Diagnostic biologique des infections humaines à mycoplasmes

Mddecine et Maladies Infectieuses.

1975 - 5 - 5 - 2 6 5 ~ 2 7 6

Diaonostic biolo0ique des inleclions humaines mycoplasmes * par Y. PEROL** et J. LATRILLE*** Ces micro-organismes ne sont ni des bact~ries, ni des virus. Ils appartiennent h une classe nouvelle de Protistes inf~rieurs, les Mollicutes (1967). Leur materiel g$n$tique est un A D N probablement circulaire d'un poids mol$culaire d'environ 5.108 daltons, dont le p ourcentage guanine-cytosine varie de 25 ~t 36 % selon les espdces ; c'est-~t-dire qu'il est different de celui des bact$ries. Leur cytoplasme contient des ribosomes et est limit$ par une membrane souple ~t trois ~euillets plus riche en lipides que celle des bact~ries ; elle contient des st~rols comme chez les Eucaryotes. Les mycoplasmes ne poss~dent aucun des constituants de la paroi rigide propre aux bactSries : ni aci'de muramique, ni acide diamino pimSlique ; ils sont donc insensibles aux lactamines qui inhibent la synth~se de la paroi bact~rienne, mais leur croissance est inhibSe par des antibiotiques bloquant la synth$se des prot$ines comme les cyclines ou la synth$se des acides nuclSiques. Ils sont ~.galement inhil~$s par le~ substances ~ormant tm complexe avec le cholesterol (dlgitonine, amp hot~ricine B). Les mycoplasmes so nt, de ce fair, d distinguer des acheloplasmes (ex. Acheloplasma laidlawii) qui ne sont pas stSrol dSpendants et dont o n ne connait pas d'esp~ce pathog~ne pour l'homme. Un mycoplasme a 6t$ isol6, pour la premiSre fols, en 1898 par Nocard et Roux : c'est l'agent de la p6ripneumonie des bovidSs, maladie qui a d$cim6 ]es 61evages pendant la deuxi~me moiti6 du XIX e si$cle. La d$couverte d'autres agents infectieux du m~me groupe, nomm6s longtemps PPLO (peripneumonia like organisms) a 6t$ lente, car ils sont difficiles ~ cultiver au laboratoire. L'agent d'Eaton, responsable chez l ' h o m m e de pneumonies atypiques primitives avec agglutinines froides, a 6t6 isol6 en 1944, en ceuf embryonn6, et consid4r4 comme un virus ; il a fallu presque 20 ans et le travail de 5 6qulpes de chercheurs avant de d6montrer qu'il Stait cultivable sur milieu acellulaire et le reconnaltre pour un Mycoplasme nomm6 Mycoplasma pneumoniae (1962). On salt, depuis peu, que les mycoplasmes sont largement r4pandus dans la nature et parasitent les vSg6taux, les animaux et l ' h o m m e . - - Chez les v@Staux, ils occasionnent des maladies transmises par les insectes et curables par la t6tracycline. Chez les mammif~res, plus de 40 espbces ont 6t$ isol6es dont beaucoup sont responsables de pneumonies, p6ricardites, arthrites, art6rites et encSphalites.

Chez l ' h o m m e le premier mycoplasme fur isol6 en 1937 par Dienes et Edsall h partir du pus d ' u n abcbs de la glande de Bartholin, mais longtemps l'intSr~t des mSdecins pour ces microorganismes rut des plus modSrSs et les souches isol6es furent conserv6es dans les laboratoires sans identification. Ce n'est qu'apr~s l'essor des cultures cellulaires et la d6couverte de mycoplasmes contaminant 80 % des lignSes cellulaires utilisSes en virologic que leurs conditions de culture et d'identification ont 6t6 pr6cis6es.

LES MYCOPLASMES DE L'HOMME Neuf espbces de mycoplasmes out 6t~ iso]6es et identifi6es chez l ' h o m m e :

1) Mycoplasma salivarium : 2) Mycoplasma pharyngis ou orale type 1 : Ce sont des saprophytes faisant partie de la flore normale du p h a r y n x chez 30 ~ 50 % des individus. 3 el 4) Mycoplasma orale types 2 et 3 : Respectivement nomm~s M. buccale et M. faucium, ee sont 6galement des saprophytes du pharynx, mais on les trouve au plus chez 1 % des individus.

* M a n u s c r i t re~u le 2 oc~obre 1974. ** L a b o r a t o i r e c e n t r a l de Microbiologie, H 6 p i t a l S a i n t Louis, 2, place du Dr A . - F o u r n i e r , 75010 P a r i s . *** H S p i t a l

E.-Sabatid,

33500 L i b o u r n e .

5) Mycoplasma Ii,pophilum : Sacrophyte exceptionnel du l'homme.

pharynx

de

265

6) Mycoplasma pneumoniae ou agent d'EatonLiu :

Mycoplasma pneumoniae est l'agent 6tiologique de la pneumonie atypique primitive avec agglutinincs froides, parfois de pleuro-pneumonies ou de p6ricardites. L ' i n f i h r a t pulmonaire ne traduit Finfection que l fois sur 8 h 1 fois sur 20. La reproduction exp6rimentale de la maladie par inoculation ~ des volontaires et les enqu~tes s6rologlques out montr6 que l'infection est souvent inapparente ou se traduit par une atteinte des voles respiratoires sup6rieures, rhinite, pharyngite, trach$ite, otite moyenne et myringite bulleuse~ avec isolement du germe de la s6rosit6 de paracent~se. L'infection est end6mique avec recrudescence ~t l'automne et au d6but de l'hiver ; la contamination d'individu h individu n6cessite un contage massif et prolong6 et l'incubation est de denx semaines en moyenne ; on peut ~tre atteint ~ tout age, mais c'est avec pr6dilection une infection de l'adoles, cent et de l'adulte jeune. L'infection est persistante ; on isole Mycoplasma pneumoniae des secretions pharyng6es des semaines apr~s le d6but de la maladie et on a pu l'isoler de porteurs sains ayant un titre d'anticorps s6riques 6lev6s. Les infections ~ M. pneumoniae s6vissent dans le monde entier et leur pouvoir pathog~ne n'est pas encore connu dans son ensemble, car peu de laboratoires en font le diagnostic. L'existence de v6ritables septicSmies h Mycoplasma pneumoniae a 6t6 suggSr6e r$cemment, ce microorganisme a $t$ isol6 en culture pure ~t partir du sang du ventricule gauche d ' u n h o m m e de 75 ans d$cSd$ dans un tableau d'infection g6n6ralis6e avec pleuropneumonie, p$ricardite, myocardite ct polyarthrites fluxionnalres ; le mycoplasme rut @alement isol5 du sac p6ricardique. Plusieurs publications font Stat de tableaux cliniques proches d ' u n RAA assoclant des polyarthrites algufis mobiles ~ une pneumopathie avec, parfois, des agglutinines froides et une ascension des anticorps anti Mycoplasma pneumon~ae.

