- Email: [email protected]
Diagnostic des mycoses profondes et apport des méthodes complémentaires en pathologie
Dossier scientifique Diagnostic des mycoses profondes et apport des méthodes complémentaires en pathologie Paul Hofman1,2,3,* 1 Laboratoire de pathologie clinique et expérimentale, hôpital Pasteur, B.P. 69 – 30 avenue de la Voie-Romaine, 06001 Nice cedex 01,
centre hospitalo-universitaire de Nice, université de Nice Sophia Antipolis, France. 2 Biobanque hospitalière (BB-0033-00025), hôpital Pasteur, Nice, France. 3 FHU OncoAge, hôpital Pasteur, université Nice Côte d’Azur, Nice, France. *Auteur correspondant : [email protected] (P. Hofman).
L’incidence des mycoses invasives augmente, et il existe aujourd’hui une modification du profil épidémiologique de ces infections à travers le monde. Plusieurs facteurs, dont le développement de nouvelles molécules thérapeutiques incluant celles utilisées en immunothérapie des cancers, participent à ces changements. Le pathologiste peut se trouver confronter à faire un diagnostic rapide de ces infections qui prennent souvent le masque clinique et/ou lésionnelle d’une maladie non infectieuse. Si les méthodes complémentaires établies il y a plusieurs décennies en pathologie sont toujours employées pour faire ou confirmer le diagnostic des mycoses profondes, de nouvelles approches technologiques pourraient bientôt aider les pathologistes dans leur pratique pour améliorer ce diagnostic. Sont décrites ici les méthodes complémentaires actuelles et futures utilisables dans un laboratoire de pathologie pour aider le pathologiste à faire ou à confirmer le diagnostic d’une mycose profonde.
MOTS CLÉS biologie moléculaire coloration ◗ immunohistochimie ◗ mycose invasive ◗ mycose profonde ◗ ◗
KEYWORDS deep mycose immunohistochemistry ◗ invasive mycose ◗ molecular biology ◗ staining ◗ ◗
© 2019 – Elsevier Masson SAS Tous droits réservés.
© Hofman
RÉSUMÉ
Infection à Alternaria spp. : Présences de levures dans une cellule géante, HES grandissement x 1000)
ABSTRACT
Diagnosis of deep mycoses and usefulness of ancillary methods in pathology The incidence of deep mycoses is increasing, and today we observe a change in the epidemiological profile of these infections around the world. Different factors, such as the development of new therapeutic molecules, including those used in cancer immunotherapy, participate to this modification. The pathologist can have the challenge to make a rapid diagnosis of these infections, which can take the mask at the clinical and/or histological level of non-infectious diseases. Even if the ancillary methods which have been established several decades ago are still used for doing or confirming the diagnosis of certain invasive mycoses, new technological approaches should soon been of great help for the pathologists in routine clinical practice for making this diagnosis. Here are described the current and future ancillary methods which can be use in a pathology laboratory to support the pathologist for deep mycoses diagnosis.
REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES • N °518 • JANVIER 2020
47
Dossier scientifique Introduction L’incidence des mycoses augmente et l’on recense actuellement environ 1 500 000 morts liés à ces infections chaque année dans le monde [1]. Cette incidence s’associe à l’émergence de certaines espèces et de nouvelles lésions apparaissent chez l’homme [1,2]. On observe en parallèle une augmentation des mycoses résistantes aux antifongiques [3]. Cela est partiellement dû à l’instauration de nouvelles thérapeutiques utilisées contre les maladies auto-immunes ou bien contre le cancer, notamment les thérapies ciblées mais aussi et surtout l’immunothérapie [4,5]. Ainsi, compte tenu de « l’explosion » du nombre des différents traitements actuellement à l’essai dans le domaine de l’immunothérapie des cancers, il est fortement probable que l’incidence des infections, et notamment des mycoses profondes, va augmenter dans cette population de patients. La physiopathologie conduisant à ces infections est alors partiellement comprise, mais peut se rapprocher de celle observée au cours du syndrome de restauration immunitaire se développant chez les patients atteints du syndrome d’immunodéficience acquise dont le système immunitaire est alors brutalement stimulé par les traitements combinés antirétroviraux [6]. D’autres facteurs peuvent être responsables de cette augmentation des maladies fungiques comme des modifications climatiques et de l’environnement ou bien les déplacements massifs des populations dans le monde [2]. Dans ce contexte, de nombreuses lésions infectieuses, dont certaines sont associées à des champignons, peuvent se développer [2].Ainsi, le pathologiste sera très certainement amené à voir une augmentation des cas de mycoses profondes, dont certaines pourraient être dues à des espèces plus ou moins rares difficiles à identifier [1]. Dans ce contexte, les techniques complémentaires sont et seront selon les circonstances d’une aide importante pour arriver au diagnostic. Cette revue aborde l’apport les méthodes actuelles ou futures et utilisables dans un laboratoire de pathologie pour réaliser ou confirmer le diagnostic d’une mycose profonde ou invasive.
