c'est ce que nous appellerons la "mont6e". Pour travailler sur des lots homog/mes, compte tenu des variations de poids individuelles ou dues au sexe, un contrfle pond&al est toujours effectu6 sur les larves. Mode op~ratoire
Apr~s ancsth~sie ~ l'~ther et dissection rapide des donneurs, les canaux collecteurs portant chacun un disque imaginal sont d~barrass6s des tubes de Malpighi larvaires. Ils sont ensuite pr~lev6set introduits dans une autre chenille ~galementanesth~si~e. Les implants sont introduits dans l'organisme du receveur par une petite incision lat6rale du 5~me segment abdominal. L'incision est ensuite recouverte par un carr~ de papier pour limiter l'h6morragie lors du r6veil de la chenille. Toutes les chenilles op6r6es sont isol6es, celles de l'avant-dernier stade ~tant aliment~es normalement. Des chenilles du dernier stade, isol6es ~t la "mont6e" mais n'ayant subi aucune op6rati0n, constituent les t6moins vrais. D'autres chenilles, d'~,ge identique, ayant subi une incision non suivie d'implantation, repr~sentent les t~moins exp6rimentaux. Les protocoles exp6rimentaux r~alis6s comprennent plusieurs s6ries d'exp~riences comportant chacune au moins 12 essais. Chaque protocole sera expos~ avec les r~sultats correspondants. M(thodes d'analyse des r~sultats
Apr/~s dissection des receveurs (nymphes d'hges diff~rents et adultes), nous avons mont~ c6te h c6te, sur une m~me lame, les tubes issus des implants et ceux du receveur. Les preparations sont alors fix~es au Dubosq - Brasil et color+es par la r~action nucl~ale de Feulgen, compl~t~epar une coloration cytoplasmique au vert-lumi~re. Ainsi nous avons pu contrfler les d6veloppements respectifs en ~liminant toute source d'erreur dans la comparaison des r6sultats exp6rimentaux.
D~veloppement des Tubes de Malpighi Adultes Obtenus par Tra'figpl~mtationde D~squesImaginaux
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Pour ~valuer le d6veloppement obtenu dans chaque cas, nous avons cumul~ les longueurs des tubes de Malpighi provenant de chaque disque, les assimilant ainsi ~t un tube unique. Ces mesures sont effectu6es au curvim~tre sur les photographies des pr6parations prises au microscope photonique. D'autre part nous avons mesur~ le diam~tre des tubes et la taille de leurs cellules. Enfin, pour comparer l'ultrastructure des cellules malpighiennes obtenues dans les divers cas, nous avons fixb des pi~ces par le glutarald~hyde ~ 2.507o(0.1 M), puis par l'osmium ~t2070(0. l M) tamponn~ par le phosphate de sodium. Les pi~ces sont ensuite incluses et orient6es dans l'6pon-araldite. Des coupes semi-fines, color~espar le bleu de toluidine, ont 6t~ examinees au microscopephotonique. Des coupes fines, recueillies sur des grilles, ont bt~ contrast6es par l'ac6tate d'uranyle et le citrate de plomb avaut d'etre observ~esau microscope~lectronique transmission Philips E.M.200. RESULTATS Avant d'exposer les r6sultats des diverses exp6riences, soulignons que la longueur totale de chaque syst6me lat6ral adulte issu du d6veloppement d ' u n disque imaginal est de l'ordre de 25 mm pour les t6moins vrais, mfiles et femelles. D'autre part, le d6veloppement de l'appareil malpighien des t6moins exp6rimentaux, dont deul le t~gument a 6t6 incis6, est semblable/l celui des t6moins vrais. On peut donc consid6rer que les effets de l'h6morragie et des autres cons6quences du choc op6ratoire sont n6gligeables. Les principaux protocoles exp6rimentaux et leurs r6sultats sont r+sum6s dans le Tableau 1.
