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Effets de l'actinomycine sur le développement embryonnaire
DEVELOPMENTAL
Effets
BIOLOGY,
de
9,
435457
( 196‘t)
I’actinomycine
sur
le d&eloppement
embryonnaire par I’actinomycine I. Etude morphologique : suppression de la comp6tence de I’ectoderme et du pouvoir inducteur de la levre blastoporale H. DENIS’ Laboratoire de Morphologic Faculte’ des Sciences de l’Uniue-r& Belgique
animale, libre de Bruxelles,
Accept6 le 29 januier 1964 INTRODUCTION
Des arguments de plus en plus nombreux permettent de croire que le systeme de traduction des messageshereditaires mis en evidence chez les batteries intervient egalement dans les phenomenes de differenciation. Pour eprouver cette hypothdse, les agents capables d’interrompre, en un point quelconque, la chaine de transcription des messagesgenetiques sont d’un precieux secours. 11 existe une famille de substances, les actinomycines, qui prksentent la proprikte remarquable de se fixer sur le DNA et d’empdcher ainsi la synthese du RNA messager et, partant, des proteines. Ce mode d’action de l’actinomycine a Cte observe tant chez les organismes simples (Kirk, 1960; Harbers et Mueller, 1962) que dans les cellules de mammifere (Goldstein et ~011.1960; Goldberg et Rabinowitz, 1962; Perry, 1963). L’actinomycine apparait done comme un agent capable de priver les cellules de l’information genetique contenue dans leur noyau. De premieres experiences (Brachet et Denis, 1963) ont montre que l’actinomycine D inhibe, chez les embryons de pleurodele, la diffkrenciation du systkme nerveux. De jeunes larves ont ktk obtenues, ou la chorde et les somites etaient recouverts, non pas dun tube neural, ’ Chargk de recherches du FNRS. phologie animale, Institut Ed. Van : Carnegie Institution Adresse actuelle ology, 115 West University Parkway,
Adresse permanente Beneden, Universitk of Washington, Baltimore, Maryland. 435
: laboratoire de Morde LiBge, Belgique. Department of Embry-
436
H.
DENIS
mais
d’ectoderme atypique. L’interdt de ces observations nous a a etudier en detail l’influence de l’actinomycine sur la differenciation nerveuse. L’absence de systeme nerveux, dans les embryons se developpant en presence d’actinomycine, pourrait &tre due a l’action de l’antibiotique soit sur le tissu inducteur (suppression du pouvoir inducteur du toit de Yarchenteron), soit sur le tissu induit (suppression de la competence de l’ectoderme), soit encore sur les deux tissus a la fois. Pour decider entre ces trois possibilites, seule la technique du “sandwich” 6tait applicable. Elle permet, en effet, de traiter de faGon independante le tissu inducteur et le tissu induit. C’est cette technique qui a Bte employee dans le present travail. poussh
MATERIEL
ET
METHODES
Toutes les experiences ont Cte effect&es sur l’urodele Pleurodeles w&ii. Les “sandwiches” sont constitues de 3 fragments de tissu fournis par 3 embryons de m&me stade (8 a-b suivant Gallien et Durocher, 1957). Deux lambeaux car&s d’ectoderme presomptif, provenant de la calotte animale de jeunes gastrulas, forment l’enveloppe du sandwich. Entre ces deux fragments, on place le tissu inducteur prelevk sur la levre dorsale du blastopore. Les operations ont et& rkalisees en conditions steriles dans du milieu de Niu et Twitty (1953). Les explantats ont et6 cultives sur fond d’agar a 1%20°C pendant 4 jours au maximum, puis fixes au Zenker, coupes a 10~ et color-es A l’Unna. Quelques series ont et6 color&es alternativement a l’Unna et au Feulgen. L’actinomycine D employee provenait dun don gitnereux de la firme Merck, Sharp et Dohme, B laquelle nous adressons nos vifs remerciements. Toutes les solutions d’actinomycine ont tttk gardees autant que possible a l’obscurite. RESULTATS
P&s de 300 sandwiches ont et6 mis en culture, types d’experience differents. Premidre exphrience : influence ation des sandwiches cultive’s Denis, 1963)
de l’actinonycine tout entiers ohs
se repartissant
en 4
sur la di~~rencil’antibiotique (cf.
Les sandwiches, form& de tissus intacts (non trait&), sont places dans l’actinomycine apres cicatrisation parfaite (2-4 heures ) . 11s sont cultives dans l’antibiotique pendant plusieurs jours. Dans une pre-
EFFETS
DE
437
L’ACTINOMYCINE
miere serie (tableau l), la dose d’actinomycine varie de 0,6 A 10 pg par millilitre. Dans une seconde serie (tableau 2), la dose d’actinomycine demeure inchangde, mais la duree de culture varie de 1 A 4 jours. TABLEAU INFLUENCE
DE
LA
CONCENTRATION
DE DES
I
L'.4cTrNO~ycIivE
SUR
DiffCrenciation (4 jours Nombre d’exp6riences
11 4 4 3 9 5
Dose
d’actinomycine (dml) 0
0,s 1,25 2,5 5 10
LA
DIFF%RENcIATI~N
S.'.NDWICHES
Tissu nerveux nbondant
de l’ectoderme de culture)
Tissu nerveux peu abondant
4
0 0
3
1
1 1 0
2 5 0
11
Tiss;b;;;eu
0
0 0 0 3 5
Le tableau 1 d&it la differentiation observee dans les explantats trait&s pendant 4 jours par des doses croissantes d’actinomycine. Tous les explantats-temoins contiennent des tubes nerveux bien caracterisks (fig. 1). 11 en va de m&me pour les sandwiches cultives dans de I’actinomycine a 0,6 pg/ml (fig. 2). L es explantats soumis B des concentrations d’actinomycine de I,25 a 2,5 pg/ml fournissent plus rarement des structures neurales bien differencikes. Les cas ou les sandwiches ne contiennent que des formations nerveuses ma1 form&es ou m&me aucune trace de tissu nerveux deviennent de plus en plus frequents. Lorsque la concentration d’actinomycine atteint 10 pg/ml, la differentiation nerveuse est totalement abolie : les sandwiches (fig. 3) sont form& dun tissu compact et depourvu de structure. Les noyaux se colorent t&s peu par le melange dUnna et ils ne presentent pas de nucleoles visibles. Si on suit de jour en jour l’evolution interne des sandwiches cultives dans de l’actinomycine a 10 pg/ml (tableau 2), on n’aperqoit durant les 72 premieres heures de culture aucune difference morphologique importante entre les explantats-temoins et les explantats trait& A l’actinomycine. Toutefois, l’etude cytologique fait apparaPtre une difference croissante entre les sandwiches-t&moms et les sandwiches trait&, a mesure que la culture se prolonge. Deja apres 24 heures, un retard dans les mitoses se manifeste dans les explantats
FIG. 1. Sandwich form6 d’ectoderme prksomptif de jeune gastrula et dune l&e dorsale de blastopore. Culture pendant 4 jours dam du milieu de Niu et Twitty normal. L’enveloppe de l’explantat s’est differenciee en ectoderme atypique (partie infkieure) et en tissu nerveux. Grossissement : X70. FIG. 2. Sandwich form& d’ectoderme presomptif de jeune gastrula et dune l&e dorsale de blastopore. Culture pendant 4 jours dans de l’actinomycine A la concentration de 0,6 pg/ml. Deux tubes nerveux sont visibles dans la partie gauche de l’explantat. La partie droite renferme un amas de tissu d’origine mkodermique. 438
EFFETS
DE
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L’ACTINOMYCINE
FIG. 3. Sandwich form& d’ectoderme pksomptif de jeune gastrula et d’une kvre dorsale de blastopore. Culture pendant 4 jours dans de I’actinomycine Q la concentration de 10 ag/ml. L’explantat prkente un aspect non organis& Noyaux extrkmement peu color& A 1’Unna. TABLEAU INFLUENCE
Nombre d’enp&iences
DE LA DURI?E DE TRAITEMENT~ DIFFkRENCIATION Durh de traitement ou de culture (jours)
2 L'ACTINOMYCII~E DES SANDWICHES Diff&enciation
Pas de tissu nerveux
Plaques W3ll%kS
(10 ~~/~I)suRLA
de l’ectoderme Gouttihres neurales
Tubes IlSVe”X
Thmoins 3 7 2 11
1 2 3 4
3Q 0 0 0
0 7 0 0
0 0 2 0
0 0 0 11
Trait& 3 6 3 5
1 2 3 4
3a 0 0 5
0 6 0 0
0 0 3 0
0 0 0 0
a Pas encore
d’induction.
soumis A l’actinomycine; celle des nucl&oles est dance s’accentue apr& qui apparaissent apr&s
la colorabilitk des noyaux A l’Unna et surtout rbduite par rapport aux tkmoins. Cette ten2 et 3 jours de culture. Les gouttikres neurales 72 heures de sejour dans l’actinomycine (fig.
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H.
