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Diagnostic de l’amplification du gène HER2 dans les cancers du sein
Disponible en ligne sur www.sciencedirect.com
Pathologie Biologie 56 (2008) 375–379 http://france.elsevier.com/direct/PATBIO/
Diagnostic de l’amplification du gène HER2 dans les cancers du sein Le point de vue génétique Diagnosis of HER2 gene amplification in breast carcinoma The genetic point of view J. Couturier a,*, A. Vincent-Salomon b, M.-C. Mathieu c, A. Valent c, A. Bernheim c,d a
Service de génétique oncologique, institut Curie, 26, rue d’Ulm, 75248 Paris cedex 05, France b Service de pathologie, institut Curie, 75248 Paris cedex 05, France c Département de pathologie moléculaire, institut Gustave-Roussy, 94805 Villejuif cedex, France d FRE2939 CNRS, institut Gustave-Roussy, 94805 Villejuif cedex, France Reçu le 3 mars 2008 ; accepté le 14 mars 2008 Disponible sur Internet le 5 mai 2008
Résumé L’amplification du gène HER2, localisé sur le chromosome 17, en 17q21.1, présente dans environ 20 % des cancers du sein, s’accompagne d’une hyperexpression de la protéine. Celle-ci a permis le développement d’une thérapeutique ciblée par l’anticorps monoclonal trastuzumab (Herceptin1). La réponse thérapeutique à ce traitement suppose une évaluation rigoureuse du statut du gène dans les tumeurs ; seules les patientes dont la tumeur montre une expression forte de la protéine ou une amplification du gène sont éligibles pour le traitement. Les cas de niveau d’expression intermédiaire sont analysés par hybridation in situ, le plus souvent par FISH, afin d’identifier ceux présentant une amplification. Les résultats sont parfois d’interprétation difficile du fait de l’aneuploïdie fréquente des tumeurs et les seuils de nombre de copies du gène définissant l’existence d’une amplification sont variables selon les études. Une tumeur est actuellement considérée comme porteuse d’une amplification si elle montre plus de six copies d’HER2 par noyau ou un rapport HER2 par centromère 17 supérieur à 2,2. L’article précise le phénomène de l’amplification d’HER2 dans les cancers du sein et le différencie des surreprésentations du gène. Il est recommandé de réaliser un test incluant le centromère 17, en cas de tumeur avec six à sept copies d’HER2. La présence de signaux en amas, témoins d’homogeneously staining regions (HSR), signe les amplifications. La démarche utilisée pour l’évaluation du statut d’HER2 dans les cancers du sein préfigure celle qui sera nécessaire pour d’autres marqueurs de futures thérapeutiques ciblées. # 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Abstract Amplification of the HER2 gene, mapping to 17q21.1, is present in about 20 % of breast carcinomas. Amplification leads to an overexpression of the protein that made it possible to develop a targeted therapy by the monoclonal antibody trastuzumab (Herceptin1). A good response to the treatment requires a stringent assessment of the gene status in tumours; only patients whose tumour shows a high expression of the protein or an amplification of the gene are eligible. Cases with intermediate level expression are checked by in situ hybridization, mainly by FISH, to identify amplifications in this subset of tumours. Results are sometimes difficult to interpret due to the frequent aneuploidy of the tumours. Moreover, copy number cut-offs of the gene for defining an amplification are variable according to the studies. A tumour is considered now as amplified when showing more than six HER2 copies per nucleus, or a ratio HER2 to centromere 17 greater than 2.2. The phenomenon of HER2 amplification in breast cancers is discussed in this paper, and distinguished from gene overrepresentation. It is recommended that tumours showing six to seven copies of HER2 are assessed with a kit including the centromere 17. Clusters of signals are characteristic of amplifications.
* Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (J. Couturier). 0369-8114/$ – see front matter # 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.patbio.2008.03.009
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The process designed for the assessment of HER2 is a model of strategies that will be used for the evaluation of markers involved in future targeted therapies. # 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Mots clés : Carcinome ; Sein ; HER2 ; Amplification ; FISH Keywords: Carcinoma; Breast; HER2; Amplification; FISH
La protéine human epidermal growth factor receptor 2 (HER2), produit du gène HER2 (alias ERBB2), localisé sur le bras long du chromosome 17, en 17q21.1, est hyperexprimée dans environ 20 % des carcinomes canalaires invasifs du sein. Il s’agit d’un récepteur tyrosine-kinase, dont l’hyperexpression est liée à l’amplification du gène [1–4]. Le développement d’un anticorps monoclonal humanisé anti-HER2, le trastuzumab (Herceptin1), et son introduction en thérapeutique en association avec d’autres chimiothérapies, ont permis des progrès significatifs dans la survie des patientes métastatiques présentant un cancer hyperexprimant la protéine HER2 [5]. Plus récemment, l’indication du traitement a été étendue en situation adjuvante, c’est-à-dire au diagnostic, aux patientes présentant une indication de chimiothérapie. En effet, plusieurs essais ont montré que le traitement adjuvant permettait de réduire le risque de récidive et d’évolution métastatique chez ces patientes [6,7]. Cependant, la réponse à ce traitement impose une évaluation adéquate de l’hyperexpression de la protéine dans les tumeurs, ou de l’amplification du gène qui la conditionne (pour revue, [8]). Cela est d’autant plus important dans le cas du traitement adjuvant, compte tenu du fait qu’il s’agit de patientes dont le pronostic individuel n’est pas défini, comme peut l’être celui des patientes en situation métastatique, et aussi du fait du nombre potentiellement élevé de patientes éligibles. Or, il a été montré qu’il existait environ 20 % d’erreurs dans l’évaluation du statut de HER2 par les laboratoires de base par rapport aux centres entraînés [9]. Dans ce contexte, il apparaît nécessaire de définir
aussi précisément que possible ce qu’est l’amplification d’HER2 dans les cancers du sein. 1. Définition de l’amplification Une amplification est un processus génétique bien caractérisé aboutissant à la multiplication sélective du nombre d’exemplaires d’un gène (ou d’un groupe limité de gènes adjacents, définissant un « amplicon »), indépendamment des gènes situés plus à distance sur le chromosome. Ce phénomène est connu comme participant à l’oncogenèse dans plusieurs types tumoraux : amplification de MYCN dans les neuroblastomes, de EGFR dans les glioblastomes, de MDM2 et CDK4 dans les liposarcomes bien différenciés, d’HER2 dans les cancers du sein, etc. . . (pour revue, [10,11]). L’amplification génique a pour conséquence, en règle, l’hyperexpression du ou des gène(s) amplifié(s), et, lorsqu’il s’agit d’un oncogène comme HER2, elle donne un avantage sélectif prolifératif aux cellules qui en sont porteuses. L’amplification peut prendre deux formes chromosomiques. La première, est celle de minuscules chromosomes, doubles au stade de la métaphase (double minutes, en anglais), qui sont de petits éléments acentriques contenant le(s) gène(s) amplifié(s). Ils sont extrachromosomiques et présents en de multiples copies. C’est, par exemple, la forme habituelle de l’amplification de MYCN dans le neuroblastome. Ils se révèlent en hybridation in situ (HIS) sous forme d’un semis de signaux dans les noyaux.
Fig. 1. FISH HER2 (signaux rouges) sur coupes de deux tumeurs incluses en paraffine. (a) : tumeur montrant une amplification ; noter la disposition des signaux en amas. (b, c) : tumeur montrant une surreprésentation. (b) : noyau interphasique : à g. signaux centromériques du 17 (vert), à d. signaux HER2 (rouge) ; 4–5 signaux sont visibles, avec un rapport HER2 par centromère 17 proche de 1. (c) : métaphase de la même tumeur, montrant la colocalisation des signaux HER2 (à d., en rouge) et centromériques (à g., en vert), confirmant que la surreprésentation de HER2 est liée à une polysomie 17.
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L’autre type d’amplification se présente sous la forme d’homogeneously staining regions (HSR), segments chromosomiques néoformés, uniques ou multiples, homogènes à l’échelle microscopique, constitués du gène ou groupe de gènes amplifiés. Les amplifications dans les carcinomes mammaires, et celles d’HER2 en particulier, surviennent en règle sous cette seconde forme [12]. Typiquement, ces multiples copies localisées du gène donnent en HIS des amas de signaux caractéristiques, dans les noyaux interphasiques (Fig. 1a). Ce sont ces amplifications réelles qui sont associées à des expressions élevées de la protéine HER2 [13–15]. Toutefois, l’aneuploïdie des cellules tumorales peut rendre le diagnostic délicat. 2. Polyploïdie, polysomie, surreprésentation et amplification La ploïdie des cellules tumorales est extrêmement variable d’une tumeur à l’autre, et peut l’être aussi au sein d’une même tumeur, particulièrement dans celles de haut grade. Les études par cytométrie en flux dans les cancers du sein [14,15] montrent une aneuploïdie dans environ 50 % des cas [16,17]. Ainsi, le caryotype des tumeurs est souvent très complexe, voire hétérogène d’une cellule à l’autre. Rappelons que les mitoses des cellules malignes sont fréquemment pathologiques, avec des figures multipolaires et des malségrégations chromosomiques. Le chromosome 17 et le gène HER2 qu’il porte entre autres, pour ne parler que d’eux, peuvent évidemment se trouver affectés dans ces variations globales de ploïdie. Les polysomies (trisomies, tétrasomies et plus), totales ou partielles (issues de translocations déséquilibrées) peuvent aussi modifier le décompte des copies d’un gène, en dehors de toute amplification. La trisomie