Eine verbesserte, sehr empfindliche Methode zur biologischen Auswertung des Insektenhormones Ecdyson

I. Insect Physiol., 1969, Vol. 15, pp. 1301 to 1307. PergamonPress. Printed in Great Britain

EINE VERBESSERTE, SEHR EMPFINDLICHE METHODE ZUR BIOLOGISCHEN AUSWERTUNG DES INSEKTENHORMONES ECDYSON D. ADELUNG

und P. KARLSON

Physiologisch-Chemisches Institut der Philipps-UniversSit Marburg (Lahn) und II. Zoologisches Institut der Justus-Liebig-Universitlt Giessen. (Received 14 February

1969)

Abstract-Rearing of Calliphora erythrocephala and Musca domestica and the bioassay of ecdysone using these animals are described. Musca larvae are five times more sensitive than Calliphora. The enhanced sensitivity of Musca larvae to the moulting hormone is only partially due to the difference in size between Calliphora and Musca. Further reasons for its higher sensitivity are discussed.

EINLEITUNG ZUR QUANTITATIVEN Bestimmung der Htiutungshormone der Insekten (BUTENANDT und KARLSON, 1954) und der Krebse (HAMPSHIRE und HORN, 1966) dient

meist der biologische Test. Als Testorganismus wurde bisher vor allem die Larve der Schmeissfliege Calliphora erythrocephala Meig. verwendet. Dieser ‘Calliphora-Test’ geht auf ein zuerst von FRAENKEL(1935) mitgeteiltes Schntirungsexperiment zuriick. Er wurde sp$iter von BECKER (1941) ausfiihrlich beschrieben und von KARLSON verbessert (1956, 1966). Der Test wird in der Weise durchgefiihrt, dass die zu priifende Lijsung in das abgeschniirte isolierte Hinterstiick verpuppungsbereiter Larven injiiiert wird. Bei Verwendung einer wirksamen Lssung bilden die isolierten Hinterstiicke innerhalb von 24 Std. ein Puparium aus. Die Einheit der biologischen Wirkung (‘Calliphora-Einheit’) ist die Menge Hormon, die pro Tier injiziert werden muss, urn einen Verpuppungswert (s.u.) von 50 Prozent zu erreichen. Sie entspricht 10 ng (=10x 10mgg) reinem Ecdyson. In vielen Faillen ist es wiinschenswert, noch geringere Hormonmengen mit Sicherheit bestimmen zu kijnnen. Wir haben deshalb 1965 mit Versuchen begonnen, den biologischen Test dadurch empfindlicher zu gestalten, dass wir statt der Schmeissfliege die kleineren Maden der Stubenfliege Muxa domestica L. 1966 verijffentlichten KAPLANIS et al. (1966) die Ergebnisse des verwendeten. gleichen Versuchs. Sie konnten durch den Wechsel des Testtieres die Empfindlichkeit gegenfiber CaZZiphora erythrocephala urn das drei- bis vierfache steigern. Urn bei den Mzlsca-Maden eine 50 Prozentige Verpuppung zu erreichen, benijtigten sie pro Tier 5 ng reines Hormon. Durch systematische Abwandlung der Testbedingungen gelang es uns, die Empfindlichkeit des Testes soweit zu steigem, dass noch 1 bis 2 ng Ecdyson mit 1301

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KARLSON

Sicherheit erfasst werden konnen. Eine gleichzeitig aufgestellte Dosis-WirkungsKurve gestattet es, die Hormonmenge in diesem Bereich mit einer Genauigkeit von etwa + 20 Prozent zu bestimmen. Da wir annehmen, dass diese Methode such fur andere Untersucher von Interesse ist, erscheint es gerechtfertigt, sie hier nochmals zu beschreiben. Gleichzeitig sol1 damit eine Standardisierung der Testbedingungen und der Vergleich der Ergebnisse verschiedener Laboratorien erleichtert werden. MATERIAL

