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Die Wirkung einer Infektion mit Cucurbita-Mosaikvirus auf den Gehalt an freien Aminosauren und organischen Säuren von Cucurbita-pepo-Blättern
Die Wirkung einer Infektion mit Cucurbita-Mosaikvirus auf den Gehalt an freien Aminosauren und organischen Sauren von Cucurbita-pepo-Blattern Eine chromatographische U ntersuchung Von
Shri Ranjan (Eingegangen am 17. Juni 1955)
In einer neuen Arbeit zeigt BAWDEN [1 J, daB durch Virusinfektion oft eine neue Gruppe von EiweiBen im Wirt gebildet wird. Andere Veroffentlichungen weisen darauf hin, daB verschiedene Viren in verschiedener Weise den Stoffwechsel ihrer Wirtspflanzen beeinflussen. MARTIN, BALLS und Mc KINNEy[3], MENEGHINI und DELWICHE, COMMONER und andere [5J und kurzlich auch LALORAYA und GOVIND JEE berichten, daB eine Tabakmosaikvirus-Infektion mit einer bemerkenswerten Zunahme an IOslichem Amino-N der Wirtspflanze verknupft ist. Alif der anderen Seite zeigen ANDREAE und KATHLEEN, daB Kartoffelknollen, die mit Kartoffelblattrollvirus infiziert sind, kein Tryptophan enthalten und einen etwas geringeren Gehalt an Tyrosin aufweisen. In dieser Arbeit wird nun versucht, die Unterschiede im Bestand an Amino- und organischen Sauren zwischen gesunden und Mosaikblattern von Cucurbita pepo chromatographisch zu untersuchen. Es wurden gleiche Mengen gesunder und kranker Blatter abgeschnitten, und zwar yom 3. Knoten der Pflanze an abwarts. Die freien Aminosauren wurden sowohl mit heiBem Wasser als auch mit 70% Alkohol extrahiert, der Ru.ckstand 1 h mit 6 n HCI und einem Druck von 5,5 at autoklaviert. Die Analyse der organischen Sauren erfolgte aus dem alkoholischen Extrakt. Fur die Trennung der Aminosauren wurde die Technik von RANJAN und anderen angewandt. Es wurde ein Filter Whatman Nr. 1 von 40 cm Durchmesser benutzt mit 16 gleichen Sektoren, die durch 16 radiale Einschnitte (2 X150 mm) voneinander getrennt waren. Tropfen von bekanntem Volumen (0,003 ml) wurden an den verschiedenen fUr diesen Zweck bezeichneten
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SIIRI RANJAN
Stellen aufgetragen. AuBerdem wurden an verschiedenen Stellen Reinsubstanzen aufgetragen zur Erleichterung der Identifikation der Banden. Das Chromatogramm lief 14 h in Butanol-Eisessig-Wasser (4: 1: 5) bei 24° ± 1° C. Die Losungsmittelfront wurde markiert, das Papier bei Zimmertemperatur getrocknet und mit 0,1% Ninhydrin in Aceton bespriiht. Die Banden wurden 4 h bei Zimmertemperatur und dann 5 min bei 70° entwickelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Tabelle 1 Aminosauren bei gesunden und Mosaikblattern von Cucurbita pepo Aminosauren des Hydrolysats
Freie Aminosauren
- - - _ . _ - - - , - - - - - -----,-------
virusinfiziert I
Aminosauren
Leucin und Isoleucin ....... . Phenylalanin .............. . Valin und Methionin ....... . Tryptophan ............... . Neue Bande Nr. 1 ......... . Tyrosin ................... . Prolin .................... . Alanin .................... . Glutaminsaure und Threonin . Asparaginsaure und Glycin .. Neue Bande Nr. 2 ......... . Asp~r.agin ................. . Argmln ................... . Histidin und Lysin ........ . Cystin .................... . Nicht identifizierte Bande .. . Zeichenerklarung:
+
0,92 I + 0,88[i 0,82 +
0,80
-
gesund
+ +
+ +
+ +
+ + +
+
0,78 0,74 0,67 0,65 0,59 0,52
+ + + + 0,43
+ + + + 0,43
+ + + +
+ + + +
0,40 0,38 0,36 0,27
+ +
+ + 0,27 +
+ + +
+ + +
0,20
Bande vorhanden. -
+ + + +
0,67
+ + +
0,67
+ + 0,27 +
Bande nicht vorhanden.