et, plus généralement, la polysomie 17, sont très fréquentes dans les tumeurs malignes de types les plus variés, dont les tumeurs du sein. On conçoit ainsi que le chromosome 17 et le gène HER2 soient entraînés dans ces anomalies de nombre. Ces surreprésentations d’HER2 liées à de multiples copies de chromosomes 17, et non à des HSR, ne donnent pas lieu à la formation d’amas de signaux dans les noyaux interphasiques après HIS (Fig. 1b et c). Si ces anomalies globales (polyploïdies) ou partielles (polysomies) de ploïdie ne sont pas recherchées par le compte du nombre de centromères du chromosome 17, cela peut amener à une interprétation erronée du statut du gène [15]. Ainsi, les amplifications spécifiques d’HER2 sont à distinguer des surreprésentations du gène liées à des anomalies globales de ploïdie, aux polysomies 17 et à des translocations déséquilibrées du bras long du 17. Par exemple, une tumeur tétraploïde ayant quatre chromosomes 17, montrera quatre signaux HER-2 et quatre signaux centromériques, sans qu’elle possède une réelle amplification du gène. Dans une telle tumeur tétraploïde, des translocations déséquilibrées aboutissant à des gains de 17q peuvent être en outre présentes, augmentant le nombre de copies HER2, toujours sans qu’il y ait amplification. Ces surreprésentations ne modifient pas spécifiquement l’expression du gène et ne donnent pas d’hyperexpression du niveau de celle des amplifications [13–15]. On conçoit, dans ces
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conditions, l’importance de la définition du seuil au-delà duquel il est considéré qu’il y a amplification. Par ailleurs, dans des cas exceptionnels, il se peut que seul un contingent des cellules tumorales montre une amplification. Cette situation s’accompagne aussi d’une hétérogénéité dans l’expression de la protéine en immunohistochimie. 3. Détermination du statut HER2 en pratique clinique La détection de la protéine est effectuée en première intention par immunohistochimie (IHC), sur coupes histologiques de la tumeur incluse en paraffine (pour revue, [8,18]). Le résultat est donné sous la forme d’un score prenant en compte l’intensité du marquage membranaire et le pourcentage de cellules marquées dans la composante invasive ou dans la métastase : 0 ou 1+, expression négative, 2+, expression intermédiaire, et 3+, expression forte. Les patientes dont les tumeurs montrent une expression 3+ sont éligibles pour le traitement. Pour les tumeurs classées 2+, la situation est plus complexe. Certains cas n’ont pas d’anomalie d’HER2, d’autres ont une surreprésentation, et enfin, les autres ont une amplification génique réelle. De ce fait, le statut du gène HER2 des tumeurs d’expression 2+ doit être vérifié dans un second temps par HIS. Les patientes porteuses d’une tumeur d’expression 2+ montrant une amplification en HIS pourront bénéficier du traitement par le trastuzumab. Cependant, des expériences étrangères et, en France, celles du groupe GEFPICS [19] ont montré que la validité des résultats obtenus par IHC suppose déjà une calibration adéquate de la technique par rapport à l’HIS, technique de référence. L’HIS permet une visualisation directe sur la coupe tissulaire, dans les noyaux des cellules tumorales invasives, du nombre de copies du gène HER2, soit par une méthode en fluorescence (FISH), soit une méthode impliquant un chromogène (CISH). C’est cette expression du résultat sous la forme d’une variable discontinue (le nombre de signaux) qui fait de l’HIS la technique de référence par rapport à l’IHC, laquelle donne une variation continue d’intensité de marquage, plus difficile à évaluer pour les niveaux intermédiaires. De plus, les résultats de la FISH sont moins sensibles aux conditions de fixation (Bouin excepté) que ceux de l’IHC [4]. Les trousses de diagnostic comprennent la sonde HER2 seule, ou associée à une sonde centromérique du 17, permettant la détermination du nombre de copies du chromosome [18]. Le résultat de l’examen est donc donné en nombre moyen de signaux HER2 par noyau, ou en rapport du nombre de signaux HER2 sur signaux centromériques. En dépit des efforts de nombreux groupes de travail, il n’avait pas été défini, jusqu’à récemment, de seuil consensus déterminant l’existence d’une amplification d’HER-2. Dans la littérature et dans les notices des fournisseurs de trousses d’HIS, ce seuil de positivité varie de quatre à six copies d’HER2, en cas de test de la sonde HER2 seule, ou d’un rapport HER2 par centromère du 17 de deux à trois, en général 2,2, en cas d’utilisation d’une trousse incluant le centromère 17 [3,15,20–23]. D’un point de vue génétique, un seuil de quatre ou cinq copies apparaît arbitraire et insuffisant pour qualifier
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Tableau 1 Modalités de comptage des signaux pour l’évaluation du statut du gène HER2, selon les recommandations ASCO/CAP [8] Signaux HER2
Signaux HER2/cen 17
Statut HER2
<4 4–6 >6
< 1,8 1,8–2,2 > 2,2
Non amplifié Ambigu Amplifié
une amplification, ce nombre de copies pouvant correspondre, comme on l’a vu, à des tumeurs aneuploïdes porteuses d’une tétrasomie 17 et/ou des translocations déséquilibrées du 17q. L’American Society of Clinical Oncology et le College of American Pathologists, après une importante méta-analyse, viennent de publier des recommandations communes [8] considérant un résultat comme positif, c’est-à-dire permettant l’éligibilité de la patiente au traitement par le trastuzumab, si la tumeur montre un nombre moyen de plus de six copies du gène HER2 par noyau ou un rapport signaux HER2 par centromère 17 supérieur à 2,2 (Tableau 1). Les résultats entre quatre copies de HER2 ou avec un rapport HER2 par centromère 17 entre 1,8 et 2,2 sont considérés ambigus ; cependant, ces cas à résultat non concluant sont rares, représentant moins de 3 % des cas [8]. Ces recommandations, bien qu’imparfaites, en particulier en raison de la discordance de seuils de positivité en fonction de l’utilisation du seul nombre de copies d’HER2 ou du rapport signaux HER2 par centromères 17, clarifient la situation et sont plus exigeantes que les antérieures. En effet, les tumeurs présentant entre quatre et six copies d’HER2 ou des rapports HER2 par centromère 17 inférieurs à 2,3 ne sont plus considérées comme porteuses d’une amplification. En pratique, en toute rigueur, les cas ne montrant que six ou sept copies d’HER2 et qui n’auraient été analysés qu’avec la sonde HER2 seule doivent être contrôlés avec une sonde centromérique du 17, afin de détecter les éventuelles polysomies de ce chromosome. Par ailleurs, comme nous l’avons vu, les signaux en amas signent les amplifications. 