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Diagnostic direct des Leptospiroses humaines
M6decine et Maladies Infectieuses -- 1981 -- 11 -- N ° 2 -- 95-99.
Diagnostic direct des Leptospiroses humaines par H. DIKKEN*
RESUME
L'isolement et l'identification des souches sont les principaux 616ments du diagnostic direct. I1 convient de respecter la chronologie de l'infection. Les principales m6thodes utilis6es sont : la microscopie en fond noir, la culture en milieux appropri6s, l'inoculation ~ l'animal, l'immunofluorescence, et de nouvelles orientations possibles : agglutination au latex, ELISA, Radio Immuno Essai. Mots-clef
:
Aigu - Phase de convalescence - Diagnostic - Isolement - Identification.
ISOLEMENT P e n d a n t les dix derni6res ann6es, il semble que l'int6rfit p o u r l ' i s o l e m e n t des leptospires ait d6cru, tandis que la s6rologie 6tait ~ l'honneur. Peut-fitre les t e c h n i q u e s d ' i s o l e m e n t ont-eUes donn6 quelques d6boires, C e p e n d a n t , chacun doit se s o u v e n i r q u ' u n i s o l e m e n t d6pend des b o n n e s conditions et de t e c h n i q u e s bien codifi6es. L o r s de la phase aigug de la m a l a d i e (les 7 p r e m i e r s jours), les l e p t o s p i r e s e x i s t e n t p a r t o u t , et le faible t a u x d ' a n t i c o r p s ne p e r m e t p a s de les d6celer. Le s a n g et le L . C . R . sont les 616ments de choix p o u r l'isolement. Les l e p t o s p i r e s e x i s t e n t d a n s le L . C . R . si des signes neurologiques s o n t d6cel6s.
A laphase de convalescence (2" - - 3" semaine), le t a u x des a n t i c o r p s s'616ve et les leptospires se nichent d a n s les t u b u l e s r6naux, d'ofi la leptospirurie. Bien que le d i a g n o s t i c soit bas6 s u r l a r6ponse s6rologique, le t a u x des a n t i c o r p s p e u t r e s t e r b a s ou ne p a s e x i s t e r (rongeurs). D a n s ce cas, la m i s e en 6vidence des leptospires d a n s l'urine e s t indispensable. * Royal Tropical Institute, Department of Microbiology, Mauritskade 57, Amsterdam, Pays-Bas. 95
P e n d a n t la phase leptospirurique (apr6s la 3" - 4 e semaine), les leptospires sont 61imin6s p a r l'urine. L a p h a s e de leptospirurie p e u t d u r e r 5 ~ 8 semaines, m a i s aussi plusieurs m o i s ou mfime t o u t e la vie de l'h6te. Ces v e c t e u r s de longue dur6e sont les r6servoirs. Ils p e u v e n t gtre d6tect6s p a r l ' e x a m e n de l'urine. Ceci est i m p o r t a n t , en 6pid6miologie, p o u r d i s t i n g u e r les p o r t e u r s de g e r m e s des a n i m a u x expos6s. L a d6couverte de l e p t o s p i r e s d a n s les urines p e u t avoir des cons6quences i m p o r t a n t e s p o u r l'imporration ou l ' e x p o r t a t i o n d ' a n i m a u x , d o n t le p r o c e s s u s est bas6 sur la s6rologie. M a i n t e n a n t , les a n i m a u x a y a n t u n taux inf$rieur ~ 1/100 ~ p e u v e n t fitre import~s ou export6s. M a i s ceci ne signifie p a s que l ' a n i m a l n'61imine p a s des leptospires. ! l e s t bien connu q u ' a p r 6 s une infection p a r ballum ou hardjo, le t a u x d ' a n t i c o r p s p e u t r e s t e r inf6rieur au 1/100% De tels a n i m a u x p e u v e n t fitre export6s bien que p e r s i s t e une leptospirurie. D ' a u t r e s s6rotypes p e u v e n t p r o v o q u e r des t a u x 61ev6s lors de la p6riode de convalescence (1/3 000e). D a n s ce cas, u n t a u x de 1/100" signifie une infection ancienne ou u n e p h a s e post6rieure ~ l a lepospirurie. C e p e n d a n t , de tels a n i m a u x , bien qu e n ' 6 t a n t p a s un d a n g e r de d i s s 6 m i n a t i o n de la maladie, ne p e u v e n t fitre ni e x p o r t 6 s ni i m p o r t 6 s selon les r 6 g l e m e n t a t i o n s actuelles. Q u a n d des m 6 t h o d e s sensibles p o u r d6celer les l e p t o s p i r e s
dans l'urine seront tout h fair au point, la r6glementation import -- export pourra ~tre bas6e sur la d6tection des leptospires dans l'urine plutSt que sur la s6rologie seule. Recherche des organiques
leptospires
dans
* Sang 1 -- 8 (10) jours * L.C.R. 3 -- 10 (12) jours * urine a partir du 7" jour
les
liquides
apr6s le d6but de la maladie
I~e sang et les tissus peuvent retarder la croissance des leptospires dans les milieux artificiels. Aussi est-il pr6f6rable d'ensemencer de faibles inoculums et plusieurs tubes de milieux en dilutions croissantes (10--1, 10--2.10--3, 10--4). E t a n t donn6 le faible diam6tre des leptospires (0,10 -- 0,15 l a g ) e t leur type de mobilit4, ils passent ~ travers les filtres. Les techniques utilisant les membranes ceUulosiques ou h base de polycarbones tr~s minces peuvent permettre d'isoler des leptospires de produits contamin6s. Incubation h 30 ° C pendant 4 -- 8 semaines. Inoculation h l'animal
METHODES -- 1) Microscopie en fond noir ; -- 2) Milieux de culture ; -- 3) inoculation ~ l'animal ; -- 4) immunofluorescence ; -- 5) nouveUes recherches : latex, Radio Immuno essai.