Die organischen Sauren wurden mit der Methode von RANJAN und RAJARAO [9] getrennt auf einem Whatman-Filter Nr. 1 von 27 cm Durchmesser mit 12 gleichen Sektoren. Tropfen von bekanntem Volumen (0,004 ml) der Losungen (alkoholische Extrakte) und VergleichslOsungen wurden an den fiir diesen Zweck bezeichneten Stellen aufgetragen. Das Chromatogramm lief 8 h lang in Butanol-Ameisensaure-Wasser (10: 2: 5) bei 24° ± 1°C. Die Losungsmittelfront wurde markiert, das Papier iiber Nacht bei Zimmertemperatur und anschlieBend 30 min im Trockenschrank getrocknet. Es wurde mit Bromphenol-Blau (40 mg in 100 m195% Alkohol) gespriiht, was zitronengelbe Banden auf blauem Grund ergab. Die Ergebnisse sind aus Tabelle 2 zu ersehen.
Die Wirkung einer Infektion mit Cucurbita-Mosaikvirus usw.
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Tabelle 2 Organische Sauren bei gesunden und Mosaikblattern von Cucurbita pepo Bekannte organische Sauren
Rf-Werte
Fumarsaure ..... Bernsteinsaure .. Malonsaure Apfelsaure ...... Zitronensaure .... Weinsaure ......
0,90 0,82 0,71 0,62 0,51 0,40
I Alkoholischer Extrakt I Alkoholischer Extrakt von gesunden Blattern
+ +. (kriiftig) + (kriiftig) -
von Mosaikblattern
!
+ + +
(schwach) (schwach)
-
I
Aus Tabelle 1 geht hervor, daJ3 das saure Hydrolysat sowohl der gesunden als auch der Mosaikblatter die folgenden Aminosa:uren enthalten: Leucin und Isoleucin (Rf 0,92), Phenylalanin (0,88), Valin und Methionin (0,82), Tyrosin (0,73), Prolin (0,67), Alanin (0,65), Glutaminsaure und Threonin (0,59), Glycin und Asparaginsaure (0,52), Arginin (0,38), Histidin und Lysin (0,36), Cystin (0,27) und einen nicht identifizierten Streifen mit dem Rf-Wert 0,20. Es wurde kein Unterschied gefunden im Aminosaurenbestand der Hydrolysate von gesunden und Mosaikblattern. Unsere Ergebnisse zeigc'lll, daJ3 die Konzentration der freien" Aminosauren (sowohl der wasserloslichen als auch der alkoholloslichen) in den virusinfizierten Blattern betrachtlich hOher ist als in den gesunden - geschatzt nach der Intensitat der Banden. AuJ3er der Zunahme der entsprechenden freien Aminosauren - und zwar Leucin und Isoleucin, Valinund Methionin, Tyrosin, Alanin, Glutaminsaure und Threonin; Asparaginsaure und Glycin, Arginin, Histidin und Lysin (und einer nicht identifizierten Bande mit dem Rf-Wert 0,20) - zeigen die virusinfizierten Blatter die Gegenwart einiger neuer ninhydrinpositiver Substanzen, sowohl im waJ3rigen als liuch im alkoholischen Extrakt. Eine neue Bande mit dem Rf-Wert 0,43 wurde sowohl aus dem alkoholischen als auch aus dem waJ3rigen Extrakt nur von Mosaikblattern gewonnen. Eine andere neue Bande mit dem Rf-Wert 0,78 (tiber dem Tyrosin) konnte nur aus dem waJ3rigen Extrakt (nicht aus dem alkoholischen) virusinfizierter Blatter gewonnen werden. Es scheint, daJ3 diese neue Substanz, wahrscheinlich eine Aminosaure, die auf Grund der Virusinfektion gebildet wurde, nur wasserloslich, nicht aber alkohollOslich ist. Man muJ3 beachten, daJ3 Cystin, das im freien Zustand nur in den virusinfizierten Blattern vorhanden ist, im waJ3rigen Extrakt nicht besonders gut, im alkoholischen dagegen ausgezeichnet aufgefunden werden kann. Aus Tabelle 2ist zu sehen, daJ3 virusinfizierte Blatter den gesunden gegentiber eine leichte Minderung des A.pfel- und Zitronensauregehaltes zeigen (geschatzt nach Tiefe und Breite der Banden). 1m Bernsteinsauregehalt zeigt sich kein wesentlicher Unterschied.
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SHRI RANJAN, Die Wirkung einer Infektion mit Cucurbita-Mosaikvirus usw.