Rôle du pathologiste pour le diagnostic d’une mycose invasive Selon l’espèce pathogène en cause, le diagnostic d’une mycose profonde ou invasive est plus ou moins facile reposant sur des tests microbiologiques et/ou sur les résultats obtenus dans un laboratoire d’anatomocytopathologie (ACP). Pour les pathologistes, faire un diagnostic de mycose profonde est de difficulté variable selon que le pathogène responsable soit plus ou moins rare, selon la conservation de la morphologie du cham-
48
pignon fonction de la réaction inflammatoire se produisant à son contact, et selon l’apport de l’examen réalisé en parallèle dans le laboratoire de mycologie. Acquérir une expertise en pathologie infectieuse est probablement moins attractif pour les nouvelles générations des pathologistes que celle orientée dans d’autres domaines de la spécialité, en particulier en pathologie tumorale [7,8]. Il paraît donc important de continuer à sensibiliser le monde des pathologistes sur la nécessité de maîtriser les principaux critères morphologiques conduisant à un diagnostic précis des maladies infectieuses [7,8]. La prise en charge diagnostique des lésions infectieuses, et, en particulier des mycoses profondes, demande aussi de développer des outils technologiques complémentaires plus ou moins complexes. C’est dans ce contexte que les laboratoires de pathologie doivent maintenir un niveau d’exigence élevé pour le déploiement de techniques complémentaires d’aide à la caractérisation des mycoses invasives [7,8]. Ces différentes méthodes doivent pouvoir s’appliquer non seulement sur les échantillons tissulaires, mais aussi sur des prélèvements cytologiques (cytoblocs, étalements cytologiques, cytologie en phase liquide) dont l’incidence augmente au sein des laboratoires de pathologie [9]. Le pathologiste doit travailler de concert avec le microbiologiste, sachant que dans certaines circonstances, seul le pathologiste reçoit un échantillon prélevé sur le patient et que le diagnostic de mycose invasive est un diagnostic à réaliser en urgence.
Devenir des techniques histochimiques, colorations spéciales et microscopie électronique Les techniques histochimiques sont développées dans les laboratoires de pathologie depuis de longues années mais leur apport reste toutefois très important dans le cadre du diagnostic des mycoses profondes et invasives [10]. Ces techniques sont réalisées de plus en plus grâce à des automates, bien que pour certaines d’entre elles (comme la coloration de Warthin-Starry par exemple), il n’existe pas d’approches automatisées suffisamment fiables, sensibles, spécifiques et reproductibles. Les colorations spéciales les plus utiles pour confirmer, voir pour mettre en évidence et identifier des champignons au sein des tissus ou des prélèvements cytologiques, sont le PAS et la coloration argentique de Gomori-Grocott [10]. Ces deux colorations ont une sensibilité variable selon l’agent fungique, mais surtout selon la nécrose tissulaire associée et le niveau d’altération morphologique du pathogène. Ainsi, il peut arriver que la coloration par le PAS soit très faible, alors que la coloration argentique soit bien positive, en particulier pour certains champignons filamenteux
REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES • N °518 • JANVIER 2020
Dossier scientifique Anatomie et cytologie pathologiques et dans des territoires ischémiques ou d’invasion vascuImmunohistochimie laire. La coloration de Gomori-Grocott a aussi l’avantage de bien mettre en évidence les formes de bourUn certain nombre d’anticorps peuvent être utilisés sur geonnement, ce qui permet parfois, selon le nombre de des coupes tissulaires déparaffinées dans le but d’identibourgeonnement, leur taille et le caractère étroit ou fier certains champignons. Ces anticorps sont rarement large du collet leur donnant naissance, de caractériser commercialisés et sont habituellement utilisés dans les de façon très précise l’espèce en cause. D’autres colocentres de référence des maladies infectieuses, comme rations histochimiques sont classiquement très utiles et l’Institut Pasteur ou le Centers for Disease Control and bien connues pour caractériser certains cryptocoques Prevention d’Atlanta. Ainsi par exemple des anticorps (en particulier Cryptococcus neoformans) en mettant en anti-histoplasma, anti-candida, anti-mucorales, antiaspergillus peuvent être utilisés sur des coupes tissuévidence leur capsule (colorations par le bleu Alcian laires à partir d’échantillons fixés. En fait, même s’ils et le mucicarmin). Certaines colorations sont moins sont parfois disponibles sur le marché, ces anticorps utilisées pour la mise en évidence des mycoses prosont rarement employés au sein des laboratoires de fondes, mais peuvent cependant présenter un grand pathologie car, compte tenu de la rareté de certaines intérêt. Ainsi, la coloration de Fontana Masson permet infections mycotiques, il n’est pas justifié de disposer de visualiser la paroi des cryptocoques dits « capsule en permanence de tels anticorps qui se périment dans déficients », la coloration de bleu Alcian étant alors des délais parfois courts. Une étude récente réanégative. La coloration de Fontana Masson lisée en France, montre que très peu de permet également la mise en évidence laboratoires ont la possibilité de réaliser Le diagnostic des champignons dématiés, naturelleune immunohistochimie dans le but ment pigmentés sur l’hématoxyline des infections d’identifier un agent mycotique [12]. du fait de la présence de mélamycotiques invasives nine. Certaines colorations sont Techniques est en augmentation exceptionnellement réalisées comme la coloration trichroconstante dans ciblées de mique de Masson permettant la les laboratoires biologie mise en évidence de certaines levures ou la coloration par le d’anatomomoléculaire rouge Sirius associée à une étude cytopathologie en polarisation. Des colorations hisLes techniques de PCR sur coupes tochimiques sont utiles pour distinguer déparaffinées ou sur du matériel cytololes champignons de pathogènes non fungique sont peu utilisées dans les laboratoires giques comme les bactéries filamenteuses ; les hospitaliers pour le diagnostic de mycoses, mais actinomycètes sont colorées par le PAS mais aussi par certaines sondes permettent grâce à ces approches le Gram, alors