DENIS
FIG. 4. Sandwich form6 d’ectoderme pr&omptif de jeune gastrula et d’une Bvre dorsale de blastopore. Culture pendant 3 jours dans de l’actinomycine A la concentration de 10 ag/ml. Une gouttike neurale en train de se fermer est visible dans la partie droite de l’explantat. Noyaux peu color& B l’Unna. FIG. 5. Sandwich form6 d’ectoderme pr&omptif de jeune gastrula et d’une l&vre dorsale de blastopore. Culture pendant 3 jours en milieu normal. Une goutti&e neurale en train de se fermer est visible dans la partie infkrieure de l’explantat. Noter la coloration intense des noyaux Q l’Unna, qui contraste avec la p%leur des noyaux trait&s A l’actinomycine (fig. 4).
EFFETS
DE
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L’ACTINOMYCINE
4) sont form&es de cellules a noyaux t&s phles, dont beaucoup n’ont plus de nu&oles visibles. Les formations nerveuses qui garnissent les explantats cultiv& en milieu normal (fig. 5) prksentent des noyaux fortement color& g l’Unna et pourvus de nuclkoles bien apparents. ,Cowlusion C’est done seulement au tours de la quatrikme journke de culture qu’une diffdrence morphologiyue decisive apparait entre les sandwithes-tkmoins et les sandwiches trait& g l’actinomycine. Toutes les structures nerveuses qui s’ktaient form&es durant les 3 premiers jours disparaissent dans les explantats cultivits en prdsence de l’antibiotique pour faire place B un tissu compact analogue B l’ectoderme atypique. Cette transformation fait suite B une perte progressive du RNA nuckaire. La disparition des structures nerveuses ne rksulte apparemment pas d’une mort lente des cellules. En effet, aprk 4 jours de culture dans l’actinomycine, les cellules adhkkent encore fermement les unes aux autres et ne montrent pas le moindre signe de pycnose. Seule la faible colorabilitk des noyaux distingue le tissu trait6 6 l’actinomycine de l’ectoderme atypique banal. DeuxiGme expe’rience : influence de l’ectoderme
de t’actinonycine
SW la compe’tence
De l’ectoderme compktent de jeune gastrula est trait6 pendant un temps variable B l’actinomycine 10 pg/ml. 11 est ensuite soumis d l’action inductrice d’une litvre blastoporale intacte. Les rksultats de ce type d’expkrience sont r&urn& dans le tableau 3. INFL~ENcE
DE
TABLEAU (10 pg/ml)
3 SUR
9 4 4 8 5 4 18 23
6h 3 h 1 h 30 45 min 22 min 11 min 5 min 2 min 30 en voie
de d&agAgation.
LA
COMPBTENCE Diffhenciation
Dur6.e de trsitement de l’ectoderme
Nombre d’exp&irnces
a Tissu
L'scTI~OMYCINE
Tissrl
1 1
1 1-2 l-2 1 2-3 2-3
nerveux present
DE
L'ECTODERME de I’ectcderme Tissu
nerveux absent
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DENIS
Les traitements d’une durke comprise entre 6 heures et 45 minutes fournissent des rksultats pratiquement identiques : les explantats se d&sag&gent, en g&-&al, aprks 24 heures de culture, saris que la duke du traitement ait une influence nette sur la dur&e de survie.
FIG. 6. Sandwich form& d’ectoderme prksomptif trait6 pendant 1 heure 30 minutes Q I’actinomycine (10 fig/ml) et d’une kvre blastoporale intacte. Culture 28 heures en milieu normal. L’explantat est en voie de dksagr6gation et des cellules d6jl dktachhes sont visibles dans la partie droite du sandwich. Noyaux pas du tout color& A l’Unna. Le groupe de noyaux plus apparents visibles vers le centre de l’explantat provient de la kvre blastoporale (non trait&e).
La figure 6 offre un exemple typique de l’6tat des sandwiches un jour ap&s leur mise en culture. L’explantat se compose essentiellement de cellules dktachkes ou en train de se dktacher les unes des autres. Leur noyau est si peu colorit A HJnna qu’il est pratiquement invisible. Les quelques noyaux plus apparents, situ& vers le centre du sandwich, sont d’origine mksodermique. La figure 7 est une vue du mGme explantat color& au Feulgen. Les noyaux d’origine ectodermique (partie droite et gauche du sandwich) sont plus clairs que les noyaux mtkodermiques, qui occupent le centre de l’explantat. Sur une vue B plus fort grossissement (fig. 8)) cinq noyaux provenant de la kvre dorsale du blastopore (partie infdrieure gauche de la photo) tranchent par leur coloration plus intense sur les autres noyaux, qui sont d’origine ectodermique. 11 convient de noter l’aspect turgescent des noyaux trait& B l’actinomycine ainsi que la structure
EFFETS
DE
L’ACTINOMYCISE
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FIG. 7. M&me sandwich que sur la figure 6, mais colori: au Feulgen. Les noyaux les plus pales, visibles dans les parties gauche et droite de l’explantat, sont d’origine ectodermique. Les noyaux mieux color& visibles au centre proviennent de la levre blastoporale (tissu non trait&).
FIG. 8. M&me coupe que sur la figure 7, mais vue a fort grossissement ( x 540). La limite entre le tissu ectodermique (traite) et le tissu mesodermique (non trait&) passe en oblique du dessus a gauche au dessous B droite de la photographie. Les noyaux provenant de la kvre blastoporale (partie gauche) sont beaucoup mieux color& que les noyaux d’origine ectodennique. Noter l’aspect turgescent de ceux-ci et l’aspect fortement &icuE de la chromatine.
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H.
DENIS
fortement rkticulee de leur chromatine. Retenons encore un a&t des mitoses : en fait foi le nombre relativement restreint de cellules par sandwich. Le traitement de l’ectoderme pendant une duree de 11 Q 22 minutes provoque une desagregation du sandwich tout aussi rapide qu’un traitement de duke plus longue. Toutefois, le nombre de cellules par explantat est plus ,eleve, ce qui indique un arret moins prkcoce des mitoses. Les noyaux d’origine ectodermique (trait&) prksentent une coloration au Feulgen aussi intense que les noyaux mesodermiques (trait&). Mais la teneur des cellules en RNA nucleaire demeure trks faible, comme le prouve l’extreme paleur des noyaux apres une coloration a 1’Unna. Si l’ectoderme est trait& pendant 5 minutes a l’actinomycine avant dike mis en sandwich, il peut survivre pendant 2 a 3 jours. Apres 48 heures de culture, la plupart des cellules sont en bon &tat. Seule une petite quantite d’entre elles s’est detach&e et rassemblee dans la cavite du sandwich. Sur 6 explantats fixes apres 2 jours de culture, l’ectoderme a forme une plaque medullaire de petites dimensions dans un seul cas. Dans les 12 cas oh la culture a et& prolong&e pendant 3 jours, une neuralisation partielle de l’ectoderme a kte observee 3 fois. Parmi les 9 sandwiches restants, 3 etaient en cytolyse partielle et 6 en cytolyse avancee. Quand le traitement de l’ectoderme est reduit a 2 minutes 30 secondes, P&tat des cellules demeure excellent aprks 48 heures de culture. Trois sur 14 sandwiches fixes apres 2 jours prksentent un Bpaississement local de l’ectoderme, qui est peut-etre une plaque neurale en train de se dessiner. Les 11 autres explantats ont un aspect analogue a celui que montre la figure 9. Les parois du sandwich sont d’epaisseur uniforme et ne manifestent aucune tendance a former de plaque medullaire. Les noyaux des cellules ectodermiques sont plus gros et plus pales que ceux des sandwiches-temoins (fig. lo), qui montrent des signes kvidents de neuralisation. Sur les 9 sandwiches qui ont et& maintenus en culture pendant 3 jours, un seul contenait un tube nerveux de petites dimensions. Les 8 autres explantats etaient form& d’ectoderme atypique (fig. 11). Parmi ces derniers, 5 Ctaient en &at de cytolyse assez avancee. Conclusion Le traitement pg/ml) pendant
de l’ectoderme competent par l’actinomycine (10 une duree &gale ou superieure a 11 minutes entrame
EFFETS
DE
L’ACTINOMYCINE
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FIG. 9. Sandwich forme d’ectoderme presomptif trait& pendant 2 minutes 30 secondes a l’actinomycine (10 pg/ml) et d’une Evre blastoporale intacte. Culture pendant 2 jours en milieu normal. Aucune trace de neurulation dans les parois du sandwich. Noyaux d’origine ectodermique peu colorb B I’Unna. FIG. 10. Sandwich form6 de tissus intacts, cultivk pendant 2 jours en milieu normal. Une plaque mkdullaire est visible dam la partie droite de l’explantat. Noyaux bien color& a 1’Unna.
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H.
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FIG. 11. Sandwich form6 d’ectoderme presomptif trait6 pendant 2 minutes 30 secondes B l’actinomycine (10 fig/ml) et dune levre blastoporale intacte. Culture 3 jours en milieu normal. L’enveloppe du sandwich a form6 un tissu compact depourvu de toute organisation. FIG. 12. Sandwich forme d’ectoderme presomptif intact et dune levre blastoporale traitee pendant 45 minutes ?I l’actinomycine ( 10 rg/ml). Culture 3 jours en milieu normal. L’enveloppe du sandwich a form& un tissu compact d6pourvu d’organisation.