Aus unverOffentlichten Ergebnissen unseres Laboratoriums geht hervor, daB virusinfizierte Cucurbita-pepo-BHitter weniger Zucker, vor allem weniger Saccharose, enthalten. Nach unseren Ergebnissen zeigt das Cucurbita-Mosaik die typischen Abwandlungen des Stoffwechsels, wie sie von BAWDEN [2] fUr Mosaikkrankheiten zusammengestellt wurden, die mit einer Abnahme des Zuckergehaltes und einer Zunahme des Gehaltes an freiem Amino-N verbunden sind. BAWDEN bestatigt die Zumthme an freien Aminosauren sowie die Bildung ninhydrinpositiver Substanzen durch Virusinfektion und nimmt hierfiir eine neue Kategorie von EiweiBen an. Es ist jedoch nicht klar, ob diese ninhydrinpositiven Substanzen, die wir durch Virusinfektion von Cucurbita-Blattern erhalten, ein Bestandteil des Virusmolekiils selbst sind oder durch die Infektion umgewandelte Stoffwechselprodukte des Wirtes. Dariiber ktinnte eine Untersuchung des N-Gehaltes des Cucurbita-Mosaik-Virus selbst AufschluB geben. Weitere Arbeiten sind im Gange. Wir danken Sri M. M. LALORAYA und GOVIND JEE fiir ihre wertvolle Hilfe bei diesen Untersuchungen. Unser Dank gilt auBerdem Sri K. S. BILGRAMI und Sri B. B. S. RAIZADA fiir das Autoklavieren der Ltisungen.
Literatur 1. BAWDEN, F. C., 1954. J. Sci. and Ind. Res. 13 (3), 106. - 2. Ders., 1952. AnnI. Review of Plant Physiology. - 3. MARTIN, L. F., BALLS, A. K., und McKINNEY, H. H., 1938. Science 87, 329. - 4. MENEGHlNI, M., u. DELWICHE, C. C., 1951. J. BioI. Chern. 189, 177. - 5. COMMONER, BARRY und VARDA NEHARI, 1953. J. Gen. PhysioI. 36 (6), 791. - 6. LALORAYA, M. M., and GOVIND JEE, 1955. Nature (im Druck). - 7. ANDREAE, W. A., and KATHLEEN, L. THOMPSON. Nature 166 (4210), 72. 8. RANJAN, S., GOVIND JEE and LALORAYA, M. M., Proc. Nat. Inst. Sci. (im Druck).9. RANJAN, S., and RAJA RAO T., 1954. Abstract presented to National Academy of Siences India.
Anschrift des Verfassers : Prof. Dr. SHRI RANJAN, Department of Botany, University of Allahabad, India.
Shri Ranjan (Eingegangen am 17. Juni 1955)
In einer neuen Arbeit zeigt BAWDEN [1 J, daB durch Virusinfektion oft eine neue Gruppe von EiweiBen im Wirt gebildet wird. Andere Veroffentlichungen weisen darauf hin, daB verschiedene Viren in verschiedener Weise den Stoffwechsel ihrer Wirtspflanzen beeinflussen. MARTIN, BALLS und Mc KINNEy[3], MENEGHINI und DELWICHE, COMMONER und andere [5J und kurzlich auch LALORAYA und GOVIND JEE berichten, daB eine Tabakmosaikvirus-Infektion mit einer bemerkenswerten Zunahme an IOslichem Amino-N der Wirtspflanze verknupft ist. Alif der anderen Seite zeigen ANDREAE und KATHLEEN, daB Kartoffelknollen, die mit Kartoffelblattrollvirus infiziert sind, kein Tryptophan enthalten und einen etwas geringeren Gehalt an Tyrosin aufweisen. In dieser Arbeit wird nun versucht, die Unterschiede im Bestand an Amino- und organischen Sauren zwischen gesunden und Mosaikblattern von Cucurbita pepo chromatographisch zu untersuchen. Es wurden gleiche Mengen gesunder und kranker Blatter abgeschnitten, und zwar yom 3. Knoten der Pflanze an abwarts. Die freien Aminosauren wurden sowohl mit heiBem Wasser als auch mit 70% Alkohol extrahiert, der Ru.ckstand 1 h mit 6 n HCI und einem Druck von 5,5 at autoklaviert. Die Analyse der organischen Sauren erfolgte aus dem alkoholischen Extrakt. Fur die Trennung der Aminosauren wurde die Technik von RANJAN und anderen angewandt. Es wurde ein Filter Whatman Nr. 1 von 40 cm Durchmesser benutzt mit 16 gleichen Sektoren, die durch 16 radiale Einschnitte (2 X150 mm) voneinander getrennt waren. Tropfen von bekanntem Volumen (0,003 ml) wurden an den verschiedenen fUr diesen Zweck bezeichneten
