- Email: [email protected]
Diagnóstico diferencial de tumores cerebrales “in vitro” por espectroscopía de resonancia magnética de protón. Método de los cocientes espectrales
Diagnóstico diferencial de tumores cerebrales "in vitro" por espectroscopía de resonancia magnética de protón. Método de los cocientes espectrales
J. Ma . Pascual; F. Carceller; S. Cerdán' y J. M. Roda. Servicio de Neurocirugía. Hospital Universitario La Paz. 28046 Madrid. *Instituto de Investigaciones Biomédicas del C.S.LC. Madrid.
Resumen Se han estudiado por espectroscopía de 'R RMN de alta resolución extractos de biopsias de cerebro humano normal (n=5), de astrocitomas de bajo grado (n=7), de astrocitomas de alto grado y glioblastomas (n=16), de meningiomas (n=18), de oligodendrogliomas (n=4) y de meduloblastomas (n=3). Los espectros obtenidos se compararon entre sí utilizando ocho cocientes de intensidad de resonancias específicas: colina/creatina, colinalN-acetilaspártico, creatinaIN-acetilaspártico, colina/inositol, glutamina/glutamato, taurinalN-acetilaspártico, alanina/creatina y alanina/N-acetilaspártico. Estos cocientes permitieron realizar un ,diagnóstico diferencial entre todos los tejidos estudiados con excepción de la comparación entre oligodendrogliomas y astrocitomas. Los tumores cerebrales pudieron diferenciarse del tejido cerebral normal por su menor contenido en N-acetilaspártico. Los meningiomas se caracterizaron por su alto contenido en alanina y los medulobiastomas por sus elevados contenidos en colina y taurina. En el caso de los astrocitomas fue posible discriminar entre los grados de malignidad bajo y alto en base al mayor valor del cociente colina/inositol y menor valor del cociente glutamina/glutamato en los astrocitomas de alto grado. Estos resultados indican que la aplicación de cocientes en la comparación de espectros de biopsias cerebrales constituy~ una herramienta útil en el diagnóstico diferencial de tumores por espectroscopía de' R RMN. PALABRAS CLAVE: Espectroscopía 'H RMN, tumores cerebrales, diagnóstico in vitro: Abreviaturas: Ala: alanina, Cho: colina, fosforilcolina, glicerolfosforilcolina y betainas, Cr: creatina y fosfocreatina, Glu: glutámico; Gln: glutamina, Gly: glicina H2, Ino: myo-inositol, Lac: lactato, NAA: N-acetil-aspártico, RMN: Resonancia Nuclear Magnética, SNC: Sistema Nervioso Central, Tau: taurina, TSP: 2,2' -3,3' - tetradeutero-trimetil-silil propionato sódico. Neurocirugía: 1998; 9: 4-10.
4
Differential diagnosis of brain tumors by proton magnetic resonance spectroscopy "in vitro". The method of spectroscopic ratios Summary We have studied high resolution 1H NMR spectra of extracts from biopsies of normal brain (n=5), low grade astrocytomas (n=7), high grade astrocytomas and glioblastomas (n=16), meningiomas (n=18), oligodendrogliomas (n=4) and medulloblastomas (n=3). The spectra were compared using eight different intensity ratios. of specific resonances: choline/creatine, choline/N-acetyl-aspartic, creatine/N-acetilaspartic, choline/inositol; glutamine/glutamate, turinelN-acetylaspartic, alanine/creatine and alaninelN-acetylaspartic. These ratios allowed a differential diagnosis for each of the tissue samples studied, with the exception of the comparison between oligodendrogliomas and astrocytomas. Brain tumors contained always less N-acetylaspartic than the normal brain. Meningiomas were characterized by their high content in alanine and medulloblastomas by their high content in choline and taurineo High grade astrocytomas and glioblastomas could be distinguished from low grade astrocytomas by their higher choline/inositol ratio and lower glutamine/glutamate ratio. These results indicate that comparisons between intensity ratios in spectra of cerebral biopsies provide a useful tool for the differential diagnosis of brain tumors by high resolution 'H NMR. KEY WüRDS: 'H NMR spectroscopy, brain tumors, in vitro diagnosis.
Introducción La imagen por Resonancia Magnética Nuclear (RMN) del cuerpo humano está ampliamente difundida como mé. todo diagnóstico en los hospitales' de los países desaUQllados. Su aplicación al estudio del Sistema Nervioso Central
Diagnóstico diferencial de tumores cerebrales "In vitro" por espectroscopía 'H RMN. Método de los cocientes espectrales
(SNC) ha supuesto un gran avance, no sólo en el conocimiento de la naturaleza de las distintas patologías, sino también en el establecimiento de las relaciones de las diversas lesiones con las estructuras vecinas, un hecho muy importante en el caso de la patología tumoral. Es indudable que en este último campo, la imagen por RMN ha aportado información que permite un claro avance en el diagnóstico de los tumores del SNC. Sin embargo, todavía no contamos con suficientes criterios que permitan establecer el diagnóstico diferencial entre las distintas neoplasias o clasificar su grado de malignidad. La RMN espectroscópica está hoy en día considerada como el método no invasivo que permite estudiar más adecuadamente el metabolismo de los seres vivos'. Esta metodología puede determinar cualitativa y cuantitativamente una gran variedad de metabolitos en cada tejido, proporcionando una información extensa sobre su metabolismo. En base a este hecho, los espectros de 'H RMN de tumores cerebrales in vivo han servido de gran ayuda para determinar algunas de las características principales de los diversos tipos tumorales 2".6.13. Sin embargo, la escasa resolución de los espectros de 'H RMN obtenidos in vivo y las dificultades encontradas en la cuantificación de metabolitos, han limitado las aplicaciones diagnósticas de esta técnica en Neurooncología. Muchas de estas limitaciones se pueden superar si se obtienen extractos de biopsias de los tumores y se realiza un estudio in vitro. Estas condiciones permiten emplear un campo magnético más alto en los análisis, lo que mejora notablemente la sensibilidad y resolución de la técnica, permitiendo determinar cuantitativamente la concentración de los distintos metabolitos que aparecen en los espectros4.7-9.11.15'17. El objetivo de este estudio ha sido investigar, mediante RMN espectroscópica de protón de alta resolución, las características espectrales de una serie de extractos de tumores cerebrales obtenidos durante cirugía intracraneal, con el fin de poder establecer un conjunto de patrones que permitan identificar cada tipo de neoplasia. En este estudio se presenta un nuevo método de diagnóstico diferencial basado en la obtención de ocho cocientes entre diversas intensidades de resonancias en los espectros del cerebro normal y de cinco patologías tumorales; gliomas de bajo y alto grado, meningiomas, oligodendrogliomas y meduloblastomas. La comparación de los espectros aplicando estos cocientes permite determinar, en la mayor parte de los casos el tipo de tumor y su grado de malignidad. Este abordaje podría complementar los estudios de 'H RMN in vivo, permitiendo en el futuro un diagnóstico diferencial y valoración pronóstica, sin necesidad de recurrir a una intervención quirúrgica.