ELISA,
Le nombre de leptospires est en g6n6ral faible. Une technique de centrifugation diff6rencielle peut 61iminer les 616ments cellulaires, artefacts, et concentrer les leptospixes. Microscopie h fond noir La morphologie caract6ristique des leptospires et leur mobilit~ permettent de les reconna~tre. Des filaments de fibrine (pseudo-spirochetes) peuvent ~tre une source d'erreur, mais sont facilement diff6renci6s par un bon Leptospirologue. Grossissement : 250 x. Culture Les souches de leptospires poussent dans les milieux sp6cifiques. Certaines ont une meilleure croissance dans le milieu avec s6rum, d'autres dans le milieu E M J H . Cependant, il est prudent, pour les isolements, d'ensemencer deux milieux diff6rents semi-solides (+_0,2 % de g61ose), l'un base de s6rum, l'autre E M J H . Pour 61iminer les contaminants, il est possible d'utiliser : -- 5-Fluorouracil : -- 150 ~ g / m l N6omycine : 5 -- 25 m g / m l Sulfathiazole : 50 m g / m l -- et/ou Cycloheximide : 0,5 mg/l. Cependant, ces produits peuvent aussi entraver la croissance des leptospires. I1 est prudent de faire plusieurs ensemencements de milieu semi-solide avec e t sans ces additifs.
Cette m6thode pourrait passer au second plan. Si le mat6riel est obtenu aseptiquement, la culture peut suffire. Cependant, les leptospires ne poussent pas toujours bien in vitro, et le passage par l'animal est n6cessaire. De m~me, certains examens d'eau ou de pr616vements fortement contamin6s doivent ~tre inocul6s h l'animal. Certaines esp6ces animales sont adapt6es aux leptospires. L'infection par canicola est souvent fatale. Mais le cobaye ne meurt n i n e fait d'ict~re s'il est infect6 par canicola. Si le cobaye et le hamster sont les animaux de choix, la souris, le chinchilla, la gerbille et le poussin peuvent ~tre utilis6s. Ces animaux de laboratoires doivent venir d'61evages clos off il n'existe pas de Leptospirose. Pour chaque 6chantillon, plusieurs animaux sont utilis6s et inocul6s h raison de 1 a 2 ml par vole intrap6riton6ale. La maladie commence 3 h 10 jours apr6s l'inoculation. I1 faut examiner les animaux chaque jour et noter les sympt5mes. Mais les signes cliniques peuvent ne pas apparaltre et la temp6rature rester normale. Aussi, l'examen au microscope h fond noir du liquide p6riton6al est-il une technique recommandable pour d6terminer s'il y a leptospir6mie. Pendant 3 h 10 jours apr6s l'inoculation intrap6riton6ale, des 6chantillons de liquide p6riton6al sont pr61ev6s dans le quadrant inf6rieur de l'abdomen, fi l'aide d'une fine pipette capillaire. Ils sont examin6s au microscope ~ fond noir. Si l'6chantillon est positif, du sang est pr61ev6 par ponction cardiaque, et mis en culture. Si l'animal meurt, l'autopsie est aussitSt pratiqu6e. Le foie, les reins et le cerveau sont inocul6s dans le milieu semi-solide. Immunofluorescence Cette m6thode semble meilleure. I1 a 6t6 d6crit des leptospires dans les liquides organiques, comme dans les tissus : cerveau, reins, muscles. Selon quelques chercheurs, cette technique est pr6f6rable h l'examen au microscope h fond noir, la culture et l'impr6gnation argentique. Tout 96
pr~l~vement peut ~tre examine, qu'il soit containing, congel~ ou conserve. Des precautions doivent ~tre prises pour la coloration de fond qui peut ~tre faible fi cause des dilutions du conjugu~. Ce test est plus sp~cifique de s~rotype ou de s~rogroupe. Selon certains, une sp~cificit~ de genre existe. EUe peut ~tre due fi diff~rentes manipulations de l'antig~ne utilis~ pour la production d'antis~rum conjugu~ ou fi rintervaUe entre les injections et la r~colte. Ce test m~riterait d'etre approfondi pour le diagnostic de genre. Nouvelles orientations possibles
Les techniques actuelles sont bas~es sur robservation directe du leptospire. Cependant, de nouvelles techniques peuvent d~celer des portions antig~niques sp~cifiques. Ces parties d'antig~nes sont reconnues par des anticorps sp~cifiques, par l'agglutination au latex, le traitement par un enzyme (ELISA*) ou par la radio-activit~ (Radio-Immuno assay : RIA). Les deux premiers tests peuvent d~celer 20 nanogrammes (2 × 10) antig~nes/ml. Le RIA en d~c~le le 1/10". I1 semble possible qu'un test puisse aussi d~celer de faibles quantit~s d'antig~nes dans un liquide organique. C'est pourquoi, il est important d'isoler et de d~terminer l'antig~ne sp~cifique qui pourait ~tre d~cel~ par les anticorps correspondants.