que les nocardia sont colorées par le d’amplification l’identification des levures ou des filaments mycéliens [13,14]. L’intérêt pour le pathologiste PAS, le Gram mais surtout par la coloration de Ziehlpeut paraître limité car les laboratoires de mycologie Neelsen à l’huile [11]. Enfin, il est parfois important de ont en général la possibilité d’identifier par un examen s’aider d’une analyse en lumière polarisée, notamment direct puis par culture l’espèce mycotique, ainsi que lorsque la réaction granulomateuse a partiellement sa sensibilité aux différentes molécules thérapeutiques. détruit les filaments ou les levures, car le diagnostic En fait, les techniques ciblées de biologie moléculaire différentiel avec un corps étranger peut se poser, ce sur tissus fixés se justifient rarement. Plusieurs points dernier étant le plus souvent réfringent. limitent leur développement : La microscopie électronique a presque disparu des ◗ la disponibilité et le choix des amorces à avoir en perlaboratoires de pathologie, seuls de rares départements manence dans un laboratoire de pathologie ; possédant encore cet équipement ont pu garder cette expertise médicale. Ainsi hormis pour des programmes ◗ pouvoir maîtriser un environnement technique et humain autorisant le développement de la biologie de recherche, il est aujourd’hui très exceptionnel de moléculaire au sein d’un laboratoire de pathologie ; faire un examen de microscopie électronique dans le cadre d’un diagnostic clinique de mycose. Certaines ◗ les délais d’obtention des résultats qui peuvent ne pas infections mycotiques présentent des caractéristiques être compatibles avec une prise en charge médicale satisfaisante du patient. ultrastructurales qui permettent de les distinguer d’autres agents pathogènes (par exemple les pénicilToutefois cette approche peut s’avérer utile dans des lioses), mais le diagnostic peut être aussi réalisé en cas assez exceptionnels, par exemple lorsque aucun prélèvement « frais » est transmis en microbiologie pour microscopie optique. REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES • N °518 • JANVIER 2020
49
Dossier scientifique l’identification et que le diagnostic morphologique peut faire discuter plusieurs mycoses filamenteuses ayant une sensibilité différente aux antifongiques (par exemple les aspergillus, les mucorales et certaines espèces de scedosporiose) ou que plusieurs mycoses différentes semblent présentes au sein d’une même lésion.Ainsi il est possible d’identifier au sein d’un même tissu fixé, des aspergillus et des mucorales en utilisant deux amorces différentes de PCR [15]. Il est parfois observé l’émergence d’une mucormycose au sein d’une lésion liée à l’aspergillose en cours de traitement et compte tenu d’une sensibilité différente aux anti-mycotiques et de la gravité de voir survenir secondairement cette mycose invasive, l’identification d’espèce peut être cruciale pour instaurer rapidement un nouveau traitement [15].
Nouvelles techniques en développement Les techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS) ont révolutionné les approches diagnostiques et la caractérisation des anomalies génomiques des tumeurs. Ainsi l’ensemble des plateformes hospitalières et des centres de lutte contre le cancer en France sont équipés de séquenceurs de type NGS pour une activité de diagnostic des altérations génomiques en oncologie. Il apparaît progressivement que ces approches de séquençage à haut débit pourraient également faire leur apparition dans le domaine de la pathologie infectieuse et ainsi apporter une aide à la caractérisation des agents pathogènes présents au sein des tissus [16,17]. Ces techniques de NGS peuvent permettre une identification précise d’un nombre important de pathogènes, d’origine virale, bactérienne, parasitaire et mycotique et de préciser la ou les espèces responsables au sein d’une lésion tissulaire ou cellulaire [16]. Le développement actuel de ces méthodes s’oriente aussi pour essayer d’avoir des informations sur la sensibilité ou la résistance aux molécules anti-infectieuses. Ces approches se font surtout sur des échantillons frais, non fixés, provenant de liquides biologiques, mais aussi de cellules ou de tissus [16]. Plusieurs applications se développent aussi à partir de cellules fixées, voire à partir de tissus inclus en paraffine, et pourront donc intéresser à court ou moyen terme les laboratoires de pathologie. Ces approches de NGS dans le champ de la pathologie infectieuse se heurtent actuellement à plusieurs écueils : ◗ des contraintes que l’on retrouve aussi dans l’approche NGS dans le domaine de l’oncologie : délai de transmission des résultats (notamment dans un contexte d’urgence médicale) ; contenu des panels (sachant qu’il est impossible ici d’être exhaustif) ; expertise pour l’analyse bioinformatique ; ◗ la place en pathologie versus une implémentation dans un laboratoire de microbiologie : il est certain que l’expertise en microbiologie est souvent peu dévelop-
50
pée en pathologie (sauf dans certains pays ou États des États-Unis) et la double compétence pour exercer en pathologie et en microbiologie n’existe pas en France. Ainsi il semble difficile de dédier cette activité dans un secteur de pathologie. Cela présente quelques similitudes avec la pathologie moléculaire dédiée à l’oncologie, assez souvent assimilée à un déploiement et à une utilisation par des biologistes (généticiens, biochimistes, hématologistes) et non par des pathologistes. Là encore certains pays, comme l’Allemagne, orientent la formation des pathologistes afin d’acquérir une forte compétence en biologie moléculaire ; ◗ l’échantillon tissulaire ou cytologique fixé présente à ce jour encore des désavantages comparativement à un échantillon frais. En effet, hormis les limites technologiques d’extraction autorisant l’accessibilité à l’ADN des agents infectieux lorsque les tissus sont fixés au formol puis inclus en paraffine, les risques de contamination des différentes solutions conduisant à la constitution d’un bloc de paraffine ou lors des étapes pré-analytiques de coupe au microtome ou d’extraction, sont très importants. Aussi le choix des librairies, les dossiers de validation des méthodes, les contrôles interlaboratoires et intralaboratoires seront des points critiques à mettre en place.