EFFETS
DE
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L’ACTINOMYC~NE
une desagregation rapide du tissu. Celle-ci s’accompagne dune dispa&ion presque totale du RNA nucleaire. Un sejour de 2 minutes 30 secondes dans I’actinomycine permet a l’ectoderme de survivre pendant 2 a 3 jours mais empeche I’induction neurale dans 80% des cas. En d’autres mots, l’actinomycine supprime la compktence de l’ectoderme. Troi&me expe’rience : influence inducteur de la ldvre bhtoporale
de l’actinomycine
PUT le pouvoir
La lkvre dorsale du blastopore est trait&e a l’actinomycine &ml), puis placee entre deux fragments d’ectoderme intact. tableau 4 resume les resultats de ce type d’experience.
INFLUENCE
DE
TABLEAU (10 &‘/Id)
L’ACTINOMYCINE LlbRE
Nombre d’exp&iences
Dur6e de trsitenent de la. I&vre blastoporale
6 6 4 3 10 4 12 4 3
24 h 6h 3h 1 h 30 45 min 22 min 11 min 5 min 0
Q Tissu
en mauvais
(10 Le
4 SUR
LE
POUVOIR
INDUCTEUR
DE
LA
BLASTOPORALE
2 3 2 4 2-3 2-3 2-4 4 4
6a 6” 40 30 9 2 4 0 0
&at.
Un traitement de longue duree (24 hem-es-6 heures) entralne, apres 2 a 3 jours de culture, une cytolyse complete du tissu mdsodermique et une cytolyse partielle du tissu ectodermique. Si la levre blastoporale est trait&e pendant 3 heures ou 1 heure 30 minutes par l’antibiotique, seule une partie de ses cellules est cytolysee aprb 2 B 4 jours. Le reste du tissu implant6 se compose de cellules a noyaux extremement pales, qui ont perdu la plus grande partie de leur RNA nucleaire. L’enveloppe du sandwich a forme un tissu compact, a cellules nombreuses, mais cl’oh toute trace d’organisation est absente.
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DENIS
Parmi les 10 cas ou le tissu inducteur avait subi un traitement de 45 minutes a l’actinomycine, l’ectoderme s’est neuralise dans un cas seulement; il est demeure saris organisation dans les 9 autres cas (fig. 12). Si la d uree du traitement est progressivement reduite a 22 minutes, puis a 11 minutes et enfin a 5 minutes, la frequence des neurulations augmente de faGon reguliere : elle passe de 56% des cas apres 22 minutes de traitement a 66% apres 11 minutes et a 100% aprbs 5 minutes. Cette evolution s’accompagne dune amelioration progressive de l’etat du tissu inducteur : la proportion de cellules lysees diminue lorsque le traitement a l’actinomycine devient plus court. 11 existe une correlation nette entre l’aspect des cellules mesodermiques et la differentiation observee dans l’ectoderme : dans les cas ou celui-ci a formit du tissu nerveux, les cellules mbodermiques presentent une coloration a 1’Unna d’intensite normale et elles se differencient en chorde, somites et mesenchyme, si la culture est de duke suffisante (4 jours ) . Chaque fois que l’ectoderme ne presente aucune trace de neuralisation, le tissu mesodermique est forme, en majeure partie, de cellules a noyau t&s faiblement color& par le melange dUnna.
FIG. 13. Sandwich form& d’ectoderme blastoporale ayant s’iijourn6 3 heures dans pendant 4 jours en conditions normales. dimensions occupe toute la partie centrale d’origine mkodermique.
pksomptif intact et d’une kvre le milieu de culture normal. Culture Une formation nerveuse de grandes de l’explantat. A son contact, tissu
EFFETS
DE
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L’ACTINOMYCINE
Un sejour de 3 heures dans le milieu de culture normal n’affecte pas le pouvoir inducteur de la kvre dorsale du blastopore (fig. 13). L’absence de tissu nerveux dans les sandwiches apres un traitement de la levre blastoporale a l’actinomycine doit done etre attribuee a l’action de l’antibiotique et non a une eventuelle perte de l’agent inducteur dans le milieu de culture. Conclusion Le traitement de la levre blastoporale par l’actinomycine pendant une duke &gale ou superieure a 1 heure 30 minutes entrame l’absence totale de tissu nerveux dans les sandwiches. Si la duree du traitement est reduite, de moitie en moitie, jusqu’a 5 minutes, la frequence des neurulations augmente regulierement jusqu’a atteindre 100% des cas. Chaque fois que, apres un traitement court, la levre dorsale n’a induit aucune structure nerveuse dans l’ectoderme place a son contact, on observe une modification cytologique profonde des cellules inductrices : leur noyau est t&s faiblement color6 a PUnna. L’abolition du pouvoir inducteur vu done de pair avec une disparition du RNA nuclhaire. Toutefois, le tissu mbodermique trait6 a l’actinomycine pendant 45 minutes ou plus subit une cytolyse plus ou moins complete, qui commence 48 heures apres la mise en culture. La presence de cellules pycnotiques a l’interieur de l’explantat pourrait exercer un effet defavorable sur la differentiation des parois du sandwich. Dans certains cas, elle entraine m&me une cytolyse partielle du tissu ectodermique. L’absence de diff erenciation nerveuse dans les explantats pourrait done dtre due, non pas a la suppression du pouvoir inducteur de la kvre blastoporale, mais a une action inhibitrice des cellules cytolysees. Celle-ci empdcherait l’ectoderme de repondre a un stimulus inducteur recu dans les premieres heures de contact avec le tissu mbodermique. Pour lever cette Bquivoque, un quatrieme type d’experience a et6 entrepris. Quatrikme exphience inducteur de la l&re
: influence blastoporale
de l’actinomycine
sur
le pouvoir
Le kvre dorsale du blastopore trait&e a I’actinomycine est mise en contact avec l’ectoderme competent pendant 45 a 48 heures. Le sandwich est alors ouvert et les cellules mesodermiques sont soig-
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H.
DENIS
neusement eliminCes a l’aide dune anse de platine. L’explantat est ensuite referme et cultive pendant 1 ou 2 jours. On kvite de la sorte de laisser subsister des cellules en cytolyse ou en precytolyse A l’interieur du sandwich. On sait qu’un contact de duke limit&e (quelques heures) entre l’ectoderme competent et l’organisateur suffit pour permettre A l’induction de se produire (Johnen, 1956; Denis, 1957). Le tableau 5 resume les resultats de ce dernier type d’experience. TABLEAU INFLUENCE
DEL'ACTINOMYCINE
BLASTOPORALE.
5
(~~~~/~~)SURLEPOUVO~RINDUCTEIJRDE
CONTACT
DE
DUR$E LIMIT&E TISSU INDUCTEUR
ENTRE
LAL&VRE L'ECTODERME
ET
LE
Dur6ede traitement de la I&w blastoporale (hams)
Nombre d’exp&iences
9 18 5 15 15 a Cytolyse
0 1 2 3 6 apr&s
Dunk totale de culture (jam)
4 34 3 3 2
9 15 0 0 0
0 3 5 15 15”
48 heures.
Quand la levre dorsale n’a pas et6 trait&e a l’actinomycine (temoin), mais a sejourne pendant 3 heures dans le milieu de culture normal, on observe dans tous les cas une neuralisation de l’ectoderme (fig. 14). Dans 3 cas sur 9, cependant, ce resultat n’a pas de signification car le tissu inducteur n’a pas ktd completement klimink du sandwich : il se retrouve sous forme dun nodule chordal au contact des formations nerveuses. Parmi les 18 cas ou la levre dorsale a Qtk trait&e pendant une heure a I’actinomycine, 10 cas seulement peuvent &tre retenus, aucune trace du tissu inducteur n’ayant Bte retrouvee dans le sandwich. Dans 4 cas sur 10, la differentiation de l’ectoderme n’a pas et6 affect&e par le traitement de la levre blastoporale. Dans 3 autres cas, l’ectoderme n’est que faiblement neural&e et dans les 3 derniers, le sandwich est tout entier forme dun tissu saris organisation. Quand la levre dorsale du blastopore a subi un traitement de 2 heures A l’actinomycine, la differentiation nerveuse de l’ectoderme est totalement abolie. Le meme resultat est obtenu lorsque la levre
EFFETS
DE
L’ACTINOMYCINE
451
blastoporaIe est trait&e pendant 3 heures (fig. 15), mais alors Ies parois du sandwich entrent frkquemment en cytolyse avant la fin de la culture. Si le traitement du tissu inducteur est prolong& jusqu’g 6 heures, la cytolyse de l’explantat se gknkralise dbjA aprbs 2 jours.
FIG. 14. Ectoderme presomptif de jeune gastrula cultivi: pendant 45 heures au contact dune levre blastoporale ayant sejournk 3 heures dans le milieu de culture normal. Le tissu inducteur a ensuite 6tB retire du sandwich et l’enveloppe de celui-ci a BtC cultivee 2 jours de plus en milieu normal. Une vesicule nerveuse est visible au centre de l’explantat. FIG. 15. M&me experience que sur la figure 14, mais la kvre blastoporale a &A trait&e pendant 3 heures 21 l’actinomycine ( 10 ag/ml). Duke totale de la culture : 3 jours. L’explantat est tout entier form6 dun tissu compact dkpourvu d’organisation.