~'

L'infectiou par Mycoplasma pneumoniae pent Sgalement s'accompagner de manifestations neurologiques, m6ningltes lymphocytaires, m~ningoenc6phalites, polyradieulon6mites, de pancrSatites, enfin de rash $ruptifs et de syndrome de Steven1onhnson. Bien que Mycoplasma pneumoniae ait 6t$ isol6 des 16slons bulleuses de la peau de deux cas d'$rythSmes polymorphes, la part de l'infection et celle d'nne r6action immunopathologique dans ces manifestations diverses n'est pas encore 61ueid~e. On salt q u ' u n e an6mie h~molytique transitoire peut accompagner un taux 61ev$ d'agglutinines froides au cours d'une infection h Mycoplasma pneumoniae. Ces agglutinines froides sont 266

des macroglobulines IgM de sp~cificit~ anti I dis. tinetes des anticorps sp6cifiques anti Mycoplasma. Elles seraient l'expression d ' u n e auto-immunisa. tion contre les h6maties alt6r6es par Faction de l'h6molysine du germe. Celle-ci est un p6roxvde capable d'attaquer les membranes cellulaires. "On salt que Mycoplasma pneumoniae s'adsorbe sur les r6cepteurs neuraminiques, que ses colonies sont observ6es darts le cytoplasme des cellules ou ~ leur contact et le p6roxyde pourrait attaquer la mere. brahe cellulaire sans 6tre d6truit par les peroxy. dases extracellnlaires.

7) Mycoplasma hominis : On a isol~ ce mycoplasme du pharynx, du trac. tus g6nito-urinaire et du canal anal des sujets bien portants ; mais 6galement de n o m b r e u x produits pathologiques : pus d'abc~s, h6mocultures, seer6. tions conjonctivales et respiratoires, plaies infect6es. - - d a n s le p h a r y n x : seulement 2 h 3 % des aduhes sont porteurs de ce mycoplasme. Son r61e pathog~ne ne pent ~tre invoqu6 que dans moins de 0,5 % des infections des voles respiratoires sup6rieures, bien que Mufson et coll. aient montr6 que l'infection provoque 9 lois sur 10 l'61aboration d'anticorps sp6cifiques et 1 lois sur 2 une pharyngite exsudative. - - dans les conjonctivites, il a 6t6 trouv6 dans le cul de sac conjonctival mais tr~s rarcment et de fagon tr~s 6pisodique ; il ne fait pas partie de la flore normale de l'ceil. par contre, Mycoplasma pneumoniae est isol6 du tractus g6nito-urinaire de 40 h 50 % des adultes. I1 est plus fr6quent chez la femme que chez l'homme. Rarement pr6sent avant l'adolescence, le pourcentage des porteurs augmente avec le hombre des partenaires et il est souvent associ6 h d'autres pathogSnes. On a invoqu6 son r61e dans les ur6thrites non gonococciques ou post gonococciques, sans en faire la preuve. I1 ponrrait ~tre responsable d'infections urinaires, car sa pr6sence a 6t6 observ6e dans les urines pr6lev6es par ponction sus-publenne. I1 a 6t$ isol6 de pus d'abc~s de la glande de Bartholin, de pyosalpinx, de p6ritonite. Au cours des syndromes infectieux du post-abortum, qu'ils aleut 6t6 provoqu6s ou qu'ils soient spontan6s, dans des cas oh les cultures pratiqu6es par des m6thodes bact~riologiques conventionnelles 6talent stSriles, Mycoplasma hominis a 6t6 isol6 non seulement du col ut6rin, du vagin et des urines, mais de l'endomStre, des membranes fcetales (amnios, chorion, decidua, villosit~s), des organes du foetus (role,

poumons). Los h6mocultures du sang de la m~re ont permis, dans des syndromes f6briles du postabortum et du p o s t - p a r t u m , de d6montrer l'existence d ' u n e mycoplasm6nie qui s e m b l e spontan6ment curable et s ' a c c o m p a g n e d ' u n e ascension des anticorps sp6cifiques. La colonisation du nouveaun6 au niveau d e s o n p h a r y n x et de ses organes g6nitaux externes survient dans environ 30 % des cas. Jones l ' a isol6 8 lois de l'oeil dans 250 conjonctivites du n o u v e a u , n 6 .

Mycoplasma hominis peut donc ~tre consid6r6 comme un s a p r o p h y t e du tractus g6nito-urinaire, pathog~ne occasionnel de faible virulence, colonisant les tissus quand les conditions locales lui sont favorables. I1 est possible que l ' a d m i n i s t r a t i o n d'antibiotiques ait fair disparaitre le germe responsable du syndrome infectieux ou de la s u p p u r a t i o n pour ne laisscr prolif6rer q u ' u n saprophyte. 8) Mycoplasma fermentans : 5 % des mycoplasmes humains d'origine g6nitale r6pondent ~ cette identification. Mycoplasma fermentans a 6t6 isol6 de vulvovaginites et de 16sions gangr6neuses du p6nis, mais ne semble j o u e r aucun r61e dans les ur6thrites n o n gonococciques. R6cemment, Williams I ' a u r a i t isol6 et identifi6 dans 39 % des liquides articulaires de malades atteints de polyarthrite rhumato~de. Cet agent infectieux ayant fix6 sur sa m e m b r a n e des i m m u n o g l o b u l i n e s G pourrait p r o v o q u e r l a f o r m a t i o n du ¢~ facteur rhumato~de ~.

9) Mycoplasma urealyticum :

T

(ou tiny)

ou Ureaplasma

Cos souches ont ~t~ iso16es p a r Shepard en 1954, du tractus g6nito-urinaire d ' h o m m e s atteints d'ur6thrites non gonococciques ; ~ l a suite de ces travaux, diff6rents auteurs ont montr6 que ce mycoplasme 6tait pr6sent dans le traetus g6nito-urinaire de 20 & 30 % des h o m m e s adultes sains ; 50 % des f e m m e s en ~ sont ~porteuses. Les souches T colonisent le vagin de 38 % des nouveau-n6s de sexe f6minin mais le taux d ' i s o l e m e n t d6croit apr~s 3 mois, d e v i e n t nul ~ 2 ans ; 6 % des nouveau-n6s m~les portent dans l ' u r ~ t h r e une souche T qui d i s p a r a i t : r a p i d e m e n t . Des souches T ont 6t6 6galement isol6es du c a n a I anal ; elles sont 6galement pr6sentes' dans l e p h a r y n x de 5 % des adultes de 17 ~ 24 a n ~ . D~s 1955, Willcox, en m o n t r a n t l'efficacit6 non seulement des cyclines mais de l ' 6 r y t h r o m y c i n e dans le t r a i t e m e n t des ur6thrites non gonococciques, a p p o r t a i t un argument de valour aux auteurs qui pr6conisent le r61e ,pathog~ne de cos souches ; p a r m i les m y c o p l a s m e s g6nitaux, seules los s o u ches T sont inhib6es par cet antibiotique, alors

