Die quantitative bestimmung von barbitursäure-derivaten in körperflüssigkeiten durch ultraviolett-spektrophotometrie

VOL.

3

CLINICA CHIMICA ACTA

(1958)

DIE QUANTITATIVE

BESTIMMUNG

BARBITURSAURE-DERIVATEN DURCH

183

VON

IN Ki)RPERFLijSSIGKEITEN

ULTRAVIOLETT-SPEKTROPHOTOMETRIE

R. RICHTERICH I. Medizi?zische

Univevsitc’its-Klinik,

Base1 (Schmeiz)

EINLEITUNG

Bei der Differentialdiagnose komatoser Zust%nde ist immer such eine akzidentelle oder suizidale Vergiftung mit Barbitursauren in Betracht zu ziehen. Die objektive Sicherung einer solchen Diagnose ist heute wichtiger denn je, stehen doch zur Therapie der Barbitursaure-Vergiftung hochwirksame Antagonisten 2 und die kiinstliche Niere3p * zur Verftigung. Besonders zur Indikationsstellung des Einsatzes von Dialysiermethoden (kiinstliche Niere) bei schwersten Vergiftungen stellt sich die Forderung nach einer zuverlassigen und vor allem rasch durchftihrbaren Methode zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Barbitursauren in Korperfliissigkeiten. Im klinischen Laboratorium wurde bisher die kolorimetrische Methode von ZWIKKER 5 in einer ihrer Modifikationen 6-8 verwendet. Die Barbiturate werden nach dem Verfahren von Stas-Otto extrahiert. Der Malonyl-Harnstoff-Ring gibt in einer Isopropylamin-Losung mit Kobaltsalzen durch Komplexbildung eine blaue Farbe. Diese Nachweismethode besitzt jedoch eine Reihe von Nachteilens, 10. Zunachst ist sie umstandlich, zeitraubend und schlecht reproduzierbar. Weiterhin ist das Verfahren wenig empfindlich und daher weder zum quantitativen Nachweis, noch zur Demonstration von Barbituraten im Plasma geeignet. Die Methode ist nicht spezifisch, sodass oft falsche positive Resultate erhalten werden. Schliesslich lassen sich durch den Barbitursaure-Nachweis im Urin bei dem verschiedenartigen Verhalten der Barbitursaure-Derivate im Organismus kaum Schltisse auf die Schwere der Vergiftung ziehen. Die Ringstruktur der 5,5substituierten Barbitursauren fuhrt zu einer intensiven Absorption im Ultraviolett12-1s. Da diese Substanzen im sauren Bereich als Lactam, im alkalischen in der Lactimform vorliegen (Fig. I), so ist das Ultraviolett-Spektrum pH_ab&ngigll, 13-15, 18-20. Auf Grund dieser Eigenschaft wurde eine Reihe von sauw

FH

alkalisch

NH-CO O=C

I

I C<;l

+

112

NH-CO Laktam (Keton) Fig. 1. Lactim-

Lzteratur s. rg5/1g6

und Lactam-Form

NH-CO Laktim (Enol) der BarbitursHure-Derivate.

Ii.

184

RICHTERICH

\‘OJ . 3 (IC)jS!

LMethoden zum Nachweis von Barbitursgure-Derivaten im Plasma angc~gebc~rl~o-2;. Wghrend die qualitative Demonstration von Barbituraten im Plasma mit Hilfc tic,< typischen Spektrums kaum Schwierigkeiten bereitete, so standcn der quantitativc>n Erfassung eine Reihe von technischen Hindernissen im Wege. Die crstc dicscr Schwicrigkeiten lag in der von Plasma zu Plasma variierenden Menge von IltraviolettChromogenen, die eine quantitative Bestimmung erschweren. WALKER ct ~3.~~schlugen als erste vor, die Differenz zwischen der optischen I)ichte des I-ltraviolettSpektrums bei pH IO und pH z zur Messung zu verwenden. 1)a bei pH 2 das typischcn Barbitursgure-Spektrum fehlt, die unspezifischc Plasma-Absorption jedoch erhalten bleibt, werden durch diesen Kunstgriff eine Reihe von stiirenden Substanzen eliminiert. Dasselhe Prinzip verwendete Lous “l, 35, dem es weiterhin gelang, das Extraktionsverfahren zu vereinfachen. Modifikationen dieser Technik werdcn bereits in vcrschiedenen Spit%ilern zum Barbiturs~ure-Nachweis verwendet 2i~3fi. Die Zuverl&sigkcit der Methode von LoLx~~, :I5leidet darunter, daO die E.xtraktion nicht vollst%ndig ist und daher bei Unkenntnis des vorliegenden Barbiturs%urc-Derivates bctr5chtliche Fehler auftreten. In der vorliegenden Arbeit wird iiber eine einfache und rasch durchfiihrbare Methode zum quantitativen Nachweisen von Barbitursguren im Plasma und tJrin berichtet. Es handelt sich dabei urn eine Weiterentwicklung des Verfahrens von WALKER et dzo und Lous 21, a5. Durch geringfiigige Abgnderungen der Extraktion wobei im Wesentlichen den Vorschl%gen von DYBISG 8i gefolgt wurde - gelang es dicse quantitativ zu gestalten und so die Zuverl%sigkeit des Verfahrens zu steigern. Da der Verbrauch der einzelnen Barbitursgure-Derivate weitgehend von wirtschaftsgeographischen Faktoren abhLngig ist, beschrgnkten sich unsrre (‘ntersuchungen auf den Nachweis der in Base1 am hzufigsten ZLISuizid-Vcrsuchen verwendeten Barbiturate (Phenyl-zthyl-barbitursgure, Isobutyl-allyl-barbitursgure, Cycloheptenyl-Zthyl-barbitursgure, DiZthyl-barbiturs$urc, Allyl-isopropyl-barbiturs%urc, Cyclohexenyl-gthyl-barbitursgure und Diallyl-barbitnrs&iure*. APPrZRATEUND REAGENTIEX Apparate

