Effects de l'actinomycine sur le développement embryonnaire

DEVELOPMENTAL

BIOLOGY,

Effets

de

9, 473483

( 1964)

I’actinomycine

sur le dhveloppement

embryonnaire III. Etude

biochimique : influence de I’actinomycine sur la synth&se des prot&nes H. DENIS’

Laboratoire de Morphologie de l’llniversite’ libre

a&male, Faculte’ des Sciences de Brurelles, Belgique

Accept& le 29 janvier 1964 INTRODUCTION

L’influence inhibitrice exercke par l’actinomycine sur la synth&se du RNA devrait se rkpercuter sur la synth&se protkique et supprimer cette derni&re dans un dklai plus ou moins court. Nous avons recherchk dans quelle mesure et avec quel retard le blocage du DNA par I’actinomycine inhibe la synthke protkique chez les embryons de pleurod&le. La rapidit& de l’inhibition produite par cet antibiotique devrait nous renseigner sur l’importance du contr6le exerc6 par les noyaux embryonnaires sur la synthbse des protkines. MATERIEL

ET

METHODES

L’action de l’actinomycine sur la synthkse protkique a 6tk suivie dans plusieurs tissus embryonnaires du pleurodkle et B plusieurs stades du dkveloppement : --nu stade 6 (blastula) : ectoderme prCsomptif; -au stade 8-9 (jeune gastrula) : (1) ectoderme pksomptif, (2) lbvre dorsale du blastopore, (3) endoderme prbomptif; -UU stude 15 (jeune neurula) : (1) plaque neurale + toit de l’archenteron, (2) endoderme; -au stade 22 (neurula avancke) : (1) tube neural + axe chordo-somitique, (2) endoderme. Comme pour 1’Btude autoradiographique, I’impermkabilitC des ’ ChargB de recherches Morphologie animale, Institut Adresse actuelle : Carnegie bryology, II5 West University

du FNRS. Ed. Van Institution Parkway,

de Adresse permanente : laboratoire Beneden, Universitk de LiBge, Belgique. of Wqshington, Department of EmBaltimore, Maryland. 473

474

H.

DENIS

oeufs entiers vis-a-vis des traceurs nous a oblige a travailler en explantat. Pour chaque experience, 40 embryons du m&me stade sont necessaires. Ces embryons sont disskques stkrilement de man&e a fournir 40 fragments de tissu identiques. De ces 40 fragments, 20 sont cultives dans du milieu de Niu et Twitty normal (temoins). Les 20 autres sont places dans la meme solution addition&e d’actinomytine a la concentration de 10 &g/ml (trait&). Ces 2 lots sont euxmemes partages en 4 groupes de 5 explantats, qui reqoivent chacun un “pulse” de dl-leucine tritiee (20 &/ml; activitk specifique : 107 millicuries par millimole) dune duree de 3 heures. Ces “pulses” sont don&s 0, 5, 14, et 21 heures apres le debut de la mise en culture. A la fin de chaque “pulse”, les 5 fragments trait& et les 5 temoins sont la&s 3 fois dans un grand exe&s de solution isotonique (NaCl 0,65%, ajuste a pH 7 par un tampon tris-maleate), puis p&eves dans 0,2 ml de cette m&me solution. Les echantillons sont immediatement congeles a -20°C et gardes a cette temperature jusqu’a la fin de l’experience. Tous les echantillons dune meme experience sont ramenes simultanement a la temperature ordinaire, homogeneises et centrifuges pendant 5 minutes a 12.500 g. Le surnageant fourni par chaque Bchantillon est applique sur une rondelle de papier Whatman no 3 MM (diametre : 2,4 cm). Le culot est ensuite resuspendu dans 0,2 ml de NaCl 0,65% et centrifuge de nouveau. Le second surnageant est egalement applique sur la rondelle de papier et l’operation est renouvelee une troisieme fois. Le dernier culot est conserve a -20°C; il servira pour le dosage des proteines. Les rondelles de papier portant les extraits de tissus embryonnaires sont traitees suivant la technique de Mans et Novelli ( 1961)) qui consiste a eliminer successivement l’acide amine non incorpore, les acides nuclkiques et les lipides, pour ne garder finalement que les proteines sur la matrice cellulosique. Le traitement comporte les &apes suivantes : (1.) sechage rapide a l’air chaud; (2) fixation a l’acide trichloracetique ( TCA ) 10% addition& de dl-leucine-C” 0,l M : une nuit; (3) lavage au TCA 5% : 15 minutes; (4) extraction au TCA 5% chaud (90°C) : 30 minutes; (5) lavage au TCA 5% froid; (6) extraction a l’alcool-ether tilde (37°C) : 30 minutes; (7) lavage a l’alcool-ether froid; (8) lavage a l’ether pur : 15 minutes; (9) skchage a l’air. La radioactivite des rondelles de papier est alors mesuree au moyen dun appareil a scintillation liquide (Nuclear, Chicago). Les “blancs” consistent, dune part, en des rondelles de papier Whatman non