1. Implantations synchrones (A) Implantation d'un deul disque. Le donneur et le receveur ayant le m~me ftge, au moment de l'implantation, l'op~ration provoque le d6veloppement d ' u n syst6me malpighien suppl6mentaire pour chaque disque implant6. Ce syst6me malpighien suppl6mentaire pr6sente, en plus de caract~res normaux et fondamentaux, certains caract~res particuliers. (i) Caractdres communs aux tubes issus des des implants, des receveurs et des t~moins. (a) Morphologie: Le syst+me malpighien suppl6mentaire se d6veloppe exactement en m~me temps que ceux du receveur selon la chronologie 6tablie pour le cas normal (Le Garff, 1974), mais il reste ind6pendant de ceux-ci et ne sera jamais en communication avec le tube digestif. La longueur totale du syst6me obtenu se r6v~le normale (25 mm environ). Quatre/t cinq jours apr~s la mue nymphale, le syst6me provenant de l'implant a, comme le syst6me normal, termin6 sa croissance en longueur; son ~talement dans la nymphe est alors maximal et favorable au contr61e: Le diam~tre des tubes issus de l'implant, ainsi que celui des tubes du receveur, restent identiques/t celui des t6moins (40 - 60/am); la taille des cellules, bien que variable, conserve 6galement le m~me ordre de grandeur (25 /am de largeur et 50 lam de longueur). Les tubes de Malpighi issus des implants produisent, comme ceux des t6moins, un liquide contenant des granulations de couleur rose p~le. (b) Ultrastructure: L'ultrastructure des tubes de Malpighi issus des implants est compar6e/l celle des tubes des receveurs et des t6moins pr61ev6s sur des nymphes de m~me w ( 4 - 5 jours). Le cytoplasme apical des cellules malpighiennes renferme d'abondants ribosomes libres et de nombreuses mitochondries qui p6n6trent dans les microviUosit6s (Fig. 1A). Entre celles-ci des expansions cytoplasmiques tendent h envahir la lumi6re des tubes. Elles renferment une substance homog6ne finement grenue of~ seules quelques rares mitochondries sont pr6sentes. Le cytoplasme basal est fortement " d 6 c o u p 6 " par de nombreux replis de la membrane plasmique (Fig. 1A). Celle-ci pr6sente des h6midesmosomes au contact de la lame basale. Les mitochondries du cytoplasme infranucl6aire sont grosses mais poss6dent une matrice tr6s r6duite. Le reticulum
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BERNARD LE GARFF et ROGER BARBIER TABLEAU 1 I
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Resume des protocoles experimentaux et des resultats. Abrdviations utilisdes: A.D.M.L.: Avant-derni~re mue larvaire; Av.D.St.L.: Avant-dernier stade larvaire; D: Donneur; D.M.L.: Derni6re mue larvaire; D.St.L.: Dernier stade larvaire; L.: Longueur totale des tubes de Malpighi des t6moins (25 mm); M.: Moment de la "mont6e"; M.C.I.: Masse cellulaire inorganis~e; M.I.: Mue imaginale; M.Ny.: Mue nymphale; n.St.L.: n. stades larvaires; Ny.: Nymphe; P.C.: Population cellulaire et croissance cellulaire; PrNy.: Pr6nymphe; R." Receveur; T.M.: Tubes de Malpighi. Symboles utilis~s: carr6 noir ( i ) : Disque imaginal transplantS; fl~che noire (~): D~veloppement du disque imaginal; tiret6 noir ( . . . . ): Attente de d~veloppement du disque; fl6che blanche (~); Transplantation de disque imaginal; 6toile noire (~-): Cycle mitotique; signe XXXX: Cycles endomitofiques.
endoplasmique granulaire, 6galement abondant, se dilate en v~sicules ofi s'accumulent des mat6riaux ayant 2 aspects tr~s diff~rents. Les premiers, les plus abondants, constituent des concr6tions ayant la forme de sph~rites qui restent envelopp~s par le reticulum granulaire. Ils sont form,s par des d~p6ts concentriques de couches sombres et de couches claires altern6es (Fig. I B, C). Les seconds mat~riaux, moins abondants, s'accumulent dans des v~sicules plus petites, souvent localis~es dans les r6gions infranucl6aires, entour~es par des digitations du noyau. Ils ont un aspect granuleux tr~s dispers~ et h6t6rog~ne, de sorte que les v~sicules apparaissent claires aux 61ectrons (Fig. 1D). Elles migrent vers le cytoplasme apical off on
D~veloppement des Tubes de Malpighi Adultes Obtenus par Transplantation de Disques Imaginaux
Tubes de Malpighi adultes obtenus par implantation de disques imaginaux chez Galleria mellonella. FIG. 1. A. Aspect d'ensemble de l'~pith~lium malpighien; contre la lame basale (lb), les replis de la membrane plasmique constituent de profondes invaginations (in). Les noyaux (n) pr~sentent une r~partition homog~ne des areas chromatiques (ch); le cytoplasme p~rinuclbaire contient un abondant reticulum granulaire (rg); la r~gion apicale est bord6e de microvillositbs {mv) contenant des mitochondries (m). La lumi~re (1) des tubes renferme des v~sicules claires (v). B. Des sph6rites (s) apparaissent dans certaines r~gions du cytoplasme infranuc|~aire. C. Les sph~rites (s) se forment dans des dilatations du r~ticulum granulaire (rg). D. Des vbsicules/t contenu granuleux (vg) proviennent du r~ticulum puis migrent vers les microvillosit6s (mv).