UND

METI-IODEN

Zucht der Versuchstiere Calliphora. Die Schmeissfliegen werden in einem tagsiiber beleuchteten Flugktig bei 26°C gehalten. Sie werden mit Zucker und in Wasser suspendierter Trockenhefe ernlhrt. Ausserdem wird ihnen in einer Petrischale Trinkwasser geboten. Taglich wird ihnen fi_ir 2 Std. Gelegenheit gegeben, auf einem kleinen Fleischstiick ihre Eier abzulegen. Einen Tag nach der Eiablage schhipfen die Maden aus den Eiern aus. Sie werden zusammen mit dem Fleischstfickchen auf ein grijsseres Stiick Rindfleisch iibertragen. Dort entwickeln sich die Tiere in 7 bis 8 Tagen zu verpuppungsreifen Larven. Die Fleischstiicke werden zu diesem Zeitpunkt iiber dem ZuchtbehZlter aufgespiesst. Die verpuppungsbereiten Maden, die das Futter verlassen wollen, fallen in den Behalter und kijnnen dort abgelesen werden. Musca. Die Fliegen werden unter den gleichen Licht- und Temperaturbedingungen wie die Schmeissfliegen gehalten. Als Nabrung erhalten sie taglich einen Becher (4 5 cm) mit frischem 10 Prozent Fett enthaltenden Molkereiquark, dem etwas Zucker zugesetzt ist. Der Quark wird mit angefeuchtetem Filtrierpapier abgedeckt, auf dem die Fliegen ihre Eier ablegen. Diese werden taglich einmal abgelesen und auf frischen Quark iiberfiihrt, der sich in der einen HHlfte einer rechteckigen Zuchtschale (Kastenhinge 25 cm) befindet. Das Gelege wird mit feuchter Weizenkleie bedeckt und in einen dunklen Schrank gebracht. Aus den Eiern schliipfen bereits nach einem halben Tag Larven, die sich innerhalb von 6 bis 7 Tagen zu verpuppungsreifen Tieren entwickeln. Wahrend dieser Zeit mtissen die heranwachsenden Larven gelegentlich mit Quark nachgefiittert werden. Am 5. Tag wird in die freie Htilfte der Zuchtschale trockene, gesiebte Roggenkleie gefiillt. Die verpuppungsbereiten Maden verlassen das Futter und wandern in die trockene Kleie. Dort konnen sie herausgesiebt werden. Schntimng und Injektion Haben sich cu. 20 Prozent der Calliphora-Maden, bzw. 10 Prozent der &%.rca-Maden verpuppt, so werden die unverpuppten Tiere hinter dem ersten Drittel ihres Korpers abgeschniirt. Zur Schniirung verwenden wir Baumwollgarn (4 0,4 mm). Es ist darauf zu achten, dass die Ligatur nicht zu stark und such nicht zu schwach angezogen wird. Nach 24 Std. werden alle Tiere herausgelesen, deren Vorderstiick sich verpuppt hat, deren Hinterstiick aber larval geblieben ist. Diese Tiere, etwa 30 Prozent der insgesamt geschniirten Maden, kommen nach