Neurocirugía
Materiales y métodos Técnicas quirúrgicas y obtención de las biopsias. Los especímenes de tumores se obtuvieron mediante una craneotomía. Una vez expuesto el tumor, se tomó biopsia de la parte sólida del mismo, evitando la coagulación previa del tejido. Esta precaución se tomó para impedir la posible influencia del calor y de la isquemia sobre los resultados obtenidos. Las muestras correspondientes al tejido cerebral normal se obtuvieron de pacientes operados de epilepsia y con tumoraciones que obligaron a la realización de lobectomías. Estas muestras se tomaron en todos los casos en zonas convenientemente alejadas de la lesión. El peso de los especímenes extraídos osciló entre 100 y sao mg. A continuación, estas muestras se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido (-169 OC) Y se almacenaron en un congelador a -70 oC hasta su procesamiento. Otra parte de la tumoración, siempre en la zona adyacente a la de la extracción, se utilizó para efectuar el diagnóstico anatomopatológico. El número total de biopsias analizadas fue de cincuenta y tres, correspondientes a seis grupos clasificados según la World Health Organization 1o con la siguiente distribución: cerebro normal (n=S), astrocitomas de grados 1 y 11 (n=7), astrocitomas anaplásicos y glioblastomas (n=16), oligodendrogliomas (n=4), meningiomas (n=18) y meduloblastomas (n=3). Preparación de extractos de metabolitos de biopsias de cerebro normal y de tumores cerebrales. Las biopsias congeladas se cubrieron con N 2 líquido y se redujeron a polvo en un mortero. Aproximadamente lOO-SaO mg del polvo obtenido se resuspendieron en 3 mI ácido perclórico 6M utilizando un homogeneizador Polytron (Kinemática AG, Suiza). La suspensión resultante se centrifugó a 10.000 g durante 10 minutos, descartando el precipitado constituido por proteínas, lípidos y otros compuestos de elevado peso molecular y conservando el sobrenadante que contiene los metabolitos de interés. El precipitado se extrajo de nuevo con 3 mI de ácido perclórico 6M, centrifugando a 10.000 g durante 10 minutos y combinando los sobrenadantes de las dos extracciones. El extracto ácido resultante se neutralizó con KOH hasta pH 7.0, centrifugando la suspensión resultante (l0.000 g, 10 min.) para descartar el precipitado de KCI0 4 . El sobrenadante neutralizado se redujo a sequedad mediante liofilización y se mantuvo a -20 oC hasta su utilización. Justo antes de su análisis por IH RMN, el residuo se resuspendió en 1.0 mI de agua deuterada (D 2 0, 99.9% D) conteniendo 1 mM TSP (2,2' - 3,3' - tetradeutero-trimetil-sililpropionato sódico).
s
Diagnóstico diferencial de tumores cerebrales "In vitro" por espectroscopía 'H RMN. Método de los cocientes espectrales
Las condiciones de adquisición fueron: pulsos de 90°, 10 s de tiempo total de ciclo y 16384 puntos adquiridos en el dominio del tiempo durante un período de adquisición de 1.90 s. Se redujo la intensidad de la señal residual del agua ligera empleando un pulso de presaturación de 2s centrado en la resonancia del agua. Los desplazamientos químicos se determinaron utilizando TSP como referencia interna. La asignación de las resonancias se realizó de acuerdo con los valores descritos en la literatura y se confirmó, en caso de duda, mediante la adición de patrones específicos5 • Las intensidades de las resonancias en los diversos espectros se determinaron manualmente sobre espectros representados en escala expandida y después de una corrección uniforme de la línea base. En cada espectro se determinaron los siguientes cocientes de intensidad: ColinalCreatina+Fosfocreatina (ChoICr; 3.20 ppm/ 3.05 ppm), Colina/N-acetilaspártico (Cho/NAA; 3.20 ppml 2.03 ppm), Colina/lnositol (ChalIna; 3.20 ppml 4.07 ppm), Creatina+FosfocreatinalN-acetilaspártico (CrINAA; 3.05 ppml 2.03 ppm), Glutamina/Glutámico (Gln/Glu; 2.45 ppml 2.35 ppm), Taurina/N-acetilaspártico (TauINAA; 3.42 ppm/2.03 ppm), AlaninaIN-acetilaspártica (AlaINAA; 1.48 PPm/ 2.03 ppm) y Alanina/Creatina (AlalCr; 1.38 ppm/3.05 ppm), respectivamente.
Astrocitoma bajo grado
Cerebro Normal
Lac
Cr Lac
NAA
Cr
Cr Cho
Cho Tau Cr
Glu Ino
Gln
Glioblastoma
Meningioma Ala
Glu Gln
Ino
Oligodendroglioma
Determinaciones Estadísticas
Meduloblastoma Cho
Tau
'4.4 4.0 3.6 32 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2
ppm
<).s·
ppm
Fig. 1.- Espectros de 'H RMN (360.13 MHz, 22 oC, pH 7.2) de extractos de tejido cerebral normal y_de diversos tipos de tumores. Lac: lactato H3, Ala: alanina H3, NAA: N-acetil-aspártico H6, Glu: glutámico H4,H4', Gln: glutamina H4,H4', Cr: creatina y fosfocreatina (CH3:3.02 ppm, CH2: 3.95 ppm), Cho: grupos (CH3)3N+- de colina, fosforilcolina, glicerolfosforilcolina y betainas, Tau: taurina H3,H3', Gly: glicina H2, ¡no: myo-inositol H2. Los desplazamientos químicos se expresan en ppm con respecto a la señal del TSP a Oppm.
Espectroscopía de 'H RMN. Los espectros de IR RMN (360.13 MRz, pR 7.2, 22 OC) de los extractos se obtuvieron en un espectrómetro Bruker AM-360 equipado con una sonda comercial selectiva para IR utilizando tubos de 5 mm (0.5 mI de muestra). 6
Neurocirugía
Los resultados se expresan como media ± error estándar para cada relación analizada. Las comparaciones de significación estadística entre grupos se realizaron utilizando el test de Student para grupos de tamaño diferente eliminando de cada grupo los resultados localizados fuera del intervalo comprendido entre la media y los límites superior e inferior al 95% de confianza!'. Las diferencias entre grupos se consideraron significativas para valores de p<0.05. Materiales El agua deuterada (D 20,99.9% D) se compró a Appo110 Scientific (Stockport, Inglaterra) y el TSP se obtuvo de S.D.S (Peypin, Francia). El resto de los reactivos fue de la más alta calidad disponible comercialmente. Resultados La Figura 1 muestra espectros representativos de IR RMN de extractos de biopsias obtenidas de cerebro humano normal y de diversos tumores cerebrales. Los espectros de !R RMN se caracterizan por presentar una serie de picos denominados resonancias. Cada resonancia corresponde a un protón específico de un determinado metabolito y se caracteriza por su posición en el espectro
D.i¡tgnóstico diferencial de tumores cerebrales "In vitro" por espectroscopía 'H RMN. Método de los cocientes espectrales
Neurocirugía
20
16
_
Cho/Cr
..