EFFETS

DE

475

L’ACTINOMYCINE

chargkes d’extrait et, d’autre part, en des rondelles chargkes de 10 ~1 de la solution d’incorporation ( leucine-H3, 20 &/ml). Les “blancs” de l’un et l’autre type sont soumis a la m&me suite de traitements que les rondelles exp&imentales. La radioactivitk obtenue en coups par minute doit &tre ramenke B une quantiti: connue de protkine. En effet, la taille des fragments de tissu prklevks par micro-dissection n’est pas nkessairement la m&me dans les skries-tkmoins et dans les skries traitites. Nous avons mesurk au moyen du rkactif de Folin (Lowry et toll., 1951) la quantit6 de tyrosine obtenue par hydrolyse alcaline B partir des culots de centrifugation. La couleur dkveloppke est comparhe a celle que donne un &talon de tyrosine. Durant la pdriode de dkveloppement ktudike, la plus grande partie des protkines insolubles est form&e par du vitellus. Or celui-ci n’est rksorbk que t&s lentement pendant la pkriode de l’ontogknke qui nous concerne (Denis, 1961). D’autre part, il est peu vraisemblable que le traitement a I’actinomycine affecte d’une man&e quelconque la richesse des cellules en vitellus, ainsi que la composition en acides aminks de celui-ci. La quantiti: de vitellus constitue done une rhfkrence stable pour l’estimation de la quantitk de tissu pr6levC: dans les skries-tkmoins et dans les skries trait&es. Cette rkfkrence n’est kvidemment valable que pour la comparaison de tissus de mGme origine (dorsale ou ventrale), done ‘Bgalement riches en vitellus. La radioactivitk brute de chaque kchantillon doit subir 2 corrections successives. I1 faut d’abord lui soustraire le nombre moyen de coups fournis par les “blancs”. La radioactivitk de ceux-ci (40-60 coup par rondelle) ne diff&re pas de manikrc sensible suivant qu’ils ont s&t& ou non chargks d’acide amini: marqu6. Le nombre net de coups obtenu par kchantillon est ensuite ramenk B une m&me quantitk de protkine (100 pg de tyrosine dans le culot). L’incorporation, dans les tissus trait&s ?3 l’actinomycine, est exprimke en pourcentage du nombre de coups fournis par les tkmoins. Chaque rksultat est la moyenne de 2 sCries indkpendantes de mesures. Certaines expkriences ont kt6 r&p&t&es en triple, en quadruple et m&me en quintuple. RESULTATS

A. E#et de Pactinomycin’e

SUT Ia synthdse

Malgrk une forte dispersion tine inhibe progressivement

prote’ique

au stade blast&

des rksultats, il apparait que l’actinomyl’incorporation de la leucine-H3 dans

476

H.

DENIS

.

% 100

timoin .

60

0 60 traiti

/___ LO 20

I

0 0

3

s

6

14

I7

21

24 heurcs

Ectoderme presomptif de blastula (stade 6). Influence de l’actinomytine (10 &ml) sur l’incorporation de la leucine-Ha dans les proteines solubles. En abscisse : duke du traitement a l’actinomycine (24 heures au maximum). La duke des “pulses” de leucine tritiee (20 &/ml) est indiquee par un renforcement de la ligne de base. L’incorporation dans les tissus trait& est exprimee en pourcentage du nombre de coups par rapport aux temoins (le tout ramen&. a 100 fig de tyrosine dans le culot). FIG.