DIE BIOLOGISCHEN

AUSWRRTUNG DES INSEKTENHORMONRS ECDYSON

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24 Std. (Calliphova erythrocephala) bzw. 12 Std. (Musca domestica) zur Injektion. Die zu testende Substanz wird in dest. Wasser gel&t; pro Tier werden jeweils 10 ~1 (Calliphora-Maden) bzw. 5 ~1 (Musca-Maden) injiziert. Vor der Injektion wird den Tieren hinter die erste Ligatur eine zweite locker angezogene Ligatur gelegt. Die Nadel des Mikroinjektionsgerates wird zwischen den beiden Ligaturen eingestochen und durch die zweite Ligatur in das Hinterstuck des Tieres eingefiihrt. Dann erfolgt die Injektion der Test&sung. Nachdem die Injektionsnadel aus dem Tier herausgezogen worden ist, wird die zweite Ligatur fest angezogen. Auf das friiher geiibte Abschneiden der Vorderstiicke kann verzichtet werden. Auswertung des Testes Zwanzig Std. nach der Injektion kiinnen die Musca-Versuche, 24 Std. nach der Injektion die Calliphma-Versuche ausgewertet werden. Die Auswertung erfolgt bei beiden Arten in gleicher Weise. Je nach dem Umfang der Puppariumbildung unterscheiden wir die fiinf folgenden Bewertungsstufen: (a) Vollpuparisiert : Die Braunfarbung (Sklerotisierung) umfasst die ganze Cuticula. Verpuppungswert 1 ,OO. (b) Stark teilpuparisiert : Der grossere Teil der Cuticula ist stark dunkelbraun pigmentiert. Verpuppungswert 0,75. umfasst 25 bis 60 Prozent der (c) Halbpuparisiert : Die Braunfarbung OberflHche der Tiere. Verpuppungswert 0,50. (d) Wenig puparisiert : Die Braunfarbung beschrankt sich nur auf kleine, aber deutlich sklerotisierte Cuticulapartien. Verpuppungswert 0,25. larval geblieben. (e) Keine Puparisierung : Die Cuticula ist vollkommen Verpuppungswert 0,OO.

Verpuppungswerfc:

1.00

0.50

1. Verschieden stark verpuppte Musca-Larven im Test. Je nach der injizierten Hormondosis und der Reaktionsbereitschaft des Gewebes erfolgt eine vollkommene oder graduell abgestufte Verpuppung, bzw. Pupariumbildung der Larven-Hinterstiicke. Die Zahlen unter den Larven geben den Verpuppungswert an. Weitere Erl?uterungen im Text.

&tB.

Bei der Auswertung ist darauf zu achten, dass tote Tiere nicht mitgezahlt werden. Toxische Substanzen (unreine Praparate) fiihren oft dazu, dass zahlreiche Tiere absterben. Das KSrperinnere farbt sich dann schwarz durch die Wirkung der Phenoloxydase. Schneidet man solche Tiere auf, rein@ die Cuticula unter Wasser und betrachtet sie, so erkennt man, dass die Cuticula nicht sklerotisiert ist.

D. ADELUNGUNDP. KARLSON

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ERGEBNISSE

(1) Die Do&

Wirkungs-Curve bei Calliphora und bei Musca

Die Abhangigkeit der Wirkung von der injizierten Dosis Ecdyson wurde erythrocephala beschrieben. Aus zuerst von KARLSON (1966) f iir Calliphora unseren Versuchen der letzten Jahre kijnnen wir diese Ergebnisse bestatigen (vergleiche Abb. 2). Fiir Musca domestica haben wir eine entsprechende Dosis-Wirkungs-Kurve aufgenommen. Jede gepriifte Dosis wurde in zehn Testen mit jeweils fiinfzehn bis dreissig Tieren gepriift. Wir haben aus diesen Ergebnissen die Mittelwerte und die mittleren Fehler berechnet (vergleiche Tabelle 1 und Abb. 2). TABELLE 1-VERPUPPCNGSREAKTION GESCHN~~TER 6-7 Tage ALTER MADEN VON Musca domestica AUFVERSCHIEDEN KONZENTRIERTE HORMONL~~SUNGEN Injizierte Hormonmenge (ng/Testtier)

Verpoppoog (%) 82,7 84,7 83,s 80,9 74,7 754 67,4 63,9 49,6 30,7 9,4 7,3 1,6

625,0 50,o 25,0 12,5 7,5 590 3J 2,7 I,9 196 120 0,5 0,3

+ 2,5 + 1,9 !C2,0 rf:3,l f 2,6 k 2,6 + 4,4 + 3,5 k 4,2 + 5,l f 2,l * 2,0 + 0,6

Injizierte Fliissigkeitsmenge pro Tier: 5 ~1. Das Hormon wurde in dest. Wasser gel&t. Angegeben sind die Mittelwerte mit mittlerem Fehler aus jeweils 10 Testen pro Losung.