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DENIS
L’ectoderme place au contact dune levre blastoporale trait&e B l’actinomycine pendant 2 a 3 heures differe de l’ectoderme atypique banal par son aspect compact et sa richesse en noyaux (fig. 15). Ceux-ci ont une basophilie normale et leurs nucleoles sont bien visibles. Ceci rend peu probable l’hypothese dune diffusion de l’antibiotique de la levre dorsale a l’ectoderme au tours du contact inducteur.
Conclusion Un skiour de 2 hewes duns l’uctinomycine (10 pg/ml) sufit done pour supprimer complBtement le pouvoir inducteur de la ldvre dorsale du biizstopore. Un traitement plus court ne supprime que partiellement ce pouvoir inducteur. Un traitement plus long provoque cytolyse plus ou moins rapide du tissu induit.
une
DISCUSSION
Les experiences qui viennent d’etre d&rites mettent en evidence une triple action de l’actinomycine : 1. Suppression de la competence de l’ectoderme. Cet effet est deja atteint par un traitement de quelques minutes Q la temperature ordinaire. 2. Suppression du pouvoir inducteur de la l&e dorsale du blastopore. Un traitement de 1 a 2 heures est necessaire pour produire cet effet. 3. Disparition des structures nerveuses deja differenciees. II est logique d’attribuer les effets morphostatiques de l’actinomytine B la faculte qu’elle possede d’inhiber totalement la synthbse du RNA. L’inhibition par l’actinomycine de la polymerase du RNA serait due a une fixation de l’antibiotique sur le DNA, rendant ainsi ce dernier inutilisable pour une transcription des messages genetiques (Kawamata et Imanishi, 1960; Kirk, 1960; Kersten et toll., 1960; Harbers et Mueller, 1962; Goldberg et Rabinowitz, 1962; Goldberg et toll., 1962; Reich et toll., 196213;Shatkin, 1962; Harbers et COIL, 1963). L’actinomycine inhibe aussi, mais dans une mesure beaueoup moindre, la synthese du DNA (Hurwitz et toll., 1962; Reich et toll., 1962a) et elle peut provoquer un arret des mitoses en prophase (Goldstein et toll., 1960). L’actinomycine produirait aussi une depolymkrisation du RNA a marquage rapide (Acs et toll., 1963). Les autres mecanismes cellulaires, en particuher la respiration et la glycolyse, ne semblent
EFFETS
DE
L’ACTINOMYCINE
453
pas affect& par l’antibiotique (Kirk, 1960; Reich et toll., 1962b; Davidson et toll., 1963). La plupart des effets attribues a l’actinomycine ont 6te observes dans les cellules embryonnaires. L’inhibition de la synthese du RNA se manifeste par la disparition des nucleoles et par un pllissement prononce du sue nucleaire. Cet effet est produit m&me par les concentrations les plus faibles d’actinomycine et par les temps d’exposition les plus courts (fig. 9). La disparition du RNA nuclkaire n’emp&he pas les mitoses de continuer a un rythme ralenti. Quand le traitement par l’actinomycine est de longue duree, les divisions s’arretent et les cellules entrent en cytolyse. I1 importe de noter que les traitements qui ont produit les effets morphostatiques les plus spectaculaires etaient de courte duree, susceptibles d’affecter plus profondement le metabolisme du RNA que celui du DNA. L’action de l’actinomycine n’est done pas celle d’un antimitotique banal mais celle dun puissant inhibiteur de la synthese du RNA. Quant a la toxicite des traitements prolong& a l’actinomycine, elle pourrait n’etre qu’une consequence de l’action antimitotique exercee par celle-ci : l’observation cytologique des cellules en prkcytolyse (fig. 8) suggere que la pycnose est preckdee d’un blocage des mitoses en pr&prophase. Notons enfin qu’aucune depolymerisation importante du RNA de forme stable n’a Btk observee en presence d’actinomycine : celle-ci n’affecte pas de man&e sensible la basophilie du cytoplasme. Chacun des effets morphostatiques que nous avons reconnus a l’actinomycine exige, pour se manifester, des traitements de duree t&s differente. La competence de l’ectoderme est abolie par une exposition de quelques minutes a l’actinomycine. Par contre, les structures nerveuses deja form&es ne disparaissent qu’apres 72 a 96 heures de sejour dans I’antibiotique. Dans ce dernier cas, un facteur de permeab’l’t11 e’ intervient, qui permet aux explantats de resister pendant plusieurs jours a une concentration relativement klevke d’actinomycine. Rappelons que les sandwiches Ctaient places dans l’actinomycine apres cicatrisation parfaite, si bien que la face interne des cellules, non protegee par le “coat” (Holtfreter, 1943), n’entre jamais en contact avec l’antibiotique. Dans les explantats de ce type, le palissement du sue nucleaire et la disparition des nucleoles ne deviennent complets qu’apres 3 a 4 jours de culture. Par contre, lorsque la face interne de l’ectoderme est exposee a l’antibiotique (deuxieme experience), celui-ci manifeste deja apres 24 heures ses effets sur la
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H.
DENIS
colorabilite des noyaux. 11 y a done tout lieu de crone que Yantibiotique ne penetre que t&s lentement a l’interieur des sandwiches, une fois que ceux-ci se sont cicatrises. Ceci explique l’influence tardive de l’antibiotique sur l’evolution des explantats. Que la suppression du pouvoir inducteur de la levre blastoporale exige un traitement plus prolong6 que l’abolition de la competence ne signifie pas nkcessairement que ces deux phenomenes sont lies Q un mktabolisme nucleique plus ou moins rapide. La suppression de la competence de l’ectoderme ne se marque que 2 jours apres le traitement a I’actinomycine. En d’autres mots, l’action de l’antibiotique s’exerce a retardement sur la differentiation cellulaire et un traitement kger suffit pour l’inhiber. Par contre, l’abolition du pouvoir inducteur de la levre blastoporale implique la suppression immediate, d&s avant la fin du traitement, de la production de substance inductrice. Or l’antibiotique n’agit qu’assez Ientement sur les mecanismes cellulaires qu’il est cerise inhiber (synthkse du RNA et des proteines : cf. les articles II et III de cette serie). I1 n’est done pas Btonnant qu’un traitement de plusieurs heures soit necessaire pour abolir le pouvoir inducteur des cellules blastoporales. La nature chimique de l’agent responsable de l’induction neurale reste toujours inconnue a l’heure actuelle. Assez recemment, des recherches soigneuses effect&es sur les inducteurs anormaux ont permis d’isoler une fraction nucleoproteique do&e dun pouvoir inducteur Cleve (Yamada, 1961). La partie active du complexe serait la proteine plutot que le RNA (Vahs, 1962). Le fait que l’actinomycine abolit la puissance Bvocatrice de la levre blastoporale n’est pas incompatible avec l’idee dun inducteur de nature proteique. Mais nos resultats plaident plutot en faveur de l’hypothese dun inducteur ribonucleique, proposee par Brachet ( 1942). En effet, si l’actinomycine inhibe la synthese des proteines, elle inhibe plus completement encore celle du RNA (cf. les articles II et III de cette s&e). De toutes faqons, ce que l’on sait du mode d’action de l’actinomycine (fixation sur le DNA) et, d’autre part, l’observation que le pouvoir inducteur des cellules blastoporales disparalt en m&me temps que le RNA nucleaire, semblent indiquer que l&ape initiale dans la synthese de l’inducteur doit etre la copie, sous forme dun polyribonucleotide, dun site chromosomique specifique. Les effets morphostatiques que nous avons reconnus a l’actinomytine apportent des arguments en faveur de l’idke que le systitme de
EFFETS
DE
L’ACTINOMYCINE
455
transcription de l’information genetique joue un role directeur dans les phenomenes de differentiation. Mais de nombreuses verifications seront necessaires avant que l’on puisse etre sOr que, dans les cellules embryonnaires, l’actinomycine affecte de man&e specifique la synthese du RNA d&pendant du DNA. RESUME
L’action de l’actinomycine D sur l’induction neurale a et6 etudiee chez le pleurodele par la technique du sandwich. L’actinomycine est connue comme une substance capable d’arreter la synthese du RNA d&pendant du DNA. En quelques minutes de traitement, l’actinomycine abolit la competence de l’ectoderme de jeune gastrula et en 1 a 2 heures supprime 1e pouvoir inducteur de la levre dorsale du blastopore. L’actinomycine arrete egalement la neuralisation de l’ectoderme alors que celle-ci ,est deja engagke et elle fait reprendre au tissu un aspect indifferencie (ectoderme atypique). La signifiation de ces resultats pour le mecanisme du developpement est discutee. SUMMARY
The influence of actinomycin D upon neural induction has been studied in Pleurodeles by means of the sandwich technique. Actinomycin is known to inhibit RNA synthesis by binding to DNA. A few minutes of treatment with actinomycin is sufficient to suppress the competence of early gastrula ectoderm. A treatment of l-2 hours suppresses the inducing power of the blastoporal lip. Actinomycin also stops the neuralization of ectoderm after it has begun and brings the tissue back to an undifferentiated stage (atypical ectoderm). The significance of these results for the mechanism of development is discussed. Ce travail a Bt& rendu 016-61-10 ABIB), auquel
possible grace & I’aide financiere de 1’Euratom now adressons nos vifs remerciements.