IDENTIFICATION L'identification des souches is01~es lors de la maladie est la base de la surveillance des Leptospiroses. La grande sp~cificit~ des relations hSte -s~rotype implique que le typage.des souches isol~es est essentiel pour les recherches ~pid~miologiques : mesures fi prendre pour le traitement et la prevention. Cette m~thode seule permet de d~celer de nouveaux s~rotypes. L'~tude de la variabilit~ antig~nique a aussi une importance scientifique. L'identification d'une souche comprend les ~tapes suivantes : d~termination de l'esp~ce, du s~rogroupe, du s~rotype. D~termination de l'esp4ce
Le genre Leptospira est divis~ en deux esp~ces : L. biflexa, non pathog~ne et L. interrogans, pathog~ne. Elles sont diff~renci~es par ces deux propri~t~s, leur possibilit~ de se d~velopper + 13 ° C, et leur sensibilit~ fi la 8-azaguanine fi la concentration de 250 mcg/ml. Les souches L. biflexa poussent fi 13 ° C et en presence d'azaguanine, tandis que les souches L, interro* ,, Enzyme-Linked-ImmunosorbentAssay ,,. 97
gans ne poussent pas. L'origine de la souche oriente d~j~ : celles isol~es des animaux sont des L. interrogans, celles de l'eau des L. biflexa. D~termination du s~rogroupe
I1 existe aujourd'hui environ 20 s~rogroupes de L. interrogans. La d~termination du s~rogroupe d'une souche peut ~tre r~alis~e par. la R.A.L. b l'aide du ,, s~rum de groupe ,, de lapin. Un ,, s~rum de groupe ,, est choisi parmi les immuns~rums qui agglutinent tous les s~rotypes du s~rogroupe donn~, et donnent le moins de r~actions crois~es avec les souches des autres s~rogroupes. La d~termination du s~rogroupe d'une souche ne pose habituellement pas de difficult~s tant que la souche n'est pas un ,, nouveau s~rotype ,. Le tableau des ,, s~rums de groupe - peut ~tre simplifi~ selon les r~gions. Pour les saprophytes, il n'existe pas de tableau de groupe. En pratique, une souche riche est d'abord test~e vis-a-vis des 20 ,, s~rums de groupe -. (D. Les taux des immuns~rums vis-a-vis de la souche homologue doivent ~tre au moins de 1/10 000% Ensuite, les s~rums r~agissant positivement seront titr~s ~ l'aide de la souche et de la souche homologue. Les taux-limites sont compares. D~termination du s~rotype
Les s~rotypes se rep~rent par une difference s~rologique. Deux souches sont consid~r~es appartenir ~ des s~rotypes diff~rents si, apr~s absorption crois~e avec le volume ad~quat d'antig~nes h~t~rologues, il reste au moins 10 % ou plus du titre homologue dans au moins un des deux s~rums. Chaque souche ~ ~tudier dolt ~tre compar~e a toutes les souches du s~rogroupe. C'est la mdthode standard classique. Une autre m~thode d~finit les s~rotypes par leurs portions sp~cifiques d'antig~nes. La souche est class$e selon les factures s~riques. C'est la m~thode des facteurs s$riques. a) M~thode classique : Une bonne culture d'une souche x est d'abord ~tudi~e en R.A.L. ~ l'aide des antiserums de toutes les souches de r~f~rence du s~rogroupe. De m~me, l'antis~rum de la souche x est test~ vis-a-vis de toutes les souches de r~f~rence du s~rogroupe auquel la souche x appartient.
Ensuite, les souches a y a n t des parent,s s~rologiques avec la souche x sont choisies (titre d'au moins 10 % du taux de la souche homologue). Les tests d'agglutination -- absorption crois~es sont effectu~s ~ l'aide de ces souches seulement. Une parent~ s~rologique avec la souche x est recherch~e chez ces diverses souches. Deux souches sont s~rologiquement identiques si, apr~s absorption par l'antig~ne h~t~rologue, il reste
moins de 10 % du taux des anticorps homologues dans les deux s6rums. Au cas od i0 % ou plus de taux d'anticorps demeure pr6sent dans toutes les absorptions, il s'agit probablement d'un nouveau s6rotype. b) M d t h o d e des f a c t e u r s s$riques :
I1 existe plusieurs agglutinog~nes dans les leptospires. Cette mosa£que diff6re avec chaque s6rotype. Un agglutinog6ne ou un ensemble d'agglutinog6nes constitue un facteur. Les facteurs dominants sont appel6s ,, majeurs ,,, les autres sont des antig~nes ,, mineurs -. Seuls, tes antig6nes ,, majeurs ,, ont une importance pour le typage.
Antig6nes majeurs
Autres ddterminations
Ces mdthodes sont surtout quantitatives. La ddtermination d'un sdrotype ddpend du degrd de plus ou moins bonne absorption, ce qui est une cause de diff6rences entre les Laboratoires. En 6tudiant les rapports A.D.N., Brendle a trouv6 6 groupes g6n6tiques de leptospires. A l'int6rieur de ces groupes, les souches ne sont pas toujours h6es antig6niquement. Aussi a-t-fl 6t6 d6crit des tests utilisant les pr6cipitines, les activit6s biochimiques. Certaines techniques ne sont pas encore au point pour les laboratoires de routine. La classification est 6volution permanente.