Cho/NAA Cho/lno
!ZZl ~
!.'S.'Sl
... (1)
12
(1)
~
·0
8
mm O
t:
Cr/NAA Gln/Glu Tau/NAA Ala/NAA Ala/Cr
8
4
o Cerebro normal
Astrocitoma alto grado
Astrocitoma bajo grado
Meningioma Meduloblastoma Oligodendroglioma
Fig. 2.- Cocientes entre las intensidades de resonancias especificas de espectros de 'H RMN de extractos de cerebro humano normal y de diversos tipos de tumores. Las abreviaturas utilizadas son las mismas que en la Figura 1. Los resultados se muestran como media±error estándar. La significación estadística se detalla en la Tabla 1. y por su altura. Estas dos variables se conocen como desplazamiento químico e intensidad, respectivamente. El desplazamiento químico se expresa en partes por millón (ppm) y depende del entorno químico del protón analizado. La intensidad de cada resonancia refleja la concentración en la muestra del metabolito que la origina. Por tanto el análisis de los espectros de 'H RMN de biopsias del cerebro normal y de tumores cerebrales proporciona el perfil de metabolitos y la concentración relativa de los mismos en la biopsia. El espectro del cerebro normal de la Figura 1, muestra como resonancias más características las de los protones H3 del lactato (Lac), H3 de la alanina (Ala), H6 de N-acetil-aspartico (NAA), los H4 de glutamato y glutamina (Glu y Gln), los grupos CH3y CH2 de creatina y fosfocreatina (Cr), los grupos trimetilamonio de colina y derivados (Cho), los protones H2 y H3de raurina (Tau) y el H2 del myo-inositol (Ino). Se puede encontrar una asignación más detallada de las resonancias observadas en espectros de 'H RMN de cerebro normal y de tumores cerebrales en las referencias 5 y 11. Los demás espectros de la Figura 1, corresponden a ejemplos representativos de cada tipo tumoral. Los tipos tumorales que hemos analizado en este estudio se han clasificado en cinco grupos: astrocitomas de bajo grado, astrocitomas anaplásicos y glioblastomas, meningiomas, oligodendrogliomas y meduloblastomas. Una comparación entre los espectros de IH RMN de la Figura 1 indica que existen diferencias apreciables entre: a) el espectro del cerebro normal y los espectros de los diversos tipos de tumores y b) entre los espectros de los
diversos tipos de tumores entre sí. El cerebro normal se caracteriza por la elevada intensidad de su señal de NAA, que es más baja en todos los tipos tumorales y particularmente ausente en el meningioma. El NAA es un metabolito de origen exclusivamente neuronal y su disminución en los tumores estudiados reflejaría un descenso en su contenido en neuronas"·13.16.17, una infiltración de tejido cerebral sano en el tumor' o a una combinación de estas circunstancias. El meningioma puede diferenciarse claramente del resto de los tumores por su alto contenido en alanina. En el grupo de tumores de origen astrocitario las señales de glutamina e inositol permiten diferenciar entre astrocitomas de grado I-Il y el grupo constituido por los astrocitomas grados IlI-IV y glioblastoma multiforme. Los astrocitomas de bajo grado presentan una intensidad de las señales de glutamina e inositol superior a la observada en los astrocitomas de alto grado. Por otro lado, el meduloblastoma destaca por la contribución dominante de las señales de colina y taurina. Con los datos de que disponemos en la actualidad, los oligodendrogliomas no presentan un patrón espectral característicamente diferente del de otros tumores de origen astrocitario. Un aspecto que merece especial consideración es la variabilidad interindividual en los espectros de cada tipo de tumor. Una manera de evaluar esta variabilidad es comparar los espectros de 'H RMN de tumores con idéntico diagnóstico anatomopatológico pero, obtenidos de diferentes pacientes. La comparación entre espectros derivados de diferentes tipos tumorales, se ve· facilitada con la 7
Diagnóstico diferencial de tumores cerebrales "In vitro" por espectroscopía I H RMN. Método de los cocientes espectrales
Neurocirugía
TABLA 1 Cocientes espectrales más útiles en el diagnóstico diferencial de tumores cerebrales mediante Espectroscopía de Resonancia Magnética de iR.
Cerebro Normal
Cerebro Normal
Astrocitoma bajo grado
Astrocitoma bajo grado
Astrocitoma alto grado
CrINAA*** ChoINAA*** TauINAA*** Cho/Cr** Gln/Glu** AlaINAA**
CrINAA*** Ala/Cr*** ChoINAA*** CholIno*** TauINAA**
CholIno*** Gln/Glu**
Astrocitoma alto grado
Meningioma
a) Ala/Cr*** Cho/Cr**
TauINAA** AlaINAA* ChoINAA* Cho/Cr* Cho/Cr*
Cho/Cr** TauINAA** CholIno* ChoINAA* Gln/Glu*
a) Ala/Cr*** Cho/Cr**
Tau/NAA*** Cho/Cr*** ChoINAA** AlaINAA** a) Ala/Cr** Cho/Cr*
a) Ala/Cr**
Cho/Cr* TauINAA*
Oligodendroglioma
8
CrINAA*
Meduloblastoma
a) Ala/Cr*** Gln/Glu** Cho/Cr*
Meningioma
utilización de cocientes entre resonancias características de cada espectro. Este procedimiento es más conveniente que la comparación directa de las intensidades de las resonancias, porque es independiente de la cantidad de tejido extraído en cada caso. En este estudio, hemos caracterizado los diversos espectros del cerebro normal y de cada tipo tumoral utilizando ocho cocientes -diferentes: Cho/Cr, Cho/NAA, Cho/Ino, Cr/NAA, Gln/Glu, Tau/NAA, AlaINAA y Ala/Cr, respectivamente. Las resonancias que forman parte de estos cocientes se escogieron por su fácil identificación en los espectros de IH RMN de extractos, pudiendo utilizarse en algunos casos las mismas resonancias y cocientes en los espectros de IH RMN in vivo. La Figura 2 recoge los resultados obtenidos al comparar estos cocientes en el cerebro normal y en los diversos tipos de tumores. Cada tipo tumoral presenta un patrón característico de valores de los diversos cocientes, que permite diferenciarle del resto. La Tabla 1 muestra la significación estadística obtenida al comparar entre sí los ocho cocientes en los distintos tejidos estudiados.
Oligodendroglioma
Discusión
Los resultados obtenidos permiten establecer unas diferencias claras entre el tejido cerebral normal y los tumores estudiados, así como entre los diversos tipos de tumores (Figura 2, Tabla 1). En la mayor parte de los casos, las diferencias entre los grupos no afectan a un solo cociente, sino que involucran a varios. Así, el cerebro normal presenta seis cocientes significativamente diferentes con los astrocitomas de bajo grado, cinco con los de alto grado, cuatro con los meduloblastomas, dos con los meningiomas y uno con los oligodendrogliomas. Similarmente, los medulobiastomas presentan cinco cocientes diferentes con los astrocitomas de bajo grado, cuatro con los de alto grado y dos con los oligodendrogliomas. Este último grupo constituye, hasta ahora, el menos definido, posiblemente por el reducido número de biopsias analizadas. Tomados en su conjunto los resultados obtenidos sugieren que las diferencias entre los grupos no afectan exclusivamente a un metabolito determinado o a un cociente específico, sino que pa-
Diagnóstico diferencial de tumores cerebrales "In vitro" por espectroscopía 'H RMN. Método de los cocientes espectrales