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les retrouve/t la base des microvillosit~s et m~me/l l'int6rieur de celles-ci. (ii) CaractOres particuliers aux tubes issus des implants. Apr6s le 5e jour de la vie nymphale, le syst6me surnum~raire s'entoure d'une enveloppe form6e de tissus provenant du donneur, comme l'atteste la chromatine sexuelle femelle dans les cas favorables off le donneur et le receveur sont de sexes diff6rents. L'enveloppe est constitute par la proliferation des trach~es apport~es avec l'implant et contient, comme dans un filet, le syst6me malpighien obtenu. C'est pourquoi il est pr6f6rable d'effectuer les dissections des receveurs avant le 6e jour de la vie nymphale, soit 8/t 9 jours apr~s l'implantation des disques. La base du syst+me, qui ne communique pas avec l'intestin du receveur, s'est obtur6e et les tubes fonctionnent sans 6vacuation. Le liquide form6 s'accumule dans la lumi6re de la zone de confluence des tubes, provoquant ainsi une v6ritable ampoule par dilatation de la base du syst6me. De plus, au del/~ du 5e jour, l'enveloppe qui appara~t comprime l'ampoule et la surpression qui en r6sulte favorise son 6clatement lors de la dissection. L'observation de l'ultrastructure des cellules issues des disques implant6s, permet de mettre en 6vidence la formation r6guli6re de cristaux intranucl6aires (Fig. 2A et B). Ils ont la forme d'un cube dont le c6t6 peut d6passer 1 txm et sont constitu6s d'une trame fibrogranuleuse pourvue d'une p6riodicit6 de 22 nm entre les fibres. Les cristaux sont toujours localis6s entre les nucl6oles ou tout pros d'eux, ce qui permet de les rep~rer plus facilement lorsqu'ils sont incompl6tement form6s. Bien que tr6s rare, leur pr6sence dans le cytoplasme a cependant 6t~ constat6e. Par ailleurs, soulignons que nous n'avons jamais trouv6 de cristaux intranucl6aires ni dans les tubes de Malpighi des receveurs ni dans ceux des t6moins. De plus ces cristaux n'ont jamais 6t6 observ+s dans les disques imaginaux des donneurs. (B) Implantation de plusieurs disques. Lorsque 2 disques imaginaux d'une chenille du dernier stade ~ la " m o n t 6 e " , sont implant6s dans une chenille de meme age, la longueur totale des tubes issus de chaque implant mesure environ 25 mm, soit la longueur d'un syst6me lat6ral provenant d'un disque t6moin. De mOme, lorsque quatre disques pr61ev6s sur 2 chenilles du dernier stade /l la " m o a t ~ e " sont implant+s dans une chenille de m~me ftge, chaque implant produit un syst6me malpighien dont la longueur reste identique /t celle observ6e chez les t~moins (25 mm). D'autre part, comme dans le cas d ' u n seul implant, le diam~tre des tubes ainsi que les dimensions cellulaires et les aspects cytologiques sont rest6s conformes/l ceux des t6moins. 2. Implantations asynchrones Ce second type d'op6rations permet, d'une part, de pr6ciser le r61e de la population cellulaire pr6sente dans le disque implant6, et d'autre part, de d6terminer les limites de la p6riode compatible avec un d6veloppement normal. (A) Receveurs n "ayant pas d~pass~ le moment de la "'montde". (i) Implant plus jeune que le receveur. Les disques imaginaux de chenilles de la fin de l'avant-dernier stade ont un cycle mitotique de retard lorsqu'ils sont implant6s dans des chenilles de la fin du dernier stade. Malgr~ cette difference, chaque implant donne toujours un syst~me malpighien. Chaque syst6me ainsi obtenu poss6de des tubes dont le diam6tre est normal, et dont les cellules ont une taille identique/~ celles des t6moins. Toutefois la longueur totale des tube de chaque syst6me est r6duite de moiti6 par rapport/t celle des receveurs et des t6moins, et n'atteint que 12 mm environ.