que les cyclines inhibent aussi les autres mycoplasmes et les bact6ries d u genre Chlamydia 6galelement incrimin6es dans ce syndrome. L a fr6quence d ' i s o l e m e n t des Mycoplasma tiny dans los cas d'ur6thrites non gonococciques est tr~s 61ev6e : 60 A 80 % des malades. Ceux-ci sont presque toujours porteurs de Mycoplasma hominis, mais la lincomycine, active sur Mycoplasma homi. his, reste sans action th6rapeutique et les souches T sont r6sistantes ~ cet antibiotique. Los souches T ont 6t6 6galement isol6es de l ' u r i n e pr61ev6e par p o n c t i o n sus-pubienne de la vessie, chez des m a l a d e s souffrant d'infection urlnaire et des travaux r6cents ont montr6 quc l'infectlon par des souches T pouvait contribuer ~ la constitution de calculs r6naux obtenus e x p 6 r i m e n t a l e m e n t chez le rat. Dans des avortements spon.tan6s et r6cidivants, l ' i s o l e m e n t d ' u n Mycoplasme T ~ partir des m e m branes foetales est p l u s fr6quent que dans les avortements prov0qu6s et K u n d s i n a montr6 que les Mycoplasmes T induisent des aberrations chromosomiques. Certes, l'invasion secondaire de l'oeuf partir de l ' e n d o c o l est possible ; eependant los souches T sont 6galement plus fr6quentes dans les m e m b r a n e s foetales des pr6matur6s que dans celles des enfants n6s ~ terme. R o m a n o et coll. ont isol6 un m y c o p l a s m e T non seulement du placenta, mais du coeur et du p 0 u m o n p n e u m o n i q u e d ' u n foetus au 5 e mois de grossesse chez une f e m m e qui en 6tait ~ son 5 e avortement spontan6 ; dans los jours qui suivirent l ' a v o r t e m e n t , elle 61abora des anticorps sp6cifiques. R6cemment, trois cas de mycoplasm6nie ~ Souche T a u cours de syndromes infectieux du p 0 s t - p a r t u m ont 6t6 rapport6s. Enfin une souche T a 6 t 6 isol6e d ' u n pus de pelvi p6ritonite et une s a l p i n g i t e aigu~ s'est accompagn6e d ' u n e ascension d ' a n t i c 0 r p s sp6cifiques. Ces microorganismes p o u r r a i e n t donc 6tre des pathog~nes occasionnels de la gestation, cornme Mycoplasma hominis. De plus, los m y c o p l a s m e s T pourraient 6tre cause de st6rilit6. G n a r p e et Friberg ont montr6 une incidence 61ev6e de porteurs de mycoplasrues T dans les secr6tions cervicales et le sperme, chez des couples dont la st6rilit6 reste inexpliqu6e ; le t r a i t e m e n t simuhan6 des conjoints par la doxycycline, dont Ia concentration dans le liquide s6minal est 6gale ou sup6rieure ~ la concentration sgrique de l'antibiotique, a permis d ' o b t e n i r la grossesse dans un pourcentage i m p o r t a n t des cas, alors que le germe disparait aux cultures de contr6!e: L ' 6 t u d e en microscopie 61ectronique du sperme contamin6 a montr6 les m y c o p l a s m e s accol6s ~ la t6te et ~ la p a t t i e interm6diaire des spermatozoides i c e t t e adsorPtiOn serait d f e ~ leur activit6 neuraminidasique. 267

M THODES D'ISOLEMENT DES MYCOPLASMES I1 semble done de plus en plus n6cessaire de disposer de techniques simples et reproductibles, p e r m e t t a n t le diagnostic des infections h Mycoplasmes. L ' e x a m e n direct d ' u n produit pathologique apr~s confection d ' u n frottis et coloration ne p e r m e t pas, en microscopic optique, de voir les m y c o p l a s m e s ; ils sont petits et tr~s open colorables. Seule, la culture p e r m e t de les mettre en 6vidence ; elle est d61icate et sa %ussite n6cessite des milieux complexes et enrichis dont les modalit6s d6rivent du milieu mis au point par H a y flick p o u r la culture de l'agent d ' E a t o n .

MILIEUX DE CULTURE 1 ) Le bouir~lon de base : II est pr6fSrable d'utiliser une macSration de coeur de bceuf, additionn6e de 1 % de p e p t o n e et d e 5 %o" de CLNa, selon la formule de Morton, Smith et L e b e r m a n (1951). Elle est commercialis6e p a r Difco (Baeto P P L O b r o t h 0554). I I e n existe une version g61os6e ~ 1,4 % d ' a g a r (Bacto P P L O agar 0412).

2) Les enrichissemenls indispensables ~ loutes les esp~ces de mycopiasmes : a) UUr extrait de levure ~ 25 O//o sera toujonrs inc0rpor6 ~ raison de 10 %. L ' a u t o l y s a t de levure doit ~tre f r a i c h e m e n t pr6par6 ~ partir de levure de boulanger ¢~ Levure royale fralche ~ ou ¢¢ Levure F l e i s c h m a n n 20-40 ~. La levure p u r e et s~che est suspendue ~ 25 % dans de l ' e a u distill6e et lys6e chaud ; l ' e x t r a i t est clarifi6 par centrifugation et filtration, puis st6rilis6 ~ l'autoclave. I1 se conserve congel6 ~ - - 25 ° C. La fraction efficace de l'autolysat de levure est thermostable, soluble et de faible poids mol6culaire : un dialysat d ' e x t r a i t de levure est aussi actif que l ' e x t r a i t lui-m6me. Les extraits de levure, commercialis6s p o u r la croissance des mycoplasmes, p e r m e t t e n t la culture des souches de laboratoire, adapt6es ~t la culture in vitro, mais ne conviennent pas p o u r l ' i s o l e m e n t des m y c o p l a s m e s exigeants c o m m e Mycoplasma pneumoniae ~ partir d ' u n produit pathologique. b) du s6rum de cheval non d6compl6ment6, st6rilis6 par filtration. I1 a p p o r t e des prot6ines naturelies, des lipides non toxiques, du cholest6rol non est6rifi6, de l'ur6e (environ 40 mg/100 m l ) . Tous les lots de s6rum de cheval ne conviennent pas ; chaque lot p r o v e n a n t d ' u n animal ou d ' u n m61ange doit ~tre test6 avant son ntilisation ; eertains pr6conisent du s6rmn de cheval priv6 de "t globulines. 268

Tous les lots de s6rum de poulain que nous avons test6s nous out donn6 satisfaction. Du s6rum d'au. tres a n i m a u x p e n t ~tre utilis6 (porc, lapin), rnais il est souvent n6cessaire de le complSter en choles. t6rol. Du Tween 80 (0,002 %) favorise 6galement la culture. Le s6rum de poulain dolt 6tre conserv6 congel6 ; il est ajout6 au milieu liquide ou au milieu g61os6 fondu, ramen6 ~ 50 ° ~ raison de 20 % p o u r l'isole. m e n t de Mycoplasma pneumoniae ; 4 ~ 10 % sont suffisants p o u r l'isolement d ' u n Mycoplasma T. Les fractions s6riques du commerce nc con. viennent pas p o u r l'isolement de tons les mycoplasmes. c) p o u r favoriser l'isolement des mycoplasmes exigeants au sortir de l ' o r g a n i s m e , Jansson conseille en outre l ' a d j o n c t i o n de 20 p,g/ml de DNA et de 1 % de j a u n e d'ceuf frais, pasteuris6 ~ 60 ~ C p e n d a n t 50 ran.