modificar el patrón espectral completo, produciendo patrones de cocientes espectrales diferentes y característipara el cerebro normal y para cada tipo de tumor. Algunos autores han sugerido que el cociente Gln/Glu sirve como elemento diferenciador entre los tumores astrocitarios Y el tejido cerebral normal ' J.15. En este tipo de tumores no había sido posible establecer un diagnóstico diferencial entre los grados I-Il y los III-IV y glioblastomas. En el presente estudio mOstramos que los cocientes ChalIna y Gln/Glu permiten diferenciar entre ambos grupos, con una elevada significación estadística. Por otra parte el aumento del cociente Cho/NAA que hemos detectado en los tumores de origen astrocitario con respecto al tejido cerebral normal está de acuerdo con el incremento en compuestos de colina observado por algunos autores en las mismas neoplasias4 .7-9 • No obstante, de acuerdo con los resultados de Usenius y cols. '6 . '7 no se ha podido confirmar una correlación positiva entre este cociente y el grado histológico de malignidad, aunque algunos estudios habían sugerido que a mayor incremento de elementos de colina mayor malignidad del proces0 4.8 • Así mismo, tampoco se ha podido corroborar que un incremento del cociente CholCr pueda discriminar significativamente entre los astrocitomas grado IV y el resto de los astrocitomas 7 • Finalmente, algunos autores han descrito un incremento de glicina en tumores de origen astrocitari04•8.9 que sólo ha resultado ocasional en nuestro estudio. Por otro lado, el aumento del cociente alanina/creatina, descrito en los meningiomas 7.l3, es detectado claramente en el presente trabajo, y sirve para diferenciar, junto con la ausencia de inositol y de NAA, esta tumoración del resto de los tejidos estudiados. Además de este cociente, hemos podido comprobar que el correspondiente a CholCr también puede ser utilizado como elemento diferenciador adicional de esta tumoración. El meduloblastoma puede ser distinguido claramente de los astrocitomas en base a cinco cocientes (Tabla 1). Previamente, se había propuesto el incremento de taurina como único elemento diferenciador de esta lesión9 , un resultado que no hemos podido confirmar, quizás por el reducido número de biopsias disponible de este tipo de tumor. El método de comparación de cocientes que hemos presentado tiene algunas ventajas sobre los métodos de análisis cuantitativo y análisis computarizado de redes neuronales utilizados previamente en el diagnóstico de tumores por 'R RMN"· 14 • En particular, el método de comparación de cocientes no requiere la cuantificación directa del contenido en metabolitos, es independiente del tamaño de la biopsia extraída y no necesita ni sofisticados análisis matemáticos ni personal altamente especializado en la interpretación de espectroscopía de 'R RMN. Sería en principio posible además, aumentar la capacidad discriminatoria del método a un número superior de tipos de tumores,
Neurocirugia
aumentando el número de cocientes de resonancias utilizados en cada comparación. Esta serie de circunstancias apoyan la incorporación de este método al entorno hospitalario. Sin embargo, la instrumentación necesaria para obtener los espectros de alta resolución requiere campos magnéticos más altos que los normalmente disponibles en -clínica, lo que involucraría una colaboración más estrecha con centros de investigación apropiados o la adquisición de nuevo equipamiento. Finalmente, conviene mencionar aquí que los resultados de este estudio están sometidos a limitaciones estadísticas producidas por diversos tipos de variabilidad experimental, que incluyen: i) variabilidad interindividual; ii) variabilidad en la localización intratumoral de la biopsia extraída; iii) variabilidad en la cuantificación RMN; y iv) variabilidad en la interpretación de los hallazgos del estudio anatomopatológico. Sin embargo, los resultados mostrados en la Figura 2 y Tabla 1 indican que a pesar de estas limitaciones, es posible obtener por espectroscopía de 'R RMN in vitro, un diagnóstico diferencial de elevada fiabilidad. No obstante, el presente trabajo representa aún una fase preliminar. La validación del procedimiento diagnóstico propuesto requerirá en el futuro del análisis de series más amplias de tumores y de la comparación de nuestros resultados con los obtenidos mediante otros métodos diagnósticos. Estos aspectos forman parte de las propuestas de investigación de nuestro laboratorio en la actualidad. Agradecimientos Este trabajo ha sido realizado con ayudas a la investigación del Fondo de Investigaciones Sanitarias de la Seguridad Social (FISss 1177/96), de la D.G.I.C.Y.T. (PB95-011) y de la Comunidad de Madrid (07/105/96). Referencias 1. Andrew, E.R., Bydder, G., Griffiths, J., Hes, R., Styles, P. (eds). Clinical Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy. New York; John Wiley & Sons, 1990. 2. Arnold, D.L., Emrich, J.F., Shoubridge, E.A., Villemure, J.G., Feindel, W.: Characterization of astrocytomas, meningiomas, and pituitary adenomas by phosphorus magnetic resonance spectroscopy. J. Neurosurg. 1991; 74: 447-453. 3. Bruhn, H., Frahm, J., Gyngell, M.L., Merboldt, K.D., Winicke, W., Sauter, R., Hamburger, c.: Noninvasive differentiation of tumors with use of 10calized H-l MR spectroscopy in vivo: Initial experience in patients with cerebral tumors. Radiology 1989; 172: 541-548. 4. Carpinelli, G., Carapella, C.M., Palombi, L., Raus, L., Caroli, F., Podo, F. Differentiation of Glioblastoma multiforme from astrocytomas by in vitro lH MRS analysis of human brain tumors. Anticancer Res. 1996; 16: 1559-1564.
9
Diagnóstico diferencial de tumores cerebrales "In vitro" por espectroscopía 'H RMN. Método de los cocientes espectrales
5. Cerdan, S., Parrilla, R., Santoro, J. y Rico, M. 1H NMR detection of cerebral myoinositol. FEBS Lett. 1985; 187: 167-172. 6. Frahm, J., Bruhn, H., Hanicke, W., Merboldt, KD., Mursch, K, Markakis, E.: Localized proton NMR spectroscopy of brain tumors using short-echo time STEAM sequences. J. Comput. Assist. Tomogr. 1991; 15:915-922. 7. Gill, S.S., Thomas, D.G.T., van Bruggen, N., Gadian, D.G., Peden, CJ., Bell, J.D., Cox, LJ., Menon, D.K, Iles, R.A., Bryant, DJ., Cutts, G.A.: Proton MR spectroscopy of intracranial tumors: In vivo and in vitro studies. l Comput. Assist. Tomogr. 1990; 14: 497-504. 8. Kinoshita, Y., Kajiwara, H., Yokota, A., Koga, Y.: Proton magnetic resonance spectroscopy of brain tumors: an in vitro study. Neuro!. Med. Chir (Tokyo). 1992; 33: 350-9. 9. Kinoshita, Y., Kajiwara, H., Yokota, A., Koga, Y.: . Proton magnetic resonance spectroscopy of brain tumors: an in vitro study. Neurosurgery. 1994; 35: 606-614. 10. Kleihues, P., Burger, P.e., Scheithauer, B.W.: Histologic typing of tumours of the central nervous system. Berlin, Springer-Verlag, 1993. 11. Peeling, J., Sutherland, G.: High-resolution lH NMR spectroscopy studies of extracts of human cerebral neoplasms. Mag. Res. Med. 1992; 24: 123-136. 12. Snedecor, G.W., Cochran, W.G. Statistical Methods, Ames, Iowa State University Press, 1980. 13. Preu1, M.e., Caramanos, Z., Collins, D.L., Villemure, J.G., LeBlanc, R., Olivier, A., Pokrupa, R., Arno1d, D.L. Accurate non invasive diagnosis of human brain tumors by
10
Neurocirugía
using 1H magnetic Resonance Spectroscopy. Nature Medicine. 1996; 2, 323-5. 14. Somorjai, R.L., Nikulin, A.E., Pizzi, N., Jackson, D., Scarth, B., Do1enco, B., Gordon, H., Russell, P., Lean, e.L., De1britge, L., Mountford, e.E., Smith, LC.P.: Computerized consensus diagnosis: A c1asification strategy for the robust ana1ysis of MR spectra. Application to 1H Spectra of thyroid neoplasms. Mag. Res. Med. 1995; 33, 257-263. 15. Sutton, L.N., Wehrli, S.L., Gennarelli, L., Wan~, Z., Zimmerman, R., Bonner, K, Rorke, L.: High-resolution 1Hmagnetic resonance spectroscopy of pediatric posterior fossa tumors in vitro. J. Neurosurg. 1994; 81: 443-448. 16. Usenius, J.P., Kauppinnen, R.A., Vainio, P.A., Hernesniemi, lA., Vapalahti, M.P., Paljarvi, L.A. y Soimakallio, S.: Quantitative Metabolite Patterns of human brain tumors: detection by 1H NMR spectroscopy in vivo and in vitro. J. Comp. Assist. Tomography. 1994; 18,705-713. 17. Usenius, J.P., Vainio, P.A., Hernesniemi, lA. y Kauppinnen, R.A. Cho1ine-containing compounds in human astrocytomas studied by 1H NMR spectroscopy in vivo and in vitro. J. Neurochem. 1994; 63, 1.538-43.