D6veloppement des Tubes de Malpighi Adultes Obtenus par Transplantation de Disques lmaginaux
F16. 2. A. Des cristaux intranuclhaires (cr) caract6risent les cellules malpighiennes provenant des implants. Ils sont toujours associ6s aux nucl6oles (nu). B. Un autre cristal (cr), vu a un plus fort grossissement, situ4 prbs du nucl6ole (nu) et de l'enveloppe nucl4aire (en).
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(ii) Implant plus ~gd gue le receveur. Les disques imaginaux de chenilles en fin de dernier stade ont un cycle mitotique d'avance par rapport aux receveurs lorsqu'ils sont implant6s dans des larves en fin d'avant-dernier stade. Chaque implant produit cette fois un syst~me en tous points identique h ceux du receveur et des t+moins (longueur totale, diam6tre des tubes, et dimensions cellulaires). Malgr6 un s6jour dans l'organisme receveur correspondant ~t un stade larvaire suppl6mentaire, le disque imaginal implant6 ne semble pas avoir augment6 sa population cellulaire au delh de la normale. I1 n'a pas fait de cycle mitotique suppl6mentaire au moment oth le receveur effectuait son dernier cycle normal. Malgr6 cette p6riode d'attente, le disque reste capable d'assurer une diff+renciation imaginale normale. (B) Receveurs ayant ddpassd le moment de la "'mont~e". Dans les 4 s~ries exp6rimentales suivantes, les disques imaginaux sont toujours pr61ev6s sur des larves de la fin du dernier static au moment de la " m o n t 6 e " , mais sont implant6s darts des receveurs plus fig6s et d'~ge croissant. Le contr61e, effectu6 sur des nymphes de 5 jours, donne les r6sultats suivants: - - L o r s q u e les receveurs sont des chenilles en pr~nymphose, environ deux jours apr6s la " m o n t ~ e " , on obtient encore des syst6mes malpighiens suppl6mentaires mais dont la longueur est d6j~ inf6rieure h la normale. De plus, les tubes pr+sentent un aspect atypique et la coloration rose de leur contenu devient plus intense. - - L o r s q u e les receveurs sont des nymphes qui viennent de muer (non encore pigment6es), les disques imaginaux produisent des syst6mes malpighiens tr6s incomplets et atypiques. Ils sont accompagn6s d'une masse cellulaire inorganisbe de teinte rose vif. - - L o r s q u e les receveurs sont des nymphes de 10 hr on observe des ph6nom6nes identiques fi ceux d6crits pr6c6demment mais plus accentu6s: seulement quelques tubes de Malpighi atypiques Se sont form6s tandis que la masse inorganis6e est devenue plus grande, sa coloration plus intense tendant vers le rouge. - - L o r s q u e les receveurs sont des nymphes de 30 hr, aucun tube de Malpighi ne se forme tandis que la masse cellulaire, encore plus importante, devient rouge vif.