pH-Meter “Microhm”. Zeiss Spektral-Photometer,

P M Q II, mit Quarz-Kiivetten.

Liisungen Chloroform, redestilliert. Bors?iure-Lijsung: 6.2 g Bors&re (p.a.) mit 0.1 X Kaliumchlorid-L6sung aur 1000 ml gel&t. 0.1 II: Natronlauge. 2 N Salzsgure. Borat-Puffer nach Clark und Lubs: IOO ml Borssure-Liisung (s.o.) werden mit 87 ml 0.1 hr Xatronlauge gemischt. Das pH wird genau auf IO eingestellt. Phosphat-Puffer nach S6rensen: 19.2 ml der Stammlijsung A (9.078 g KH,PO, * Isobutyl-allyl-barbiturskre wurde uns freundlicherweise van der Firma Sandoz A.G., Basel, Isopropyl-allyl-barbitur&ure van der Firma F. Hoffmann-La Roche & Co. A.G., Basel, und Cycloheptenyl-Qthyl-barbitukiure van der Firma J. R. Geigy A.G., Basel, zur Verfiigung geskllt. Litcratur S. 19,j/r96

VOL.

3

(1g5Sf~

BESTIMMUNG VO?? B~RBITURS~URE-DERIV.~TE~

1%

auf IOOO ml destilliertes Wasser) und 80.8 ml der Stammlosung B (11.876 g Na,HPO, * z H,O) werden gemischt. Das pH wird genau auf 7.4 eingestellt. Barbitursaure-Standard-Losungen : 50 mg Barbitursaure-Derivat werden in zoo ml Phosphat-Puffer (pH 7.4) durch S~h~tteln und Erwarmen geliist und mit destilliertem Wasser auf IOOO ml verdiinnt. 0.1 ml der Standard-Losung enthalt 0.005 mg Barbiturat. EXPERIlllENTELLEIZ TEII.

(a} ~~~~1~~~~~~~~~ ~~~~~~.~~~s vfln Barbitz~rs~,i~re-P)erivaten Die qualitative Erfassung der Barbiturate erfolgt durch den Nachweis des spezifischen, pH-abhangigen Spektrums im Wellenbereich von 220 bis 280 mp. Experiment .r. Je 0.5 ml Di%.thyl-barbitursPure-Standard-Ltisung Natronlauge (pH II.~), 8 ml Borat-Puffer (pH IO.O), BorsBure-Ldsung Puffer + 5 Tropfen 2 N Saizs&re (pH 2.0) gel&t. Die Konzentration Messung des Spektrums betrug 0.00312 mgjml.

-

pH 10.0

M

pH lt.6

em+

pH

6.0

o--Q

pH

2.0

D&g

230

Fig. 2. Ab~n~gk~i~

240

2.50

260

wurden in 8 ml 0.1 ~5' (pH 6.0) und 8 ml Boratder BarbitursPure bei der

43orbitursiiw

2x)

mo w

des UItrav~olett-5pektrums der Di~thyl-barbiturs~ur~ ionen-Konzentration.

van der Wasserstoff-

Die Kesultate dieses Versuches wurden auf Fig. 2 dargestellt. Im alkalischen Bereich ist eine starke Absorption nachweisbar, wahrend eine solche im sauren pHBereich fehlt. Da bei der Verwendung von Plasma-Extrakten eine Interferenz durch Verunreinigungen, K~vettenfehler usw. bei der alleinigen Messung der Absorption im alkalischen Bereich nicht ausgeschlossen werden kann, war es naheliegend, die pH-Abhangigkeit der Spektral-Eigenschaften der Barbiturate zum qualitativen LitcratuY S, IgjjI96

186

R. RICHTERICB

VOL.