Pascual, J.M a .; Carceller, F.; Cerdán, S.; Roda, J.M.: Diagnóstico diferencial de tumores cerebrales "in vitro" por espectroscopía de resonancia magnética de protón. Método de cocientes espectrales. Neurocirugía 1998; 9: 4-10.
J. Ma . Pascual; F. Carceller; S. Cerdán' y J. M. Roda. Servicio de Neurocirugía. Hospital Universitario La Paz. 28046 Madrid. *Instituto de Investigaciones Biomédicas del C.S.LC. Madrid.
Resumen Se han estudiado por espectroscopía de 'R RMN de alta resolución extractos de biopsias de cerebro humano normal (n=5), de astrocitomas de bajo grado (n=7), de astrocitomas de alto grado y glioblastomas (n=16), de meningiomas (n=18), de oligodendrogliomas (n=4) y de meduloblastomas (n=3). Los espectros obtenidos se compararon entre sí utilizando ocho cocientes de intensidad de resonancias específicas: colina/creatina, colinalN-acetilaspártico, creatinaIN-acetilaspártico, colina/inositol, glutamina/glutamato, taurinalN-acetilaspártico, alanina/creatina y alanina/N-acetilaspártico. Estos cocientes permitieron realizar un ,diagnóstico diferencial entre todos los tejidos estudiados con excepción de la comparación entre oligodendrogliomas y astrocitomas. Los tumores cerebrales pudieron diferenciarse del tejido cerebral normal por su menor contenido en N-acetilaspártico. Los meningiomas se caracterizaron por su alto contenido en alanina y los medulobiastomas por sus elevados contenidos en colina y taurina. En el caso de los astrocitomas fue posible discriminar entre los grados de malignidad bajo y alto en base al mayor valor del cociente colina/inositol y menor valor del cociente glutamina/glutamato en los astrocitomas de alto grado. Estos resultados indican que la aplicación de cocientes en la comparación de espectros de biopsias cerebrales constituy~ una herramienta útil en el diagnóstico diferencial de tumores por espectroscopía de' R RMN. PALABRAS CLAVE: Espectroscopía 'H RMN, tumores cerebrales, diagnóstico in vitro: Abreviaturas: Ala: alanina, Cho: colina, fosforilcolina, glicerolfosforilcolina y betainas, Cr: creatina y fosfocreatina, Glu: glutámico; Gln: glutamina, Gly: glicina H2, Ino: myo-inositol, Lac: lactato, NAA: N-acetil-aspártico, RMN: Resonancia Nuclear Magnética, SNC: Sistema Nervioso Central, Tau: taurina, TSP: 2,2' -3,3' - tetradeutero-trimetil-silil propionato sódico. Neurocirugía: 1998; 9: 4-10.
4
Differential diagnosis of brain tumors by proton magnetic resonance spectroscopy "in vitro". The method of spectroscopic ratios Summary We have studied high resolution 1H NMR spectra of extracts from biopsies of normal brain (n=5), low grade astrocytomas (n=7), high grade astrocytomas and glioblastomas (n=16), meningiomas (n=18), oligodendrogliomas (n=4) and medulloblastomas (n=3). The spectra were compared using eight different intensity ratios. of specific resonances: choline/creatine, choline/N-acetyl-aspartic, creatine/N-acetilaspartic, choline/inositol; glutamine/glutamate, turinelN-acetylaspartic, alanine/creatine and alaninelN-acetylaspartic. These ratios allowed a differential diagnosis for each of the tissue samples studied, with the exception of the comparison between oligodendrogliomas and astrocytomas. Brain tumors contained always less N-acetylaspartic than the normal brain. Meningiomas were characterized by their high content in alanine and medulloblastomas by their high content in choline and taurineo High grade astrocytomas and glioblastomas could be distinguished from low grade astrocytomas by their higher choline/inositol ratio and lower glutamine/glutamate ratio. These results indicate that comparisons between intensity ratios in spectra of cerebral biopsies provide a useful tool for the differential diagnosis of brain tumors by high resolution 'H NMR. KEY WüRDS: 'H NMR spectroscopy, brain tumors, in vitro diagnosis.
Introducción La imagen por Resonancia Magnética Nuclear (RMN) del cuerpo humano está ampliamente difundida como mé. todo diagnóstico en los hospitales' de los países desaUQllados. Su aplicación al estudio del Sistema Nervioso Central
Diagnóstico diferencial de tumores cerebrales "In vitro" por espectroscopía 'H RMN. Método de los cocientes espectrales
(SNC) ha supuesto un gran avance, no sólo en el conocimiento de la naturaleza de las distintas patologías, sino también en el establecimiento de las relaciones de las diversas lesiones con las estructuras vecinas, un hecho muy importante en el caso de la patología tumoral. Es indudable que en este último campo, la imagen por RMN ha aportado información que permite un claro avance en el diagnóstico de los tumores del SNC. Sin embargo, todavía no contamos con suficientes criterios que permitan establecer el diagnóstico diferencial entre las distintas neoplasias o clasificar su grado de malignidad. La RMN espectroscópica está hoy en día considerada como el método no invasivo que permite estudiar más adecuadamente el metabolismo de los seres vivos'. Esta metodología puede determinar cualitativa y cuantitativamente una gran variedad de metabolitos en cada tejido, proporcionando una información extensa sobre su metabolismo. En base a este hecho, los espectros de 'H RMN de tumores cerebrales in vivo han servido de gran ayuda para determinar algunas de las características principales de los diversos tipos tumorales 2".6.13. Sin embargo, la escasa resolución de los espectros de 'H RMN obtenidos in vivo y las dificultades encontradas en la cuantificación de metabolitos, han limitado las aplicaciones diagnósticas de esta técnica en Neurooncología. Muchas de estas limitaciones se pueden superar si se obtienen extractos de biopsias de los tumores y se realiza un estudio in vitro. Estas condiciones permiten emplear un campo magnético más alto en los análisis, lo que mejora notablemente la sensibilidad y resolución de la técnica, permitiendo determinar cuantitativamente la concentración de los distintos metabolitos que aparecen en los espectros4.7-9.11.15'17. El objetivo de este estudio ha sido investigar, mediante RMN espectroscópica de protón de alta resolución, las características espectrales de una serie de extractos de tumores cerebrales obtenidos durante cirugía intracraneal, con el fin de poder establecer un conjunto de patrones que permitan identificar cada tipo de neoplasia. En este estudio se presenta un nuevo método de diagnóstico diferencial basado en la obtención de ocho cocientes entre diversas intensidades de resonancias en los espectros del cerebro normal y de cinco patologías tumorales; gliomas de bajo y alto grado, meningiomas, oligodendrogliomas y meduloblastomas. La comparación de los espectros aplicando estos cocientes permite determinar, en la mayor parte de los casos el tipo de tumor y su grado de malignidad. Este abordaje podría complementar los estudios de 'H RMN in vivo, permitiendo en el futuro un diagnóstico diferencial y valoración pronóstica, sin necesidad de recurrir a una intervención quirúrgica.