4. Conclusion Le risque de traitement de patientes en fait non éligibles du fait du statut HER2 non amplifié de leur tumeur est à prendre particulièrement en considération lorsqu’il doit s’appliquer en situation adjuvante, donc pour des patientes dont le pronostic est relativement bon, cela du fait que l’Herceptin1 est dotée d’une toxicité cardiaque et aussi pour des raisons économiques du fait du coût du traitement. L’analyse de l’évaluation du statut de HER2 dans les tumeurs d’expression 2+ montre que l’essentiel des difficultés d’interprétation tient aux cas avec faible augmentation du nombre de copies du gène. La nécessité de différencier les amplifications des surreprésentations liées à des polysomies 17 dans ces cas impose la vérification du nombre de centromères 17 [17]. Dans cette situation, l’observation de signaux en amas est aussi une aide pour affirmer une amplification. Le traitement par Herceptin1 est actif, bien qu’incomplètement, dans les cas typiquement amplifiés. La réponse des cas avec faible augmentation du nombre de copies de HER2 (quatre à six copies, HER2 par
centromère 17 entre 1,8 et 2,2), jusqu’ici mélangés dans les études avec les cas clairement amplifiés, n’est pas connue, et sa connaissance précise ne peut reposer que sur des recherches cliniques spécifiques [21,23]. Plus généralement, il paraît important que les tests d’éligibilité au traitement par Herceptin1 soient effectués dans le cadre d’un réseau national de centres experts soumis à un contrôle de qualité. L’organisation de la détermination du statut d’HER2 préfigurera certainement celle qui devra être mise en place pour les autres marqueurs de thérapeutiques ciblées issus de la génomique à venir. Références [1] Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science 1987;235:177–82. [2] Jacobs TW, Gown AM, Yaziji H, Barnes MJ, Schnitt SJ. Comparison of fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry for the evaluation of HER-2/neu in breast cancer. J Clin Oncol 1999;17:1974–82. [3] Couturier J, Vincent-Salomon A, Nicolas A, Beuzeboc P, Mouret E, Zafrani B, et al. Strong correlation between results of fluorescent in situ hybridization and immunohistochemistry for the assessment of the ERBB2 (HER-2/neu) gene status in breast carcinoma. Mod Pathol 2000;13:1238–43. [4] Pauletti G, Dandekar S, Rong H, Ramos L, Peng H, Seshadri R, et al. Assessment of methods for tissue-based detection of the HER-2/neu alteration in human breast cancer: a direct comparison of fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry. J Clin Oncol 2000;18: 3651–64. [5] Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, Fuchs H, Paton V, Bajamonde A, et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. N Engl J Med 2001;344:783–92. [6] Piccart-Gebhart MJ, Procter M, Leyland-Jones B, Goldhirsch A, Untch M, Smith I, et al. Trastuzumab after adjuvant chemotherapy in HER2-positive breast cancer. N Engl J Med Oct 20; 2005;353(16):1659–72. [7] Romond EH, Perez EA, Bryant J, Suman VJ, Geyer Jr CE, Davidson NE, et al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2positive breast cancer. N Engl J Med Oct 20; 2005;353(16):1673–84. [8] Wolff AC, Hammond EH, Schwartz JN, Hagerty KL, Allred DC, Cote RJ, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. J Clin Oncol 2007;25:118–45. [9] Paik S, Bryant J, Tan-Chiu E, Romond E, Hiller W, Park K, et al. Realworld performance of HER2 testing – National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project experience. J Natl Cancer Inst 2002;94:852–4. [10] Bernheim A, Huret JL, Guillaud-Bataille M, Brison O, Couturier J, Groupe français de cytogénétique oncologique. De la cytogénétique à la cytogénomique des tumeurs : le point en 2004. Bull Cancer 2004;91:29–43. [11] Albertson DG. Gene amplification in cancer. Trends Genet 2006;22:447–55. [12] Bernardino J, Gerbault-Seureau M, Zafrani B, Dericke Y, Boudou E, Magdelenat H, et al. Homogeneously staining regions in 223 breast carcinomas: cytogenetic and clinicopathological correlations. Br J Cancer 1998;78:1214–8. [13] Bartlett JM, Going JJ, Mallon EA, Watters AD, Reeves JR, Stanton P, et al. Evaluating HER2 amplification and overexpression in breast cancer. J Pathol 2001;195:422–8. [14] Downs-Kelly E, Yoder BJ, Stoler M, Tubbs RR, Skacel M, Grogan T, et al. The influence of polysomy 17 on HER2 gene and protein expression in adenocarcinoma of the breast: a fluorescent in situ hybridization, immunohistochemical, and isotopic mRNA in situ hybridization study. Am J Surg Pathol 2005;29:1221–7. [15] Dal Lago L, Durbecq V, Desmedt C, Salgado R, Verjat T, Lespagnard L, et al. Correction for chromosome 17 is critical for the determination of true