3 &5X)

Nachweis heranzuziehen. Am einfachsten und zuverl&ssigsten schien die von W.ALKER d al. 2ound LOUS 21, 36 angegebene Methode, bei der zungchst das Spektrum bci pH IO gemessen wird, dann der Losung in der Quarz-Kiivette 5 Tropfen z 1V Salzsaure zugesetzt werden und anschliessend das Spektrum bei pH z nochmals gemessen wird. Der dabei auftretende volumetrische Fehler betragt weniger als I y/o. Nach dieser Doppelmessung wird die optische Dichte bei pH z (unspezifische Absorption) von dcrjenigen bei pH IO (spezifische -+ unspezifische ~4bsorption) subtrah~ert. Es resultiert daraus eine fur alfe untersuchten Barbitursaure-Derivate charakteristischc Spektralkurvc. Die auf Fig. 3 dargestellte Kurve wurde auf Gruud der in Exp. T (Fig. 2) erhaltenen Daten konstruiert.

MPH

10

e--.mpHlO-pH2

230

240

250

m

270

280 v

Fig. 3. Ultraviolett-Spektrum von 0.0031~ mg/ml Dibthyl-barbitursaure bei pH 2 und pH ro sowie Differenz der optischen Dichten bei pH 2 und pR TO.

Das Spektrum der Barbiturate im UltravioIett-Bereich zeichnet sich durch zwei Eigenschaften aus: zun%hst geben alle Derivate bei pH IO eine maximale Absorption bei 240 m,u. Zweitens verschwindet diese spezifische Absorption beim Vorliegen eines sauren Milieus. E~~e~~~~~~ 2. Je 0.5 ml der 7 3arb~turs~nre-Standard-~~sungen wurden in o ml BoratPuffer (pH IO) gel&t und das Spektrum bei diesem pH und - nach Zufiigen van j Tropfen z S SalzsFmre - bei pH zzbestimmt. Die Differenz der optischen Dichten wurde fiir jedes Barbiturslure-D&vat auf Fig. 4 dargestellt. Die Konzentration in der Mess-Kuvette betrug 0.0027 mg/ml.

Wie aus Fig, 4 hervorgeht, unterscheiden sich die untersuchten Barbiturs%ureDerivate nur wenig. Gewisse kleine Unterschiede im Absorption-Spektrum lassen sich L&R&M S. x95/196

VOL. 3 (1958)

BESTIMMUNG VON BARBITURSAURE-DERIV.4TEN

187

jedoch nachweisen. GOLDBAUM~~, 26 gelang es durch Messung der Verhgltnisse der optischen Dichte bei bestimmten Wasserstoff ionen-Konzentrationen eine Reihe von Barbituraten zu identifizieren und MAHER UND PUCKETT~’ zeigten, dass sich das Verfahren such tiir - allerdings spezialisierte - klinische Laboratorien eignet.

opt.

M

Cl.

@-@

0.12-

O+S

Diathyl-Borbiturs6ure Dialiyl

-8orbiturs6ure

Allyl-tsopropyl-Borbitursdure

e8Allyl-isobutyl

0.11O.lO-

-Borbiturtiure

bd

Cyclohexenyl-6thyl-Barbiturs~ure

H

Cycloheptenyldthyl-Borblturs6ure

W

Phenyl

-bthyl-

Barbiturs8ure

0.09 -

0.08 0.07 0.060.050.04-

0.03 --

0.02-

0.01 -

I

1

230

240

Fig. 4. Ultraviolett-Spektrum

250

260

van 7 Barbituraten

270

I

rnj_~

(0.0027 mg/ml).

Wichtiger scheint uns in diesem Zusammenhang, dass die Absorptions-Kurven der einzelnen Barbiturate nicht nur qualitativ, sondern such quantitativ sehr nahe zusammen liegen. Dies wird ermbglichen, die Barbitursgure-Konzentration in biologischen Fliissigkeiten such ohne vorg%ngige Identifizierung des Derivates quantitativ zu erfassen. Eine grobe Orientierung fiber den pharmakologischen Typ des vorliegenden Barbiturates erhglt man einfacher durch gleichzeitigen Nachweis des Derivates in Plasma und Urin. Hohe Urin- bei hoher Plasma-Konzentration spricht fiir das Literatur S. Igjlrg6

Ii. RICHTERICH

188

SOL. 3 (1958)