Conclusion Malgré l’aide incontournable et obligatoire des laboratoires de mycologie pour le diagnostic, la caractérisation et la définition de la sensibilité aux anti-fungiques, l’expertise anatomo-cyto-pathologique reste incontournable pour faire le diagnostic de mycoses profondes ou invasives. En effet, seul le pathologiste est capable d’intégrer la présence d’un agent microbien et l’existence d’une réaction inflammatoire au contact. Ainsi le caractère pathogène d’un microbe ne peut être parfois affirmé que par le pathologiste. Bien souvent également, le diagnostic pré-opératoire n’oriente pas immédiatement vers une mycose profonde, et le diagnostic peut s’avérer être une découverte réalisée par le pathologiste sous son microscope [18]. Dans ce contexte, aucun échantillon frais n’est transmis avant fixation au laboratoire de mycologie, rendant l’examen direct et la culture impossible. Si les sérologies ne sont pas concluantes ou non accessibles, le pathologiste se trouve alors être l’acteur essentiel pour poser le diagnostic de mycose profonde ou invasive. Dans ce contexte, soit le diagnostic est évident sur le plan morphologique, soit les méthodes complémentaires que nous avons décrites plus haut permettront de faire ou bien d’affirmer le diagnostic. QQ Liens d’intérêts : l'auteur déclare ne pas avoir de liens d'intérêts.
REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES • N °518 • JANVIER 2020
Dossier scientifique Anatomie et cytologie pathologiques Points à retenir ◗tLes
mycoses profondes peuvent prendre le masque clinique et radiologique d’une maladie non infectieuse, en particulier d’une tumeur. ◗tLes méthodes complémentaires peuvent permettre de faire ou de confirmer le diagnostic d’une mycose profonde ou invasive, mais l’examen morphologique est la pierre angulaire du diagnostic initial. ◗tLes colorations complémentaires automatisées doivent faire l’objet de nombreux contrôles de qualité et doivent être, au mieux, accrédités selon la norme ISO 15189.
◗tSeuls
Références
[11] McHugh KE, Sturgis CD, Procop GW, et al. The cytopathology of Actinomyces, Nocardia, and their mimickers. Diagn Cytopathol. 2017;45:1105-15. [12] Tauziède-Espariat A, Chrétien F, Jouvion G et al. Practices in infectious pathology in France in 2015. Results of the national survey. Ann Pathol. 2018;38:55-63 [13] Canberk S, Longatto-Filho A, Schmitt F. Molecular diagnosis of infectious diseases using cytological specimens. Diagn Cytopathol. 2016;44:156-64. [14] Procop GW. Molecular diagnostics for the detection and characterization of microbial pathogens. Clin Infect Dis. 2007;45 Suppl 2:S99-S111. [15] Hofman V, Dhouibi A, Butori C et al. Usefulness of molecular biology performed with formaldehyde-fixed paraffin embedded tissue for the diagnosis of combined pulmonary invasive mucormycosis and aspergillosis in an immunocompromised patient. Diagn Pathol. 2010;5:1. [16] Mitchell SL, Simner PJ. Next-Generation Sequencing in Clinical Microbiology: Are We There Yet ? Clin Lab Med. 2019;39:405-18. [17] Schlaberg R, Chiu CY, Miller S et al. Professional Practice Committee and Committee on Laboratory Practices of the American Society for Microbiology; Microbiology Resource Committee of the College of American Pathologists. Validation of Metagenomic NextGeneration Sequencing Tests for Universal Pathogen Detection. Arch Pathol Lab Med. 2017;141:776-86. [18] Hofman P, Tauziède-Espariat A. Pseudotumor lesions induced by infectious agents. Introduction. Ann Pathol. 2019;39:246-7.
[1] Bongomin F, Gago S, Oladele RO et al. Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision. J Fungi (Basel). 2017;3: pii: E57. [2] Enoch DA, Yang H, Aliyu SH et al. The Changing Epidemiology of Invasive Fungal Infections. Methods Mol Biol. 2017;1508:17-65. [3] Fisher MC, Hawkins NJ, Sanglard D et al. Worldwide emergence of resistance to antifungal drugs challenges human health and food security. Science. 2018;360:739-42. [4] Fujita K, Kim YH, Kanai O et al. Emerging concerns of infectious diseases in lung cancer patients receiving immune checkpoint inhibitor therapy. Respir Med. 2019;146:66-70. [5] Procop GW, Roberts GD. Emerging fungal diseases: the importance of the host. Clin Lab Med. 2004;24:691-719. [6] Hofman P, Nelson AM. The pathology induced by highly active antiretroviral therapy against human immunodeficiency virus: an update. Curr Med Chem. 2006;13:3121-32. [7] Hofman P. What place and what future for the pathology of infectious and tropical diseases in France ? Ann Pathol. 2014;34:171-82. [8] Hofman P, Lucas S, Jouvion G et al. Pathology of infectious diseases: what does the future hold ? Virchows Arch. 2017;470:483-92. [9] Allison DB, Simner PJ, Ali SZ. Identification of infectious organisms in cytopathology: A review of ancillary diagnostic techniques. Cancer Cytopathol. 2018;126 Suppl 8:643-53 [10] Procop GW, Wilson M. Infectious disease pathology. Clin Infect Dis. 2001;32:1589-1601.
les centres d’expertise possèdent un nombre important d’anticorps utilisables sur des coupes tissulaires ou des échantillons cytologiques pour détecter et/ou caractériser des champignons. ◗tLes techniques de biologie moléculaire sur matériel tissulaire fixé peuvent caractériser des agents mycotiques mais une corrélation avec l’examen morphologique est le plus souvent nécessaire pour affirmer la pathogénicité du champignon mis en évidence.
REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES • N °518 • JANVIER 2020
51
centre hospitalo-universitaire de Nice, université de Nice Sophia Antipolis, France. 2 Biobanque hospitalière (BB-0033-00025), hôpital Pasteur, Nice, France. 3 FHU OncoAge, hôpital Pasteur, université Nice Côte d’Azur, Nice, France. *Auteur correspondant : [email protected] (P. Hofman).
L’incidence des mycoses invasives augmente, et il existe aujourd’hui une modification du profil épidémiologique de ces infections à travers le monde. Plusieurs facteurs, dont le développement de nouvelles molécules thérapeutiques incluant celles utilisées en immunothérapie des cancers, participent à ces changements. Le pathologiste peut se trouver confronter à faire un diagnostic rapide de ces infections qui prennent souvent le masque clinique et/ou lésionnelle d’une maladie non infectieuse. Si les méthodes complémentaires établies il y a plusieurs décennies en pathologie sont toujours employées pour faire ou confirmer le diagnostic des mycoses profondes, de nouvelles approches technologiques pourraient bientôt aider les pathologistes dans leur pratique pour améliorer ce diagnostic. Sont décrites ici les méthodes complémentaires actuelles et futures utilisables dans un laboratoire de pathologie pour aider le pathologiste à faire ou à confirmer le diagnostic d’une mycose profonde.
MOTS CLÉS biologie moléculaire coloration ◗ immunohistochimie ◗ mycose invasive ◗ mycose profonde ◗ ◗
KEYWORDS deep mycose immunohistochemistry ◗ invasive mycose ◗ molecular biology ◗ staining ◗ ◗
© 2019 – Elsevier Masson SAS Tous droits réservés.
© Hofman
RÉSUMÉ
Infection à Alternaria spp. : Présences de levures dans une cellule géante, HES grandissement x 1000)
ABSTRACT
Diagnosis of deep mycoses and usefulness of ancillary methods in pathology The incidence of deep mycoses is increasing, and today we observe a change in the epidemiological profile of these infections around the world. Different factors, such as the development of new therapeutic molecules, including those used in cancer immunotherapy, participate to this modification. The pathologist can have the challenge to make a rapid diagnosis of these infections, which can take the mask at the clinical and/or histological level of non-infectious diseases. Even if the ancillary methods which have been established several decades ago are still used for doing or confirming the diagnosis of certain invasive mycoses, new technological approaches should soon been of great help for the pathologists in routine clinical practice for making this diagnosis. Here are described the current and future ancillary methods which can be use in a pathology laboratory to support the pathologist for deep mycoses diagnosis.
REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES • N °518 • JANVIER 2020
47
Dossier scientifique Introduction L’incidence des mycoses augmente et l’on recense actuellement environ 1 500 000 morts liés à ces infections chaque année dans le monde [1]. Cette incidence s’associe à l’émergence de certaines espèces et de nouvelles lésions apparaissent chez l’homme [1,2]. On observe en parallèle une augmentation des mycoses résistantes aux antifongiques [3]. Cela est partiellement dû à l’instauration de nouvelles thérapeutiques utilisées contre les maladies auto-immunes ou bien contre le cancer, notamment les thérapies ciblées mais aussi et surtout l’immunothérapie [4,5]. Ainsi, compte tenu de « l’explosion » du nombre des différents traitements actuellement à l’essai dans le domaine de l’immunothérapie des cancers, il est fortement probable que l’incidence des infections, et notamment des mycoses profondes, va augmenter dans cette population de patients. La physiopathologie conduisant à ces infections est alors partiellement comprise, mais peut se rapprocher de celle observée au cours du syndrome de restauration immunitaire se développant chez les patients atteints du syndrome d’immunodéficience acquise dont le système immunitaire est alors brutalement stimulé par les traitements combinés antirétroviraux [6]. D’autres facteurs peuvent être responsables de cette augmentation des maladies fungiques comme des modifications climatiques et de l’environnement ou bien les déplacements massifs des populations dans le monde [2]. Dans ce contexte, de nombreuses lésions infectieuses, dont certaines sont associées à des champignons, peuvent se développer [2].Ainsi, le pathologiste sera très certainement amené à voir une augmentation des cas de mycoses profondes, dont certaines pourraient être dues à des espèces plus ou moins rares difficiles à identifier [1]. Dans ce contexte, les techniques complémentaires sont et seront selon les circonstances d’une aide importante pour arriver au diagnostic. Cette revue aborde l’apport les méthodes actuelles ou futures et utilisables dans un laboratoire de pathologie pour réaliser ou confirmer le diagnostic d’une mycose profonde ou invasive.