3) Les bacl6rioslatiques el les antifungiques : Afin d'6viter la prolif6ration des contaminants, les produits suivants sont incorpor6s darts les milieux :" a) la p6nicilline est pr6sente dans toutes les formules ~ raison de 1.000 ou 2.000 U / m l . b) d ' a u t r e s antibiotiques peuvent y 6tre associ6s : H a r w i c k conseille la p o l y m y x i n e B ~ 25 ~ g / m l ; Shepard utilise le m61ange VCN ~ 1 % . c) l'ac6tate de thallium au 1/2.000 ° peut 6tre incorpor6 dans les milieux d ' i s o l e m e n t de Myco. plasma pneumoniae ; il est h a u t e m e n t bact6riostatique p o u r des germes a6robies sporul6s et les bact6ries G r a m - - ; mais il est 6galement inhibiteur de la croissance des m y c o p l a s m e s T ; son adjonction syst6matique dans les milieux d'isolement p o u r m y c o p l a s m e s a $t6 la cause de r6sultats contradictoires publi6s par diffSrents auteurs dans les fr6quences d ' i s o l e m e n t des m y e o p l a s m e s g6nitanx. d) l ' a m p h o t 6 r i c i n e B (Fungizone), conseill6e par certains ~t raison de 2,5 ~ 5 ~g/ml, afin d'6viter l ' e n v a h i s s e m e n t des milieux par les levures, surtout quand ils sont inocul6s avec des pr61~vements d'origine g6nitale, est ~ rejeter car en fixant les st6rols, elle inhibe la croissance de tous les m y c o p l a s m e s pathog~nes qui sont st6rol d6pendants.

4) Le pH du milieu : I1 doit ~tre ajust6 avec pr6cision au p H optim u m favorisant la culture de tel ou tel mycoplasme : p H 6 p o u r l'isolement des Mycoplasmes T, entre 7,6 et 8 p o u r l'isolement de Mycoplasma

pneumoniae,

les autres m y c o p l a s m e s h u m a i n s connus culfivent /L ce p H alcalin, bien que 1cur optimum soit souvent plus has. L ' i n e o r p o r a t i o n de rouge de ph6nol dans les milieux liquides p e r m e t /t tout instant de la culture d ' a p p r 6 c i e r les modifications de c e p H . L ' a d j o n c t i o n de t a m p o n s dans les milieux peut am61iorer le r e n d e m e n t et la qualit6 de la culture et favoriser la conservation de sa viabilit6.

p e r m e t l ' o b t e n t i o n d ' u n fitre plus 61ev6 en milieu liquide et de colonies de Mycoplasmes T beaucoup plus larges en milieu g61os6. L a viabilit6 de la culture n ' e s t pas p o u r autant prolong6, car sa m o r t ne semble pas due ~ l'alcalinisation du milieu, ni /L l a production d'NH3, cons6cutive l ' a t t a q u e de l'ur6e mais a la production d ' u n e substance toxique dialysable, thermostable, r6sistante/~ la catalase.

5) L'adjoncUon d'un m6labolite pr6f6rentiel ou indispensable ~ la croissance de telle ou telle esp~ce de mycoplasmes :

On p e u t 6galement utillser un t a m p o n p h o s p h a t e tel que le PBS, mais une concentration en phosphates sup6rieure ~ 0,025 M est toxique et inhibe la croissance des Mycoplasmes T quand la concentration en ur6e du milieu est inf6rieure 5 1 % o

Cette adjonction transforme ce milieu en un milieu 61ectif. Les m y c o p l a s m e s h u m a i n s se divisent en deux groupes : ceux qui f e r m e n t e n t le glucose et acidifient le milieu : Mycoplasma pneumoniae et Myco-

plasma ]ermentans.

ceux qui ne f e r m e n t e n t pas le glucose, mais qui g6n6ralement hydrolysent l ' a r g i n i n e ou l'ur6e, en alcalinisant le milieu. Seul Mycoplasma hominis est exigeant en arginine ; Mycoplasma fermentans l'utilise mais ne l'exige pas. Ces m y c o p l a s m e s ont une arginine d6iminase et cette vole m6tabolique p o u r r a l t &re g6n6ratrice d'ad6nosine trip h o s p h a t e et donc source d'6nergie, mais ce n ' e s t pas d6montr6. Les m y c o p l a s m e s T sont seuls capables d ' h y d r o l y s e r l'ur6e grace une ur6ase qui le d6grade en 1NH3 et CO 2. I1 est ~ noter que t o u s l e s m y c o p l a s m e s g6nito- urinaires, Mycoplasma hominis, Mycoplasma /ermentans et les Ureaplasma produisent d e l ' a m m o n i a q u e , En p r a t i q u e : 1) l ' a d j o n c t i o n de glucose ~ 1 % dans le milieu liquide favorise la culture des Mycoplasmes fermentaires ; l'acidification qu'iis p r o v o q u e n t r6v~le la pr6sence de Mycoplasma pneumoniae ou de Mycoplasma ]ermentans : le rouge de ph6nol vire au j a u n e ; mais la perte de la viabilit6 de la culture est rapide en l'absence de r e p i q u a g e ; un a p p o r t de soude ou la pr6sence d ' u n t a m p o n peut la retarder. 2) l ' a d j o n c t i o n d'ur6e 0,05 h 0 , 1 % p e r m e t la culture des Mycoplasmes T. Certes le s6rum de cheval incorpor6 dans le milieu de base satisfait partiellement ce besoin en ur6e, mais la qualit6 du milieu pour l'isolement des Mycoplasmes T n'est o p t i m u m que quand ces deux facteurs sont pr6sents conjoiutement. L'activit6 ur6asique des Mycoplasmes T entraine une alcalinisation rapide du milieu d e culture qui de j a u n e devient rouge et s ' a c c o m p a g n e d ' u n e perte de viabilit6. L ' i n c o r p o r a t i o u clans le milieu de 0,05 M du t a m p o n dipolaire H E P E S (N2 hydroxy-6thylpip6razine N ' 2 6thane sulfonic acide)

3) l ' a r g i n i n e est n o r m a l e m e n t apport6 par le milieu de base ; au taux m i n i m u m de 4 m M indispensable & la croissance de Mycoplasma hominis ; mais un milieu enrichi /t 0,5 % de monochlorydrate d ' a r g i n i n e (L + ) favorise la croissance de ce m y c o p l a s m e qui entraine une alcalinisation rapide.

6) L'adjonction de bleu de m6thyl6ne : Le b l e u de m6thyl~ne inhibe t o u s l e s mycoplasmes h u m a i n s connus, /t 1'exception de Mycoplasma pneumoniae qui est totalement r6sistant/t une concentration de 0,002 % en milieu solide et 0 , 1 % en milieu liquide. Son incorporation dans les milieux les t r a n s f o r m e en uu milieu s61ectif pour

Mycoplasma pneumoniae. 7) Les diff~rentes formules utilis6es : De ces donn6es, il r6sulte q u ' i l n ' y a pas un milieu de culture unique, eonvenant p o u r l'isolem e n t de tous les mycoplasmes. Deux eat6gories de milieux sont pour le moins n6cessaires. a), ceux qui p e r m e t t e n t l ' i s o l e m e n t des mycoplasmes elassiques, dits ~ larges colonies : leur p H est gt 7,8 ; ils ne sont pas enrichis en ur6e ; ils contiennent 6ventuellement de l'ac6tate de thallium. Ces milieux r6pondent ~ ]a f o r m u l e 6tablie p a r Hayfliek, dont les vari6t6s suivantes sont utilis6es : milieu liquide avec ou sans glucose ; avee ou sans bleu de m6thyl~ne - - milieu g6los6 - milieu diphasique , e o m p r e n a n t une phase g61os6e et une phase liquide enrichie de glucose. h) eeux qui p e r m e t t e n t l ' i s o l e m e n t des myeoplasmes T i n y ~ petites colonies : leur p H est 6 ; ils sont enrichis en ur6e ; ils ne contiennent jamais d'ac6tate de thallium. Ces milieux r6pondent aux formules propos6es par Shepard : bouillon Ug, g61ose Aa. Cependant, le milieu de H a y f l i c k convient pour l ' i s o l e m e n t des Mycoplasmes T e n y a p p o r t a n t tes modifications suivantes : s6rum de cheval r6duit ~ 10 % - adjonction d'ur6e 0 , 1 % - - t a m p o n PBS concentr6 10 f o i s l %. Ou encore seulement : s6rum de cheval r6duit ~ 10 % - - adjonction d'ur6e 0,05 %. 269