Vorliegen eines der langwirkenden Barbiturate (Diathyl-, Phenyl-athylund Diallylbarbitursaure) ; niedrige Urin- bei hoher Plasma-Konzentration fur ein kurzwirkendes und weniger gefahrliches Barbitursaure-Derivdt. Muss eine Identihzierung vorgenommen werden, so gelingt dies heute am raschesten und zuverlassigsten durch chromatographische Methoden 38, :3R. (c) Quantitativer Nachweis der Barbit~rsii~re-Uerivati? Die quantitative Erfassung der Barbiturate erfolgt durch den Nachweis der Intensitat der Ultraviolett-Absorption unter definierten Bedingungen. Die meisten Autoren verwenden dazu die maximale Absorption bei pH 11.5 und 255 rn,uz3. 24, 26, 27. Zwei Griinde lassen jedoch das Verfahren von WALKER~~ und Lous 21, 35, wobei die Differenz der Absorption zwischen pH IO und 2 bei einer Wellenlange von 240 rnp bestimmt wird, zuverlassiger erscheinen. Zunachst ist die spezifische Absorption, wie aus Fig. 2 deutlich hervorgeht, bei pH IO hoher als bei einem pH tiber II. Dazu kommt, dass die Stabilitat der Barbiturate bei pH IO deutlich grosser ist als bei pH 11.5~~. Experzment 3. 0.2. 0.5, I, 2, 4 und 6 ml der Di~thyl-barbiturs~ure-Standard-lbsung wurden mit 5, bezw. 3 ml Borat-Puffer (pH IO) verdiinnt und das Volumen mit destilliertem Wasser auf 9 ml gebracht. Die Konzentration in den einzelnen AnsHtzen betrug o.oorr, o.oorS, 0.0056, 0.011 o,o.ozzo und 0.330 mg/ml. Die optische Dichte wurde bei pH IO und pH L bei den Wellenl&ngen van 220 bis 280 ml” gemessen. Die Differenz der opt&hen Dichtcn bei den beidenM’asserstoff ionen-Konzentrationen wurde auf Fig. -5 dargestcllt.

OF (pH 10:

M

0.0330

M

0.0220 n-q/ml

mg/ml

M

0.0110

M

0.0056

mg/ml

m

0.0020

mgf

M

0.00

mg/ml

ml

11 mq/ml

Dldthyl-BarbttursBure

Fig. 5. AbhOngigkeit Lit87atUr S. 19 j/I96

der Ultraviolett-.4bsorption

van der Barbiturat-Konzentration.

VOL.

3 (1958)

BESTIMMUNG

VON

BARBITURSKURE-DERIVATEN

189

Wie Fig. 5 zeigt, ist das typische Spektrum der Barbitursauren unabhangig von der Konzentration. Vor allem bleibt die maximale Absorption stets bei 240 m,u nachweisbar. Es verbleibt somit nachzuweisen, dass eine direkte Proportionalitat zwischen der Konzentration und der optischen Dichte bei 240 rnp besteht. Werden die in Exp. 3 erhaltenen Werte bei 240 rnp gegen die Barbiturat-Konzentration abgetragen, so ergeben sich die auf Fig. 6 dargestellten Verhaltnisse. Bis zu einer Konzen-

(PH

Fig. 6. Beziehung

zwischen

der maximalen Ultraviolett-Absorption Barbiturskn-e-Konzentration.

bei qo

my und der

tration von 0.025 mg/ml besteht eine lineare Beziehung zwischen Absorption und Barbitursaure-Konzentration. Diese Beziehung zwischen optischer Dichte und Konzentration wurde such fur die tibrigen 6 Barbitursaure-Derivate geprtift. In jedem Fall entsprachen die Resultate der Lambert-Beer’schen Forderung. Es gelingt somit mit der hier beschriebenen Methode Barbitursaure-Konzentrationen von 0.0001 bis 0.025 mg/ml nachzuweisen. Da vor der quantitativen Bestimmung der Barbitursaure-Konzentration keine Identifizierung der einzelnen Derivate vorgenommen Eichkurve fur die 7 analysierten Derivate festgelegt

wird, so musste als nachstes werden.

die

Experiment 4. Je 0.04, 0.08, 0.20 und 0.40 ml der Barbiturs%iure-Derivat-Standard-L&ungen wurden mit Borat-Puffer auf 7.5 ml aufgefiillt (pH 7.5) und die Differenz der optischen Dichten bei pH 10 und pH 2 bei 240 my gemessen. Die Konzentrationen betrugen 0.00027, o.00054, o.oor35 und 0.00266 mg/ml.

Die Resultate dieser Analysen wurden auf Tabelle I zusammengestellt. Der Mittelwert und die quadratische Streuung fur die gemeinsame Standard-Kurve wurde berechnet und auf Fig. 7 aufgezeichnet. Es geht daraus hervor, dass trotz der durch Litcrntur s. 1951196

x9o

Ii. RICHTERICH

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3 (1958)

die individuellcn Verschiedenheiten bedingten Streuung in der Absorption die einzelnen Werte geniigend nahe beisammen liegen, urn die Verwendung einer einzigen Standard-Kurve zu rechtfertigen. Die in Experiment 4 verwendeten Barbiturat-s Konzentratione~ liegen ungiinstiger fiir den Nachweis als diejenigen in Exp. 3 (Fig. 6), da sie etwa IQ ma1 niedriger sind. Praktische Griinde (Eliminierung der Plasma-Leerwerte) bewogen uns jedoch zur Wahl dieser Konzentrationen (vgl. S. 193).

