Durchflußzytophotometrische Bestimmung des DNS-Gehaltes von Nectria coccinea Pers. ex Fr. bei Fungizideinwirkung

Chemosphere No. 1, pp 51 - 58, 1978.

Pergamon PL-ess.

Prin%ed i n G r e a t B r i % ~ i n .

D u r c h f l u B z y t o p h o t o m e t r i s c h e Bestinlnung des D N S - G e h a l t e s yon Nectria

K.-J.

coccinea

Pers. ex Fr. bei F u n g i z i d e i n w i r k u n g

Hutter, Th. G6rtz,

H. Oldiges und H.E. E i D e l ~

Fraunhofer-Gesellschaft I n s t i t u t fur A e r o b i o l o g i e G r a f s c h a f t D - 5948 S c h m a l l e n b e r g / H o c h s a u e r l a n d und Biophysics

Systems GmbH., D - 6 1 4 0 B e n s h e i m 3, Im E i c h e n b O h l

24 m

(Received in Germany24 November 1977; reoeive4L~fo~lmxblio6%ion2])ecember

Einleitun~ Die w i r t s c h a f t l i c h e B e d e u t u n g der F u n g i z i d e w i r d d a d u r c h dokumentiert,

dab 1974 z.B. a n n ~ h e r n d 25 % des P e s t i z i d u m s a t z e s

in der BRD auf diese a n o r g a n i s c h e n oder o r g a n i s c h e n S u b s t a n z e n 1

entfiel.

Das A u f t r e t e n p i l z p a r a s i t ~ r e r E r k r a n k u n g e n ist starken S c h w a n k u n g e n u n t e r w o r f e n und w i r d durch K l i m a f a k t o r e n m a B g e b lich beeinfluSt.

In der land- und f o r s t w i r t s c h a f t l i c h e n Praxis

hat es sich jedoch als n o t w e n d i g erwiesen, F u n g i z i d e p r o t e k t i v auszubringen, beugen.

um einem m 6 g l i c h e n P i l z b e f a l l w e i t g e h e n d vorzu-

T r o t z d e m ist eine z u s ~ t z l i c h e c u r a t i v e B e h a n d l u n g be-

reits e r k r a n k t e r P f l a n z e n in v i e l e n F M l l e n durch l o c o s y s t e m i sche oder s y s t e m i s c h e F u n g i z i d e notwendig.

In I n t e n s i v k u l t u r e n

ist heute ein w i e d e r h o l t e s A u s b r i n g e n yon F u n g i z i d e n die Regel.

51

19~7)

52

No. 1

Um die W i r t s p f l a n z e n i c h t Aufwandmengen

auszubringen,

zu s c h ~ d i g e n oder u n n 6 t i g hohe g e h e n die B e m ~ h u n g e n dahin,~ d u r c h

verfeinerte Testmethoden beJden Kriterien

gerecht

zu werden.

N e b e n dem O b j e k t t r ~ , g e r - S p o r e n k e i m - T e s t wird h i e r z u der AgarDlatten-Test

angewendet. 2 Der i n

Test

vitro

E r m i t t l u n g des K o n z e n t r a t i o n s g r e n z w e r t e s oarat, in

damit die A b t 6 t u n q

den in

vivo

Test,

Vertr~glichkeit

zur

i e w e i l i q e Pr~-

des P a r a s i t e n g e w ~ h r l e i s t e t

M e t h o d e n g e b e n w i c h t i q e Hinweise,

vitro

ist n o t w e n d i ~

f[~r das

ersetzen

ist.

Beide

abet nicht

der ~ber die W i r k u n ~ des = u n ~ i z i d s

und d e s s e n

f~r die hTirtsoflanze im ~ r e i l a n d v e r s u c h Auf-

schlu~ gibt. Als neue i n

Methode

vitro

zur B e u r t e i l u n g der W i r k u n a

F u n g i z i d s b i e t e t sich die D u r c h f l u ~ z y t o D h o t o m e t r i e ihrer Hilfe k 6 n n e n A u s s a g e n ~ber V e r ~ n d e r u n q e n stoffen,

z.B.

des D N S - G e h a l t e s

Die U n t e r s u c h u n g e n h a t t e n photometrie Bewertung

ein V e r f a h r e n

einzelner

eines

an. Mit

von Z e l l i n h a l t s -

Zellen o e m a c h t werden.

3-6

zum Ziel, mit der D u r c h f l u ~ z y t o -

zu e n t w i c k e l n ,

zur W i r k u n g yon F u n g i z i d e n

das d e m H e r s t e l l e r eine

auf P i l z D a r a s i t e n

erlaubt.

M a t e r i a l und M e t h o d e n AIs T e s t o r g a n i s m u s

diente Nectria

coccinea

Pers.

ex Fr.,

der

E r r e g e r des B u c h e n k r e b s e s . 7 Der Pilz w u r d e 5 Tage in Y E P - L 6 sung 8 bei 28 o C gez[~chtet. Der D N S - G e h a l t der Zellen w u r d e mit ProDidiumjodid

(Calbiochem,

537059)

nach O,1 9 s c h l i e B e n d e r P e p s i n b e h a n d l u n g gef~rbt.