Neurocirugía
Materiales y métodos Técnicas quirúrgicas y obtención de las biopsias. Los especímenes de tumores se obtuvieron mediante una craneotomía. Una vez expuesto el tumor, se tomó biopsia de la parte sólida del mismo, evitando la coagulación previa del tejido. Esta precaución se tomó para impedir la posible influencia del calor y de la isquemia sobre los resultados obtenidos. Las muestras correspondientes al tejido cerebral normal se obtuvieron de pacientes operados de epilepsia y con tumoraciones que obligaron a la realización de lobectomías. Estas muestras se tomaron en todos los casos en zonas convenientemente alejadas de la lesión. El peso de los especímenes extraídos osciló entre 100 y sao mg. A continuación, estas muestras se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido (-169 OC) Y se almacenaron en un congelador a -70 oC hasta su procesamiento. Otra parte de la tumoración, siempre en la zona adyacente a la de la extracción, se utilizó para efectuar el diagnóstico anatomopatológico. El número total de biopsias analizadas fue de cincuenta y tres, correspondientes a seis grupos clasificados según la World Health Organization 1o con la siguiente distribución: cerebro normal (n=S), astrocitomas de grados 1 y 11 (n=7), astrocitomas anaplásicos y glioblastomas (n=16), oligodendrogliomas (n=4), meningiomas (n=18) y meduloblastomas (n=3). Preparación de extractos de metabolitos de biopsias de cerebro normal y de tumores cerebrales. Las biopsias congeladas se cubrieron con N 2 líquido y se redujeron a polvo en un mortero. Aproximadamente lOO-SaO mg del polvo obtenido se resuspendieron en 3 mI ácido perclórico 6M utilizando un homogeneizador Polytron (Kinemática AG, Suiza). La suspensión resultante se centrifugó a 10.000 g durante 10 minutos, descartando el precipitado constituido por proteínas, lípidos y otros compuestos de elevado peso molecular y conservando el sobrenadante que contiene los metabolitos de interés. El precipitado se extrajo de nuevo con 3 mI de ácido perclórico 6M, centrifugando a 10.000 g durante 10 minutos y combinando los sobrenadantes de las dos extracciones. El extracto ácido resultante se neutralizó con KOH hasta pH 7.0, centrifugando la suspensión resultante (l0.000 g, 10 min.) para descartar el precipitado de KCI0 4 . El sobrenadante neutralizado se redujo a sequedad mediante liofilización y se mantuvo a -20 oC hasta su utilización. Justo antes de su análisis por IH RMN, el residuo se resuspendió en 1.0 mI de agua deuterada (D 2 0, 99.9% D) conteniendo 1 mM TSP (2,2' - 3,3' - tetradeutero-trimetil-sililpropionato sódico).
s
Diagnóstico diferencial de tumores cerebrales "In vitro" por espectroscopía 'H RMN. Método de los cocientes espectrales
Las condiciones de adquisición fueron: pulsos de 90°, 10 s de tiempo total de ciclo y 16384 puntos adquiridos en el dominio del tiempo durante un período de adquisición de 1.90 s. Se redujo la intensidad de la señal residual del agua ligera empleando un pulso de presaturación de 2s centrado en la resonancia del agua. Los desplazamientos químicos se determinaron utilizando TSP como referencia interna. La asignación de las resonancias se realizó de acuerdo con los valores descritos en la literatura y se confirmó, en caso de duda, mediante la adición de patrones específicos5 • Las intensidades de las resonancias en los diversos espectros se determinaron manualmente sobre espectros representados en escala expandida y después de una corrección uniforme de la línea base. En cada espectro se determinaron los siguientes cocientes de intensidad: ColinalCreatina+Fosfocreatina (ChoICr; 3.20 ppm/ 3.05 ppm), Colina/N-acetilaspártico (Cho/NAA; 3.20 ppml 2.03 ppm), Colina/lnositol (ChalIna; 3.20 ppml 4.07 ppm), Creatina+FosfocreatinalN-acetilaspártico (CrINAA; 3.05 ppml 2.03 ppm), Glutamina/Glutámico (Gln/Glu; 2.45 ppml 2.35 ppm), Taurina/N-acetilaspártico (TauINAA; 3.42 ppm/2.03 ppm), AlaninaIN-acetilaspártica (AlaINAA; 1.48 PPm/ 2.03 ppm) y Alanina/Creatina (AlalCr; 1.38 ppm/3.05 ppm), respectivamente.
Astrocitoma bajo grado
Cerebro Normal
Lac
Cr Lac
NAA
Cr
Cr Cho
Cho Tau Cr
Glu Ino
Gln
Glioblastoma
Meningioma Ala
Glu Gln
Ino
Oligodendroglioma
Determinaciones Estadísticas
Meduloblastoma Cho
Tau
'4.4 4.0 3.6 32 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2
ppm
<).s·
ppm
Fig. 1.- Espectros de 'H RMN (360.13 MHz, 22 oC, pH 7.2) de extractos de tejido cerebral normal y_de diversos tipos de tumores. Lac: lactato H3, Ala: alanina H3, NAA: N-acetil-aspártico H6, Glu: glutámico H4,H4', Gln: glutamina H4,H4', Cr: creatina y fosfocreatina (CH3:3.02 ppm, CH2: 3.95 ppm), Cho: grupos (CH3)3N+- de colina, fosforilcolina, glicerolfosforilcolina y betainas, Tau: taurina H3,H3', Gly: glicina H2, ¡no: myo-inositol H2. Los desplazamientos químicos se expresan en ppm con respecto a la señal del TSP a Oppm.
Espectroscopía de 'H RMN. Los espectros de IR RMN (360.13 MRz, pR 7.2, 22 OC) de los extractos se obtuvieron en un espectrómetro Bruker AM-360 equipado con una sonda comercial selectiva para IR utilizando tubos de 5 mm (0.5 mI de muestra). 6
Neurocirugía
Los resultados se expresan como media ± error estándar para cada relación analizada. Las comparaciones de significación estadística entre grupos se realizaron utilizando el test de Student para grupos de tamaño diferente eliminando de cada grupo los resultados localizados fuera del intervalo comprendido entre la media y los límites superior e inferior al 95% de confianza!'. Las diferencias entre grupos se consideraron significativas para valores de p<0.05. Materiales El agua deuterada (D 20,99.9% D) se compró a Appo110 Scientific (Stockport, Inglaterra) y el TSP se obtuvo de S.D.S (Peypin, Francia). El resto de los reactivos fue de la más alta calidad disponible comercialmente. Resultados La Figura 1 muestra espectros representativos de IR RMN de extractos de biopsias obtenidas de cerebro humano normal y de diversos tumores cerebrales. Los espectros de !R RMN se caracterizan por presentar una serie de picos denominados resonancias. Cada resonancia corresponde a un protón específico de un determinado metabolito y se caracteriza por su posición en el espectro
D.i¡tgnóstico diferencial de tumores cerebrales "In vitro" por espectroscopía 'H RMN. Método de los cocientes espectrales
Neurocirugía
20
16
_
Cho/Cr
..