8) Les cultures cellulaires : Les mycoplasmes humains peuvent croitre dans les cultures cellulaires, le plus souvent sans dommage apparent, mais parfois en p r o v o q u a n t un effet cytopathog~ne transmissible en s6rie ; ceci pent induire en erreur le virologue qui tente d'isoler un virus pathog~ne en inoculant un produit pathologique sur des cultures cellulaires. Cet effet cytopathog~ne de type toxique est dfi l'utilisation de l'arginine du milieu nutritif et partiellement corrig6 par l ' a d j o n c t i o n d ' a r g i n i n e suppl6mentaire. Apr~s coloration de Giemsa, des 16sions nucl6aires sont observ6es qui n ' o n t rien de sp6cifique, mais les colonies sont visibles sous f o r m e de petits amas roses extracellulaires coll6s aux cellules ou intracytoplasmiques. Quelques cellules de la culture seront inocul6es dans des milieux pour mycoplasmes, incub6s en ana6robiose afin d ' o b t e n i r les colonies caract6ristiques et de poursuivre l'identification. Mais en l'absence d ' u n e ascension des anticorps inhibant la croissance de ce m y c o p l a s m e , dans les s6rums du malade dont provient l ' i n o c u l u m , il ne sera pas possible de le prendre en consid6ration 6tant donn6 la fr6quence des contaminants dans les cultures cellulaires.

PRI~Lr=VEMENTS ET CONSERVATION DES PRODUITS PATHOLOGIQUES Les m y c o p l a s m e s sont peu r6sistants ; il est donc souhaitable d'inoculer les diff6rents milieux de culture directement avec les pr616vements. Si ceux-ci doivent ~tre transport6s, il rant les d6charget dans un milieu de transport tamponn6, contenant des prot6ines et 500 U de p6nicilline par ml, mais aucun antre antibiotique ou inhibiteur. Si ]'inoculation ne peut ~tre rapide, ces milieux de transport peuvent ~tre conserv6s ~ - - 70 ° p o u r une culture uh6rieure. Deux pr616vements sont n6cessaires p o u r inoculer les diff6rents milieux. Ils doivent 6tre pratiqu6s avec un instrument suffisamment rigide afin de pr61ever des cellules contamin6es, car les my,:oplasmes sont adh6rents aux cellules ou intracellulaires. Les mycoplasmes respiratoires sont isol6s ~ partir des crachats ou des pr616vements pharyng6s post6rieurs ; l ' i s o l e m e n t devrait ~tre tent6 plus souvent h partir des liquides p l e u r a u x ou des liquides p6ricardiques. Ces liquides pathologiques seront centrifug6s et le culot de centrifugation sera ino-

cul6 avec quelques gouttes de surnageant. Un frag. ment de tissu biopsique ou autopsique choisi en zone i n f l a m m a t o i r e et non n6crotique sera d6pos6 dans un r6cipient st6rile. P o u r la culture, il sera coup6 et non broy6 et la section fraiche sera trai. n6e "h la surface de la g61ose, puis d6pos6e en milieu liquide. Chez la f e m m e , les m y c o p l a s m e s g6nitaux sont isol6s avec une plus grande fr6quence apr~s un 6couvillonnage 6nergique de la m u q u e u s e vaginale qu'apr~s un pr61~vement endocervical, mais une recherche unique ne d6c61e que 77 % des porteurs ; il est donc p r u d e n t de la r6p6ter h plusieurs reprises. Chez l ' h o m m e , le grattage de la muqueuse ur6thrale sera pratiqu6 avec une minuscule curette, en r e m o n t a n t ~ 1 cm du m6at. Le pr616vement du p r e m i e r jet des urines p e r m e t l'isolement avec la m~me fr6quence et les mycoplasmes sont isol6s aussi bien du culot urinaire remis en suspension dans quelques gouttes d ' u r i n e que de l ' u r i n e non centrifug6e. La fr6quence des arthrites dues h des mycoplasmes bien caract6ris6s chez les oiseaux et les m a m m i f 6 r e s et l'activit6 th6rapeutique des sels d ' o r qui sont inhibiteurs de la croissance des mycoplasmes (et non des Chlamydia) devrait inciter plus de biologistes h des tentatives d'isolement de m y c o p l a s m e s h partir de liquides articulaires et de biopsies synoviales dans les arthrites non bact6riennes. Des m y c o p l a s m e s ont 6t6 isol6s d'h6mocultures d'abc~s du cerveau, de plaies, de 16sions v6siculenses cutan6es, des conjonctivites etc... I1 faudrait donc chercher les m y c o p l a s m e s dans tout produit pathologique ou pr616vement p r o v e n a n t d ' u n malade pr6sentant un syndrome f6brile inexpliqu6 ou un foyer d'6tiologie ind6termin6 quand il est dit bact6riologiquement st6rile, ou q u ' i l ne montre q u ' u n e flore s a p r o p h y t e banale. Cette. recherche semble particuli~rement indiqu6e chez les i m m u nosnpprim6s. On connait chez ces malades la fr6quence et la gravit6 des infections virales, bact6riennes ou mycosiques et leur sensibilit6 aux microorganismes saprophytes ou peu virulents. Chez les leuc6miques, des m y c o p l a s m e s ont 6t6 isol6s par h6moculture ou h partir d ' 6 c h a n t i l l o n de moelle osseuse, avec une fr6quence plus 61eV6e que chez des t6moins n o r m a u x et leur r61e 6ventuel dans les complications infectieuses des th6rapeutiques antileuc6miques serait ~ pr6ciser.

INOCULATION, INCUBATION ET SURVEILLANCE DES CULTURES 1) Inoculation : Les milieux de culture sont inocul6s toujours dans le m~me ordre : d ' a b o r d les milieux d'isolem e n t des m y c o p l a s m e s T ( F r pr6l~vement) puis 270

les milieux d ' i s o l e m e n t des m y c o p l a s m e s h larges colonies (2 e pr61~vement) en veillant h toucher en dernier avec l ' i n o c u l n m les milieux contenant le plus d ' i n h i b i t e u r s (ac6tate de thallium et enfin bleu de m6thylSne).

2) incubation : La temperature d'incubation est de 35 h 37 ° C. • La olupart des mycoplasmes hurnains ne croissent qu en mlcroaerophdle ; seuls Mycoplasma pneumoniae et Mycoplasma hominis se multiplient en aSrobiose, ou mieux dabs une atmosphere 5 % de CO 2- Les milieux liquides peuvent tous ~tre incub6s dans une 6tuve ordinaire, si leurs hauteur est suffisante et s'ils sont herm6tiquement bouch6s. Les milieux g61os6s doivent ~tre incub6s daBS des jarres "~ vide ou dans des caissons h double robinet dabs lesquels Fair est remplac6 par un m6lange gazeux tt 90 % d ' N et 10 % de CO2. L

~

.