Un tel antig6ne est d6termin6 par ses anticorps homologues : ,, facteur s6rique -. Chaque facteur s6rique est pr6par6 par absorption d'un immuns6rum sp6cifique ~ l'aide de certaines souches pour 61iminer t o u s l e s anticorps sauf ceux directement dirig6s contre rantig6ne sp6cifique ,, majeur -. Apr~s des recherchbs empiriques et l'utilisation des facteurs s6riques, Kmety a pr6par6 une classification utilisable pour les s6rotypes de plusieurs s6rogroupes. A l'int6rieur d'un m~me s6rogroupe, les facteurs antig6niques sont group6s et constituent un sch6ma qui donne la composition des antig6nes ,, majeurs ,, de chaque s6rotype. D'apr6s ce sch6ma, plusieurs s6rogroupes sont nettement divis6s en sous-groupes.
Application L'examen d'une culture fi l'aide d'une gamme de ,, facteurs s6riques - du s6rogroupe, pr6alablement
d6termin6, r6v61era l'existence de facteurs dans cette souche. La R.A.L., avec les ,, facteurs s6riques ,,, est ex6cut6e selon des dilutions de d6part de 1/200 -- 1/400. Chaque r6action demande deux contr61es : -- 1. avec la souche homologue, utilis6e pour la pr6paration de l'immuns6rum (contrSle positif) ; 2. avec ta souche ayant servi ~ l'absorption (contr61e n6gatif). La mise en 6vidence d'un s6rotype par l'analyse factorielle est seulement une f o r t e p r S s o m p t i o n . Ceci dolt ~tre compl6t6 par une preuve : la r6action d'agglutination -- absorption avec la souche de r6f6rence du s6rotype diagnostiqu6. S y n t h ~ s e des d e u x m d t h o d e s : Ces deux m6thodes peuvent ~tre associ6es. Le sous-groupe de la souche peut ~tre d6termin6 h l'aide des facteurs s6riques et le typage final par la m6thode classique. D'ofi les avantages : r6duction du hombre d'absorptions crois6es et des facteurs s6riques.
donc un
syst~me en
DISCUSSION Les m6thodes de standardisation de ces techniques sont capitales : -- 1) Pr6paration de l'immuns6rum de lapin (cf. Congr6s de Munich, 1978}. -- 2) R.A.L. -- 3) R6action d ' a g g l u t i n a t i o n - absorption. Pour ce dernier test, l'utilisation de cultures tu6es par le formol, comme antigone et le taux r6siduel de 0,5 % -- 1 % sont suffisants. Un projet de standardisation pourrait ~tre adress6 aux participants. Ce projet, r6vis6, serait soumis au Dr Stallman, Secrdtaire du Sous-Comit6 de Taxonomie, pour amendements et accord officiel. Immunsdrum
II existe des diff6rences dans les taux d'anticorps obtenus par immunisation des animaux de laboratoire. O n salt que la rdponse immunologique des lapins varie d'un animal l'autre et d'une espbce ~ l'autre. U n r6cent travail, fait en Nouvelle-Z61ande, a ~montr6 que les immuns6rums de lapin et les s6rums de bovin ou de mouton ne permettaient pas de diff6rencier les s6rotypes, tandis que l'immuns6rum de hamster 6tait hautement spdcifique et donnait des titres homologues significatifs, probablement grace au taux d'IgG {2}.
Facteurs sdriques Le travail du Dr Kmety sur les facteurs s6riques est discut6. Certains s6rogroupes sont divis6s en
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sous-groupes. Pyrogenes a 6t6 divis6 en d e u x sous-groupes : pyrogenes (avec 5 sdrotypes possddant le facteur n ° 2) et zanoni (avec 5 sdrotypes p o s s d d a n t le facteur n ° 7). Le sdrogroupe Hebdomadis est ddsormais divis6 en trois n o u v e a u x groupes : Hebdomadis avec 9 sdrotypes, Sejrog c o m p r e n a n t 12 sdrotypes d o n t hardjo et wolfii, et Mini avec 6 sdrotypes dont: swajizak. L e sdrogroupe Sejro~ p e u t fitre divis6 en sousgroupes : Sejro~ avec 4 sdrotypes (facteurs 2 et 3), Saxkoebing avec 5 sdrotypes (facteur 21), et Wolfii avec 7 sdrotypes (facteurs 5 et 8).
SUMMARY
L e D r Little ddcrit son travail p o u r l'identification des souches du g r o u p e H e b d o m a d i s d'apr6s la m6thode de K m e t y . P o u r lui, les souches rdcemment isol6es sont moins faciles ~ identifier que les souches adapthes au Laboratoire. D'apr6s sa m6thode, il semble que les souches isoldes d u b6tail en G r a n d e - B r e t a g n e appartiennent s u r t o u t au s6rotype hardjo ou u n s6rotype tr6s voisin, tandis que les isolements effectu6s p a r t i r d ' a n i m a u x sauvages sont s u r t o u t saxkoebing. Le f a c t e u r s6rique n ° 13 est tr6s utile p o u r l'identification de hardjo.
Isolation and strain identification are the most important stages of direct diagnosis. I t is necessary to follow the chronology of the disease. Principal methods are : dark-field microscopy, culture in media, animal inoculation, fluorescent antibody technique, and possible new developments : latex agglutination test, E L I S A , Radio l m m u n o Assay.
Key-words : Acute - Convalescent stage - Diagnosis - Isolation - Identification.
BIBLIOGRAPHIE 1. D I K K E N H., et KMETY E. methods of Leptospires. Meth. 259-294.
- - Serological typing Microbiol., 1978, 11,
2. RIS D.R., H A M E L K.L. - - Use of hamster antisera in the preliminary differenciation of Leptospira interrogans serovars hardjo and balcanica. J. Med. Microbiol., 1978, 11, 351-353.