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Résumé L’amplification du gène HER2, localisé sur le chromosome 17, en 17q21.1, présente dans environ 20 % des cancers du sein, s’accompagne d’une hyperexpression de la protéine. Celle-ci a permis le développement d’une thérapeutique ciblée par l’anticorps monoclonal trastuzumab (Herceptin1). La réponse thérapeutique à ce traitement suppose une évaluation rigoureuse du statut du gène dans les tumeurs ; seules les patientes dont la tumeur montre une expression forte de la protéine ou une amplification du gène sont éligibles pour le traitement. Les cas de niveau d’expression intermédiaire sont analysés par hybridation in situ, le plus souvent par FISH, afin d’identifier ceux présentant une amplification. Les résultats sont parfois d’interprétation difficile du fait de l’aneuploïdie fréquente des tumeurs et les seuils de nombre de copies du gène définissant l’existence d’une amplification sont variables selon les études. Une tumeur est actuellement considérée comme porteuse d’une amplification si elle montre plus de six copies d’HER2 par noyau ou un rapport HER2 par centromère 17 supérieur à 2,2. L’article précise le phénomène de l’amplification d’HER2 dans les cancers du sein et le différencie des surreprésentations du gène. Il est recommandé de réaliser un test incluant le centromère 17, en cas de tumeur avec six à sept copies d’HER2. La présence de signaux en amas, témoins d’homogeneously staining regions (HSR), signe les amplifications. La démarche utilisée pour l’évaluation du statut d’HER2 dans les cancers du sein préfigure celle qui sera nécessaire pour d’autres marqueurs de futures thérapeutiques ciblées. # 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Abstract Amplification of the HER2 gene, mapping to 17q21.1, is present in about 20 % of breast carcinomas. Amplification leads to an overexpression of the protein that made it possible to develop a targeted therapy by the monoclonal antibody trastuzumab (Herceptin1). A good response to the treatment requires a stringent assessment of the gene status in tumours; only patients whose tumour shows a high expression of the protein or an amplification of the gene are eligible. Cases with intermediate level expression are checked by in situ hybridization, mainly by FISH, to identify amplifications in this subset of tumours. Results are sometimes difficult to interpret due to the frequent aneuploidy of the tumours. Moreover, copy number cut-offs of the gene for defining an amplification are variable according to the studies. A tumour is considered now as amplified when showing more than six HER2 copies per nucleus, or a ratio HER2 to centromere 17 greater than 2.2. The phenomenon of HER2 amplification in breast cancers is discussed in this paper, and distinguished from gene overrepresentation. It is recommended that tumours showing six to seven copies of HER2 are assessed with a kit including the centromere 17. Clusters of signals are characteristic of amplifications.
* Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (J. Couturier). 0369-8114/$ – see front matter # 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.patbio.2008.03.009
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The process designed for the assessment of HER2 is a model of strategies that will be used for the evaluation of markers involved in future targeted therapies. # 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Mots clés : Carcinome ; Sein ; HER2 ; Amplification ; FISH Keywords: Carcinoma; Breast; HER2; Amplification; FISH
La protéine human epidermal growth factor receptor 2 (HER2), produit du gène HER2 (alias ERBB2), localisé sur le bras long du chromosome 17, en 17q21.1, est hyperexprimée dans environ 20 % des carcinomes canalaires invasifs du sein. Il s’agit d’un récepteur tyrosine-kinase, dont l’hyperexpression est liée à l’amplification du gène [1–4]. Le développement d’un anticorps monoclonal humanisé anti-HER2, le trastuzumab (Herceptin1), et son introduction en thérapeutique en association avec d’autres chimiothérapies, ont permis des progrès significatifs dans la survie des patientes métastatiques présentant un cancer hyperexprimant la protéine HER2 [5]. Plus récemment, l’indication du traitement a été étendue en situation adjuvante, c’est-à-dire au diagnostic, aux patientes présentant une indication de chimiothérapie. En effet, plusieurs essais ont montré que le traitement adjuvant permettait de réduire le risque de récidive et d’évolution métastatique chez ces patientes [6,7]. Cependant, la réponse à ce traitement impose une évaluation adéquate de l’hyperexpression de la protéine dans les tumeurs, ou de l’amplification du gène qui la conditionne (pour revue, [8]). Cela est d’autant plus important dans le cas du traitement adjuvant, compte tenu du fait qu’il s’agit de patientes dont le pronostic individuel n’est pas défini, comme peut l’être celui des patientes en situation métastatique, et aussi du fait du nombre potentiellement élevé de patientes éligibles. Or, il a été montré qu’il existait environ 20 % d’erreurs dans l’évaluation du statut de HER2 par les laboratoires de base par rapport aux centres entraînés [9]. Dans ce contexte, il apparaît nécessaire de définir
aussi précisément que possible ce qu’est l’amplification d’HER2 dans les cancers du sein. 1. Définition de l’amplification Une amplification est un processus génétique bien caractérisé aboutissant à la multiplication sélective du nombre d’exemplaires d’un gène (ou d’un groupe limité de gènes adjacents, définissant un « amplicon »), indépendamment des gènes situés plus à distance sur le chromosome. Ce phénomène est connu comme participant à l’oncogenèse dans plusieurs types tumoraux : amplification de MYCN dans les neuroblastomes, de EGFR dans les glioblastomes, de MDM2 et CDK4 dans les liposarcomes bien différenciés, d’HER2 dans les cancers du sein, etc. . . (pour revue, [10,11]). L’amplification génique a pour conséquence, en règle, l’hyperexpression du ou des gène(s) amplifié(s), et, lorsqu’il s’agit d’un oncogène comme HER2, elle donne un avantage sélectif prolifératif aux cellules qui en sont porteuses. L’amplification peut prendre deux formes chromosomiques. La première, est celle de minuscules chromosomes, doubles au stade de la métaphase (double minutes, en anglais), qui sont de petits éléments acentriques contenant le(s) gène(s) amplifié(s). Ils sont extrachromosomiques et présents en de multiples copies. C’est, par exemple, la forme habituelle de l’amplification de MYCN dans le neuroblastome. Ils se révèlent en hybridation in situ (HIS) sous forme d’un semis de signaux dans les noyaux.