Ein direkter Nachweis der Barbiturate im Plasma und Turin ist nicht mijglich, da sich in diesen K~rper~~ssjgkeite~ verschiedene, zum gr&ten Teil nicht identifizierte Substanzen finden, die im Ultraviolett-Bereich eine Absorption geben. Es ist daher notwendig, die Barbiturate zuerst zu extrahieren, GOULD usn HXNE%~ verwendeten Aether, doch ist dieser wegen seiner WasserlGslichkeit nicht sehr geeignet. WALXER et al. 2o f%lien die Serum-Proteine mit Phosphorwolframs~ure und extrahierten anschliessend mit Chloroform. Der ~auptnachte~~ dieser Nethade liegt darin, dass bei der EiweissfUung such BarbitursZure-Derivate zum Teil prgzipitiert werden, wodurch eine quantitative Extra&ion verunm&$icht wird. GO~TNXA~M 24, 26 gelang es durch Extraktion von 1.5 ml Serum mit 50 ml Chloroform etwa 85% der Ditithylbarbitursgure zu extrahieren, w&rend LOUS % s5 3 ml Serum mit 25 ml Chloroform mit un~k~~tern E&rag extrahierte. Diese &was unklaren VerhUnisse wusden durch die systematischen St&en van DYBIWC,~~ weitgehend abgekl%t. Dieser zeigte, dass bei der am schwierigsten zu extrahierenden Di~th~~-barbiturs~ure (niedr@ster Verteilungsquotient Chloroform-Wasser) das VerhZltnis der wsssrigen zur ChloraformExtraktion zu gewtirleisten. Phase mindestens I : 50 betragen muss, urn einc 95 O/oige Da die Zuverl&sigkeit einer quantitativen Erfassung weitgehend von der Vollst%ndigk&t der Extraktion abhsngig ist, Xegten wir unserer Xethode die prinzipiellen BeobLilcraftrrs. 19$/X96

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BESTIMMUNEVON BARBITURSAURE-DERIVATEN

*9= gingen wir bei

achtungen von DYEING 37 zu Grunde. auf Grund dieser ErwZgungen der Extraktion

des Serums oder Urins wie folgt vor: ODt.7

6.

(pII2)

O.lO-

0.08

-

0.06

-

0.04

-

0.02 -

0.0020

0.0010

t

I 3

I

6

1

9

I

12

I

0.0030 mg/ml

15

mg/lOOml

I

18 (Serum.

I

Urin)

Fig. 7. Standard-Kurve ftir den Nachweis von 7 Barbiturslure-Derivaten. Die obere Skala auf der Abszisse entspricht der Barbiturat-Konzentration in der Quarz-Kuvette, die untere erlaubt ein direktes Abfesen der plasma-Konzentration bei der hier beschriebenen Methode.

(I) 0.2 ml. Serum oder Urin werden mit Phosphat-Puffer (pH 7.4) auf 0.5 ml verdiinnt. (2) Diese Losung wird im Schtitteltrichter zwei Ma1mit je 30 ml Chloroform w&hrend je 3 min extrahiert. (3) Die im C~oroform gel&ten Barbiturate werden anschliessend wahrend 3 min wiederum im Schiitteltrichter mit 6 ml einer 0.1 N Natronlauge extrahiert. (4) Die Natronlauge wird in einer gewiihnlichen Laboratoriums-Zentrifuge wahrend 5 min zentrifugiert. (5) 4 ml der Natronlauge werden vorsichtig ohne den Bodensatz aufzurtihren abgehoben und 4 ml der Borat-Losung zugesetzt. Das pH dieses Gemisches muss zwischen g-7 und IO liegen. (6) 3 ml dieser Losung werden in eine Quarz-Kuvette gegeben und das Spektrum bei pH IO und pH z bestimmt.

Urn die Zuverlassigkeit dieser Methode zu iiberpriifen ftihrten wir eine grijssere Zahl von Extraktionsversuchen durch. Liter&w

S.

19.51196

I<.RICHTERICH

192

VOL.

(3

1958)

l3peviment5. Bekannte Mengenvon BarbitursLuren wurden in Serum gel&t. Je 0.2 ml dieser Seren wurden extrahiert und die Barbiturs%ure-Konzentration bestimmt. Die Resultate wurden auf Tabelle II und Fig. 7 dargestellt.

m

TABELLE UNTERSUCHUNGEN BEOBACHTETER

tiBER

DIE

II

DIFFERENZEN

ZWISCHEN

BARBITURAT-KONZENTRATIOX AUF

FIG.