Rôle du pathologiste pour le diagnostic d’une mycose invasive Selon l’espèce pathogène en cause, le diagnostic d’une mycose profonde ou invasive est plus ou moins facile reposant sur des tests microbiologiques et/ou sur les résultats obtenus dans un laboratoire d’anatomocytopathologie (ACP). Pour les pathologistes, faire un diagnostic de mycose profonde est de difficulté variable selon que le pathogène responsable soit plus ou moins rare, selon la conservation de la morphologie du cham-
48
pignon fonction de la réaction inflammatoire se produisant à son contact, et selon l’apport de l’examen réalisé en parallèle dans le laboratoire de mycologie. Acquérir une expertise en pathologie infectieuse est probablement moins attractif pour les nouvelles générations des pathologistes que celle orientée dans d’autres domaines de la spécialité, en particulier en pathologie tumorale [7,8]. Il paraît donc important de continuer à sensibiliser le monde des pathologistes sur la nécessité de maîtriser les principaux critères morphologiques conduisant à un diagnostic précis des maladies infectieuses [7,8]. La prise en charge diagnostique des lésions infectieuses, et, en particulier des mycoses profondes, demande aussi de développer des outils technologiques complémentaires plus ou moins complexes. C’est dans ce contexte que les laboratoires de pathologie doivent maintenir un niveau d’exigence élevé pour le déploiement de techniques complémentaires d’aide à la caractérisation des mycoses invasives [7,8]. Ces différentes méthodes doivent pouvoir s’appliquer non seulement sur les échantillons tissulaires, mais aussi sur des prélèvements cytologiques (cytoblocs, étalements cytologiques, cytologie en phase liquide) dont l’incidence augmente au sein des laboratoires de pathologie [9]. Le pathologiste doit travailler de concert avec le microbiologiste, sachant que dans certaines circonstances, seul le pathologiste reçoit un échantillon prélevé sur le patient et que le diagnostic de mycose invasive est un diagnostic à réaliser en urgence.
Devenir des techniques histochimiques, colorations spéciales et microscopie électronique Les techniques histochimiques sont développées dans les laboratoires de pathologie depuis de longues années mais leur apport reste toutefois très important dans le cadre du diagnostic des mycoses profondes et invasives [10]. Ces techniques sont réalisées de plus en plus grâce à des automates, bien que pour certaines d’entre elles (comme la coloration de Warthin-Starry par exemple), il n’existe pas d’approches automatisées suffisamment fiables, sensibles, spécifiques et reproductibles. Les colorations spéciales les plus utiles pour confirmer, voir pour mettre en évidence et identifier des champignons au sein des tissus ou des prélèvements cytologiques, sont le PAS et la coloration argentique de Gomori-Grocott [10]. Ces deux colorations ont une sensibilité variable selon l’agent fungique, mais surtout selon la nécrose tissulaire associée et le niveau d’altération morphologique du pathogène. Ainsi, il peut arriver que la coloration par le PAS soit très faible, alors que la coloration argentique soit bien positive, en particulier pour certains champignons filamenteux
REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES • N °518 • JANVIER 2020
Dossier scientifique Anatomie et cytologie pathologiques et dans des territoires ischémiques ou d’invasion vascuImmunohistochimie laire. La coloration de Gomori-Grocott a aussi l’avantage de bien mettre en évidence les formes de bourUn certain nombre d’anticorps peuvent être utilisés sur geonnement, ce qui permet parfois, selon le nombre de des coupes tissulaires déparaffinées dans le but d’identibourgeonnement, leur taille et le caractère étroit ou fier certains champignons. Ces anticorps sont rarement large du collet leur donnant naissance, de caractériser commercialisés et sont habituellement utilisés dans les de façon très précise l’espèce en cause. D’autres colocentres de référence des maladies infectieuses, comme rations histochimiques sont classiquement très utiles et l’Institut Pasteur ou le Centers for Disease Control and bien connues pour caractériser certains cryptocoques Prevention d’Atlanta. Ainsi par exemple des anticorps (en particulier Cryptococcus neoformans) en mettant en anti-histoplasma, anti-candida, anti-mucorales, antiaspergillus peuvent être utilisés sur des coupes tissuévidence leur capsule (colorations par le bleu Alcian laires à partir d’échantillons fixés. En fait, même s’ils et le mucicarmin). Certaines colorations sont moins sont parfois disponibles sur le marché, ces anticorps utilisées pour la mise en évidence des mycoses prosont rarement employés au sein des laboratoires de fondes, mais peuvent cependant présenter un grand pathologie car, compte tenu de la rareté de certaines intérêt. Ainsi, la coloration de Fontana Masson permet infections mycotiques, il n’est pas justifié de disposer de visualiser la paroi des cryptocoques dits « capsule en permanence de tels anticorps qui se périment dans déficients », la coloration de bleu Alcian étant alors des délais parfois courts. Une étude récente réanégative. La coloration de Fontana Masson lisée en France, montre que très peu de permet également la mise en évidence laboratoires ont la possibilité de réaliser Le diagnostic des champignons dématiés, naturelleune immunohistochimie dans le but ment pigmentés sur l’hématoxyline des infections d’identifier un agent mycotique [12]. du fait de la présence de mélamycotiques invasives nine. Certaines colorations sont Techniques est en augmentation exceptionnellement réalisées comme la coloration trichroconstante dans ciblées de mique de Masson permettant la les laboratoires biologie mise en évidence de certaines levures ou la coloration par le d’anatomomoléculaire rouge Sirius associée à une étude cytopathologie en polarisation. Des colorations hisLes techniques de PCR sur coupes tochimiques sont utiles pour distinguer déparaffinées ou sur du matériel cytololes champignons de pathogènes non fungique sont peu utilisées dans les laboratoires giques comme les bactéries filamenteuses ; les hospitaliers pour le diagnostic de mycoses, mais actinomycètes sont colorées par le PAS mais aussi par certaines sondes permettent grâce à ces approches le Gram, alors