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Diagnostic direct des Leptospiroses humaines par H. DIKKEN*
RESUME
L'isolement et l'identification des souches sont les principaux 616ments du diagnostic direct. I1 convient de respecter la chronologie de l'infection. Les principales m6thodes utilis6es sont : la microscopie en fond noir, la culture en milieux appropri6s, l'inoculation ~ l'animal, l'immunofluorescence, et de nouvelles orientations possibles : agglutination au latex, ELISA, Radio Immuno Essai. Mots-clef
:
Aigu - Phase de convalescence - Diagnostic - Isolement - Identification.
ISOLEMENT P e n d a n t les dix derni6res ann6es, il semble que l'int6rfit p o u r l ' i s o l e m e n t des leptospires ait d6cru, tandis que la s6rologie 6tait ~ l'honneur. Peut-fitre les t e c h n i q u e s d ' i s o l e m e n t ont-eUes donn6 quelques d6boires, C e p e n d a n t , chacun doit se s o u v e n i r q u ' u n i s o l e m e n t d6pend des b o n n e s conditions et de t e c h n i q u e s bien codifi6es. L o r s de la phase aigug de la m a l a d i e (les 7 p r e m i e r s jours), les l e p t o s p i r e s e x i s t e n t p a r t o u t , et le faible t a u x d ' a n t i c o r p s ne p e r m e t p a s de les d6celer. Le s a n g et le L . C . R . sont les 616ments de choix p o u r l'isolement. Les l e p t o s p i r e s e x i s t e n t d a n s le L . C . R . si des signes neurologiques s o n t d6cel6s.
A laphase de convalescence (2" - - 3" semaine), le t a u x des a n t i c o r p s s'616ve et les leptospires se nichent d a n s les t u b u l e s r6naux, d'ofi la leptospirurie. Bien que le d i a g n o s t i c soit bas6 s u r l a r6ponse s6rologique, le t a u x des a n t i c o r p s p e u t r e s t e r b a s ou ne p a s e x i s t e r (rongeurs). D a n s ce cas, la m i s e en 6vidence des leptospires d a n s l'urine e s t indispensable. * Royal Tropical Institute, Department of Microbiology, Mauritskade 57, Amsterdam, Pays-Bas. 95
P e n d a n t la phase leptospirurique (apr6s la 3" - 4 e semaine), les leptospires sont 61imin6s p a r l'urine. L a p h a s e de leptospirurie p e u t d u r e r 5 ~ 8 semaines, m a i s aussi plusieurs m o i s ou mfime t o u t e la vie de l'h6te. Ces v e c t e u r s de longue dur6e sont les r6servoirs. Ils p e u v e n t gtre d6tect6s p a r l ' e x a m e n de l'urine. Ceci est i m p o r t a n t , en 6pid6miologie, p o u r d i s t i n g u e r les p o r t e u r s de g e r m e s des a n i m a u x expos6s. L a d6couverte de l e p t o s p i r e s d a n s les urines p e u t avoir des cons6quences i m p o r t a n t e s p o u r l'imporration ou l ' e x p o r t a t i o n d ' a n i m a u x , d o n t le p r o c e s s u s est bas6 sur la s6rologie. M a i n t e n a n t , les a n i m a u x a y a n t u n taux inf$rieur ~ 1/100 ~ p e u v e n t fitre import~s ou export6s. M a i s ceci ne signifie p a s que l ' a n i m a l n'61imine p a s des leptospires. ! l e s t bien connu q u ' a p r 6 s une infection p a r ballum ou hardjo, le t a u x d ' a n t i c o r p s p e u t r e s t e r inf6rieur au 1/100% De tels a n i m a u x p e u v e n t fitre export6s bien que p e r s i s t e une leptospirurie. D ' a u t r e s s6rotypes p e u v e n t p r o v o q u e r des t a u x 61ev6s lors de la p6riode de convalescence (1/3 000e). D a n s ce cas, u n t a u x de 1/100" signifie une infection ancienne ou u n e p h a s e post6rieure ~ l a lepospirurie. C e p e n d a n t , de tels a n i m a u x , bien qu e n ' 6 t a n t p a s un d a n g e r de d i s s 6 m i n a t i o n de la maladie, ne p e u v e n t fitre ni e x p o r t 6 s ni i m p o r t 6 s selon les r 6 g l e m e n t a t i o n s actuelles. Q u a n d des m 6 t h o d e s sensibles p o u r d6celer les l e p t o s p i r e s
dans l'urine seront tout h fair au point, la r6glementation import -- export pourra ~tre bas6e sur la d6tection des leptospires dans l'urine plutSt que sur la s6rologie seule. Recherche des organiques
leptospires
dans
* Sang 1 -- 8 (10) jours * L.C.R. 3 -- 10 (12) jours * urine a partir du 7" jour
les
liquides
apr6s le d6but de la maladie
I~e sang et les tissus peuvent retarder la croissance des leptospires dans les milieux artificiels. Aussi est-il pr6f6rable d'ensemencer de faibles inoculums et plusieurs tubes de milieux en dilutions croissantes (10--1, 10--2.10--3, 10--4). E t a n t donn6 le faible diam6tre des leptospires (0,10 -- 0,15 l a g ) e t leur type de mobilit4, ils passent ~ travers les filtres. Les techniques utilisant les membranes ceUulosiques ou h base de polycarbones tr~s minces peuvent permettre d'isoler des leptospires de produits contamin6s. Incubation h 30 ° C pendant 4 -- 8 semaines. Inoculation h l'animal
METHODES -- 1) Microscopie en fond noir ; -- 2) Milieux de culture ; -- 3) inoculation ~ l'animal ; -- 4) immunofluorescence ; -- 5) nouveUes recherches : latex, Radio Immuno essai.