IM SERUM

7 DARGESTELLTEN

Barbitursiiure-L)erizrat ~_ Diithyl-barbitursgure

Diallyl-barbiturs%ure

Allyl-isobutyl-barbitursgure

Cyclohexenyl-Ethyl-barbitursgure

Cycloheptenyl-Hthyl-barbitursHure

PhenyMthyl-barbiturstiurc

VERWENDUNG

UND DER

STANDARD-KURVE

Evwartet (mglml) 0.000~2 0.00042

Allyl-isopropyl-barbiturslure

ERWARTETER BEI

0.00166 0.00166 o.oooq2 0.00208 0.00208 o.oooLp 0.000‘+2 0.00208 0.00208 0.000‘+2 o.ooo‘p 0.00208 0.00208 0.00042 O.OOO@ 0.00208 0.00208 o.oooL$r 0.00042 0.00208

Beobachtet (mslmt) __ ._ 0.00065 0.0007* 0.00210 o.ooIgo O.OOO_jO

0.00260 0.00213 O.OOO~I 0.00060 0.00200 0.002LL 0.00040 0.00035 0.00213 0.00213 0.00058 0.00045 o.oorgg 0.0020

j

0.00033 0.000~8 o.oorXo

0.0020x

o.oorgo

0.000~2

0.00038 0.0004r 0.00200 O.OOLIO

0.00042

0.00208 0.00208

Wie aus Fig. 7 und Tabelle II hervorgeht, lagen die beobachteten Werte zwischen -21 y. der erwarteten Resultate, wobei nur 6 Bestimmungen ausserhalb die Standard-Abweichung fielen. Fiir die praktische Verwendbarkeit der Methode spielen diese Abweichungen eine nebensgchliche Rolle. Zun$chst ist zu beriicksichtigen, dass die Eichkurve auf Grund der Durchschnitts-Absorption von 7 verschiedenen Barbituraten aufgestellt wurde. Barbitur&ure-Derivate mit relativ hoher Absorption (Fig. 4) wie Digthyl-, Isopropyl-allyl- und Diallyl-barbitursgure gaben erwartungsgem& eine deutliche positive Abweiching, w&rend Cycloheptenyl-Ethyl-, Cyclohexenyl&hyl und Phenyl-Hthyl-barbiturskure nur wenig in negativer Richtung differierten. Diese durchschnittliche Verschiebung der Werte gegen eine hijhere Konzentration ist durch die geringe Absorption des Serums zu erkltien. Weiterhin geht aus Tabelle II hervor, dass die Abweichungen bei niedrigeren Konzentrationen bedeutend griisser sind als bei hijheren. Da bei Vergiftungen Werte in der Grijssenordnung von O.OOI~ bis 0.0040 mg/ml zu erwarten sind, so betrPgt die Abweichung im praktischen Fall kaum iiber IO y. und wird damit bedeutungslos.

f71 y. und

Literatur S. rgjjrg6

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BESTIMMIJNG

VON BARBITURSAURE-DERIVATEN

I93

Die grossten Schwierigkeiten beim Nachweis von Barbituraten in biologischen Fliissigkeiten bereitet die Eliminierung der unspezifischen Absorption. Nach den Beobachtungen von GOULD UND HINE 25 ist diese grossen Schwankungen unterworfen. WALKER et al. z” fiihrten zur Eliminierung des Serum-Leerwertes den “alkaline-acid shift” ein, ein Verfahren, das aber nach ihren Angaben bei direkten Serum-Extrakten ohne vorgangige ~iweissf~lung nicht verwendbar sein ~011.Lousal+ zeigte jedoch, dass dieses Prinzip such auf direkte Serum-Extrakte iibertragen werden darf. Wir fiihrten einige Versuche iiber das Verhalten des Serum-Leerwertes bei verschiedenen Patienten durch. Experiment 6. Je 0.5 und 0.2 ml Serum wurden direkt nach der oben angegebenen Methode extrahiert und die Differenz der opt&hen Dichten bei pH IO und pH 2 bei verschiedenen Welleni%ngen bestimmt.

U

Extrakt

0.5

o--O

Extrakt

0.2ml

ml

Plasma Plosmo

L 230

240

250

260

280

270 m)r

Fig. 8. Unspezifische Absorption von Plasma-Extrakten.

Wie aus Fig. 8 hervorgeht, besitzt der Extrakt von 0.5 ml Serum eine Absorption, die beim quantitativen Nachweis von Barbituraten ins Gewicht fallen kann und die Resultate zu entstellen vermag. Eine Korrektur dafiir ist nicht moglich, da bei verschiedenen Seren grosse individuelle Schwankungen beobachtet werden. Bei der Verwendung von 0.2 ml Serum ist die unspezifische Absorption hingegen so gering, dass sie vernachl%ssigt werden kann. Bei Barbiturs~ure-Vergiftungell sind in 0.2 ml Serum Barbituratmengen von 0.004 bis 0.06 mg zu erwarten (entsprechend 2 bis 30 mg Barbiturat in IOO ml Serum). Durch Multiplikation der in Expt. 4 erhaltenen Werte mit 8 (Volumen der Pufferlijssung mit pH IO), 6/4 (nur 4 der 6 ml Borat-Losung werden verwendet) und 500 (von mg/o.z ml Serum auf mg/roo ml Serum) werden die auf der unteren Skala von Fig. 7 aufgezeichneten Werte erhalten. Durch die Analyse von 0.2 ml Serum gelingt es somit Barbiturat-Konzentrationen von 0.5 bis 40 mg pro roe ml Serum zu erfassen. Nach den Angaben von LOUSES* 38 werden bei Vergiftungen Werte von z.bis 30 mg/roo ml Serum beobachtet, Die oben gemachten Feststellungen gelten such fur Urin undMagensaft. Auch bei diesen biologischen Fliissigkeiten spielt die unspezifische Absorption bei der Verwendung von 0.2 ml eine zu vernachh&sigende Kolle. Liter&w S. x95/196