(contrat
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EFFETS
DE
L’ACTINOMYCINE
457
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Effets
BIOLOGY,
de
9,
435457
( 196‘t)
I’actinomycine
sur
le d&eloppement
embryonnaire par I’actinomycine I. Etude morphologique : suppression de la comp6tence de I’ectoderme et du pouvoir inducteur de la levre blastoporale H. DENIS’ Laboratoire de Morphologic Faculte’ des Sciences de l’Uniue-r& Belgique
animale, libre de Bruxelles,
Accept6 le 29 januier 1964 INTRODUCTION
Des arguments de plus en plus nombreux permettent de croire que le systeme de traduction des messageshereditaires mis en evidence chez les batteries intervient egalement dans les phenomenes de differenciation. Pour eprouver cette hypothdse, les agents capables d’interrompre, en un point quelconque, la chaine de transcription des messagesgenetiques sont d’un precieux secours. 11 existe une famille de substances, les actinomycines, qui prksentent la proprikte remarquable de se fixer sur le DNA et d’empdcher ainsi la synthese du RNA messager et, partant, des proteines. Ce mode d’action de l’actinomycine a Cte observe tant chez les organismes simples (Kirk, 1960; Harbers et Mueller, 1962) que dans les cellules de mammifere (Goldstein et ~011.1960; Goldberg et Rabinowitz, 1962; Perry, 1963). L’actinomycine apparait done comme un agent capable de priver les cellules de l’information genetique contenue dans leur noyau. De premieres experiences (Brachet et Denis, 1963) ont montre que l’actinomycine D inhibe, chez les embryons de pleurodele, la diffkrenciation du systkme nerveux. De jeunes larves ont ktk obtenues, ou la chorde et les somites etaient recouverts, non pas dun tube neural, ’ Chargk de recherches du FNRS. phologie animale, Institut Ed. Van : Carnegie Institution Adresse actuelle ology, 115 West University Parkway,
Adresse permanente Beneden, Universitk of Washington, Baltimore, Maryland. 435
: laboratoire de Morde LiBge, Belgique. Department of Embry-
436
H.
DENIS
mais
d’ectoderme atypique. L’interdt de ces observations nous a a etudier en detail l’influence de l’actinomycine sur la differenciation nerveuse. L’absence de systeme nerveux, dans les embryons se developpant en presence d’actinomycine, pourrait &tre due a l’action de l’antibiotique soit sur le tissu inducteur (suppression du pouvoir inducteur du toit de Yarchenteron), soit sur le tissu induit (suppression de la competence de l’ectoderme), soit encore sur les deux tissus a la fois. Pour decider entre ces trois possibilites, seule la technique du “sandwich” 6tait applicable. Elle permet, en effet, de traiter de faGon independante le tissu inducteur et le tissu induit. C’est cette technique qui a Bte employee dans le present travail. poussh
MATERIEL
ET
METHODES
Toutes les experiences ont Cte effect&es sur l’urodele Pleurodeles w&ii. Les “sandwiches” sont constitues de 3 fragments de tissu fournis par 3 embryons de m&me stade (8 a-b suivant Gallien et Durocher, 1957). Deux lambeaux car&s d’ectoderme presomptif, provenant de la calotte animale de jeunes gastrulas, forment l’enveloppe du sandwich. Entre ces deux fragments, on place le tissu inducteur prelevk sur la levre dorsale du blastopore. Les operations ont et& rkalisees en conditions steriles dans du milieu de Niu et Twitty (1953). Les explantats ont et6 cultives sur fond d’agar a 1%20°C pendant 4 jours au maximum, puis fixes au Zenker, coupes a 10~ et color-es A l’Unna. Quelques series ont et6 color&es alternativement a l’Unna et au Feulgen. L’actinomycine D employee provenait dun don gitnereux de la firme Merck, Sharp et Dohme, B laquelle nous adressons nos vifs remerciements. Toutes les solutions d’actinomycine ont tttk gardees autant que possible a l’obscurite. RESULTATS
P&s de 300 sandwiches ont et6 mis en culture, types d’experience differents. Premidre exphrience : influence ation des sandwiches cultive’s Denis, 1963)
de l’actinonycine tout entiers ohs
se repartissant
en 4
sur la di~~rencil’antibiotique (cf.
Les sandwiches, form& de tissus intacts (non trait&), sont places dans l’actinomycine apres cicatrisation parfaite (2-4 heures ) . 11s sont cultives dans l’antibiotique pendant plusieurs jours. Dans une pre-
EFFETS
DE
437
L’ACTINOMYCINE
miere serie (tableau l), la dose d’actinomycine varie de 0,6 A 10 pg par millilitre. Dans une seconde serie (tableau 2), la dose d’actinomycine demeure inchangde, mais la duree de culture varie de 1 A 4 jours. TABLEAU INFLUENCE
DE
LA
CONCENTRATION
DE DES
I
L'.4cTrNO~ycIivE
SUR
DiffCrenciation (4 jours Nombre d’exp6riences
11 4 4 3 9 5
Dose
d’actinomycine (dml) 0
0,s 1,25 2,5 5 10
LA
DIFF%RENcIATI~N
S.'.NDWICHES
Tissu nerveux nbondant
de l’ectoderme de culture)
Tissu nerveux peu abondant
4
0 0
3
1
1 1 0
2 5 0
11
Tiss;b;;;eu
0
0 0 0 3 5
Le tableau 1 d&it la differentiation observee dans les explantats trait&s pendant 4 jours par des doses croissantes d’actinomycine. Tous les explantats-temoins contiennent des tubes nerveux bien caracterisks (fig. 1). 11 en va de m&me pour les sandwiches cultives dans de I’actinomycine a 0,6 pg/ml (fig. 2). L es explantats soumis B des concentrations d’actinomycine de I,25 a 2,5 pg/ml fournissent plus rarement des structures neurales bien differencikes. Les cas ou les sandwiches ne contiennent que des formations nerveuses ma1 form&es ou m&me aucune trace de tissu nerveux deviennent de plus en plus frequents. Lorsque la concentration d’actinomycine atteint 10 pg/ml, la differentiation nerveuse est totalement abolie : les sandwiches (fig. 3) sont form& dun tissu compact et depourvu de structure. Les noyaux se colorent t&s peu par le melange dUnna et ils ne presentent pas de nucleoles visibles. Si on suit de jour en jour l’evolution interne des sandwiches cultives dans de l’actinomycine a 10 pg/ml (tableau 2), on n’aperqoit durant les 72 premieres heures de culture aucune difference morphologique importante entre les explantats-temoins et les explantats trait& A l’actinomycine. Toutefois, l’etude cytologique fait apparaPtre une difference croissante entre les sandwiches-t&moms et les sandwiches trait&, a mesure que la culture se prolonge. Deja apres 24 heures, un retard dans les mitoses se manifeste dans les explantats
FIG. 1. Sandwich form6 d’ectoderme prksomptif de jeune gastrula et dune l&e dorsale de blastopore. Culture pendant 4 jours dam du milieu de Niu et Twitty normal. L’enveloppe de l’explantat s’est differenciee en ectoderme atypique (partie infkieure) et en tissu nerveux. Grossissement : X70. FIG. 2. Sandwich form& d’ectoderme presomptif de jeune gastrula et dune l&e dorsale de blastopore. Culture pendant 4 jours dans de l’actinomycine A la concentration de 0,6 pg/ml. Deux tubes nerveux sont visibles dans la partie gauche de l’explantat. La partie droite renferme un amas de tissu d’origine mkodermique. 438
EFFETS
DE
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L’ACTINOMYCINE
FIG. 3. Sandwich form& d’ectoderme pksomptif de jeune gastrula et d’une kvre dorsale de blastopore. Culture pendant 4 jours dans de I’actinomycine Q la concentration de 10 ag/ml. L’explantat prkente un aspect non organis& Noyaux extrkmement peu color& A 1’Unna. TABLEAU INFLUENCE
Nombre d’enp&iences
DE LA DURI?E DE TRAITEMENT~ DIFFkRENCIATION Durh de traitement ou de culture (jours)
2 L'ACTINOMYCII~E DES SANDWICHES Diff&enciation
Pas de tissu nerveux
Plaques W3ll%kS
(10 ~~/~I)suRLA
de l’ectoderme Gouttihres neurales
Tubes IlSVe”X
Thmoins 3 7 2 11
1 2 3 4
3Q 0 0 0
0 7 0 0
0 0 2 0
0 0 0 11
Trait& 3 6 3 5
1 2 3 4
3a 0 0 5
0 6 0 0
0 0 3 0
0 0 0 0
a Pas encore
d’induction.
soumis A l’actinomycine; celle des nucl&oles est dance s’accentue apr& qui apparaissent apr&s
la colorabilitk des noyaux A l’Unna et surtout rbduite par rapport aux tkmoins. Cette ten2 et 3 jours de culture. Les gouttikres neurales 72 heures de sejour dans l’actinomycine (fig.