DISCUSSION
ET C O N C L U S I O N
Les rSsultats expSrimentaux confirment que les territoires cellulaires 8tudiSs antSrieurement chez la chenille (Le Garff, 1972) sont effectivement les disques imaginaux du systSme malpighien du papillon, et que les tubes larvaires ne sont pas remaniSs chez Galleria, comme dans le cas g6n6ral des L6pidoptSres, puisqu'ils sont enlev6s avant la transplantation du disque. Nos rSsultats concernent aussi les r61es respectifs de l'implant et du receveur, ainsi que leurs limites, dans le d~veloppement des tubes de l'adulte. Ils permettent aussi des observations originales sur le fonctionnement malpighien du papillon. Les disques imaginaux de larves de dernier stade ~t la " m o n t S e " implantSs dans des chenilles de m~me ~tge donnent autant de syst~mes malpighiens supplSmentaires dont la taille est identique ~ celle des tubes des receveurs et des tSmoins. Le d~veloppement des disques du donneur et celui des disques du receveur sont parfaitement synchrones. Le milieu interne du receveur contr61e donc le d~veloppement des disques implant,s. De plus, ceux-ci ont effectu8 leur dernier cycle mitotique larvaire puisqu'ils ont produit autant de cellules malpighiennes que les disques des t6moins. D'autre part, il n'y a pas de
D~veloppementdes Tubes de Malpigbi AdultesObtenus par Transplantationde Disques Imaginaux
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concurrence de d6veloppement entre eux, ni entre eux et ceux du receveur, m~me lorsque 4 disques sont implant,s simultan~ment. Rappelons par ailleurs que des trach6es larvaires, apport~es lors de l'opbration, peuvent prolifbrer et, en fin de vie nymphale, enfermer les tubes dans un r~seau qui les comprime. L'amplitude de d6veloppement des tubes adultes d~pend directement du nombre de cycles mitotiques effectu6s par le disque imaginal au cours de la vie larvaire: Lorsque des disques imaginaux sont implant6s avec un cycle mitotique de retard par rapport ~ ceux du receveur, ils r~pondent n6anmoins au milieu interne de celui-ci en donnant chacun un syst~me malpighien. De plus, le d6veloppement des disques implant6s et celui des disques du receveur restent synchrones, et les dimensions cellulaires restent identiques ~ celles des t6moins. Par contre, la longueur totale des tubes est r6duite de moiti6. Ce d6ficit de d~veloppement r~sulte de la r~duction de moiti~ de la population cellulaire des disques, due, elle-m~me, au fait que le retard d'un cycle mitotique a 6t~ conserv6. Cependant, les cellules des disques implant6s ont effectu6 le m6canisme normal de polyplol'disation comme l'indiquent les dimensions cellulaires des tubes de Malpighi obtenus. Ces r~sultats compl6tent ceux obtenus par carences protidiques (Le Garff, 1977), grace auxquelles nous avons bgalement produit un systbme malpighien rbduit, mais par diminution de la taille des cellules des tubes et non par diminution de leur nombre, l'activit6 endomitotique ayant seule 6t6 r6duite lors de la morphogen6se imaginale. Lorsque des disques imaginaux sont implant6s avec un cycle mitotique d'avance par rapport aux disques du receveur, il est logique de penser qu'ils vont effectuer un cycle mitotique surnum6raire lorsque ceux du receveur vont r6aliser leur dernier cycle normal. On peut s'attendre ~ obtenir un doublement de la taille du syst~me par rapport ~ la normale. I1 n'en est rien puisque leur d6veloppement reste identique ~ celui des t6moins. Ceci implique pratiquement une limite maximale de d~veloppement des tubes de Malpighi de l'adulte. Ces exp6riences apportent, en outre, les 2 r6sultats suivants: d'une part, l'~tat hormonal du receveur lorsqu'il atteint la fin du dernier stade larvaire, est sans action sur l'activit~ mitotique des ceUules des disques implant6s. La " m a t u r a t i o n " de leurs cellules, d~j~ acquise peu apr~s l'implantation, semble les emp~cher de r6pondre aux conditions hormonales qui provoquent pourtant le dernier cycle mitotique des disques du receveur. L'importance de la " m a t u r a t i o n " a 6t6 soulign6e pour le d6veloppement postembryonnaire de l'~piderme de Pieris brassicae (Mauchamp, 1980). D'autre part, bien que les disques du donneur aient d6j~ termin~ leur croissance normale, ils ne se diff~rencient pas mais restent en attente dans le receveur pendant le dernier stade larvaire. L'organogen6se de l'appareil malpighien provenant de l'implant ne d6butera qu'en d6but de