.

.

.

En l'absence de cette pr$caution, les mycoplasmes isol6s en milieux liquides sont perdus lots des repiquages en milieux g61osSs et aueun passage en s6rie ne peut ~tre obtenu. I1 faut, de plus, veiller soigneusement au maintien d'une atmosphere humide, les myeoplasrnes 6taut tr~s sensibles ~ la dessication ; c'est pourquoi certains auteurs prSfgrent cr6er l'ana6robiose par la m6thode de Fortner, c'est-~-dire en cultirant uue souche de Serratia marescens sur une g$lose glucos6e ~ 1 % coul6e dans le couvercle de la boite de Petri destin6e ~ la culture du Mycoplasrne. Les milieux g61os6s d~pos6s en a6robiose pour l'isolement de Mycoplasma pneumoniae ou de Mycoplasma hominis seront scell6s herm6tiqueBent.

3) Surveillance des cultures : a) les milieux liquides sont contrS16s quotidiennement. La culture d ' u n mycoplasme n ' e n t r a l n e aucun trouble ou un trouble si 16get q u ' i l n'est appr6ciable que par comparaison avec un milieu t6moin non inocul6. Une contamination par une bact~rie ou un champignon s'accompagne d ' u n trouble important. En cas de doute, un repiquage sur milieu bact6riologique sans antibiotique ou sur milieu de Sabouraud s'impose.

mande un repiquage rapide sur g61ose enrichie d'ur6e si /'on veut caractSriser la souc h e . Le contr61e du bouillon A l'ur6e dolt 6tre poursuivi deux semaines car il arrive que le virage soit plus tardif. Cependant, aude!h de 48 heures, il peut 6tre dO h ]'alcal i n i s a t i o n du milieu par un autre mycoplasme, en particulier Mycoplasma hominis, qui accompagne avec une grande fr6quence les mycoplasmes T dabs les pr61~vements. Mais alors le bouillon enrichi d'arginine a vir6 de l'orange au rouge en g6n6ral dans les quatre jours qui ont suivi son inoculation. b) Les milieux solides sont contr616s au 3e, 7 ° et 14e jour aprSs leur inoculation. I1 ne faut pas esp6rer voir les colonies fi l'ceil nu o u m~me h la loupe. Elles ne peuvent gtre d6cel6es sans oubli qu'h un grossissement de × 100, c'est-h-dire en les cherchant g travers le milieu de culture dans les boltes invers~es sur la platine d ' u n microscope ordinaire ou sans retourner les boites sur un microscope invers6 de virologie. Les colonies de mycoplasmes classiques dites (( larges )) ont de 10 h 500 p. de diam~tre. Elles sont arrondies, granuleuses, homog~nes. En vieillissant, elles devienBent 16g~rement brunfitres et leur centre est enchass$ dabs la g$1ose, ce qui leur donne un aspect en (( cenf sur le plat )) tr~s caract6ristique (fig. 1 e t 2). Les colonies de mycoplasmes T n ' o n t que 15 h 50 p~ de diam~tre ; c'est ce qui leur a valu le n o m de T (tiny) ; de plus, elles sont ~ bords irr6gu]iers, patrols multilobes ; elles sont en 6troite association avec les cellules 6pith61iales urSthrales de l'inoeulum. Si le milieu g$1os6 contient un tampon ou si ]'atmosphere d~incubation est de 20 % de CO 2, elles tendent h s'6taler et fi preudre un aspect en ceuf sur le plat, sans cependant ~tre semblables aux colonies de mycoplasmes classiques (fig. 3). FIGURE I

- - l e virage au jaune du bouillon glucos$ de I-Iayflick 6voque la pr6sence d ' u n mycoplasme fermentaire. Si le virage est pr6coce (5 e au 8¢ j o u r ) , il s'agit plus probablement de Mycoplasma fermentans que de Mycoplasma pneumoniae dont la culture in vitro au sortir de l'organisme est lente et n'est ddcelable en r~gle qu'h partir du 8" jour et peut survenir jusqu'h la 6" semaine apr~s l'inoeulation. D~s que le virage apparalt, il faut repiquer si l ' o n ne veut pas perdre la souche. Si le milieu Stait enrichi de bleu de m~thyl~ne, le virage se fera du violet vers le jaune-vert ; il est 6vocateur de Mycoplas-

ma pneumoniae. le virage au rouge du bouillon U9 de Shepard ou du bouillon de Hayflick h l'ur6e en 24 48 heures 6voque un mycoplasme T et corn-

Colonies en <> de pnenmoniae × 250,

Mgcoplasma 271

FIGURE II

FIGURE III

Colonies de lnyeoplasines vues au eontraste de phase X 125.

Colonies de Ureaplasma urealyticum X 250.

Un repiquage ~ l'aveugle augmente le pourcentage des isolements positifs. I1 peut 6tre pratiqu$ syst6matiquement au 7° jour sur les boites apparcmment st6riles en d6posant ~ leur surface deux gouttes de milieu liquide et en r6alisant un r$isolement fi la pipette boutonn6e. La coloration de Dienes permet de %v61er de petites colonies qui pourraient passer inaper~ues, en colorant en bleu la colonic de mycoplasme, elle r6v~le sa structure grannleuse et la distingue d ' u n e colonic bact6rienne dont les 616ments sont cocco,des ou bacillaires. Dans la zone off l ' i n o c u l u m a 6t$ d6pos6, un petit bloc de g61ose de 1 cm2 est

d6coup6 et d6pos6 sur une la,ne, face inocul6e vers le haut. Une petite goutte de colorant dilu6e au 1/10 e en eau distillSe est d6pos6e ~ sa surface et le tout recouvert d ' n n e lamelle. Au grossissement de 100, on cherche les tr~s petites colonies qui apparaissent granuleuses et bleues et d ' u n bleu plus intense au niveau de la zone centrale, sur uno g61ose bleu pfile ou un peu ros6e. Le repiquage des colonies se fait en d6coupant avec un scalpel st6rile le fragment de g61ose contenant la colonic ; il est immerg6 dans un milieu liquide qui est ensuite homog6n6is6 vivement. De ce milieu, 1 ou 2 gouttes servent ~ inoculer les milieux g61os6s.

IDENTIFICATION DES ESPECES Les crit~res sont morphologiques, biochimiques et antig6niques.