Cho/NAA Cho/lno
!ZZl ~
!.'S.'Sl
... (1)
12
(1)
~
·0
8
mm O
t:
Cr/NAA Gln/Glu Tau/NAA Ala/NAA Ala/Cr
8
4
o Cerebro normal
Astrocitoma alto grado
Astrocitoma bajo grado
Meningioma Meduloblastoma Oligodendroglioma
Fig. 2.- Cocientes entre las intensidades de resonancias especificas de espectros de 'H RMN de extractos de cerebro humano normal y de diversos tipos de tumores. Las abreviaturas utilizadas son las mismas que en la Figura 1. Los resultados se muestran como media±error estándar. La significación estadística se detalla en la Tabla 1. y por su altura. Estas dos variables se conocen como desplazamiento químico e intensidad, respectivamente. El desplazamiento químico se expresa en partes por millón (ppm) y depende del entorno químico del protón analizado. La intensidad de cada resonancia refleja la concentración en la muestra del metabolito que la origina. Por tanto el análisis de los espectros de 'H RMN de biopsias del cerebro normal y de tumores cerebrales proporciona el perfil de metabolitos y la concentración relativa de los mismos en la biopsia. El espectro del cerebro normal de la Figura 1, muestra como resonancias más características las de los protones H3 del lactato (Lac), H3 de la alanina (Ala), H6 de N-acetil-aspartico (NAA), los H4 de glutamato y glutamina (Glu y Gln), los grupos CH3y CH2 de creatina y fosfocreatina (Cr), los grupos trimetilamonio de colina y derivados (Cho), los protones H2 y H3de raurina (Tau) y el H2 del myo-inositol (Ino). Se puede encontrar una asignación más detallada de las resonancias observadas en espectros de 'H RMN de cerebro normal y de tumores cerebrales en las referencias 5 y 11. Los demás espectros de la Figura 1, corresponden a ejemplos representativos de cada tipo tumoral. Los tipos tumorales que hemos analizado en este estudio se han clasificado en cinco grupos: astrocitomas de bajo grado, astrocitomas anaplásicos y glioblastomas, meningiomas, oligodendrogliomas y meduloblastomas. Una comparación entre los espectros de IH RMN de la Figura 1 indica que existen diferencias apreciables entre: a) el espectro del cerebro normal y los espectros de los diversos tipos de tumores y b) entre los espectros de los
diversos tipos de tumores entre sí. El cerebro normal se caracteriza por la elevada intensidad de su señal de NAA, que es más baja en todos los tipos tumorales y particularmente ausente en el meningioma. El NAA es un metabolito de origen exclusivamente neuronal y su disminución en los tumores estudiados reflejaría un descenso en su contenido en neuronas"·13.16.17, una infiltración de tejido cerebral sano en el tumor' o a una combinación de estas circunstancias. El meningioma puede diferenciarse claramente del resto de los tumores por su alto contenido en alanina. En el grupo de tumores de origen astrocitario las señales de glutamina e inositol permiten diferenciar entre astrocitomas de grado I-Il y el grupo constituido por los astrocitomas grados IlI-IV y glioblastoma multiforme. Los astrocitomas de bajo grado presentan una intensidad de las señales de glutamina e inositol superior a la observada en los astrocitomas de alto grado. Por otro lado, el meduloblastoma destaca por la contribución dominante de las señales de colina y taurina. Con los datos de que disponemos en la actualidad, los oligodendrogliomas no presentan un patrón espectral característicamente diferente del de otros tumores de origen astrocitario. Un aspecto que merece especial consideración es la variabilidad interindividual en los espectros de cada tipo de tumor. Una manera de evaluar esta variabilidad es comparar los espectros de 'H RMN de tumores con idéntico diagnóstico anatomopatológico pero, obtenidos de diferentes pacientes. La comparación entre espectros derivados de diferentes tipos tumorales, se ve· facilitada con la 7
Diagnóstico diferencial de tumores cerebrales "In vitro" por espectroscopía I H RMN. Método de los cocientes espectrales
Neurocirugía
TABLA 1 Cocientes espectrales más útiles en el diagnóstico diferencial de tumores cerebrales mediante Espectroscopía de Resonancia Magnética de iR.
Cerebro Normal
Cerebro Normal
Astrocitoma bajo grado
Astrocitoma bajo grado
Astrocitoma alto grado
CrINAA*** ChoINAA*** TauINAA*** Cho/Cr** Gln/Glu** AlaINAA**
CrINAA*** Ala/Cr*** ChoINAA*** CholIno*** TauINAA**
CholIno*** Gln/Glu**
Astrocitoma alto grado
Meningioma
a) Ala/Cr*** Cho/Cr**
TauINAA** AlaINAA* ChoINAA* Cho/Cr* Cho/Cr*
Cho/Cr** TauINAA** CholIno* ChoINAA* Gln/Glu*
a) Ala/Cr*** Cho/Cr**
Tau/NAA*** Cho/Cr*** ChoINAA** AlaINAA** a) Ala/Cr** Cho/Cr*
a) Ala/Cr**
Cho/Cr* TauINAA*
Oligodendroglioma
8
CrINAA*
Meduloblastoma
a) Ala/Cr*** Gln/Glu** Cho/Cr*
Meningioma
utilización de cocientes entre resonancias características de cada espectro. Este procedimiento es más conveniente que la comparación directa de las intensidades de las resonancias, porque es independiente de la cantidad de tejido extraído en cada caso. En este estudio, hemos caracterizado los diversos espectros del cerebro normal y de cada tipo tumoral utilizando ocho cocientes -diferentes: Cho/Cr, Cho/NAA, Cho/Ino, Cr/NAA, Gln/Glu, Tau/NAA, AlaINAA y Ala/Cr, respectivamente. Las resonancias que forman parte de estos cocientes se escogieron por su fácil identificación en los espectros de IH RMN de extractos, pudiendo utilizarse en algunos casos las mismas resonancias y cocientes en los espectros de IH RMN in vivo. La Figura 2 recoge los resultados obtenidos al comparar estos cocientes en el cerebro normal y en los diversos tipos de tumores. Cada tipo tumoral presenta un patrón característico de valores de los diversos cocientes, que permite diferenciarle del resto. La Tabla 1 muestra la significación estadística obtenida al comparar entre sí los ocho cocientes en los distintos tejidos estudiados.
Oligodendroglioma
Discusión
Los resultados obtenidos permiten establecer unas diferencias claras entre el tejido cerebral normal y los tumores estudiados, así como entre los diversos tipos de tumores (Figura 2, Tabla 1). En la mayor parte de los casos, las diferencias entre los grupos no afectan a un solo cociente, sino que involucran a varios. Así, el cerebro normal presenta seis cocientes significativamente diferentes con los astrocitomas de bajo grado, cinco con los de alto grado, cuatro con los meduloblastomas, dos con los meningiomas y uno con los oligodendrogliomas. Similarmente, los medulobiastomas presentan cinco cocientes diferentes con los astrocitomas de bajo grado, cuatro con los de alto grado y dos con los oligodendrogliomas. Este último grupo constituye, hasta ahora, el menos definido, posiblemente por el reducido número de biopsias analizadas. Tomados en su conjunto los resultados obtenidos sugieren que las diferencias entre los grupos no afectan exclusivamente a un metabolito determinado o a un cociente específico, sino que pa-
Diagnóstico diferencial de tumores cerebrales "In vitro" por espectroscopía 'H RMN. Método de los cocientes espectrales