R. RICHTERICH

194 (f) Unspe@che

Absorption

VOL. 3 (1958)

van Serum im Ultraviolett

Durch die Extraktion mit Alkali bleiben verschiedene Substanzen mit Absorption im Ultraviolett-Bereich, wie zum Beispiel Salizylsaure, in der Chloroformphase zuriick. Wird das Chloroform statt mit Natronlauge mit 0.1 N Salzsaure extrahiert, so wird, wie aus eigenen Beobachtungen hervorging, der Serum-Leerwert bedeutend grosser. Aber selbst nach der Extraktion der Barbiturate mit 0.1 N Natronlauge passieren noch andere physiologische und pharmakologische Ultraviolett-Chromogene. Als praktisch wichtigste Substanz sind Sulfonamide zu erwahnen. Diese geben ausser der fur Barbiturate charakteristischen maximalen Absorption bei 240 m,u noch einen zweiten Gipfel bei 260 rnpsi. Ubcrhaupt ist aus dem Vorliegen mehrerer Gipfel auf das gleichzeitige Vorkommen anderer Substanzen zu schliessen. In diesem Falle empfiehlt sich eine Wiederholung der Analyse nach einigen Stunden. Die SerumKonzentration der Barbiturate verandert sich in dieser Zeit im Gegensatz ZLI den meisten anderen Pharmaka nur unbedeutend. Ahnliche spektroskopische Eigenschaften wie die Barbitursaure-Derivate weisen moglicherweise such gewisse Metaboliten auf. Nach bisherigen UntersuchungenZ1v 85, 40, 11 dtirfte dieser Fehlerquelle aber wenig praktische Bedeutung zukommen. Die folgenden Pharmaka geben nach eigenen Beobachtungen mit der hier empfohlenen Technik keine Interferenz : Morphin-Derivate, Digitalis-Abkommlinge, ein barbitursaure-freies Schlafmittel (a, a-Phenyl-ithyl-glutarsaureimid), ein barbituratantagonistisches (/3, /3-Methyl-athyl-glutarimid) und ein morphin-antagonistisches zentrales Analepticum (2,4-Diamino-5-phenylthiazol-hydrobromid) und Antibiotica (Penicillin, Streptomycin, Oxytetracyclin). PRAKTISCHES

VORGEHEiY

(a) Herstellung einer Eichkurve Zur Aufstellung einer Standard-Kurve eignet sich wegen der mittleren Lage ihrer Absorption (Fig. 4) die Cyclohexenyl-athyloder die Allyl-isobutyl-barbitursatire am besten. IOO mg des Barbiturates werden in IOO ml Phosphat-Puffer (pH 7.4) und cu. 800 ml destilliertem Wasser durch Schtitteln und Erwarmen gel&t. Das Volumen wird mit destilliertem Wasser auf IOOO ml gebracht. Je 0.05 ml, 0.10 ml, 0.20 ml und 0.3 ml der Standard-Losung werden mit 0.2 ml Serum undphosphat-Puffer (pH 7.4) auf 0.5 mlverdtinnt.DieBarbiturat-Konzentration in diesen Ansatzen entspricht 2.5 mg/roo ml, 5.0 mg/roo ml, IO mg/roo ml und 15 mg/roo ml Serum, dem Bereich der meisten Barbiturat-Vergiftungen. Durch die Verwendung einer I: IO verdiinnten Standard-Losung kann die Eichkurve bis zu IOO mg/roo ml Serum erweitert werden. Diese Ansatze werden nach dem unten beschriebenen Verfahren extrahiert und die optische Dichte bei pH IO und pH 2 bei 240 rnp gemessen. Die Differenz der optischen Dichten wird auf der Ordinate, die Barbitursaure-Konzentration auf der Abszisse abgetragen (vgl. Fig. 6). (b) Extraktion 0.2 ml Serum, Urin oder Magensaft werden mit Phosphat-Puffer (pH 7.4) auf 0.5 ml verdtinnt. Die Liisung wird im Schiitteltrichter zwei Ma1 mit je 30 ml redestilliertem Chloroform w&rend je 3 min extrahiert. Das Chloroform wird anschliessend Literatur

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VOL.