Mycoplasma pneumoni~e : Outre son caract~re fermentaire et sa r6sistance au bleu de m6thyl~ne : --i]

poss~de une h6molysine soluble de type $, active sur les h6maties de cobaye. Seul Acheloplasma laidlawii donne une h6molyse identique. Dans les m~mes conditions, les autres mycoplasmes humains ne donnent q u ' u n e h6molyse de type a incomplete, verdfitre et d ' a p p a r i t i o n retard6e. Elle est facile mettre en 6vidence sur g61ose de Hayflick, condition de disposer de colonies bien isolSes et pas trop serrSes, fig6es de 10 h 15 jours de culture. I1 suffit de couler une mince couche de milieu g6]os6 (3 ml pour une boite dc 5 cm de diamOre) dans laquelle ont 6t6 incorpor6s des globules rouges de

272

cobaye de fa~on ~ r6aliser une concentration finale de 3 %. Apr~s une incubation ~ 37 ° en a6robiose de 24 ~ 48 heures, chaque coIonic apparalt entour6e d ' u n e zone d'h6molyse totale. ses colonies h6madsorbent les globules rouges de diff6rentes esp~ces ; ceux-ci se fixent la surface de la colonic et, dans un 2e temps, se lysent. il rSduit le chlorure de triph6nyl t6trazolium en a6robiose. Seul Acheloplasma laidlawii possSde le m~me pouvoir r6ducteur ; les autres mycoplasmes humains ne r6duisent le TTC q u ' e n ana6robiose. Un test rapide met cette propri6t6 en 6vidence : sur la g6lose oh ont 6t6 isol6es les colonies incub6es en a~robiose, il suffit de couler un m$1ange volumes 6gaux de solution aqueuse st6rile de chlorure de 2, 3, 5 triph6nyl t6trazolium h 0 , 2 1 % et Ionagar n ° 2 ~ 1,3 % fondue et

ramen~e h 45 ° , "h raison de 2 m l par boite ; e n 15 mn h 1 heure, les colonies deviennent roses, puis violettes, noires en 3 h 4 heures. Le test peut 6tre ainsi rSalis6 avec autant de succ~s apr~s avoir vSrifi6 le caract~re h6madsorbant des colonies. parmi les mycoplasmes h larges colonies, il est seu] sensible h l ' 6 r y t h r o m y c i n e .

Mycoplasma fermentans : M. ~ermentans fermentc le glucose, mais ne poss~de ni h~molyse ~, ni pouvoir h 6 m a d s o r b a n t et ne r6duit pas ]e T T C en a6robiose.

Mycoplasma hominis : Outre sa croissance plus rapide, il ne f e r m e n t e pas le glucose, ne donne q u ' u n e h6molyse a en pr6sence de globules rouges de cobaye ; l'h6molyse n'est totale de type ~ que si les h6maties sont de cheval et ne r6duit le T T C q u ' e n ana6robiose. I1 est de plus r6sistant h l ' 6 r y t h r o m y c i n e et sensible h la lincomycine.

Les Ureaplasma : Les Ureaplasma sont reconnaissables ~ leurs petites colonies et h leur croissance r a p i d e en 18 heures. Ils sont sensibles h l ' 6 r y t h r o m y c i n e et r6sistants ~ la lincomycine. Et surtout ce sont les seuls mycoplasmes ayant une ur6ase : un test direct, Squivalent du test d'oxydase pour les colonies de gonocoque, p e r m e t actuellement de caract6riser les mycoplasmes T sur la g61ose d ' i s o l e m e n t et de les diff6rencier de petites colonies de Mycoplasma hominis. Le bloc de g61ose contenant les colonies 6tudier est d6coup6 et d6pos~ sur une lame, colonies en h a u t ; une h deux gouttes d'une solution d'ur6e h 10 % est ddpos6e la surface de la g61ose et 10 secondes apr~s, un 6gal volume de chlorure de manganese h 0,8 % en eau distill6e est ajout6 en surface (la solution dolt Ore pr6par6e e x t e m p o r a n 6 m e n t ou conserv6e h - - 20 ° C en tubes ferm6s et d6congel6e une seule fois). Apr~s cinq secondes de rotation 16gale, l'exc~s de liquide est aspir6 et, aprSs coloration de Dienes, le tout est recouvert d ' u n e lamelle. La pr6paration est examinSe h × 100. Les colonies de Mycoplasma T apparaissent fonc6 gris brun dor~, avec un 16ger halo b r u n autour de la colonie, par suite d ' u n d6p6t d ' o x y d e de mangan~se h la surface de la colonie, alors que les

colonies de mycoplasmes classiques sont bleut6es ; le test p e r m e t parfois de d6celer une colonic de Mycoplasma T inclue dans une large colonic bleue. Ce test est rSalisable, tant que la viabilit6 est conserv6e, en particulier sur une culture gard6e -t- 4 ° p e n d a n t plusieurs jours. Les solutions h a b i t u e l l e m e n t utilis6es en bact6riologie p o u r les rcherches d'ur6ase ne conviennent pas. Les bact6ries et les formes L de Proteus connues pour leur activit6 ur6sique ne donnent pas un test positif ; il est donc sp6cifique des Mycoplasma T ; il est d'ailleurs inhib6 si la colonie est expos6e un inhibiteur de l'ur6ase, tel q u ' u n e solution de chlorure m e r c u r i q u e dilu6e h 0,01 M.

LA CARACTERISATION ANTIGENIQUE DES ESPECES La croissance des mycoplasmes est inhib6e pal" l'anticorps sp6cifique dont il provoque la formation. Cette inhibition est h a b h u e l l e m e n t r6v616e par la technique d$crite par Clyde. A la surface d ' u n milieu de culture g$1os6 inocul6 l a r g e m e n t avec le m y c o p l a s m e fi 6tudier, sont d6pos6s des disques de papier f i h r e dont chacun est impr6gn6 avec 0,025 ml d ' u n des s6rums i m m u n s de r6f6rence ; apr~s 3 h 7 jours d'incubation, on peut appr$cier une zone de non croissance autour d ' u n des disques. Cette technique peu sensible n6cessite de disposer de s6rums ~ titre 61ev6. L ' i n h i b i t i o n de croissance en prSsence d ' u n des antis6rums p e u t 6galement 6tre r6v~16e par inhibition du m6tabolisme, par exemple de la fermentation du glucose par Mycoplasma pneumoniae ou de son pouvoir r6ducteur du TTC en a6robiose ou encore de son h6molyse. Ces techniques d'identification antig6nique ne peuvent 6tre utilis6es c o u r a m m e n t p o u r les Mycoplasma T, car ils f o r m e n t un groupe non homog~ne comprenant, pour l'instant, au moins 9 s6rotypes diff6rents. Les souches de Mycoplasma hominis d'origine buccale poss~dent un antigone suppl6meutaire par r a p p o r t aux souches g6nitales.

Mycoplasma pneumoniae est c o m p l O e m e n t distinct du point de vue antig~nique des autres mycoplasmes h u m a i n s ; on ne lui connait pas de variations antig6niques.

METHODES IMMUNOLOGIQUES Etant donn$ la fr6quence de porteurs sains de mycoplasmes, l'isolement et l'identification d ' u n mycoplasme h partir d ' u n produit pathologique ne peut suffire h 6tablir une relation de cause h effet

entre ce m y c o p l a s m e et le syndrome m o r b i d e observ6. I1 est indispensable de prouver son r61e antig6nique en d6montrant l'61aboration d'anticorps sp6cifiques h u m o r a u x ou cellulaires. 273

DIAGNOSTIC SEROLOGIQUE Les immunog6nes des cellules mycopJasmiques sont des antig6nes de surface localis6s s u r leur m e m b r a n e ; comme les virus, les mycoplasmes sont inhib6s dans leurs synthSses par l'anticorps sp6cifique dont ils provoquent la formation. Ces anticorps inhibiteurs de croissance peuvent ~tre r6v616s par num6ration des colonies, ou plus simplement par des tests d'inhibition m6tabolique, par exemple d'une r6action enzymatique caract6risti~me du mycoplasme ; l'union antig~neanticorps dans les s6rums pr6coces est facilit6e par la pr6sence d ' u n facteur plasmatique thermolabile, proche du compl6ment. L e titrage des anticorps s6riques sp6cifiques d ' u n mycoplasme peut 6galement 6tre r6alis6 par l'une des techniques s6rologiques classiques : immunofluorescence indirecte, d6viation du compl6ment, h6magglutination indirecte.