ELISA,
Le nombre de leptospires est en g6n6ral faible. Une technique de centrifugation diff6rencielle peut 61iminer les 616ments cellulaires, artefacts, et concentrer les leptospixes. Microscopie h fond noir La morphologie caract6ristique des leptospires et leur mobilit~ permettent de les reconna~tre. Des filaments de fibrine (pseudo-spirochetes) peuvent ~tre une source d'erreur, mais sont facilement diff6renci6s par un bon Leptospirologue. Grossissement : 250 x. Culture Les souches de leptospires poussent dans les milieux sp6cifiques. Certaines ont une meilleure croissance dans le milieu avec s6rum, d'autres dans le milieu E M J H . Cependant, il est prudent, pour les isolements, d'ensemencer deux milieux diff6rents semi-solides (+_0,2 % de g61ose), l'un base de s6rum, l'autre E M J H . Pour 61iminer les contaminants, il est possible d'utiliser : -- 5-Fluorouracil : -- 150 ~ g / m l N6omycine : 5 -- 25 m g / m l Sulfathiazole : 50 m g / m l -- et/ou Cycloheximide : 0,5 mg/l. Cependant, ces produits peuvent aussi entraver la croissance des leptospires. I1 est prudent de faire plusieurs ensemencements de milieu semi-solide avec e t sans ces additifs.
Cette m6thode pourrait passer au second plan. Si le mat6riel est obtenu aseptiquement, la culture peut suffire. Cependant, les leptospires ne poussent pas toujours bien in vitro, et le passage par l'animal est n6cessaire. De m~me, certains examens d'eau ou de pr616vements fortement contamin6s doivent ~tre inocul6s h l'animal. Certaines esp6ces animales sont adapt6es aux leptospires. L'infection par canicola est souvent fatale. Mais le cobaye ne meurt n i n e fait d'ict~re s'il est infect6 par canicola. Si le cobaye et le hamster sont les animaux de choix, la souris, le chinchilla, la gerbille et le poussin peuvent ~tre utilis6s. Ces animaux de laboratoires doivent venir d'61evages clos off il n'existe pas de Leptospirose. Pour chaque 6chantillon, plusieurs animaux sont utilis6s et inocul6s h raison de 1 a 2 ml par vole intrap6riton6ale. La maladie commence 3 h 10 jours apr6s l'inoculation. I1 faut examiner les animaux chaque jour et noter les sympt5mes. Mais les signes cliniques peuvent ne pas apparaltre et la temp6rature rester normale. Aussi, l'examen au microscope h fond noir du liquide p6riton6al est-il une technique recommandable pour d6terminer s'il y a leptospir6mie. Pendant 3 h 10 jours apr6s l'inoculation intrap6riton6ale, des 6chantillons de liquide p6riton6al sont pr61ev6s dans le quadrant inf6rieur de l'abdomen, fi l'aide d'une fine pipette capillaire. Ils sont examin6s au microscope ~ fond noir. Si l'6chantillon est positif, du sang est pr61ev6 par ponction cardiaque, et mis en culture. Si l'animal meurt, l'autopsie est aussitSt pratiqu6e. Le foie, les reins et le cerveau sont inocul6s dans le milieu semi-solide. Immunofluorescence Cette m6thode semble meilleure. I1 a 6t6 d6crit des leptospires dans les liquides organiques, comme dans les tissus : cerveau, reins, muscles. Selon quelques chercheurs, cette technique est pr6f6rable h l'examen au microscope h fond noir, la culture et l'impr6gnation argentique. Tout 96
pr~l~vement peut ~tre examine, qu'il soit containing, congel~ ou conserve. Des precautions doivent ~tre prises pour la coloration de fond qui peut ~tre faible fi cause des dilutions du conjugu~. Ce test est plus sp~cifique de s~rotype ou de s~rogroupe. Selon certains, une sp~cificit~ de genre existe. EUe peut ~tre due fi diff~rentes manipulations de l'antig~ne utilis~ pour la production d'antis~rum conjugu~ ou fi rintervaUe entre les injections et la r~colte. Ce test m~riterait d'etre approfondi pour le diagnostic de genre. Nouvelles orientations possibles
Les techniques actuelles sont bas~es sur robservation directe du leptospire. Cependant, de nouvelles techniques peuvent d~celer des portions antig~niques sp~cifiques. Ces parties d'antig~nes sont reconnues par des anticorps sp~cifiques, par l'agglutination au latex, le traitement par un enzyme (ELISA*) ou par la radio-activit~ (Radio-Immuno assay : RIA). Les deux premiers tests peuvent d~celer 20 nanogrammes (2 × 10) antig~nes/ml. Le RIA en d~c~le le 1/10". I1 semble possible qu'un test puisse aussi d~celer de faibles quantit~s d'antig~nes dans un liquide organique. C'est pourquoi, il est important d'isoler et de d~terminer l'antig~ne sp~cifique qui pourait ~tre d~cel~ par les anticorps correspondants.