1.

les protdines solubles (fig. 1) . L’inhibition heures de traitement, mais elle est de l’ordre 24 heures. B. Efet de l’actinomycine gaztrulu

sur la synthdse

semble nulle jusqu’a 8 de 30 A 40% au bout de prote’ique

au stade jeun.e

La figure 2 montre un exemple typique de l’inhibition exercee par l’actinomycine sur l’incorporation de la leucine dans les proteines au stade jeune gastrula. Dans la lbvre dorsale du blastopore et dans l’endoderme, l’antibiotique reduit de 40% en 24 heures la synthese des protkines solubles. L’inhibition semble moins rapide dans l’ectoderme presomptif. Cependant, &ant donne la dispersion des resultats, la comparaison entre les effets de l’actinomycine sur les divers tissus de la jeune gastrula n’a aucune signification. C. Effet de Pactinomycine neurula

sur la sytih2s.e

protkique

au stade jeune

L’influence inhibitrice exercee par l’actinomycine sur la synthese proteique est plus rapide au stade 15 qu’aux stades 6 et 8-9. Ceci vaut autant pour les tissus dorsaux que pour les tissus ventraux (fig. 3). En 24 heures, l’antibiotique reduit de 75% l’incorporation de la leucine tritiee dans les proteines solubles,

EFFETS

DE

D. Efet de l’actinomycine avance’e

477

L’ACTINOMYCINE

SW la synthdse

prote’ique

au stade new&a

Beaucoup d’explantats form& du tube neural et de l’axe chordosomitique de la neurula avancee se recouvrent rapidement d’ttpiderme. Dans ces conditions, la penetration du traceur devient tres aleatoire. De fait, certains explantats incorporent une quantite notable de leucine tritiee, tandis que certains autres sont A peine marques. 11 est, par consequent, impossible de comparer, dans les tissus dorsaux, l’incorporation de la leucine-H3 en presence et en l’absence d’actinomytine. Dans le tissu endodermique, par contre, les resultats sont plus rCgu-

'I. 100

timoin

80 60

trait6

40 20

I 0

0

FIG. 2. tinomycine

3

5

a

LBvre blastoporale SW l’incorporation

14

17

21

de jeune gastrula (stade de la leucine tritike dans

24 hwms

8-9). Influence de l’acles protkines solubles.

a0 60

FIG. 3. figure

1.

Endoderme

de jeune

neurula

(stade

15).

M&me

lmhgende

que

pour

la

478

H.

DENIS

'1. 100 60

60 40 20

0

traiti I 0

3

5

coups/min/100~g

14

a

FIG. 4. Endoderme la figure 1.

de neurula

achevee

(stade

17

22).

21

M&me

24 heures

legende

que

pour

tyrosine

2000

1500

1000

500

0 6

5.

a

15

22

stades

R&urn& des resultats pour les tissus ecto-mesodermiques (ectoderme pr&omptif + Mvre dorsale du blastopore; plaque neurale + toit de l’archenteron; tube nerveux + axe chordo-somitique). Incorporation de la leucine-H3 dans les prot&nes solubles apres 24 heures de sejour, soit dans le milieu de culture normal, soit en pr&ence d’actinomycine ( 10 fig/ml). Le dernier point de la FIG.

KYPETS

DE

479

L’ACTINOMYCINE

liers et l’actinomycine exerce, sur la synthkse protkique, une inhibition plus rapide encore qu’au stade 15 (fig. 4). Au bout de 24 heures de contact avec l’antibiotique, l’incorporation de la leucine-H3 dans les protkines solubles n’atteint plus que le cinquikme du niveau observk chez les tkmoins. Les figures 5 et 6 rksument les rksultats et montrent l’influence exerc&e par un traitement de 24 heures g l’actinomycine sur l’incorporation de leucine tritiee dans les protkines solubles. L’effet observk sur le tissu ecto-mksodermique et sur le tissu endodermique est indiquk coupslmin/lOOyg

tyrosinc

1500 t

1000

_.

500

0

1

. 6

0

15

22

stades

FIG. 6. R&urn& des rksultats pour le tissu endodermique. Inhibition exe&e sur l’incorporation de la leucine tritike dans les protkines solubles par un skjour de 24 heures dans l’actinomycine ( 10 @g/ml).

skparkment. 11 faut noter que, dans l’ecto-mksoderme, la synth&se des protkines ne devient importante qu’8 partir du dhbut de la gastrulation. Dans l’endoderme, l’incorporation de la leucine n’atteint des valeurs 6levkes que vers la fin de la neurulation. Dans un tissu comme dans l’autre, l’action inhibitrice de l’actinomycine cro^lt r6gulGrement ligne infkrieure (pointillk) n’est pas une mesure Selle, mais une extrapolation obtenue A partir du niveau d’incorporation dans le t6moin en se basant sur pourcentage d’inhibition observe dans le tissu endodermique.

le

480

H.