440
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DENIS
FIG. 4. Sandwich form6 d’ectoderme pr&omptif de jeune gastrula et d’une Bvre dorsale de blastopore. Culture pendant 3 jours dans de l’actinomycine A la concentration de 10 ag/ml. Une gouttike neurale en train de se fermer est visible dans la partie droite de l’explantat. Noyaux peu color& B l’Unna. FIG. 5. Sandwich form6 d’ectoderme pr&omptif de jeune gastrula et d’une l&vre dorsale de blastopore. Culture pendant 3 jours en milieu normal. Une goutti&e neurale en train de se fermer est visible dans la partie infkrieure de l’explantat. Noter la coloration intense des noyaux Q l’Unna, qui contraste avec la p%leur des noyaux trait&s A l’actinomycine (fig. 4).
EFFETS
DE
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L’ACTINOMYCINE
4) sont form&es de cellules a noyaux t&s phles, dont beaucoup n’ont plus de nu&oles visibles. Les formations nerveuses qui garnissent les explantats cultiv& en milieu normal (fig. 5) prksentent des noyaux fortement color& g l’Unna et pourvus de nuclkoles bien apparents. ,Cowlusion C’est done seulement au tours de la quatrikme journke de culture qu’une diffdrence morphologiyue decisive apparait entre les sandwithes-tkmoins et les sandwiches trait& g l’actinomycine. Toutes les structures nerveuses qui s’ktaient form&es durant les 3 premiers jours disparaissent dans les explantats cultivits en prdsence de l’antibiotique pour faire place B un tissu compact analogue B l’ectoderme atypique. Cette transformation fait suite B une perte progressive du RNA nuckaire. La disparition des structures nerveuses ne rksulte apparemment pas d’une mort lente des cellules. En effet, aprk 4 jours de culture dans l’actinomycine, les cellules adhkkent encore fermement les unes aux autres et ne montrent pas le moindre signe de pycnose. Seule la faible colorabilitk des noyaux distingue le tissu trait6 6 l’actinomycine de l’ectoderme atypique banal. DeuxiGme expe’rience : influence de l’ectoderme
de t’actinonycine
SW la compe’tence
De l’ectoderme compktent de jeune gastrula est trait6 pendant un temps variable B l’actinomycine 10 pg/ml. 11 est ensuite soumis d l’action inductrice d’une litvre blastoporale intacte. Les rksultats de ce type d’expkrience sont r&urn& dans le tableau 3. INFL~ENcE
DE
TABLEAU (10 pg/ml)
3 SUR
9 4 4 8 5 4 18 23
6h 3 h 1 h 30 45 min 22 min 11 min 5 min 2 min 30 en voie
de d&agAgation.
LA
COMPBTENCE Diffhenciation
Dur6.e de trsitement de l’ectoderme
Nombre d’exp&irnces
a Tissu
L'scTI~OMYCINE
Tissrl
1 1
1 1-2 l-2 1 2-3 2-3
nerveux present
DE
L'ECTODERME de I’ectcderme Tissu
nerveux absent
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Les traitements d’une durke comprise entre 6 heures et 45 minutes fournissent des rksultats pratiquement identiques : les explantats se d&sag&gent, en g&-&al, aprks 24 heures de culture, saris que la duke du traitement ait une influence nette sur la dur&e de survie.
FIG. 6. Sandwich form& d’ectoderme prksomptif trait6 pendant 1 heure 30 minutes Q I’actinomycine (10 fig/ml) et d’une kvre blastoporale intacte. Culture 28 heures en milieu normal. L’explantat est en voie de dksagr6gation et des cellules d6jl dktachhes sont visibles dans la partie droite du sandwich. Noyaux pas du tout color& A l’Unna. Le groupe de noyaux plus apparents visibles vers le centre de l’explantat provient de la kvre blastoporale (non trait&e).
La figure 6 offre un exemple typique de l’6tat des sandwiches un jour ap&s leur mise en culture. L’explantat se compose essentiellement de cellules dktachkes ou en train de se dktacher les unes des autres. Leur noyau est si peu colorit A HJnna qu’il est pratiquement invisible. Les quelques noyaux plus apparents, situ& vers le centre du sandwich, sont d’origine mksodermique. La figure 7 est une vue du mGme explantat color& au Feulgen. Les noyaux d’origine ectodermique (partie droite et gauche du sandwich) sont plus clairs que les noyaux mtkodermiques, qui occupent le centre de l’explantat. Sur une vue B plus fort grossissement (fig. 8)) cinq noyaux provenant de la kvre dorsale du blastopore (partie infdrieure gauche de la photo) tranchent par leur coloration plus intense sur les autres noyaux, qui sont d’origine ectodermique. 11 convient de noter l’aspect turgescent des noyaux trait& B l’actinomycine ainsi que la structure
EFFETS
DE
L’ACTINOMYCISE
443
FIG. 7. M&me sandwich que sur la figure 6, mais colori: au Feulgen. Les noyaux les plus pales, visibles dans les parties gauche et droite de l’explantat, sont d’origine ectodermique. Les noyaux mieux color& visibles au centre proviennent de la levre blastoporale (tissu non trait&).
FIG. 8. M&me coupe que sur la figure 7, mais vue a fort grossissement ( x 540). La limite entre le tissu ectodermique (traite) et le tissu mesodermique (non trait&) passe en oblique du dessus a gauche au dessous B droite de la photographie. Les noyaux provenant de la kvre blastoporale (partie gauche) sont beaucoup mieux color& que les noyaux d’origine ectodennique. Noter l’aspect turgescent de ceux-ci et l’aspect fortement &icuE de la chromatine.
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fortement rkticulee de leur chromatine. Retenons encore un a&t des mitoses : en fait foi le nombre relativement restreint de cellules par sandwich. Le traitement de l’ectoderme pendant une duree de 11 Q 22 minutes provoque une desagregation du sandwich tout aussi rapide qu’un traitement de duke plus longue. Toutefois, le nombre de cellules par explantat est plus ,eleve, ce qui indique un arret moins prkcoce des mitoses. Les noyaux d’origine ectodermique (trait&) prksentent une coloration au Feulgen aussi intense que les noyaux mesodermiques (trait&). Mais la teneur des cellules en RNA nucleaire demeure trks faible, comme le prouve l’extreme paleur des noyaux apres une coloration a 1’Unna. Si l’ectoderme est trait& pendant 5 minutes a l’actinomycine avant dike mis en sandwich, il peut survivre pendant 2 a 3 jours. Apres 48 heures de culture, la plupart des cellules sont en bon &tat. Seule une petite quantite d’entre elles s’est detach&e et rassemblee dans la cavite du sandwich. Sur 6 explantats fixes apres 2 jours de culture, l’ectoderme a forme une plaque medullaire de petites dimensions dans un seul cas. Dans les 12 cas oh la culture a et& prolong&e pendant 3 jours, une neuralisation partielle de l’ectoderme a kte observee 3 fois. Parmi les 9 sandwiches restants, 3 etaient en cytolyse partielle et 6 en cytolyse avancee. Quand le traitement de l’ectoderme est reduit a 2 minutes 30 secondes, P&tat des cellules demeure excellent aprks 48 heures de culture. Trois sur 14 sandwiches fixes apres 2 jours prksentent un Bpaississement local de l’ectoderme, qui est peut-etre une plaque neurale en train de se dessiner. Les 11 autres explantats ont un aspect analogue a celui que montre la figure 9. Les parois du sandwich sont d’epaisseur uniforme et ne manifestent aucune tendance a former de plaque medullaire. Les noyaux des cellules ectodermiques sont plus gros et plus pales que ceux des sandwiches-temoins (fig. lo), qui montrent des signes kvidents de neuralisation. Sur les 9 sandwiches qui ont et& maintenus en culture pendant 3 jours, un seul contenait un tube nerveux de petites dimensions. Les 8 autres explantats etaient form& d’ectoderme atypique (fig. 11). Parmi ces derniers, 5 Ctaient en &at de cytolyse assez avancee. Conclusion Le traitement pg/ml) pendant
de l’ectoderme competent par l’actinomycine (10 une duree &gale ou superieure a 11 minutes entrame
EFFETS
DE
L’ACTINOMYCINE
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FIG. 9. Sandwich forme d’ectoderme presomptif trait& pendant 2 minutes 30 secondes a l’actinomycine (10 pg/ml) et d’une Evre blastoporale intacte. Culture pendant 2 jours en milieu normal. Aucune trace de neurulation dans les parois du sandwich. Noyaux d’origine ectodermique peu colorb B I’Unna. FIG. 10. Sandwich form6 de tissus intacts, cultivk pendant 2 jours en milieu normal. Une plaque mkdullaire est visible dam la partie droite de l’explantat. Noyaux bien color& a 1’Unna.
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FIG. 11. Sandwich form6 d’ectoderme presomptif trait6 pendant 2 minutes 30 secondes B l’actinomycine (10 fig/ml) et dune levre blastoporale intacte. Culture 3 jours en milieu normal. L’enveloppe du sandwich a form6 un tissu compact depourvu de toute organisation. FIG. 12. Sandwich forme d’ectoderme presomptif intact et dune levre blastoporale traitee pendant 45 minutes ?I l’actinomycine ( 10 rg/ml). Culture 3 jours en milieu normal. L’enveloppe du sandwich a form& un tissu compact d6pourvu d’organisation.