Wird die Dosis iiber 5 ng Ecdyson gesteigert, so steigt die Wirkung (Verpuppungsquote) nur sehr langsam an. In diesem Bereich ist ein Riickschluss von der Wirkung auf die Dosis unsicher. Entsprechendes gilt fiir eine Dosis unter 1 ng Ecdyson pro Tier. Dagegen verlauft die Kurve (in balblogarithmischer Auftragung) in dem Bereich von 1 bis 3 ng linear. Damit ist ein Interpolieren von Zwischenwerten, die nicht einer biologischen Einheit entsprechen, leicht miiglich. (2) Die Genauigkeit

und Reproduxierbarkeit

des Testes

Beim Calliphora-Test haben unsere Erfahrungen gezeigt, dass die Genauigkeit innerhalb einer Versuchsserie (d.h. mit Tieren der gleichen Zucht) recht gut ist, ein Vergleich zwischen Testen aus verschiedenen Zuchten, d.h. zu verschiedenen Zeiten, aber nicht immer iibereinstimmende Werte liefert. Ein Grund hierfiir

DIEBIOLOGISCHEN AUSWERTUNG DESINSEKTENHORMONES ECDYSON

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wurde in dem verschiedenen physiologischen Alter der Tiere erkannt (KARLSON, 1956; KARLSON und SHAAYA, 1964). Tiere, die verh&nismHssig sp2t geschntirt wurden, reagierten nahezu doppelt so empfindlich wie Tiere aus Friihschniirungen. Das physiologische Alter wurde deshalb spster in der Weise beticksichtigt, dass der Prozentsatz der nach der Schniirung spontan verpuppten Tiere notiert wurde (bis 30 Prozent Friihschniirung, 30 bis 60 Prozent Mittel-, fiber 60 Prozent Sp%tschni_irung). 100

% Verpuppung

-

Musca domestica

---

Calliphora

eryihrocephala

90

ABE. 2. Dosis-Wirkungs-Kurve fi_irreines, in Wasser gel6stes Ecdyson. Abszisse: Injizierte Hormonmengen pro Tier in logarithmischer Auftragung. Ordinate: Verpuppungswerte in Prozent (Verpuppungswert 1 = 100 Prozent, lineare Auftragung). Bei Musca domestica konnten wir entsprechende Unterschiede nicht beobachten. Unter den gewPhlten Bedingungen reagieren die Maden mit hoher ZuverlSissigkeit, wie aus den angegebenen mittleren Fehlern (in der Grijssenordnung von + 20 Prozent) hervorgeht. Unter sehr konstanten Bedingungen kann man allerdings such mit dem CaZZ@ora-Test eine Zhnliche Reproduzierbarkeit erreichen. DISKUSSION Die hier im Einzelnen beschriebene Methode der Schniirung, Injektion und Auswertung hat sich in bisher iiber 200 Testen sehr gut bew5hrt. Von besonderer Bedeutung ist die Auswertung, d.h. die Klassifizierung nach ganz-, stark-, mittelund schwach teilverpuppten Tieren. Sie erfordert einige ‘ijbung und muss vor allem stets nach gleichmHssigen Kriterien erfolgen. Andererseits lbst die Berechnung des Verpuppungswertes in Prozent eine Fehlklassifizierung von ein oder zwei Tieren in jeder Serie zu, ohne dass sich der Endwert wesentlich Pndert.