DENIS

TABLEAU INHIBITION

EXERC~E

APRI&

L'INCORPORATION

24 DE

HEURES LA

1 PAR

LEUCINE-H3

L'ACTINOMYCINE DANS

LES

Stade

% Inhibition (rkwltats moyens pour tous les tissus)

F 8-9 15 22

24,3 33,G 64,3 72,2

au cours de l’ontogenese. Le tableau 1 montre cette inhibition entre les stades 6 et 22. E. Influence

de l’actinowycine

(~O~G/ML)

SUR

PROTfiINES

bien les progres

de

sur la permbaabilite’ cellulaire

Dans le systeme que nous avons utilise, le precurseur marque doit franchir la barriere des membranes cellulaires avant de pouvoir s’incorporer dans les protdines. Toute reduction de la radioactivite pourrait done &tre attribuee autant a une influence de l’antibiotique sur la permeabilite cellulaire qu’a un effet sur la synthese protkique ellem&me. L’action de l’actinomycine sur la penetration du traceur dans les cellules embryonnaires a Bte etudiee de la faGon suivante. Un groupe de 5 fragments d’endoderme (stade 22) est mis au contact de leucineH3 (20 &/ml) durant 24 heures. Un autre groupe, preleve dans les memes conditions, est cultive pendant la m&me periode en presence du traceur et d’actinomycine (10 pug/ml). Chaque serie d’explantats est la&e 3 fois pendant 5 minutes dans 10 ml de milieu de culture normal, puis extraite 3 fois de suite dans 0,2 ml de TCA 10% froid. Les 3 surnageants successifs sont appliques sur une rondelle de papier Whatman, puis sechb a l’air chaud. La radioactivite de l’extrait au TCA est ramenee a une m&me quantite de proteine (100 PLg de tyrosine dans le culot). L’experience montre que le traitement a l’actinomycine n’aff ecte pas sensiblement la radioactivite du “pool” des acides amines. L’antibiotique ne semble done avoir aucune influence notable sur la permeabilite cellulaire vis-a-vis de la leucine. Ce resultat a et& confirm6 a plusieurs reprises. DISCUSSION

Comme le montrent les figures 1 a 4, nos rksultats sur l’influence de l’actinomycine sur la synthese proteique sont sujets a une grande variabilitk. Celle-ci provient du fait que nous avons etudik l’incorpora-

EFFETS

DE

L’ACHNOMYCINE

481

tion de la leucine tritike dans les cellules intactes, oh la barriere constit&e par les membranes s’oppose B la p&&ration de l’acide amink. Un facteur non contr8lable est ainsi introduit dans les experiences et il entralne la dispersion des r6sultats. La perm6abiM des tissus ?I la leucine peut varier d’une man&e considhrable, suivant la taille et la forme de l’explantat, ainsi que son comportement en culture (rktraction, enroulement etc.). L’influence exerche par l’actinomycine sur la synth&se prothique est beaucoup moins rapide que l’effet produit sur la synth&se du RNA. Apr&s 1 jour de contact avec l’actinomycine, la synth&e des protkines se poursuit B un rythme ralenti, alors que l’uridine ne s’incorpore pratiquement plus dans le RNA. Par la resistance relativement &levbe de leurs synth&ses protkiques vis-8-vis de l’actinomycine, les cellules embryonnaires se rapprochent davantage des tissus diff&renci& de mammif&e (rkticulocytes, fibroblastes en culture) que des bacthries. Chez celles-ci, l’actinomycine reduit t&s rapidement (aprks quelques minutes) l’incorporation des acides aminks dans les prothines (Levinthal, et toll., 1962). Dans les tissus de mammifkre, par contre, la synthitse des protbines n’est inhibke que t&s lentement par l’antibiotique (Goldstein et toll., 1960; Davidson et toll., 1963; Shatkin, 1963; Penman et toll., 1963). Aucune difference significative n’apparait entre les tissus dorsaux et les tissus ventraux en ce qui concerne l’inhibition produite par l’actinomycine sur la synthkse prot6ique. Pourtant, l’antibiotique r& duit la synth&se du RNA davantage dans le tissu nerveux et les somites que dans l’endoderme (cf. le second article de cette sAie). Cette discordance tient probablement au fait que les r&ultats fournis par l’incorporation de la leucine sont sujets Z+ une forte variabilitd. L’inhibition exercee par l’actinomycine sur la synth&se protkique est particuli&ement lente au tours de la segmentation et au dt5but de la gastrulation (figs. 5 et 6). Ceci pourrait signifier que la synthdse des prot&nes est soutenue pendant la pitriode du clivage par un messager relativement stable. Une telle hypoth&se n’est certainement pas g exclure chez les kchinodermes, si l’on considkre le peu d’influence que poss&de l’actinomycine sur le clivage des oeufs d’oursin et, en particulier sur la synthkse protkique durant cette pCriode (Gross et Cousineau, 1963). La m&me possibilitk existe chez les amphibiens, OI?I les noyaux n’exercent un rBle morphogkn&ique v&itable qu’& partir du d&but de la gastrulation (Brachet, 1962). La prksence d’un messager stable sur les ribosomes d’oeufs en segmentation n’est pas incompa-