modificar el patrón espectral completo, produciendo patrones de cocientes espectrales diferentes y característipara el cerebro normal y para cada tipo de tumor. Algunos autores han sugerido que el cociente Gln/Glu sirve como elemento diferenciador entre los tumores astrocitarios Y el tejido cerebral normal ' J.15. En este tipo de tumores no había sido posible establecer un diagnóstico diferencial entre los grados I-Il y los III-IV y glioblastomas. En el presente estudio mOstramos que los cocientes ChalIna y Gln/Glu permiten diferenciar entre ambos grupos, con una elevada significación estadística. Por otra parte el aumento del cociente Cho/NAA que hemos detectado en los tumores de origen astrocitario con respecto al tejido cerebral normal está de acuerdo con el incremento en compuestos de colina observado por algunos autores en las mismas neoplasias4 .7-9 • No obstante, de acuerdo con los resultados de Usenius y cols. '6 . '7 no se ha podido confirmar una correlación positiva entre este cociente y el grado histológico de malignidad, aunque algunos estudios habían sugerido que a mayor incremento de elementos de colina mayor malignidad del proces0 4.8 • Así mismo, tampoco se ha podido corroborar que un incremento del cociente CholCr pueda discriminar significativamente entre los astrocitomas grado IV y el resto de los astrocitomas 7 • Finalmente, algunos autores han descrito un incremento de glicina en tumores de origen astrocitari04•8.9 que sólo ha resultado ocasional en nuestro estudio. Por otro lado, el aumento del cociente alanina/creatina, descrito en los meningiomas 7.l3, es detectado claramente en el presente trabajo, y sirve para diferenciar, junto con la ausencia de inositol y de NAA, esta tumoración del resto de los tejidos estudiados. Además de este cociente, hemos podido comprobar que el correspondiente a CholCr también puede ser utilizado como elemento diferenciador adicional de esta tumoración. El meduloblastoma puede ser distinguido claramente de los astrocitomas en base a cinco cocientes (Tabla 1). Previamente, se había propuesto el incremento de taurina como único elemento diferenciador de esta lesión9 , un resultado que no hemos podido confirmar, quizás por el reducido número de biopsias disponible de este tipo de tumor. El método de comparación de cocientes que hemos presentado tiene algunas ventajas sobre los métodos de análisis cuantitativo y análisis computarizado de redes neuronales utilizados previamente en el diagnóstico de tumores por 'R RMN"· 14 • En particular, el método de comparación de cocientes no requiere la cuantificación directa del contenido en metabolitos, es independiente del tamaño de la biopsia extraída y no necesita ni sofisticados análisis matemáticos ni personal altamente especializado en la interpretación de espectroscopía de 'R RMN. Sería en principio posible además, aumentar la capacidad discriminatoria del método a un número superior de tipos de tumores,
Neurocirugia
aumentando el número de cocientes de resonancias utilizados en cada comparación. Esta serie de circunstancias apoyan la incorporación de este método al entorno hospitalario. Sin embargo, la instrumentación necesaria para obtener los espectros de alta resolución requiere campos magnéticos más altos que los normalmente disponibles en -clínica, lo que involucraría una colaboración más estrecha con centros de investigación apropiados o la adquisición de nuevo equipamiento. Finalmente, conviene mencionar aquí que los resultados de este estudio están sometidos a limitaciones estadísticas producidas por diversos tipos de variabilidad experimental, que incluyen: i) variabilidad interindividual; ii) variabilidad en la localización intratumoral de la biopsia extraída; iii) variabilidad en la cuantificación RMN; y iv) variabilidad en la interpretación de los hallazgos del estudio anatomopatológico. Sin embargo, los resultados mostrados en la Figura 2 y Tabla 1 indican que a pesar de estas limitaciones, es posible obtener por espectroscopía de 'R RMN in vitro, un diagnóstico diferencial de elevada fiabilidad. No obstante, el presente trabajo representa aún una fase preliminar. La validación del procedimiento diagnóstico propuesto requerirá en el futuro del análisis de series más amplias de tumores y de la comparación de nuestros resultados con los obtenidos mediante otros métodos diagnósticos. Estos aspectos forman parte de las propuestas de investigación de nuestro laboratorio en la actualidad. Agradecimientos Este trabajo ha sido realizado con ayudas a la investigación del Fondo de Investigaciones Sanitarias de la Seguridad Social (FISss 1177/96), de la D.G.I.C.Y.T. (PB95-011) y de la Comunidad de Madrid (07/105/96). Referencias 1. Andrew, E.R., Bydder, G., Griffiths, J., Hes, R., Styles, P. (eds). Clinical Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy. New York; John Wiley & Sons, 1990. 2. Arnold, D.L., Emrich, J.F., Shoubridge, E.A., Villemure, J.G., Feindel, W.: Characterization of astrocytomas, meningiomas, and pituitary adenomas by phosphorus magnetic resonance spectroscopy. J. Neurosurg. 1991; 74: 447-453. 3. Bruhn, H., Frahm, J., Gyngell, M.L., Merboldt, K.D., Winicke, W., Sauter, R., Hamburger, c.: Noninvasive differentiation of tumors with use of 10calized H-l MR spectroscopy in vivo: Initial experience in patients with cerebral tumors. Radiology 1989; 172: 541-548. 4. Carpinelli, G., Carapella, C.M., Palombi, L., Raus, L., Caroli, F., Podo, F. Differentiation of Glioblastoma multiforme from astrocytomas by in vitro lH MRS analysis of human brain tumors. Anticancer Res. 1996; 16: 1559-1564.
9
Diagnóstico diferencial de tumores cerebrales "In vitro" por espectroscopía 'H RMN. Método de los cocientes espectrales
5. Cerdan, S., Parrilla, R., Santoro, J. y Rico, M. 1H NMR detection of cerebral myoinositol. FEBS Lett. 1985; 187: 167-172. 6. Frahm, J., Bruhn, H., Hanicke, W., Merboldt, KD., Mursch, K, Markakis, E.: Localized proton NMR spectroscopy of brain tumors using short-echo time STEAM sequences. J. Comput. Assist. Tomogr. 1991; 15:915-922. 7. Gill, S.S., Thomas, D.G.T., van Bruggen, N., Gadian, D.G., Peden, CJ., Bell, J.D., Cox, LJ., Menon, D.K, Iles, R.A., Bryant, DJ., Cutts, G.A.: Proton MR spectroscopy of intracranial tumors: In vivo and in vitro studies. l Comput. Assist. Tomogr. 1990; 14: 497-504. 8. Kinoshita, Y., Kajiwara, H., Yokota, A., Koga, Y.: Proton magnetic resonance spectroscopy of brain tumors: an in vitro study. Neuro!. Med. Chir (Tokyo). 1992; 33: 350-9. 9. Kinoshita, Y., Kajiwara, H., Yokota, A., Koga, Y.: . Proton magnetic resonance spectroscopy of brain tumors: an in vitro study. Neurosurgery. 1994; 35: 606-614. 10. Kleihues, P., Burger, P.e., Scheithauer, B.W.: Histologic typing of tumours of the central nervous system. Berlin, Springer-Verlag, 1993. 11. Peeling, J., Sutherland, G.: High-resolution lH NMR spectroscopy studies of extracts of human cerebral neoplasms. Mag. Res. Med. 1992; 24: 123-136. 12. Snedecor, G.W., Cochran, W.G. Statistical Methods, Ames, Iowa State University Press, 1980. 13. Preu1, M.e., Caramanos, Z., Collins, D.L., Villemure, J.G., LeBlanc, R., Olivier, A., Pokrupa, R., Arno1d, D.L. Accurate non invasive diagnosis of human brain tumors by
10
Neurocirugía
using 1H magnetic Resonance Spectroscopy. Nature Medicine. 1996; 2, 323-5. 14. Somorjai, R.L., Nikulin, A.E., Pizzi, N., Jackson, D., Scarth, B., Do1enco, B., Gordon, H., Russell, P., Lean, e.L., De1britge, L., Mountford, e.E., Smith, LC.P.: Computerized consensus diagnosis: A c1asification strategy for the robust ana1ysis of MR spectra. Application to 1H Spectra of thyroid neoplasms. Mag. Res. Med. 1995; 33, 257-263. 15. Sutton, L.N., Wehrli, S.L., Gennarelli, L., Wan~, Z., Zimmerman, R., Bonner, K, Rorke, L.: High-resolution 1Hmagnetic resonance spectroscopy of pediatric posterior fossa tumors in vitro. J. Neurosurg. 1994; 81: 443-448. 16. Usenius, J.P., Kauppinnen, R.A., Vainio, P.A., Hernesniemi, lA., Vapalahti, M.P., Paljarvi, L.A. y Soimakallio, S.: Quantitative Metabolite Patterns of human brain tumors: detection by 1H NMR spectroscopy in vivo and in vitro. J. Comp. Assist. Tomography. 1994; 18,705-713. 17. Usenius, J.P., Vainio, P.A., Hernesniemi, lA. y Kauppinnen, R.A. Cho1ine-containing compounds in human astrocytomas studied by 1H NMR spectroscopy in vivo and in vitro. J. Neurochem. 1994; 63, 1.538-43.
Pascual, J.M a .; Carceller, F.; Cerdán, S.; Roda, J.M.: Diagnóstico diferencial de tumores cerebrales "in vitro" por espectroscopía de resonancia magnética de protón. Método de cocientes espectrales. Neurocirugía 1998; 9: 4-10.