EFFETS
DE
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L’ACTINOMYC~NE
une desagregation rapide du tissu. Celle-ci s’accompagne dune dispa&ion presque totale du RNA nucleaire. Un sejour de 2 minutes 30 secondes dans I’actinomycine permet a l’ectoderme de survivre pendant 2 a 3 jours mais empeche I’induction neurale dans 80% des cas. En d’autres mots, l’actinomycine supprime la compktence de l’ectoderme. Troi&me expe’rience : influence inducteur de la ldvre bhtoporale
de l’actinomycine
PUT le pouvoir
La lkvre dorsale du blastopore est trait&e a l’actinomycine &ml), puis placee entre deux fragments d’ectoderme intact. tableau 4 resume les resultats de ce type d’experience.
INFLUENCE
DE
TABLEAU (10 &‘/Id)
L’ACTINOMYCINE LlbRE
Nombre d’exp&iences
Dur6e de trsitenent de la. I&vre blastoporale
6 6 4 3 10 4 12 4 3
24 h 6h 3h 1 h 30 45 min 22 min 11 min 5 min 0
Q Tissu
en mauvais
(10 Le
4 SUR
LE
POUVOIR
INDUCTEUR
DE
LA
BLASTOPORALE
2 3 2 4 2-3 2-3 2-4 4 4
6a 6” 40 30 9 2 4 0 0
&at.
Un traitement de longue duree (24 hem-es-6 heures) entralne, apres 2 a 3 jours de culture, une cytolyse complete du tissu mdsodermique et une cytolyse partielle du tissu ectodermique. Si la levre blastoporale est trait&e pendant 3 heures ou 1 heure 30 minutes par l’antibiotique, seule une partie de ses cellules est cytolysee aprb 2 B 4 jours. Le reste du tissu implant6 se compose de cellules a noyaux extremement pales, qui ont perdu la plus grande partie de leur RNA nucleaire. L’enveloppe du sandwich a forme un tissu compact, a cellules nombreuses, mais cl’oh toute trace d’organisation est absente.
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Parmi les 10 cas ou le tissu inducteur avait subi un traitement de 45 minutes a l’actinomycine, l’ectoderme s’est neuralise dans un cas seulement; il est demeure saris organisation dans les 9 autres cas (fig. 12). Si la d uree du traitement est progressivement reduite a 22 minutes, puis a 11 minutes et enfin a 5 minutes, la frequence des neurulations augmente de faGon reguliere : elle passe de 56% des cas apres 22 minutes de traitement a 66% apres 11 minutes et a 100% aprbs 5 minutes. Cette evolution s’accompagne dune amelioration progressive de l’etat du tissu inducteur : la proportion de cellules lysees diminue lorsque le traitement a l’actinomycine devient plus court. 11 existe une correlation nette entre l’aspect des cellules mesodermiques et la differentiation observee dans l’ectoderme : dans les cas ou celui-ci a formit du tissu nerveux, les cellules mbodermiques presentent une coloration a 1’Unna d’intensite normale et elles se differencient en chorde, somites et mesenchyme, si la culture est de duke suffisante (4 jours ) . Chaque fois que l’ectoderme ne presente aucune trace de neuralisation, le tissu mesodermique est forme, en majeure partie, de cellules a noyau t&s faiblement color& par le melange dUnna.
FIG. 13. Sandwich form& d’ectoderme blastoporale ayant s’iijourn6 3 heures dans pendant 4 jours en conditions normales. dimensions occupe toute la partie centrale d’origine mkodermique.
pksomptif intact et d’une kvre le milieu de culture normal. Culture Une formation nerveuse de grandes de l’explantat. A son contact, tissu
EFFETS
DE
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L’ACTINOMYCINE
Un sejour de 3 heures dans le milieu de culture normal n’affecte pas le pouvoir inducteur de la kvre dorsale du blastopore (fig. 13). L’absence de tissu nerveux dans les sandwiches apres un traitement de la levre blastoporale a l’actinomycine doit done etre attribuee a l’action de l’antibiotique et non a une eventuelle perte de l’agent inducteur dans le milieu de culture. Conclusion Le traitement de la levre blastoporale par l’actinomycine pendant une duke &gale ou superieure a 1 heure 30 minutes entrame l’absence totale de tissu nerveux dans les sandwiches. Si la duree du traitement est reduite, de moitie en moitie, jusqu’a 5 minutes, la frequence des neurulations augmente regulierement jusqu’a atteindre 100% des cas. Chaque fois que, apres un traitement court, la levre dorsale n’a induit aucune structure nerveuse dans l’ectoderme place a son contact, on observe une modification cytologique profonde des cellules inductrices : leur noyau est t&s faiblement color6 a PUnna. L’abolition du pouvoir inducteur vu done de pair avec une disparition du RNA nuclhaire. Toutefois, le tissu mbodermique trait6 a l’actinomycine pendant 45 minutes ou plus subit une cytolyse plus ou moins complete, qui commence 48 heures apres la mise en culture. La presence de cellules pycnotiques a l’interieur de l’explantat pourrait exercer un effet defavorable sur la differentiation des parois du sandwich. Dans certains cas, elle entraine m&me une cytolyse partielle du tissu ectodermique. L’absence de diff erenciation nerveuse dans les explantats pourrait done dtre due, non pas a la suppression du pouvoir inducteur de la kvre blastoporale, mais a une action inhibitrice des cellules cytolysees. Celle-ci empdcherait l’ectoderme de repondre a un stimulus inducteur recu dans les premieres heures de contact avec le tissu mbodermique. Pour lever cette Bquivoque, un quatrieme type d’experience a et6 entrepris. Quatrikme exphience inducteur de la l&re
: influence blastoporale
de l’actinomycine
sur
le pouvoir
Le kvre dorsale du blastopore trait&e a I’actinomycine est mise en contact avec l’ectoderme competent pendant 45 a 48 heures. Le sandwich est alors ouvert et les cellules mesodermiques sont soig-
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neusement eliminCes a l’aide dune anse de platine. L’explantat est ensuite referme et cultive pendant 1 ou 2 jours. On kvite de la sorte de laisser subsister des cellules en cytolyse ou en precytolyse A l’interieur du sandwich. On sait qu’un contact de duke limit&e (quelques heures) entre l’ectoderme competent et l’organisateur suffit pour permettre A l’induction de se produire (Johnen, 1956; Denis, 1957). Le tableau 5 resume les resultats de ce dernier type d’experience. TABLEAU INFLUENCE
DEL'ACTINOMYCINE
BLASTOPORALE.
5
(~~~~/~~)SURLEPOUVO~RINDUCTEIJRDE
CONTACT
DE
DUR$E LIMIT&E TISSU INDUCTEUR
ENTRE
LAL&VRE L'ECTODERME
ET
LE
Dur6ede traitement de la I&w blastoporale (hams)
Nombre d’exp&iences
9 18 5 15 15 a Cytolyse
0 1 2 3 6 apr&s
Dunk totale de culture (jam)
4 34 3 3 2
9 15 0 0 0
0 3 5 15 15”
48 heures.
Quand la levre dorsale n’a pas et6 trait&e a l’actinomycine (temoin), mais a sejourne pendant 3 heures dans le milieu de culture normal, on observe dans tous les cas une neuralisation de l’ectoderme (fig. 14). Dans 3 cas sur 9, cependant, ce resultat n’a pas de signification car le tissu inducteur n’a pas ktd completement klimink du sandwich : il se retrouve sous forme dun nodule chordal au contact des formations nerveuses. Parmi les 18 cas ou la levre dorsale a Qtk trait&e pendant une heure a I’actinomycine, 10 cas seulement peuvent &tre retenus, aucune trace du tissu inducteur n’ayant Bte retrouvee dans le sandwich. Dans 4 cas sur 10, la differentiation de l’ectoderme n’a pas et6 affect&e par le traitement de la levre blastoporale. Dans 3 autres cas, l’ectoderme n’est que faiblement neural&e et dans les 3 derniers, le sandwich est tout entier forme dun tissu saris organisation. Quand la levre dorsale du blastopore a subi un traitement de 2 heures A l’actinomycine, la differentiation nerveuse de l’ectoderme est totalement abolie. Le meme resultat est obtenu lorsque la levre
EFFETS
DE
L’ACTINOMYCINE
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blastoporaIe est trait&e pendant 3 heures (fig. 15), mais alors Ies parois du sandwich entrent frkquemment en cytolyse avant la fin de la culture. Si le traitement du tissu inducteur est prolong& jusqu’g 6 heures, la cytolyse de l’explantat se gknkralise dbjA aprbs 2 jours.
FIG. 14. Ectoderme presomptif de jeune gastrula cultivi: pendant 45 heures au contact dune levre blastoporale ayant sejournk 3 heures dans le milieu de culture normal. Le tissu inducteur a ensuite 6tB retire du sandwich et l’enveloppe de celui-ci a BtC cultivee 2 jours de plus en milieu normal. Une vesicule nerveuse est visible au centre de l’explantat. FIG. 15. M&me experience que sur la figure 14, mais la kvre blastoporale a &A trait&e pendant 3 heures 21 l’actinomycine ( 10 ag/ml). Duke totale de la culture : 3 jours. L’explantat est tout entier form6 dun tissu compact dkpourvu d’organisation.