% RNase- und an-

Die D N S - M e s s u n g e n w u r d e n mit d e m C v t o f l u o r o g r a f ~ (Ortho I n s t r u m e n t s ,

Westwood,

Mass.,

fr~iher B i o p h y s i c s

a u s g e r ~ s t e t mit e i n e m 5 0 - m W - A r g o n - L a s e r , w e l l e n l ~ n g e von

514,5 nm durchqef<~hrt.

ist ein d i c h r o i t i s c h e r

FC-200

Im F l u o r e s z e n z l i c h t k a n a l

S p i e g e l mit einer T r e n n k a n t e yon

z u s a m m e n m i t e i n e m S p e r r f i l t e r von

Systems),

bei einer A n r e g u n g s -

590 nm anqebracht. 9

570 nm

No. i

53

Nach 5 Tagen Vorzucht in 100 ml YEp-L6sung wurden der N e c t r i a Kultur 5 ml einer w~ssrigen EUPAREN ~ -

coccinea

(Celamerck, Wirkstoff Dichlofluanid) konzentration O,1 % E U P A R E ~ b e t r u g .

Suspension

zugegeben, so dab die EndIn die KontrollsusDension

wurde die entsprechende Menge H20 gegeben. Unmittelbar nach Zugabe der EUPAREN ~ -

Suspension und nach 24 Stunden Einwirkungs-

zeit wurden sowohl v o n d e r

behandelten als auch v o n d e r

Kon-

trollsuspension Plattenausstriche vorgenommen und ~ber mehrere Tage mikro- und makroskopisch ~berDr~ft. Die durchfluSzytophotometrische Untersuchung der Susnensionen erfolgte nach 24 Stunden Fungizideinwirkung. Vor dieser Messung wl/rden die Pilzzellen durch ein Polyamid-Sieb

(Vereinigte Sei-

denwebereien, Krefeld) mit einer Maschenweite von 65 ~m passiert.

Er@ebnisse und Diskussion Zur Bewertung der Fungizideinwirkung wurde in vergleichender Betrachtung der DNS-Gehalt der mit EUPAREN ~ behandelten bzw. unbehandelten Pilzzellen durchfluSphotometrisch bestimmt. Die Abb.

1 zeigt die Kombination eines Cytogramms und Histo-

gramms des DNS-Gehaltes der Kontrollsuspension yon N e c t r i a coccinea.

Abb.

I: DurchfluSzytophotometrische Messung des DNS-Gehaltes der Kontrollsuspension von N e c t r i a gramm

(ausgezogene Kurve)

coccinea.

Das Histo-

stellt die rel. H~ufigkeit

der Zellen in Abh~ngigkeit von ihrer Fluoreszenzintensit~t

(DNS-Gehalt) dar.

Im darUber aufgetragenen Cytogramm ist die Zellgr68e vertikal, die Fluoreszenzintensit~t horizontal, f~r jede einzelne gemessene Zelle als Punkt registriert. Das Histogramm besteht aus 92.000 vermessenen Pilzzellen, das entsDrechende Cytogramm setzt sich aus 1.OO0 vermessenen Zellen zusammen. F0r beide Messungen wurden

54

No.

ca.

fHnf

Minuten

ben6tigt.

1000 z w

9264~

50

800

w u0

40

:O n~ O

._,1

I..U N n,I.u o

600.

30

~00"

"

200~~

._1

1"< N

z

10

20

30

_J

uJ N w >

20

uJ c~

50

40

60

REL. FLUORESZENZINT,

I m Cytogranln

wird

die

Fluoreszenzintensit~t

Streulicht

, das

mit

gistriert.

Jeder

Punkt

messene wird der

die

Zelle.

der

Zellgr68e

des

Cytogramms

Im entsDrechenden

FluoreszenzintensitMt

Zellen

vertikal

len v e r m e s s e n .

Das

beim

Fluoreszenzwert

12,5,

wert

22,5.

Bestimmungen

n6tigt.

FHr

beide

zweite

92.000

Anzahl

der

Maximum

wurden

eine

(ausgezogene

horizontal,

Es w u r d e n der

und

ca.

f~nf

re-

verKurve)

die

Anzahl

einzelne

Zellen

beim

das

vertikal

reDrMsentiert

ebenfalls

Maximum das

ist,

Histogramm

registriert. erste

horizontal

korreliert

Zel-

liegt

FluoreszenzMinuten

be-

No. i

55

Abb.

2: D u r c h f l u S z y t o p h o t o m e t r i s c h e yon N e c t r i a

coccinea

Messung

nach E U P A R E N ~

Hber der K o n t r o l l s u s D e n s i o n sit,ten m e r k l i c h Die A n z a h l bzw.

LU W

N

entspricht

Zellen

f0r das Histogran~n

den v o r h e r

angegebenen

9231~

Werten.