nymphose, en m~me temps que celle de l'appareil malpighien du receveur, lorsque les conditions hormonales se seront modifi~es et permettront l'activit6 endomitotique des cellules des disques imaginaux. Les p~riodes mitotique et endomitotique des disques imaginaux malpighiens correspondent respectivement aux pics d'ecdyst6rone qui s'6tablissent vers la 152e hr du dernier stade larvaire et vers la 24e hr du stade nymphal (Sehnal et al., 1981). Le degr~ de d6veloppement des implants est conditionn6 par l'fige du receveur: Lorsque les disques imaginaux provenant de larves /~ la " m o n t 6 e " sont implant6s dans des receveurs plus ftg~s, les tubes se d6veloppent incompl6tement tandis que se forme une masse cellulaire inorganis6e. La longueur des tubes ainsi obtenus est inversement proportionnelle ~ l'~ge du receveur au moment de l'implantation. Au contraire, le volume de la masse cellulaire form6e est proportionnel ~ l'fige du receveur. Enfin, lorsque les
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disques sont implant6s plus tardivement encore (dans des nymphes de plus de 20 hr), l'6tat physiologique du receveur ne leur permet plus aucun d~veloppement. Par contre, une masse cellulaire inorganis6e reste toujours pr~sente. Celle-ci r~sulte du d~veloppement aberrant d'une partie ou m~me de la totalit~ du disque imaginal. La " m o n t 6 e " qui pr6c~de le filage du cocon correspond donc, pour le receveur, h u n moment critique au del~t duquel l'implantation des disques imaginaux ne peut aboutir ~t un syst~me malpighien complet: non seulement le disque implant~ n'a pas fait le dernier cycle mitotique qui suit normalement la mont6e, mais il a aussi 6vit6 une partie plus ou moins grande, selon les cas exp~rimentaux, de la p6riode qui induit les endomitoses. Des exp6riences compl~mentaires, actuellement en cours, sont n~cessaires pour comprendre cette perturbation croissante de l'organogen~se. Des r6implantations des masses cellulaires obtenues, en milieu favorable, permettront de v6rifier si elles sont encore capables de donner des tubes de Malpighi, m~me atypiques, ce qui serait comparable aux cas de transd~termination d~crits par Hadorn (1966) pour la drosophile. D'autre part, l'augmentation de la coloration des masses cellulaires semble provenir de la concentration de la substance qui colore les tubes t~moins en rose pgtle et dont la nature reste h pr,~ciser. Dans t o u s l e s cas o~ l'on obtient des tubes imaginaux h morphologie normale, les aspects cytologique et ultrastructural sont 6galement rest~s conformes aux t~moins. Des sph~rites sont observ6s dans les cellules issus des implants comme dans celles des t6moins. Ceci prouve que m~me lorsque les tubes proviennent de disques implant,s, ils sont fonctionnels et participent ~ l'~puration de l'h~molymphe du receveur. Des urosph~rites tout ~t fair semblables ont ~t~ signal6s dans les cellules malpighiennes de Achetadomestica (Berkaloff, I961). D'autre part, les tubes issus des implants n'~tant plus connect6s ~ l'appareil digestif, leur contenu ne peut s'~vacuer et s'accumule tandis que des cristaux intranucl~aires se forment de facon r6guli~re. Leur presence semble li6e au fonctionnement anormal du syst~me malpighien implant6, car nous n'en avons jamais observ6 dans les tubes adultes des receveurs ni dans ceux des t~moins. De plus, les cristaux intranucl6aires n'ont pu ~tre apport6s avec les disques implant,s car ceux des larves t6moins en sont toujours d~pourvus. Des cristaux comparables, de nature prot~ique, ont 6t~ observes dans diverses cellules, notamment darts celles de l'intestin moyen de Tenebrio molitor (Thomas, 1972; Thomas et Gouranton, 1973) et de Gyrinus marinus (Gouranton et Thomas, 1976). Chez Galleria, comme dans les cas pr~cit~s, les cristaux intranucl~aires ont une taille inversement proportionnelle &celle des nucl~oles pros desquels ils se forment. Leur origine semble ~tre 6galement extranucl~aire car leur presence a ~t~ observ6e dans le cytoplasme. La possibilit6 de provoquer exp~rimentalement la formation de cristaux intranucl~aires chez Galleria peut constituer un module exp6rimental favorable pour aider & r6soudre le probl~me de leur signification dans les cas off ils sont signal6s comme spontan6s et permanents. Remerciements--Nous remercions M a d a m e Allo et Monsieur D~delot pour leur collaboration technique.
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