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hELuNG

UND P. KARLSON

Ausser der grosseren Empfindlichkeit ist ein weiterer Vorteil des Muxa-Testes der steilere Anstieg der Dosis-Wirkungs-Kurve. Dieser Unterschied tragt wesentlich zu der hijheren Genauigkeit des Musca-Testes bei: Nimmt man z.B. eine biologische Schwankungsbreite des Verpuppungswertes von 10 Prozent an, so bedeutet dies bei 40 Prozent Verpuppung einen Bereich von 36 bis 44 Prozent. Dem entspricht bei Musca eine abgelesene Dosis von 17,0 bis 182 ng, bei Calliphora eine solche von 4,6 bis 7,3 ng Ecdyson. Obwohl der Musca-Test erheblich empfindlicher ist als der Calliphora-Test, verzichten wir darauf, hier such noch eine besondere Musca-Einheit festzulegen. Da es reine Praparate von Ecdyson gibt, ist es verniinftiger, Mengenangaben nicht mehr auf die biologische Einheit, sondern auf die Gewichtsmenge Ecdyson zu beziehen und gegebenenfalls die biologisch ermittelten Mengen an Hand der Dosis-Wirkungs-Kurve umzurechnen. Eine interessante Frage ist nun: Worauf beruht die grijssere Empfindlichkeit von Musca ? Es ist denkbar, dass die grossere Empfindlichkeit allein in der GrSsse der Tiere bedingt ist. Gut entwickelte verpuppungsreife Muxa-Maden wiegen im Mittel30 mg und haben eine Oberflache von durchschnittlich 61 mm2. Vergleichbare Calliphora-Maden wiegen dagegen im Mittel 59 mg und haben eine Oberflache von 103 n-n-r+. Wie aus diesen Daten hervorgeht, kann die Ursache fiir die hijhere Empfindlichkeit von Mwca nicht allein auf die Grossenunterschiede zuriickgefiihrt werden. Diese bedingen nur eine 1,7 bis Z-fach gesteigerte Empfindlichkeit von Musca. Als weitere Ursachen kommen in Betracht : (a) eine hiihere Reaktionsbereitschaft

der Epidermiszellen;

(b) die schnellere Entwicklung von Muxa, die such solche physiologischen Prozesse wie die Sklerotisierung schneller ablaufen lasst ; (c) eine geringere biologische

Inaktivierungsrate von Ecdyson.

Wie kiirzlich in unserem Labor gezeigt werden konnte, wird Ecdyson sehr schnell inaktiviert (KARLSON und BODE, 1969). Im isolierten Hinterstuck von CaZZiphora hat das Ecdyson eine Halbwertszeit von ca. 2,5 Std. (SHAAYA, 1969). Bei Sarcophaga peregrina betragt die biologische Halbwertszeit fiir Ecdyson 1 Std. (OHTAKI et al., 1968). Versuche, die biologische Halbwertszeit bei Musca domestica zu messen, sind im Gange. Allerdings hat sich such gezeigt, .dass der Ecdysonabbau in den Calliphora-Maden 48 Std. nach dem Anlegen der ersten Ligatur, also zum normalen Injektionszeitpunkt nur noch ausserst gering ist. Es ist daher unwahrscheinlich, dass die geringere Empfindlichkeit von Calliphora auf Ecydson mit dadurch bedingt ist, dass ein erheblicher Teil des im Test injizierten Ecdysons abgebaut wird, bevor es zur Wirkung kommt. Eine geringe Steigerung der Empfindlichkeit von Musca aufgrund der etwas schnelleren Entwicklung ist nicht auszuschliessen. Obwolil sich die Larven von Musca domestica nur ungefghr einen Tag eher als CaZZiphwa-Maden verpuppen, verl2iuft die Pupariumbildung urn das 1,4-fache schneller.

DIE BIOLOGISCHKN AUSUTERTUNG DESINSEKTENHORMONES ECDYSON

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Daher verbleibt nur noch die MGglichkeit, dass die Epidermiszellen von Musca eine hiihere Reaktionsbereitschaft auf das H%utungshormon Ecdyson besitzen. Hierfiir spricht such der oben diskutierte steilere Verlauf der DosisWirkungs-Kurve. Anerkeaenmzg-Die Arbeit wurde mit Unterstitzung schaft durchgeftihrt.

der Deutschen Forschungsgemein-

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