50 w

800"

40

600'

-30

:O C~

n,,U.I

o T .,:% N Z

Gegen-

sind die F l u o r e s z e n z i n t e n -

I000. z

- Einwirkung.

geringer.

der v e r m e s s e n e n

Cytogramm

des D N S - G e h a l t e s

o &u

N

TC

400•

-20

,,,

ik

w n,-

;io 3'0

50

60

REI-. FLUORESZENZINT.

Die Abb. diger

wieder. Maxima

2 gibt die A u f z e i c h n u n g

Einwirkung Vermessen liegen

einer E U P A R E N ~ wurden

- Suspension

auch hier

beim F l u o r e s z e n z w e r t

Die L i n k s v e r s c h i e b u n g dab

des D N S - G e h a l t e s

sich der D N S - G e h a l t

Fluoreszenzlichtsignale

der M a x i m a

ca.

Die

19,O.

ist d a r a u f

inhibierten

24 stOn-

92.000 E i n z e l z e l l e n .

11,O bzw.

nach F u n g i z i d e i n w i r k u n g der

nach

auf den P a r a s i t e n

Zellen

zur~ckzufUhren, verMndert. sind

Die

schw~cher

56

No. 1

als die der K o n t r o l l s u s p e n s i o n , chromierung

und M e s s u n g

der

obwohl

die Fixierung,

Zellen g l e i c h e n

Fluoro-

Bedingungen

unter-

lag. Zum V e r g l e i c h

der d u r c h f l u B z y t o m h o t o m e t r i s c h e n

wurden Ausstrichpr~parate konnten

nur die

Der V o r t e i l gegenNber nach

Zellen

Bedingung len einzeln,

Nach

d.h.

liegt

dab die E r g e b n i s s e

Untersuchungen

als Sporen,

Mycel

Mikro-

ist,

kurz

Messungen.

Bestimmung

durch

dab die Pilzzel-

oder M a k r o k o n i d i e n

oder V e r f l e c h t u n g e n

fluBzytophotometrischen her vor dieser

Methode

werden.

vorliegen.

for d e r a r t i g e

HyDhen,

Bebr~tung

kultiviert

der d u r c h f l u B z v t o D h o t o m e t r i s c h e n darin,

Ergebnisse

48 Stunden

der K o n t r o l l s u s D e n s i o n

den A u s s t r i c h D r ~ p a r a t e n

der P r o b e n a h m e

liegen.

anqefertigt.

Die

behindern

ZellsusDension

ein P o l y a m i d - S i e b

vor-

die durchmu~te

da-

filtriert

werden. Da die

Zellen

den,

durch

ten

genOgend

einzelner

sich

optimale

im Stadium

Bedingungen

einzelne

Zellen

"Hochkultur" alle

selektiert

10,11

Zelltypen

werden.

die

da in den

zum V e r g l e i c h

Zellpopulationen

befan-

vor,

konn-

Die S e l e k t i o n

fNr die d u r c h f l u B z y t o p h o t o m e t r i s c h e n

ist g e r e c h t f e r t i g t , trollversuchen

Zellen

der lagen

Messungen

herangezogenen

unselektiert

Kon-

ausgeplattet

wurden. Die bisher

erzielten

zytophotometrie Zellwachstum erm~glicht

Ergebnisse

zur B e w e r t u n g

phytopathogener

die Feststellung,

in ihrem D N S - G e h a l t sie nicht mehr

Pilze

sind,

lung von K o n z e n t r a t i o n s g r e n z w e r t e n metrie

eine w e r t v o l l e

Hilfe

sein.

dab die D u r c h f l u B von P u n g i z i d e n

eingesetzt

dab e i n z e l n e

durch F u n g i z i d e

in der Lage

zeigen,

der W i r k u n g

werden

Zellen,

gesch~digt

auszukeimen.

auf das

kann.

wie

werden,

Sie

Sporen, so dab

Bei der Ermitt-

kann die D u r c h f l u B z y t o D h o t o -

• o. 1

57

summary A very

rapid m e t h o d

to fungicides treatment

is reported.

with

EUPAREN ~

The m e a s u r e m e n t s were p e r f o r m e d

The cells were

histogroms

subjected

(final c o n c e n t r a t i o n

of DNA c o n t e n t

of N e c t r i a

O,1

cells

to a 24 hour

%).

coccinea

The results

and cytograms

of fungus

Pers.

are shown

which

were

ex Fr.

in the

received

5 minutes.

Compared

to a control

substantial was

the r e s p o n s e

by flow cytometry.

flow c y t o m e t r i c about

of m e a s u r i n g

decrease

measurement

with untreated

in DNA c o n t e n t

of N e c t r i a

cells

coccinea

a cells

found.

Wir d a n k e n Forstlichen Anregungen

H e r r n Dr. K.J.

Lang,

Forschungsanstalt und U b e r l a s s u n g

Forstbotanisches

MOnchen,

Instltut

der

for seine w e r t v o l l e n

der Pilzkultur.

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58

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