Fig. 1. FISH HER2 (signaux rouges) sur coupes de deux tumeurs incluses en paraffine. (a) : tumeur montrant une amplification ; noter la disposition des signaux en amas. (b, c) : tumeur montrant une surreprésentation. (b) : noyau interphasique : à g. signaux centromériques du 17 (vert), à d. signaux HER2 (rouge) ; 4–5 signaux sont visibles, avec un rapport HER2 par centromère 17 proche de 1. (c) : métaphase de la même tumeur, montrant la colocalisation des signaux HER2 (à d., en rouge) et centromériques (à g., en vert), confirmant que la surreprésentation de HER2 est liée à une polysomie 17.
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L’autre type d’amplification se présente sous la forme d’homogeneously staining regions (HSR), segments chromosomiques néoformés, uniques ou multiples, homogènes à l’échelle microscopique, constitués du gène ou groupe de gènes amplifiés. Les amplifications dans les carcinomes mammaires, et celles d’HER2 en particulier, surviennent en règle sous cette seconde forme [12]. Typiquement, ces multiples copies localisées du gène donnent en HIS des amas de signaux caractéristiques, dans les noyaux interphasiques (Fig. 1a). Ce sont ces amplifications réelles qui sont associées à des expressions élevées de la protéine HER2 [13–15]. Toutefois, l’aneuploïdie des cellules tumorales peut rendre le diagnostic délicat. 2. Polyploïdie, polysomie, surreprésentation et amplification La ploïdie des cellules tumorales est extrêmement variable d’une tumeur à l’autre, et peut l’être aussi au sein d’une même tumeur, particulièrement dans celles de haut grade. Les études par cytométrie en flux dans les cancers du sein [14,15] montrent une aneuploïdie dans environ 50 % des cas [16,17]. Ainsi, le caryotype des tumeurs est souvent très complexe, voire hétérogène d’une cellule à l’autre. Rappelons que les mitoses des cellules malignes sont fréquemment pathologiques, avec des figures multipolaires et des malségrégations chromosomiques. Le chromosome 17 et le gène HER2 qu’il porte entre autres, pour ne parler que d’eux, peuvent évidemment se trouver affectés dans ces variations globales de ploïdie. Les polysomies (trisomies, tétrasomies et plus), totales ou partielles (issues de translocations déséquilibrées) peuvent aussi modifier le décompte des copies d’un gène, en dehors de toute amplification. La trisomie et, plus généralement, la polysomie 17, sont très fréquentes dans les tumeurs malignes de types les plus variés, dont les tumeurs du sein. On conçoit ainsi que le chromosome 17 et le gène HER2 soient entraînés dans ces anomalies de nombre. Ces surreprésentations d’HER2 liées à de multiples copies de chromosomes 17, et non à des HSR, ne donnent pas lieu à la formation d’amas de signaux dans les noyaux interphasiques après HIS (Fig. 1b et c). Si ces anomalies globales (polyploïdies) ou partielles (polysomies) de ploïdie ne sont pas recherchées par le compte du nombre de centromères du chromosome 17, cela peut amener à une interprétation erronée du statut du gène [15]. Ainsi, les amplifications spécifiques d’HER2 sont à distinguer des surreprésentations du gène liées à des anomalies globales de ploïdie, aux polysomies 17 et à des translocations déséquilibrées du bras long du 17. Par exemple, une tumeur tétraploïde ayant quatre chromosomes 17, montrera quatre signaux HER-2 et quatre signaux centromériques, sans qu’elle possède une réelle amplification du gène. Dans une telle tumeur tétraploïde, des translocations déséquilibrées aboutissant à des gains de 17q peuvent être en outre présentes, augmentant le nombre de copies HER2, toujours sans qu’il y ait amplification. Ces surreprésentations ne modifient pas spécifiquement l’expression du gène et ne donnent pas d’hyperexpression du niveau de celle des amplifications [13–15]. On conçoit, dans ces
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conditions, l’importance de la définition du seuil au-delà duquel il est considéré qu’il y a amplification. Par ailleurs, dans des cas exceptionnels, il se peut que seul un contingent des cellules tumorales montre une amplification. Cette situation s’accompagne aussi d’une hétérogénéité dans l’expression de la protéine en immunohistochimie. 