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SIIRI RANJAN
Stellen aufgetragen. AuBerdem wurden an verschiedenen Stellen Reinsubstanzen aufgetragen zur Erleichterung der Identifikation der Banden. Das Chromatogramm lief 14 h in Butanol-Eisessig-Wasser (4: 1: 5) bei 24° ± 1° C. Die Losungsmittelfront wurde markiert, das Papier bei Zimmertemperatur getrocknet und mit 0,1% Ninhydrin in Aceton bespriiht. Die Banden wurden 4 h bei Zimmertemperatur und dann 5 min bei 70° entwickelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Tabelle 1 Aminosauren bei gesunden und Mosaikblattern von Cucurbita pepo Aminosauren des Hydrolysats
Freie Aminosauren
- - - _ . _ - - - , - - - - - -----,-------
virusinfiziert I
Aminosauren
Leucin und Isoleucin ....... . Phenylalanin .............. . Valin und Methionin ....... . Tryptophan ............... . Neue Bande Nr. 1 ......... . Tyrosin ................... . Prolin .................... . Alanin .................... . Glutaminsaure und Threonin . Asparaginsaure und Glycin .. Neue Bande Nr. 2 ......... . Asp~r.agin ................. . Argmln ................... . Histidin und Lysin ........ . Cystin .................... . Nicht identifizierte Bande .. . Zeichenerklarung:
+
0,92 I + 0,88[i 0,82 +
0,80
-
gesund
+ +
+ +
+ +
+ + +
+
0,78 0,74 0,67 0,65 0,59 0,52
+ + + + 0,43
+ + + + 0,43
+ + + +
+ + + +
0,40 0,38 0,36 0,27
+ +
+ + 0,27 +
+ + +
+ + +
0,20
Bande vorhanden. -
+ + + +
0,67
+ + +
0,67
+ + 0,27 +
Bande nicht vorhanden.
Die organischen Sauren wurden mit der Methode von RANJAN und RAJARAO [9] getrennt auf einem Whatman-Filter Nr. 1 von 27 cm Durchmesser mit 12 gleichen Sektoren. Tropfen von bekanntem Volumen (0,004 ml) der Losungen (alkoholische Extrakte) und VergleichslOsungen wurden an den fiir diesen Zweck bezeichneten Stellen aufgetragen. Das Chromatogramm lief 8 h lang in Butanol-Ameisensaure-Wasser (10: 2: 5) bei 24° ± 1°C. Die Losungsmittelfront wurde markiert, das Papier iiber Nacht bei Zimmertemperatur und anschlieBend 30 min im Trockenschrank getrocknet. Es wurde mit Bromphenol-Blau (40 mg in 100 m195% Alkohol) gespriiht, was zitronengelbe Banden auf blauem Grund ergab. Die Ergebnisse sind aus Tabelle 2 zu ersehen.
Die Wirkung einer Infektion mit Cucurbita-Mosaikvirus usw.
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Tabelle 2 Organische Sauren bei gesunden und Mosaikblattern von Cucurbita pepo Bekannte organische Sauren
Rf-Werte
Fumarsaure ..... Bernsteinsaure .. Malonsaure Apfelsaure ...... Zitronensaure .... Weinsaure ......
0,90 0,82 0,71 0,62 0,51 0,40
I Alkoholischer Extrakt I Alkoholischer Extrakt von gesunden Blattern
+ +. (kriiftig) + (kriiftig) -
von Mosaikblattern
!