que les nocardia sont colorées par le d’amplification l’identification des levures ou des filaments mycéliens [13,14]. L’intérêt pour le pathologiste PAS, le Gram mais surtout par la coloration de Ziehlpeut paraître limité car les laboratoires de mycologie Neelsen à l’huile [11]. Enfin, il est parfois important de ont en général la possibilité d’identifier par un examen s’aider d’une analyse en lumière polarisée, notamment direct puis par culture l’espèce mycotique, ainsi que lorsque la réaction granulomateuse a partiellement sa sensibilité aux différentes molécules thérapeutiques. détruit les filaments ou les levures, car le diagnostic En fait, les techniques ciblées de biologie moléculaire différentiel avec un corps étranger peut se poser, ce sur tissus fixés se justifient rarement. Plusieurs points dernier étant le plus souvent réfringent. limitent leur développement : La microscopie électronique a presque disparu des ◗ la disponibilité et le choix des amorces à avoir en perlaboratoires de pathologie, seuls de rares départements manence dans un laboratoire de pathologie ; possédant encore cet équipement ont pu garder cette expertise médicale. Ainsi hormis pour des programmes ◗ pouvoir maîtriser un environnement technique et humain autorisant le développement de la biologie de recherche, il est aujourd’hui très exceptionnel de moléculaire au sein d’un laboratoire de pathologie ; faire un examen de microscopie électronique dans le cadre d’un diagnostic clinique de mycose. Certaines ◗ les délais d’obtention des résultats qui peuvent ne pas infections mycotiques présentent des caractéristiques être compatibles avec une prise en charge médicale satisfaisante du patient. ultrastructurales qui permettent de les distinguer d’autres agents pathogènes (par exemple les pénicilToutefois cette approche peut s’avérer utile dans des lioses), mais le diagnostic peut être aussi réalisé en cas assez exceptionnels, par exemple lorsque aucun prélèvement « frais » est transmis en microbiologie pour microscopie optique. REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES • N °518 • JANVIER 2020
49
Dossier scientifique l’identification et que le diagnostic morphologique peut faire discuter plusieurs mycoses filamenteuses ayant une sensibilité différente aux antifongiques (par exemple les aspergillus, les mucorales et certaines espèces de scedosporiose) ou que plusieurs mycoses différentes semblent présentes au sein d’une même lésion.Ainsi il est possible d’identifier au sein d’un même tissu fixé, des aspergillus et des mucorales en utilisant deux amorces différentes de PCR [15]. Il est parfois observé l’émergence d’une mucormycose au sein d’une lésion liée à l’aspergillose en cours de traitement et compte tenu d’une sensibilité différente aux anti-mycotiques et de la gravité de voir survenir secondairement cette mycose invasive, l’identification d’espèce peut être cruciale pour instaurer rapidement un nouveau traitement [15].
Nouvelles techniques en développement Les techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS) ont révolutionné les approches diagnostiques et la caractérisation des anomalies génomiques des tumeurs. Ainsi l’ensemble des plateformes hospitalières et des centres de lutte contre le cancer en France sont équipés de séquenceurs de type NGS pour une activité de diagnostic des altérations génomiques en oncologie. Il apparaît progressivement que ces approches de séquençage à haut débit pourraient également faire leur apparition dans le domaine de la pathologie infectieuse et ainsi apporter une aide à la caractérisation des agents pathogènes présents au sein des tissus [16,17]. Ces techniques de NGS peuvent permettre une identification précise d’un nombre important de pathogènes, d’origine virale, bactérienne, parasitaire et mycotique et de préciser la ou les espèces responsables au sein d’une lésion tissulaire ou cellulaire [16]. Le développement actuel de ces méthodes s’oriente aussi pour essayer d’avoir des informations sur la sensibilité ou la résistance aux molécules anti-infectieuses. Ces approches se font surtout sur des échantillons frais, non fixés, provenant de liquides biologiques, mais aussi de cellules ou de tissus [16]. Plusieurs applications se développent aussi à partir de cellules fixées, voire à partir de tissus inclus en paraffine, et pourront donc intéresser à court ou moyen terme les laboratoires de pathologie. Ces approches de NGS dans le champ de la pathologie infectieuse se heurtent actuellement à plusieurs écueils : ◗ des contraintes que l’on retrouve aussi dans l’approche NGS dans le domaine de l’oncologie : délai de transmission des résultats (notamment dans un contexte d’urgence médicale) ; contenu des panels (sachant qu’il est impossible ici d’être exhaustif) ; expertise pour l’analyse bioinformatique ; ◗ la place en pathologie versus une implémentation dans un laboratoire de microbiologie : il est certain que l’expertise en microbiologie est souvent peu dévelop-
50
pée en pathologie (sauf dans certains pays ou États des États-Unis) et la double compétence pour exercer en pathologie et en microbiologie n’existe pas en France. Ainsi il semble difficile de dédier cette activité dans un secteur de pathologie. Cela présente quelques similitudes avec la pathologie moléculaire dédiée à l’oncologie, assez souvent assimilée à un déploiement et à une utilisation par des biologistes (généticiens, biochimistes, hématologistes) et non par des pathologistes. Là encore certains pays, comme l’Allemagne, orientent la formation des pathologistes afin d’acquérir une forte compétence en biologie moléculaire ; ◗ l’échantillon tissulaire ou cytologique fixé présente à ce jour encore des désavantages comparativement à un échantillon frais. En effet, hormis les limites technologiques d’extraction autorisant l’accessibilité à l’ADN des agents infectieux lorsque les tissus sont fixés au formol puis inclus en paraffine, les risques de contamination des différentes solutions conduisant à la constitution d’un bloc de paraffine ou lors des étapes pré-analytiques de coupe au microtome ou d’extraction, sont très importants. Aussi le choix des librairies, les dossiers de validation des méthodes, les contrôles interlaboratoires et intralaboratoires seront des points critiques à mettre en place.