IDENTIFICATION L'identification des souches is01~es lors de la maladie est la base de la surveillance des Leptospiroses. La grande sp~cificit~ des relations hSte -s~rotype implique que le typage.des souches isol~es est essentiel pour les recherches ~pid~miologiques : mesures fi prendre pour le traitement et la prevention. Cette m~thode seule permet de d~celer de nouveaux s~rotypes. L'~tude de la variabilit~ antig~nique a aussi une importance scientifique. L'identification d'une souche comprend les ~tapes suivantes : d~termination de l'esp~ce, du s~rogroupe, du s~rotype. D~termination de l'esp4ce
Le genre Leptospira est divis~ en deux esp~ces : L. biflexa, non pathog~ne et L. interrogans, pathog~ne. Elles sont diff~renci~es par ces deux propri~t~s, leur possibilit~ de se d~velopper + 13 ° C, et leur sensibilit~ fi la 8-azaguanine fi la concentration de 250 mcg/ml. Les souches L. biflexa poussent fi 13 ° C et en presence d'azaguanine, tandis que les souches L, interro* ,, Enzyme-Linked-ImmunosorbentAssay ,,. 97
gans ne poussent pas. L'origine de la souche oriente d~j~ : celles isol~es des animaux sont des L. interrogans, celles de l'eau des L. biflexa. D~termination du s~rogroupe
I1 existe aujourd'hui environ 20 s~rogroupes de L. interrogans. La d~termination du s~rogroupe d'une souche peut ~tre r~alis~e par. la R.A.L. b l'aide du ,, s~rum de groupe ,, de lapin. Un ,, s~rum de groupe ,, est choisi parmi les immuns~rums qui agglutinent tous les s~rotypes du s~rogroupe donn~, et donnent le moins de r~actions crois~es avec les souches des autres s~rogroupes. La d~termination du s~rogroupe d'une souche ne pose habituellement pas de difficult~s tant que la souche n'est pas un ,, nouveau s~rotype ,. Le tableau des ,, s~rums de groupe - peut ~tre simplifi~ selon les r~gions. Pour les saprophytes, il n'existe pas de tableau de groupe. En pratique, une souche riche est d'abord test~e vis-a-vis des 20 ,, s~rums de groupe -. (D. Les taux des immuns~rums vis-a-vis de la souche homologue doivent ~tre au moins de 1/10 000% Ensuite, les s~rums r~agissant positivement seront titr~s ~ l'aide de la souche et de la souche homologue. Les taux-limites sont compares. D~termination du s~rotype
Les s~rotypes se rep~rent par une difference s~rologique. Deux souches sont consid~r~es appartenir ~ des s~rotypes diff~rents si, apr~s absorption crois~e avec le volume ad~quat d'antig~nes h~t~rologues, il reste au moins 10 % ou plus du titre homologue dans au moins un des deux s~rums. Chaque souche ~ ~tudier dolt ~tre compar~e a toutes les souches du s~rogroupe. C'est la mdthode standard classique. Une autre m~thode d~finit les s~rotypes par leurs portions sp~cifiques d'antig~nes. La souche est class$e selon les factures s~riques. C'est la m~thode des facteurs s$riques. a) M~thode classique : Une bonne culture d'une souche x est d'abord ~tudi~e en R.A.L. ~ l'aide des antiserums de toutes les souches de r~f~rence du s~rogroupe. De m~me, l'antis~rum de la souche x est test~ vis-a-vis de toutes les souches de r~f~rence du s~rogroupe auquel la souche x appartient.
Ensuite, les souches a y a n t des parent,s s~rologiques avec la souche x sont choisies (titre d'au moins 10 % du taux de la souche homologue). Les tests d'agglutination -- absorption crois~es sont effectu~s ~ l'aide de ces souches seulement. Une parent~ s~rologique avec la souche x est recherch~e chez ces diverses souches. Deux souches sont s~rologiquement identiques si, apr~s absorption par l'antig~ne h~t~rologue, il reste
moins de 10 % du taux des anticorps homologues dans les deux s6rums. Au cas od i0 % ou plus de taux d'anticorps demeure pr6sent dans toutes les absorptions, il s'agit probablement d'un nouveau s6rotype. b) M d t h o d e des f a c t e u r s s$riques :
I1 existe plusieurs agglutinog~nes dans les leptospires. Cette mosa£que diff6re avec chaque s6rotype. Un agglutinog6ne ou un ensemble d'agglutinog6nes constitue un facteur. Les facteurs dominants sont appel6s ,, majeurs ,,, les autres sont des antig~nes ,, mineurs -. Seuls, tes antig6nes ,, majeurs ,, ont une importance pour le typage.
Antig6nes majeurs
Autres ddterminations
Ces mdthodes sont surtout quantitatives. La ddtermination d'un sdrotype ddpend du degrd de plus ou moins bonne absorption, ce qui est une cause de diff6rences entre les Laboratoires. En 6tudiant les rapports A.D.N., Brendle a trouv6 6 groupes g6n6tiques de leptospires. A l'int6rieur de ces groupes, les souches ne sont pas toujours h6es antig6niquement. Aussi a-t-fl 6t6 d6crit des tests utilisant les pr6cipitines, les activit6s biochimiques. Certaines techniques ne sont pas encore au point pour les laboratoires de routine. La classification est 6volution permanente.