482

H.

DENIS

tible avec ce que l’on sait a l’heure actuelle du mecanisme de la synthese proteique. En effet, l’instabilite apparait de moins en moins comme une propriete indispensable du RNA messager. Si celui-ci a une vie tres courte chez les batteries (Gros et toll., 1961), il n’en va pas necessairement de m&me ailleurs, en particulier dans les rkticulocytes de mammifhe (Tissieres et Watson, 1962; Marks et toll., 1962) et dans les cellules de HeLa (Penman et toll., 1963). Le debut de la gastrulation est marque, non seulement par une forte augmentation des syntheses proteiques, mais encore par une sensibilitk accrue de celles-ci vis-a-vis de l’actinomycine (fig. 5 et tableau 1). Ceci montre que le contrble exerce par les noyaux sur la synthese des proteines s’instaure et s’accrolt au tours des mouvements morphogknetiques (stades 8-22). Ce contrble s’exerce sans doute par une synthese acceleree de RNA messager, lequel, en se fixant sur les ribosomes, Ieverait le blocage de ces derniers, qui s’etablit en fin d’oogenese et persiste jusqu’a la fin du clivage (Brachet, 1962). Le moment ou les syntheses proteiques deviennent sensibles a l’actinomycine est precisement celui oh la morphogenese commence a Btre affect&e par l’antibiotique. Celui-ci n’a, en effet, pratiquement aucune influence sur la segmentation (Brachet et Denis, 1963). RESUME

L’influence de I’actinomycine sur l’incorporation de la leucine trit&e dans les proteines solubles a ete etudiee chez les embryons de pleurodele. L’actinomycine inhibe lentement les syntheses proteiques (2535% en 24 heures) dans les cellules de la blastula et de la jeune gastrula. L’inhibition est plus rapide ulterieurement : elle passe a 65%en 24 heures, au debut de la neurulation et a plus de 70%B la fin de la neurulation. Aucune difference n’apparait entre les divers tissus embryonnaires en ce qui concerne la sensibilite de leurs syntheses protkiques vis-a-vis de l’actinomycine. Le controle des noyaux sur la synthese des proteines semble faible ou nul pendant la segmentation mais s’exerce dune man&e de plus en plus Btroite a partir du debut de la gastrulation. SUMMARY

The influence of actinomycin on the incorporation of tritiated leutine into soluble proteins has been studied in the embryonic tissues of Pleurode~es. Actinomycin slowly inhibits protein synthesis (25-358 in 24 hours) in blastula and early gastrula cells. The inhibition is faster during later development: it reaches 65%in 24 hours at the beginning

EFFETS

DE

L’ACTINOMYCINE

483

of neurulation and more than 70% at the end of neurulation. NO significant difference has been found between the embryonic tissues as far as the sensitivity of their protein synthesis toward actinomycin is concerned. The control of the nuclei upon protein synthesis seems to be loose or absent during cleavage, but sets in at the beginning of gastrulation and increases steadily. Ce (contrat

travail a ‘CtC rendu possible grace B l’aide financi&re de l’Euratom 916-61-19 ABIB ), auqnel nous adressons nos vifs remerciements. BIBLIOGRAPHIE

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