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BESTIMMUNG

VON

BARBITURSkJRE-DERIVATEN

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wiederum im Sch~tteltrichter mit 6 ml einer 0.1 N Natronlauge wahrend 3 min extrahiert und die Lauge in einer kleinen Laborzentrifuge wahrend 5 min zentrifugiert. 4 ml der Natronlauge werden sorgfaltig abgehoben und 4 ml Borat-LGsung zugesetzt. Das pH dieses Gemisches muss zwischen 9.7 und IO liegen.

Ca. 3 ml. der gepufferten Losung (pH IO) werden in eine ~uarz-K~vette gebracht und die optische Dichte bei 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255 und 260 rnp gemessen. Anschliessend werden 5 Tropfen einer 2 N Salzsaure-Losung zugesetzt (pH 2) und die optische Dichte bei denselben Wellenlangen nochmals bestimmt. Die Differenz der opt&hen Dichten bei pH IO und pH 2 ergibt beim Vorliegen von Barbiturs%.ue-Derivaten eine typische Kurve mit maximaler Absorption bei 240 rnp. Mit Hilfe der Eichkurve kann aus der Grosse der optischen Dichte bei 240 rnp direkt die SerumKonzentration der Barbiturate in mg/roo ml Plasma abgelesen werden. ZUSAMMENFASSUNG Eine Modifikation der Methode von WALKER et al. So und Lous err 35 zum quantitativen Nachweis von Barbitursaure-Derivaten im Plasma und Urin wird beschrieben. 0.2 ml der Kijrperfliissigkeiten werden mit Chloroform und dieses mit Natronlauge (pH 11.5) extrahiert. Das Ultraviolett-Spektrum (zzo--280 m,u) der AnalysenlBsung wird bei pH ro und pH z gemessen. Die optische Dichte bei pH 2 (unspezifische Absorption) wird van derjenigen bei pH IO (spezifische + unspezifische Absorption) subtrahiert. Der qualitative Nachweis der Barbiturate erfolgt durch die Demonstration einer typischen Kurve mit Maximum bei 240 m,u. Die maximale Absorption dient gleichzeitig der quantitativen Erfassung der Barbitursaure-Konzentration (z-40 mg/roo ml Plasma). Die Methode ist einfach, zuverlassig und rasch. Eine Analyse kann im I3uplikat innert 20 mm durchgeftihrt werden. SUMMARY A modification of the WALKER et al. 2o and Lous $r*as methods for the quantitative estimation of barbiturates in plasma and urine (0.2 ml) is presented. 0.2 ml of these body fluids were extracted with chloroform and with a solution of sodium hydroxide (pH rr.5). The ultraviolet-spectrum (220-280 rnp) of the solution analysed is read at pH IO and pH 2. The optical density at pH z (non-specific absorption) was subtracted from the optical density at pH ro (specific + non-specific absorption). Qualitative demonstration of the presence of barbiturate follows from the presence of a typical curve with a peak at 240 mp. The maximum absorption is used at the same time for the quantitative estimation of the barbiturate concentrations (z-40 mg/roo ml plasma). The method is reliable, simple, and rapid. A duplicate analysis can be performed within 20 min. LITEKATIJIC I A. SHULMAIY, F. SHAD, N. Iii.CASS AND H. M. WHYTE, &it. Med. J., (195-j I) 1238. 2 P. VON PLANTA UND %I. KLINGLER, Sch-zeiz.need.U'ocinschr., 86 fro561 691. 3 J. P. MERILL, X'ew En,+. J. Med., 246 (1952) 17. 4 L. H. KYLE, Ii. JEGHERS, W. P. WALSH, P. DOOLAN, H. WISHINSKY UND A. PALLOTTA, J. C&z. Invest., 32 (1953) 364. 5 J. J. L. ZWIKKER, Pharm. Weekblad, 68 (1931) 975. 6 T. KOPPANYI, W. S. MURPHY UND S. KROP, Proc. Sot. Exptl. Biol. Ned., 30 (1933) 542. 7 J. T. BRUNDACE UND C. &I.GRUBER, J. Pkarmacol. Exptl. Therap., $9 (1937) 379. 8 G. A. LEVY,&oche%z. J., 34 (1940) 73. 9 K. F. RILEY, R. F. KRAUSE, L. T. STEADMAN, F. E. HUNTER UND H.C. HODGE, Pwc. Sot. Ex@ BiaE. Msd., 45 (1940) 424. IO H. IVERSEN, Acta Pharmacol. Toxicol., z (1945) 255. II A. K. MACBETH, T. H. NUNAN UND D. TRAIL,J. Chem. SOL-.,(rpz8) 1248. 12 M. A. CASTILLE UND E. KUPPOL, Bull. Sot. Chem. Viol., IO (1pz8) 623. 13 R. E. STUCKEY, Quart. J. Pharm. and Pharmacol., 13 (1940) 312. 14 R.E.STUCKEY,Q~M. J. P?tarm.and Pharmacol.,rq (1941) 214. 15 R. E. STUCKEY, Qua& J. Pharm. asd Pharmacol., 15 (1942) 370.

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Eingegangen

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