3. Détermination du statut HER2 en pratique clinique La détection de la protéine est effectuée en première intention par immunohistochimie (IHC), sur coupes histologiques de la tumeur incluse en paraffine (pour revue, [8,18]). Le résultat est donné sous la forme d’un score prenant en compte l’intensité du marquage membranaire et le pourcentage de cellules marquées dans la composante invasive ou dans la métastase : 0 ou 1+, expression négative, 2+, expression intermédiaire, et 3+, expression forte. Les patientes dont les tumeurs montrent une expression 3+ sont éligibles pour le traitement. Pour les tumeurs classées 2+, la situation est plus complexe. Certains cas n’ont pas d’anomalie d’HER2, d’autres ont une surreprésentation, et enfin, les autres ont une amplification génique réelle. De ce fait, le statut du gène HER2 des tumeurs d’expression 2+ doit être vérifié dans un second temps par HIS. Les patientes porteuses d’une tumeur d’expression 2+ montrant une amplification en HIS pourront bénéficier du traitement par le trastuzumab. Cependant, des expériences étrangères et, en France, celles du groupe GEFPICS [19] ont montré que la validité des résultats obtenus par IHC suppose déjà une calibration adéquate de la technique par rapport à l’HIS, technique de référence. L’HIS permet une visualisation directe sur la coupe tissulaire, dans les noyaux des cellules tumorales invasives, du nombre de copies du gène HER2, soit par une méthode en fluorescence (FISH), soit une méthode impliquant un chromogène (CISH). C’est cette expression du résultat sous la forme d’une variable discontinue (le nombre de signaux) qui fait de l’HIS la technique de référence par rapport à l’IHC, laquelle donne une variation continue d’intensité de marquage, plus difficile à évaluer pour les niveaux intermédiaires. De plus, les résultats de la FISH sont moins sensibles aux conditions de fixation (Bouin excepté) que ceux de l’IHC [4]. Les trousses de diagnostic comprennent la sonde HER2 seule, ou associée à une sonde centromérique du 17, permettant la détermination du nombre de copies du chromosome [18]. Le résultat de l’examen est donc donné en nombre moyen de signaux HER2 par noyau, ou en rapport du nombre de signaux HER2 sur signaux centromériques. En dépit des efforts de nombreux groupes de travail, il n’avait pas été défini, jusqu’à récemment, de seuil consensus déterminant l’existence d’une amplification d’HER-2. Dans la littérature et dans les notices des fournisseurs de trousses d’HIS, ce seuil de positivité varie de quatre à six copies d’HER2, en cas de test de la sonde HER2 seule, ou d’un rapport HER2 par centromère du 17 de deux à trois, en général 2,2, en cas d’utilisation d’une trousse incluant le centromère 17 [3,15,20–23]. D’un point de vue génétique, un seuil de quatre ou cinq copies apparaît arbitraire et insuffisant pour qualifier
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Tableau 1 Modalités de comptage des signaux pour l’évaluation du statut du gène HER2, selon les recommandations ASCO/CAP [8] Signaux HER2
Signaux HER2/cen 17
Statut HER2
<4 4–6 >6
< 1,8 1,8–2,2 > 2,2
Non amplifié Ambigu Amplifié
une amplification, ce nombre de copies pouvant correspondre, comme on l’a vu, à des tumeurs aneuploïdes porteuses d’une tétrasomie 17 et/ou des translocations déséquilibrées du 17q. L’American Society of Clinical Oncology et le College of American Pathologists, après une importante méta-analyse, viennent de publier des recommandations communes [8] considérant un résultat comme positif, c’est-à-dire permettant l’éligibilité de la patiente au traitement par le trastuzumab, si la tumeur montre un nombre moyen de plus de six copies du gène HER2 par noyau ou un rapport signaux HER2 par centromère 17 supérieur à 2,2 (Tableau 1). Les résultats entre quatre copies de HER2 ou avec un rapport HER2 par centromère 17 entre 1,8 et 2,2 sont considérés ambigus ; cependant, ces cas à résultat non concluant sont rares, représentant moins de 3 % des cas [8]. Ces recommandations, bien qu’imparfaites, en particulier en raison de la discordance de seuils de positivité en fonction de l’utilisation du seul nombre de copies d’HER2 ou du rapport signaux HER2 par centromères 17, clarifient la situation et sont plus exigeantes que les antérieures. En effet, les tumeurs présentant entre quatre et six copies d’HER2 ou des rapports HER2 par centromère 17 inférieurs à 2,3 ne sont plus considérées comme porteuses d’une amplification. En pratique, en toute rigueur, les cas ne montrant que six ou sept copies d’HER2 et qui n’auraient été analysés qu’avec la sonde HER2 seule doivent être contrôlés avec une sonde centromérique du 17, afin de détecter les éventuelles polysomies de ce chromosome. Par ailleurs, comme nous l’avons vu, les signaux en amas signent les amplifications. 