1) Sarologie des pneumoniaa :

'infections

~

Mycoplasma

- - Quant aux techniques s6rologiques non sp6cifiques, seule la recherche d'agglutinines froides conserve un int6rSt pathog6nique.

2) Sarologie hominis :,

des

infections

~

Mycoplasma

- - L'immunofluorescence indirecte, la d6viation du compl6ment, l'h6magglutination indirecte et l'inhibition de croissance r6v616e par non utilisation de l'arginine, ont 6t6 utilis6es. Darts une population les anticorps apparaissent h la pubert6, augmentent en titre et en fr6quence pendant la p6riode d'activit6 sexuelle et d6croissent apr6s 50 ans.

3) S~rologie des infections a Mycoplasma T : --La technique la plus couramment utilis6e est l'inhibition par les anticorps de l'alcalinisation cons6cutive /, l'attaque de l'ur6e. Mais elle est d61icate et les r6suhats de cette s6rologie sont d6cevants : il n'a 6t6 observ6 chez les adultes infect6s que des titres faibles d'anticorps pour la souche isol6e, et les r6actions s6rologiques ne sont d'aucune aide pour le diagnostic de l'infection. Enfin il existe une dizaine de vari6t6s antig6niques.

- - L ' i m m u n o f l u o r e s c e n c e indirecte fut la premi6re m6thode utilis6e par Chien-Lu en 1957, mais les difficuh6s de sa technique limitent son application courante. Elle est d'une grande sensibilit6 et d6tecte des anticorps qui apparaisent & la 2°, 3 e semaine de la maladie et persistent un an et plus.

4) Sdrologie des infections & Mycoplasma fermentans :

--La d6viation du compl6ment s'est toujours montr6e moins sensible que l'immunofluorescence indirecte, ne d6celant que 80 % des cas positifs en immunofluorescence. Sa sensibilit6 et sa sp6cificit6 varient suivant le type d'antig6ne utilis6 ; les antig6nes complets d6c61ent parfois une augmentation significative du titre des anticorps q u e n e d6c~lent pas les antig6nes lipidiques, purifi6s apr6s extraction par les solvants organiques. Les anticorps d6viant le compl6ment apparaissent d6s le 7e jour apr~s le d6but de Finfection et ils persistent plusieurs tools.

ETUDE DE L'IMMUNITI~ CELLULAIRE

--Les anticorps inhibiteurs du m6tabolisme peuvent ~tre r6v616s par inhibition de r6duction du t6trazolium ou par inhibition de la fermentation du glucose. Ces tests colorim6triques sont sensibles, mais chez l ' h o m m e leur sp6cificit6 peut ~tre d6faillante : la pr6sence d'antibiotiques, en particulier d'6rythromycine dans le s6rum d ' u n malade, peut stimuler la pr6sence d'anticorps. Ceux-ci apparaissent & la 2e, 3 e semaine de la maladie, croissent jusqu'au 6 e mois apr6s Finfection et persistent longtemps. - - L ' h 6 m a g g l u t i n a t i o n indirecte et l'inhibition de l'h6magglutinine de Mycoplasma pneumoniae ne sont pas pratiqu6es couramment. 274

- - L e titrage des anticorps s6riques peut ~tre r6alis6 par inhibition du pouvoir fermentaire. Taylor-Robinson et coll. out montr6 que 13 % seulement des s6rums d'adultes contenaient des anticorps & titre faible < 40 pour ce mycoplasme ; un seul avait un titre 61ev6 640.

La recherche d'une hypersensibilit6 retard6e cons6cutive & l'infection par un mycoplasme est possible d6s que l'on dispose d~une souche en culture pure h titre 61ev6 ; les pr6parations antig6niques sont en g6n6ral obtenues apr6s sonication. Leventhal et co11., puis Fernald ont montr6 que les lymphocytes p6riph6riques des sujets ayant exp6riment6 une infection par Mycoplasma pneumoniae sont stimul6s en pr6sence de ces antig6nes. Chez le hamster inocul6 par voie intranasale, la migration des macrophages est inhib6e et la r6action cellulaire du processus inflammatoire qui accompagne l'infection pulmonaire et !a r6infection sugg6re la formation de rosettes. Des processus inflammatoires immunopathologiques accompagneraient donc volontiers l'infection par un mycoplasme, d'autant que celle-ci est souvent chronique, favoris6e sans doute par l'affinit6 de ces germes pour les membranes celluiaires.

D ' a p r b s W i l l i a m s , 67 % d e s p o l y a r t h r i t e s c h r o niques 6volutives t6moignent d'une hypersensibil i t 6 e n v e r s Mycoplasma ]ermentans~ m i s e e n 6vidence par inhibition de la migration des l e u c o c y t e s e n p r 6 s e n c e d e ses a n t i g b n e s d e m e m brane pax la m6thode de Bendixen. De

nombreux

RESUME

travaux

ont

montr6

une

corr6-

lation entre la pr6sence d'un antigbne d'histocompatibilit6 HLA W 27 e t l a s u s c e p t i b i l i t 6 h d6velopper une spondylarthrite ankylosante ou un syndrome de Fiessinger-Leroy-Reiter. Le pouvoir pathog~ne de certaines souches de mycoplasmes, invoqu6 dans les ur6thrites non gonococciques ou les a r t h r i t e s r h u m a t o i d e s , n e p o u r r a i t - i l d 6 p e n d r e 6 g a l e m e n t d e ces f a c t e u r s g 6 n 6 t i q u e s ?

Au cours des quinze dernibres ann6es, la culture des mycoplasmes sur milieux acellulaires a permis l'identification de 9 espbces contaminant l'homme. Des m6thodes standardis6es permettant la r6ussite des isolements sont d6crites : d e s m i l i e u x c o m p l e x e s s 0 n t n 6 c e s s a i r e s e t c h a q u e l o t d e m i l i e u , a v a n t sa r a i s e e n s e r v i c e , e s t t e s t 6 p o u r sa c a p a c i t 6 /t p e r m e t t r e la croissance des mycop l a s m e s q u e l ' o n d 6 s i r e i s o l e r . B i c n q u e ces m 6 t h o d e s p e r m e t t e n t l ' i s o l e m e n t et la croissance des mycoplasmes connus, elles ne permettent certainement pas le diagnostic de toutes les infections ~ mycoplasmes et elles devront ~tre arn61ior6es.

Mols-clef

:

1V[ycoplasmes - D i a g n o s t i c

SUMMARY

biologique.

During the last ]i]teen years cultivation o/ mycoplasmas on cell-]ree media has allowed identi]ication o] nine species infecting man. Standard procedures ]or successful isolation are described • c o m p l e x media are required and each batch o] m e d i u m is tested be]ore use ]or its ability in growing the mycoplasma it is desired to isolate. A l t h o u g h these procedures allow isolation and growth o] k n o w n species o~ mycoplasma, they certainly do not allow diagnosis o] all mycoplasma injection and must be improved. Key-words : Mycoplasma - Biological diagnosis.

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