Conclusion Malgré l’aide incontournable et obligatoire des laboratoires de mycologie pour le diagnostic, la caractérisation et la définition de la sensibilité aux anti-fungiques, l’expertise anatomo-cyto-pathologique reste incontournable pour faire le diagnostic de mycoses profondes ou invasives. En effet, seul le pathologiste est capable d’intégrer la présence d’un agent microbien et l’existence d’une réaction inflammatoire au contact. Ainsi le caractère pathogène d’un microbe ne peut être parfois affirmé que par le pathologiste. Bien souvent également, le diagnostic pré-opératoire n’oriente pas immédiatement vers une mycose profonde, et le diagnostic peut s’avérer être une découverte réalisée par le pathologiste sous son microscope [18]. Dans ce contexte, aucun échantillon frais n’est transmis avant fixation au laboratoire de mycologie, rendant l’examen direct et la culture impossible. Si les sérologies ne sont pas concluantes ou non accessibles, le pathologiste se trouve alors être l’acteur essentiel pour poser le diagnostic de mycose profonde ou invasive. Dans ce contexte, soit le diagnostic est évident sur le plan morphologique, soit les méthodes complémentaires que nous avons décrites plus haut permettront de faire ou bien d’affirmer le diagnostic. QQ Liens d’intérêts : l'auteur déclare ne pas avoir de liens d'intérêts.
REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES • N °518 • JANVIER 2020
Dossier scientifique Anatomie et cytologie pathologiques Points à retenir ◗tLes
mycoses profondes peuvent prendre le masque clinique et radiologique d’une maladie non infectieuse, en particulier d’une tumeur. ◗tLes méthodes complémentaires peuvent permettre de faire ou de confirmer le diagnostic d’une mycose profonde ou invasive, mais l’examen morphologique est la pierre angulaire du diagnostic initial. ◗tLes colorations complémentaires automatisées doivent faire l’objet de nombreux contrôles de qualité et doivent être, au mieux, accrédités selon la norme ISO 15189.
◗tSeuls
Références
[11] McHugh KE, Sturgis CD, Procop GW, et al. The cytopathology of Actinomyces, Nocardia, and their mimickers. Diagn Cytopathol. 2017;45:1105-15. [12] Tauziède-Espariat A, Chrétien F, Jouvion G et al. Practices in infectious pathology in France in 2015. Results of the national survey. Ann Pathol. 2018;38:55-63 [13] Canberk S, Longatto-Filho A, Schmitt F. Molecular diagnosis of infectious diseases using cytological specimens. Diagn Cytopathol. 2016;44:156-64. [14] Procop GW. Molecular diagnostics for the detection and characterization of microbial pathogens. Clin Infect Dis. 2007;45 Suppl 2:S99-S111. [15] Hofman V, Dhouibi A, Butori C et al. Usefulness of molecular biology performed with formaldehyde-fixed paraffin embedded tissue for the diagnosis of combined pulmonary invasive mucormycosis and aspergillosis in an immunocompromised patient. Diagn Pathol. 2010;5:1. [16] Mitchell SL, Simner PJ. Next-Generation Sequencing in Clinical Microbiology: Are We There Yet ? Clin Lab Med. 2019;39:405-18. [17] Schlaberg R, Chiu CY, Miller S et al. Professional Practice Committee and Committee on Laboratory Practices of the American Society for Microbiology; Microbiology Resource Committee of the College of American Pathologists. Validation of Metagenomic NextGeneration Sequencing Tests for Universal Pathogen Detection. Arch Pathol Lab Med. 2017;141:776-86. [18] Hofman P, Tauziède-Espariat A. Pseudotumor lesions induced by infectious agents. Introduction. Ann Pathol. 2019;39:246-7.
[1] Bongomin F, Gago S, Oladele RO et al. Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision. J Fungi (Basel). 2017;3: pii: E57. [2] Enoch DA, Yang H, Aliyu SH et al. The Changing Epidemiology of Invasive Fungal Infections. Methods Mol Biol. 2017;1508:17-65. [3] Fisher MC, Hawkins NJ, Sanglard D et al. Worldwide emergence of resistance to antifungal drugs challenges human health and food security. Science. 2018;360:739-42. [4] Fujita K, Kim YH, Kanai O et al. Emerging concerns of infectious diseases in lung cancer patients receiving immune checkpoint inhibitor therapy. Respir Med. 2019;146:66-70. [5] Procop GW, Roberts GD. Emerging fungal diseases: the importance of the host. Clin Lab Med. 2004;24:691-719. [6] Hofman P, Nelson AM. The pathology induced by highly active antiretroviral therapy against human immunodeficiency virus: an update. Curr Med Chem. 2006;13:3121-32. [7] Hofman P. What place and what future for the pathology of infectious and tropical diseases in France ? Ann Pathol. 2014;34:171-82. [8] Hofman P, Lucas S, Jouvion G et al. Pathology of infectious diseases: what does the future hold ? Virchows Arch. 2017;470:483-92. [9] Allison DB, Simner PJ, Ali SZ. Identification of infectious organisms in cytopathology: A review of ancillary diagnostic techniques. Cancer Cytopathol. 2018;126 Suppl 8:643-53 [10] Procop GW, Wilson M. Infectious disease pathology. Clin Infect Dis. 2001;32:1589-1601.
les centres d’expertise possèdent un nombre important d’anticorps utilisables sur des coupes tissulaires ou des échantillons cytologiques pour détecter et/ou caractériser des champignons. ◗tLes techniques de biologie moléculaire sur matériel tissulaire fixé peuvent caractériser des agents mycotiques mais une corrélation avec l’examen morphologique est le plus souvent nécessaire pour affirmer la pathogénicité du champignon mis en évidence.
REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES • N °518 • JANVIER 2020
51