+ + +
(schwach) (schwach)
-
I
Aus Tabelle 1 geht hervor, daJ3 das saure Hydrolysat sowohl der gesunden als auch der Mosaikblatter die folgenden Aminosa:uren enthalten: Leucin und Isoleucin (Rf 0,92), Phenylalanin (0,88), Valin und Methionin (0,82), Tyrosin (0,73), Prolin (0,67), Alanin (0,65), Glutaminsaure und Threonin (0,59), Glycin und Asparaginsaure (0,52), Arginin (0,38), Histidin und Lysin (0,36), Cystin (0,27) und einen nicht identifizierten Streifen mit dem Rf-Wert 0,20. Es wurde kein Unterschied gefunden im Aminosaurenbestand der Hydrolysate von gesunden und Mosaikblattern. Unsere Ergebnisse zeigc'lll, daJ3 die Konzentration der freien" Aminosauren (sowohl der wasserloslichen als auch der alkoholloslichen) in den virusinfizierten Blattern betrachtlich hOher ist als in den gesunden - geschatzt nach der Intensitat der Banden. AuJ3er der Zunahme der entsprechenden freien Aminosauren - und zwar Leucin und Isoleucin, Valinund Methionin, Tyrosin, Alanin, Glutaminsaure und Threonin; Asparaginsaure und Glycin, Arginin, Histidin und Lysin (und einer nicht identifizierten Bande mit dem Rf-Wert 0,20) - zeigen die virusinfizierten Blatter die Gegenwart einiger neuer ninhydrinpositiver Substanzen, sowohl im waJ3rigen als liuch im alkoholischen Extrakt. Eine neue Bande mit dem Rf-Wert 0,43 wurde sowohl aus dem alkoholischen als auch aus dem waJ3rigen Extrakt nur von Mosaikblattern gewonnen. Eine andere neue Bande mit dem Rf-Wert 0,78 (tiber dem Tyrosin) konnte nur aus dem waJ3rigen Extrakt (nicht aus dem alkoholischen) virusinfizierter Blatter gewonnen werden. Es scheint, daJ3 diese neue Substanz, wahrscheinlich eine Aminosaure, die auf Grund der Virusinfektion gebildet wurde, nur wasserloslich, nicht aber alkohollOslich ist. Man muJ3 beachten, daJ3 Cystin, das im freien Zustand nur in den virusinfizierten Blattern vorhanden ist, im waJ3rigen Extrakt nicht besonders gut, im alkoholischen dagegen ausgezeichnet aufgefunden werden kann. Aus Tabelle 2ist zu sehen, daJ3 virusinfizierte Blatter den gesunden gegentiber eine leichte Minderung des A.pfel- und Zitronensauregehaltes zeigen (geschatzt nach Tiefe und Breite der Banden). 1m Bernsteinsauregehalt zeigt sich kein wesentlicher Unterschied.
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SHRI RANJAN, Die Wirkung einer Infektion mit Cucurbita-Mosaikvirus usw.
Aus unverOffentlichten Ergebnissen unseres Laboratoriums geht hervor, daB virusinfizierte Cucurbita-pepo-BHitter weniger Zucker, vor allem weniger Saccharose, enthalten. Nach unseren Ergebnissen zeigt das Cucurbita-Mosaik die typischen Abwandlungen des Stoffwechsels, wie sie von BAWDEN [2] fUr Mosaikkrankheiten zusammengestellt wurden, die mit einer Abnahme des Zuckergehaltes und einer Zunahme des Gehaltes an freiem Amino-N verbunden sind. BAWDEN bestatigt die Zumthme an freien Aminosauren sowie die Bildung ninhydrinpositiver Substanzen durch Virusinfektion und nimmt hierfiir eine neue Kategorie von EiweiBen an. Es ist jedoch nicht klar, ob diese ninhydrinpositiven Substanzen, die wir durch Virusinfektion von Cucurbita-Blattern erhalten, ein Bestandteil des Virusmolekiils selbst sind oder durch die Infektion umgewandelte Stoffwechselprodukte des Wirtes. Dariiber ktinnte eine Untersuchung des N-Gehaltes des Cucurbita-Mosaik-Virus selbst AufschluB geben. Weitere Arbeiten sind im Gange. Wir danken Sri M. M. LALORAYA und GOVIND JEE fiir ihre wertvolle Hilfe bei diesen Untersuchungen. Unser Dank gilt auBerdem Sri K. S. BILGRAMI und Sri B. B. S. RAIZADA fiir das Autoklavieren der Ltisungen.
Literatur 1. BAWDEN, F. C., 1954. J. Sci. and Ind. Res. 13 (3), 106. - 2. Ders., 1952. AnnI. Review of Plant Physiology. - 3. MARTIN, L. F., BALLS, A. K., und McKINNEY, H. H., 1938. Science 87, 329. - 4. MENEGHlNI, M., u. DELWICHE, C. C., 1951. J. BioI. Chern. 189, 177. - 5. COMMONER, BARRY und VARDA NEHARI, 1953. J. Gen. PhysioI. 36 (6), 791. - 6. LALORAYA, M. M., and GOVIND JEE, 1955. Nature (im Druck). - 7. ANDREAE, W. A., and KATHLEEN, L. THOMPSON. Nature 166 (4210), 72. 8. RANJAN, S., GOVIND JEE and LALORAYA, M. M., Proc. Nat. Inst. Sci. (im Druck).9. RANJAN, S., and RAJA RAO T., 1954. Abstract presented to National Academy of Siences India.
Anschrift des Verfassers : Prof. Dr. SHRI RANJAN, Department of Botany, University of Allahabad, India.