Un tel antig6ne est d6termin6 par ses anticorps homologues : ,, facteur s6rique -. Chaque facteur s6rique est pr6par6 par absorption d'un immuns6rum sp6cifique ~ l'aide de certaines souches pour 61iminer t o u s l e s anticorps sauf ceux directement dirig6s contre rantig6ne sp6cifique ,, majeur -. Apr~s des recherchbs empiriques et l'utilisation des facteurs s6riques, Kmety a pr6par6 une classification utilisable pour les s6rotypes de plusieurs s6rogroupes. A l'int6rieur d'un m~me s6rogroupe, les facteurs antig6niques sont group6s et constituent un sch6ma qui donne la composition des antig6nes ,, majeurs ,, de chaque s6rotype. D'apr6s ce sch6ma, plusieurs s6rogroupes sont nettement divis6s en sous-groupes.
Application L'examen d'une culture fi l'aide d'une gamme de ,, facteurs s6riques - du s6rogroupe, pr6alablement
d6termin6, r6v61era l'existence de facteurs dans cette souche. La R.A.L., avec les ,, facteurs s6riques ,,, est ex6cut6e selon des dilutions de d6part de 1/200 -- 1/400. Chaque r6action demande deux contr61es : -- 1. avec la souche homologue, utilis6e pour la pr6paration de l'immuns6rum (contrSle positif) ; 2. avec ta souche ayant servi ~ l'absorption (contr61e n6gatif). La mise en 6vidence d'un s6rotype par l'analyse factorielle est seulement une f o r t e p r S s o m p t i o n . Ceci dolt ~tre compl6t6 par une preuve : la r6action d'agglutination -- absorption avec la souche de r6f6rence du s6rotype diagnostiqu6. S y n t h ~ s e des d e u x m d t h o d e s : Ces deux m6thodes peuvent ~tre associ6es. Le sous-groupe de la souche peut ~tre d6termin6 h l'aide des facteurs s6riques et le typage final par la m6thode classique. D'ofi les avantages : r6duction du hombre d'absorptions crois6es et des facteurs s6riques.
donc un
syst~me en
DISCUSSION Les m6thodes de standardisation de ces techniques sont capitales : -- 1) Pr6paration de l'immuns6rum de lapin (cf. Congr6s de Munich, 1978}. -- 2) R.A.L. -- 3) R6action d ' a g g l u t i n a t i o n - absorption. Pour ce dernier test, l'utilisation de cultures tu6es par le formol, comme antigone et le taux r6siduel de 0,5 % -- 1 % sont suffisants. Un projet de standardisation pourrait ~tre adress6 aux participants. Ce projet, r6vis6, serait soumis au Dr Stallman, Secrdtaire du Sous-Comit6 de Taxonomie, pour amendements et accord officiel. Immunsdrum
II existe des diff6rences dans les taux d'anticorps obtenus par immunisation des animaux de laboratoire. O n salt que la rdponse immunologique des lapins varie d'un animal l'autre et d'une espbce ~ l'autre. U n r6cent travail, fait en Nouvelle-Z61ande, a ~montr6 que les immuns6rums de lapin et les s6rums de bovin ou de mouton ne permettaient pas de diff6rencier les s6rotypes, tandis que l'immuns6rum de hamster 6tait hautement spdcifique et donnait des titres homologues significatifs, probablement grace au taux d'IgG {2}.
Facteurs sdriques Le travail du Dr Kmety sur les facteurs s6riques est discut6. Certains s6rogroupes sont divis6s en
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sous-groupes. Pyrogenes a 6t6 divis6 en d e u x sous-groupes : pyrogenes (avec 5 sdrotypes possddant le facteur n ° 2) et zanoni (avec 5 sdrotypes p o s s d d a n t le facteur n ° 7). Le sdrogroupe Hebdomadis est ddsormais divis6 en trois n o u v e a u x groupes : Hebdomadis avec 9 sdrotypes, Sejrog c o m p r e n a n t 12 sdrotypes d o n t hardjo et wolfii, et Mini avec 6 sdrotypes dont: swajizak. L e sdrogroupe Sejro~ p e u t fitre divis6 en sousgroupes : Sejro~ avec 4 sdrotypes (facteurs 2 et 3), Saxkoebing avec 5 sdrotypes (facteur 21), et Wolfii avec 7 sdrotypes (facteurs 5 et 8).
SUMMARY
L e D r Little ddcrit son travail p o u r l'identification des souches du g r o u p e H e b d o m a d i s d'apr6s la m6thode de K m e t y . P o u r lui, les souches rdcemment isol6es sont moins faciles ~ identifier que les souches adapthes au Laboratoire. D'apr6s sa m6thode, il semble que les souches isoldes d u b6tail en G r a n d e - B r e t a g n e appartiennent s u r t o u t au s6rotype hardjo ou u n s6rotype tr6s voisin, tandis que les isolements effectu6s p a r t i r d ' a n i m a u x sauvages sont s u r t o u t saxkoebing. Le f a c t e u r s6rique n ° 13 est tr6s utile p o u r l'identification de hardjo.
Isolation and strain identification are the most important stages of direct diagnosis. I t is necessary to follow the chronology of the disease. Principal methods are : dark-field microscopy, culture in media, animal inoculation, fluorescent antibody technique, and possible new developments : latex agglutination test, E L I S A , Radio l m m u n o Assay.
Key-words : Acute - Convalescent stage - Diagnosis - Isolation - Identification.
BIBLIOGRAPHIE 1. D I K K E N H., et KMETY E. methods of Leptospires. Meth. 259-294.
- - Serological typing Microbiol., 1978, 11,
2. RIS D.R., H A M E L K.L. - - Use of hamster antisera in the preliminary differenciation of Leptospira interrogans serovars hardjo and balcanica. J. Med. Microbiol., 1978, 11, 351-353.
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