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L’ectoderme place au contact dune levre blastoporale trait&e B l’actinomycine pendant 2 a 3 heures differe de l’ectoderme atypique banal par son aspect compact et sa richesse en noyaux (fig. 15). Ceux-ci ont une basophilie normale et leurs nucleoles sont bien visibles. Ceci rend peu probable l’hypothese dune diffusion de l’antibiotique de la levre dorsale a l’ectoderme au tours du contact inducteur.
Conclusion Un skiour de 2 hewes duns l’uctinomycine (10 pg/ml) sufit done pour supprimer complBtement le pouvoir inducteur de la ldvre dorsale du biizstopore. Un traitement plus court ne supprime que partiellement ce pouvoir inducteur. Un traitement plus long provoque cytolyse plus ou moins rapide du tissu induit.
une
DISCUSSION
Les experiences qui viennent d’etre d&rites mettent en evidence une triple action de l’actinomycine : 1. Suppression de la competence de l’ectoderme. Cet effet est deja atteint par un traitement de quelques minutes Q la temperature ordinaire. 2. Suppression du pouvoir inducteur de la l&e dorsale du blastopore. Un traitement de 1 a 2 heures est necessaire pour produire cet effet. 3. Disparition des structures nerveuses deja differenciees. II est logique d’attribuer les effets morphostatiques de l’actinomytine B la faculte qu’elle possede d’inhiber totalement la synthbse du RNA. L’inhibition par l’actinomycine de la polymerase du RNA serait due a une fixation de l’antibiotique sur le DNA, rendant ainsi ce dernier inutilisable pour une transcription des messages genetiques (Kawamata et Imanishi, 1960; Kirk, 1960; Kersten et toll., 1960; Harbers et Mueller, 1962; Goldberg et Rabinowitz, 1962; Goldberg et toll., 1962; Reich et toll., 196213;Shatkin, 1962; Harbers et COIL, 1963). L’actinomycine inhibe aussi, mais dans une mesure beaueoup moindre, la synthese du DNA (Hurwitz et toll., 1962; Reich et toll., 1962a) et elle peut provoquer un arret des mitoses en prophase (Goldstein et toll., 1960). L’actinomycine produirait aussi une depolymkrisation du RNA a marquage rapide (Acs et toll., 1963). Les autres mecanismes cellulaires, en particuher la respiration et la glycolyse, ne semblent
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DE
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pas affect& par l’antibiotique (Kirk, 1960; Reich et toll., 1962b; Davidson et toll., 1963). La plupart des effets attribues a l’actinomycine ont 6te observes dans les cellules embryonnaires. L’inhibition de la synthese du RNA se manifeste par la disparition des nucleoles et par un pllissement prononce du sue nucleaire. Cet effet est produit m&me par les concentrations les plus faibles d’actinomycine et par les temps d’exposition les plus courts (fig. 9). La disparition du RNA nuclkaire n’emp&he pas les mitoses de continuer a un rythme ralenti. Quand le traitement par l’actinomycine est de longue duree, les divisions s’arretent et les cellules entrent en cytolyse. I1 importe de noter que les traitements qui ont produit les effets morphostatiques les plus spectaculaires etaient de courte duree, susceptibles d’affecter plus profondement le metabolisme du RNA que celui du DNA. L’action de l’actinomycine n’est done pas celle d’un antimitotique banal mais celle dun puissant inhibiteur de la synthese du RNA. Quant a la toxicite des traitements prolong& a l’actinomycine, elle pourrait n’etre qu’une consequence de l’action antimitotique exercee par celle-ci : l’observation cytologique des cellules en prkcytolyse (fig. 8) suggere que la pycnose est preckdee d’un blocage des mitoses en pr&prophase. Notons enfin qu’aucune depolymerisation importante du RNA de forme stable n’a Btk observee en presence d’actinomycine : celle-ci n’affecte pas de man&e sensible la basophilie du cytoplasme. Chacun des effets morphostatiques que nous avons reconnus a l’actinomycine exige, pour se manifester, des traitements de duree t&s differente. La competence de l’ectoderme est abolie par une exposition de quelques minutes a l’actinomycine. Par contre, les structures nerveuses deja form&es ne disparaissent qu’apres 72 a 96 heures de sejour dans I’antibiotique. Dans ce dernier cas, un facteur de permeab’l’t11 e’ intervient, qui permet aux explantats de resister pendant plusieurs jours a une concentration relativement klevke d’actinomycine. Rappelons que les sandwiches Ctaient places dans l’actinomycine apres cicatrisation parfaite, si bien que la face interne des cellules, non protegee par le “coat” (Holtfreter, 1943), n’entre jamais en contact avec l’antibiotique. Dans les explantats de ce type, le palissement du sue nucleaire et la disparition des nucleoles ne deviennent complets qu’apres 3 a 4 jours de culture. Par contre, lorsque la face interne de l’ectoderme est exposee a l’antibiotique (deuxieme experience), celui-ci manifeste deja apres 24 heures ses effets sur la
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colorabilite des noyaux. 11 y a done tout lieu de crone que Yantibiotique ne penetre que t&s lentement a l’interieur des sandwiches, une fois que ceux-ci se sont cicatrises. Ceci explique l’influence tardive de l’antibiotique sur l’evolution des explantats. Que la suppression du pouvoir inducteur de la levre blastoporale exige un traitement plus prolong6 que l’abolition de la competence ne signifie pas nkcessairement que ces deux phenomenes sont lies Q un mktabolisme nucleique plus ou moins rapide. La suppression de la competence de l’ectoderme ne se marque que 2 jours apres le traitement a I’actinomycine. En d’autres mots, l’action de l’antibiotique s’exerce a retardement sur la differentiation cellulaire et un traitement kger suffit pour l’inhiber. Par contre, l’abolition du pouvoir inducteur de la levre blastoporale implique la suppression immediate, d&s avant la fin du traitement, de la production de substance inductrice. Or l’antibiotique n’agit qu’assez Ientement sur les mecanismes cellulaires qu’il est cerise inhiber (synthkse du RNA et des proteines : cf. les articles II et III de cette serie). I1 n’est done pas Btonnant qu’un traitement de plusieurs heures soit necessaire pour abolir le pouvoir inducteur des cellules blastoporales. La nature chimique de l’agent responsable de l’induction neurale reste toujours inconnue a l’heure actuelle. Assez recemment, des recherches soigneuses effect&es sur les inducteurs anormaux ont permis d’isoler une fraction nucleoproteique do&e dun pouvoir inducteur Cleve (Yamada, 1961). La partie active du complexe serait la proteine plutot que le RNA (Vahs, 1962). Le fait que l’actinomycine abolit la puissance Bvocatrice de la levre blastoporale n’est pas incompatible avec l’idee dun inducteur de nature proteique. Mais nos resultats plaident plutot en faveur de l’hypothese dun inducteur ribonucleique, proposee par Brachet ( 1942). En effet, si l’actinomycine inhibe la synthese des proteines, elle inhibe plus completement encore celle du RNA (cf. les articles II et III de cette s&e). De toutes faqons, ce que l’on sait du mode d’action de l’actinomycine (fixation sur le DNA) et, d’autre part, l’observation que le pouvoir inducteur des cellules blastoporales disparalt en m&me temps que le RNA nucleaire, semblent indiquer que l&ape initiale dans la synthese de l’inducteur doit etre la copie, sous forme dun polyribonucleotide, dun site chromosomique specifique. Les effets morphostatiques que nous avons reconnus a l’actinomytine apportent des arguments en faveur de l’idke que le systitme de
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DE
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transcription de l’information genetique joue un role directeur dans les phenomenes de differentiation. Mais de nombreuses verifications seront necessaires avant que l’on puisse etre sOr que, dans les cellules embryonnaires, l’actinomycine affecte de man&e specifique la synthese du RNA d&pendant du DNA. RESUME
L’action de l’actinomycine D sur l’induction neurale a et6 etudiee chez le pleurodele par la technique du sandwich. L’actinomycine est connue comme une substance capable d’arreter la synthese du RNA d&pendant du DNA. En quelques minutes de traitement, l’actinomycine abolit la competence de l’ectoderme de jeune gastrula et en 1 a 2 heures supprime 1e pouvoir inducteur de la levre dorsale du blastopore. L’actinomycine arrete egalement la neuralisation de l’ectoderme alors que celle-ci ,est deja engagke et elle fait reprendre au tissu un aspect indifferencie (ectoderme atypique). La signifiation de ces resultats pour le mecanisme du developpement est discutee. SUMMARY
The influence of actinomycin D upon neural induction has been studied in Pleurodeles by means of the sandwich technique. Actinomycin is known to inhibit RNA synthesis by binding to DNA. A few minutes of treatment with actinomycin is sufficient to suppress the competence of early gastrula ectoderm. A treatment of l-2 hours suppresses the inducing power of the blastoporal lip. Actinomycin also stops the neuralization of ectoderm after it has begun and brings the tissue back to an undifferentiated stage (atypical ectoderm). The significance of these results for the mechanism of development is discussed. Ce travail a Bt& rendu 016-61-10 ABIB), auquel
possible grace & I’aide financiere de 1’Euratom now adressons nos vifs remerciements.
(contrat
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