4. Conclusion Le risque de traitement de patientes en fait non éligibles du fait du statut HER2 non amplifié de leur tumeur est à prendre particulièrement en considération lorsqu’il doit s’appliquer en situation adjuvante, donc pour des patientes dont le pronostic est relativement bon, cela du fait que l’Herceptin1 est dotée d’une toxicité cardiaque et aussi pour des raisons économiques du fait du coût du traitement. L’analyse de l’évaluation du statut de HER2 dans les tumeurs d’expression 2+ montre que l’essentiel des difficultés d’interprétation tient aux cas avec faible augmentation du nombre de copies du gène. La nécessité de différencier les amplifications des surreprésentations liées à des polysomies 17 dans ces cas impose la vérification du nombre de centromères 17 [17]. Dans cette situation, l’observation de signaux en amas est aussi une aide pour affirmer une amplification. Le traitement par Herceptin1 est actif, bien qu’incomplètement, dans les cas typiquement amplifiés. La réponse des cas avec faible augmentation du nombre de copies de HER2 (quatre à six copies, HER2 par
centromère 17 entre 1,8 et 2,2), jusqu’ici mélangés dans les études avec les cas clairement amplifiés, n’est pas connue, et sa connaissance précise ne peut reposer que sur des recherches cliniques spécifiques [21,23]. Plus généralement, il paraît important que les tests d’éligibilité au traitement par Herceptin1 soient effectués dans le cadre d’un réseau national de centres experts soumis à un contrôle de qualité. L’organisation de la détermination du statut d’HER2 préfigurera certainement celle qui devra être mise en place pour les autres marqueurs de thérapeutiques ciblées issus de la génomique à venir. Références [1] Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science 1987;235:177–82. [2] Jacobs TW, Gown AM, Yaziji H, Barnes MJ, Schnitt SJ. Comparison of fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry for the evaluation of HER-2/neu in breast cancer. J Clin Oncol 1999;17:1974–82. [3] Couturier J, Vincent-Salomon A, Nicolas A, Beuzeboc P, Mouret E, Zafrani B, et al. Strong correlation between results of fluorescent in situ hybridization and immunohistochemistry for the assessment of the ERBB2 (HER-2/neu) gene status in breast carcinoma. Mod Pathol 2000;13:1238–43. [4] Pauletti G, Dandekar S, Rong H, Ramos L, Peng H, Seshadri R, et al. Assessment of methods for tissue-based detection of the HER-2/neu alteration in human breast cancer: a direct comparison of fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry. J Clin Oncol 2000;18: 3651–64. [5] Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, Fuchs H, Paton V, Bajamonde A, et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. N Engl J Med 2001;344:783–92. [6] Piccart-Gebhart MJ, Procter M, Leyland-Jones B, Goldhirsch A, Untch M, Smith I, et al. Trastuzumab after adjuvant chemotherapy in HER2-positive breast cancer. N Engl J Med Oct 20; 2005;353(16):1659–72. [7] Romond EH, Perez EA, Bryant J, Suman VJ, Geyer Jr CE, Davidson NE, et al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2positive breast cancer. N Engl J Med Oct 20; 2005;353(16):1673–84. [8] Wolff AC, Hammond EH, Schwartz JN, Hagerty KL, Allred DC, Cote RJ, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. J Clin Oncol 2007;25:118–45. [9] Paik S, Bryant J, Tan-Chiu E, Romond E, Hiller W, Park K, et al. Realworld performance of HER2 testing – National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project experience. J Natl Cancer Inst 2002;94:852–4. [10] Bernheim A, Huret JL, Guillaud-Bataille M, Brison O, Couturier J, Groupe français de cytogénétique oncologique. De la cytogénétique à la cytogénomique des tumeurs : le point en 2004. Bull Cancer 2004;91:29–43. [11] Albertson DG. Gene amplification in cancer. Trends Genet 2006;22:447–55. [12] Bernardino J, Gerbault-Seureau M, Zafrani B, Dericke Y, Boudou E, Magdelenat H, et al. Homogeneously staining regions in 223 breast carcinomas: cytogenetic and clinicopathological correlations. Br J Cancer 1998;78:1214–8. [13] Bartlett JM, Going JJ, Mallon EA, Watters AD, Reeves JR, Stanton P, et al. Evaluating HER2 amplification and overexpression in breast cancer. J Pathol 2001;195:422–8. [14] Downs-Kelly E, Yoder BJ, Stoler M, Tubbs RR, Skacel M, Grogan T, et al. The influence of polysomy 17 on HER2 gene and protein expression in adenocarcinoma of the breast: a fluorescent in situ hybridization, immunohistochemical, and isotopic mRNA in situ hybridization study. Am J Surg Pathol 2005;29:1221–7. [15] Dal Lago L, Durbecq V, Desmedt C, Salgado R, Verjat T, Lespagnard L, et al. Correction for chromosome 17 is critical for the determination of true
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