Einfluß der D-Galaktose auf den Kohlenhydratstoffwechsel pflanzlicher Gewebe

Flora, Abt. A, Bd. 159, S. 82-103 (1968)

Aus dem Institut fUr Allgemeine Botanik der Humboldt-Universitat zu Berlin

EinfluB der D-Galaktose auf den Kohlenhydratstoffwechsel pflanzlicher Gewebe Von H. GORING und E. RECKIN unter Mitwirkung von R. KAISER Mit 14 Abbildungen (Eingegangen am 4. J anuar 1968)

In isolierten pflanzlichen Geweben nimmt der endogene Zuckerspiegel mehr oder weniger rasch ab, daher mu.f3 ihnen zur Aufrechterhaltung des Stoffwechsels bald und kontinuierlich eine exogene Kohlenstoffquelle geboten werden (RAMSHORN 1960). In zahlreichen Versuchen zeigte sich jedoch, da.f3 nicht aIle Zucker in gleicher Weise als Substrat geeignet sind. Glucose, Fruktose, und Saccharose sind im Pflanzenreich allgemein bevorzugte Substrate, aber auch Maltose, Raffinose, Cellobiose und Trehalose bewirken bei verschiedenen Geweben eine Wachstumsforderung; als weniger geeignete Kohlenstoffquellen erweisen sich Melibiose, Laktose, Ribose und Mannit. Eine Zusammenstellung diesbeztiglicher Befunde nahmen GORING und GERLACH (1966) vor. Mannose (KNUDSON 1917, STEINBERG 1947, STENLID 1957a, FERGUSON u. a. 1958b, GORING und GERLACH 1966 u. a.), Sorbose (FERGUSON u. a. 1958 a, GORING und GERLACH 1966) und Galaktose (KNUDSON 1917, BURSTROM 1948, FARKAS 1954, FERGUSON u. a. 1958a und b, BAKER und RAY 1965 u. a.) haben sogar toxische Wirkungen auf pflanzliche Gewebe. Das ist bei Galaktose um so bemerkenswerter, als dieser Zucker bzw. seine Derivate Bausteine zahlreicher Verbindungen wie der Raffinose, Stachyose und hOherer Oligosaccharide der Raffinose-Zucker, der Galaktoside, der Pektinstoffe u. a. sind (s. JEREMIAS 1964). Bereits KNUDSON (1917) beobachtete an intakten Wurzeln von Pisum sativum und Triticum aestivum einen toxischen Effekt der Galaktose. An isolierten Wurzelspitzen von Triticum konnte BURSTROM (1948) die Beobachtungen von KNUDSON bekraftigen, allerdings schienen isolierte Wurzelspitzen von Helianthus annuus und Linum usitatissimum gegen Galaktose nicht empfindlich zu sein. In mannigfachen Versuchen wurde die toxische Wirkung der Galaktose an weiteren Objekten festgestellt (WYND 1933, BONNER und ADDICOTT 1937, WHITE 1940, STREET und LOWE 1950), so da.f3 FARKAS (1954) auf Grund seiner Versuchsergebnisse und unter Berticksichtigung bis dahin bekannter Befunde den Schlu.f3 zog, da.f3 die toxische Wir-

EinfluB der D-Galaktose auf den Kohlenhydratstoffwechsel pflanzlicher Gewebe

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kung der Galaktose auf pflanzliche Gewebe eine im Pflanzenreich allgemein verbreitete Erscheinung sei. STENLID und DANCKWARDT-LILLIESTROM (1961) beobachteten indessen, daB das Wachstum intakter Keimpflanzenwurzeln von Cucumis sativus durch Galaktose nicht gehemmt wird, und daB isolierte Wurzeln dieser Pflanze Galaktose flir Wachstumsvorgange verbrauchen. Aus den an tierischen und pflanzlichen Objekten gewonnenen Ergebnissen ergab sich die Vorstellung, daB die Toxizitat der Galaktose auf eine Hemmung der Phosphoglucomutase zuriickzufiihren sei. Die Synthese der Cellulose scheint als Folge dieser Ferment-Hemmung vermindert oder vtillig unterdriickt zu werden (STENLID 1959, ORDIN und ALTMANN 1965, ROZENFELD 1965). UnbeeinfluBt bzw. gcftirdert sind bei Galaktose-Applikation demgegeniiber die Atmung (FARKAS 1954, GORING 1966a) und energieverbrauchende Prozesse der Chlorid- und Phosphataufnahme (STENLID 1954 und 1957 a). Dariiber hinaus ist bekannt, daB Galaktose auf die Saccharose-Synthese und Zuckerakkumulation ftirdernd wirkt (HASSID u. a. 1956, GRANT und BEEVERS 1964). Wie diese verschiedenartigen Befunde sich mit der toxischen Wirkung der Galaktose in Einklang bringen lassen, ist bis heute noch nicht endgiiltig geklart. Mit der vorliegenden Untersuchung solI zur Klarung der Frage beigetragen werden, wie von auBen aufgenommene Galaktose in das Stoffwechselgeschehen eingreift. Als besonders aussichtsreich erschien eine vergleichende Untersuchung zwischen Geweben, auf die Galaktose toxisch wirkt (z. B. von Zea mays) und solchen, die Galaktose als Substrat verwerten (Cucumis sativus). Daher wurde an Wurzelspitzen dieser Arten bzw. Koleoptilen von Zea mays die Kinetik der Aufnahme applizierter Galaktose und deren Wirkung auf das Streckungswachstum, den endogenen Zuckerspiegel und die stoffliche Zusammensetzung der Zellwandfraktionen gepriift.

Material Es wurden Karyopsen von Zea mays, Sorte Schindelmeiser, Ernte 1965 und 1966, und Samen von Cucumis sativus, Sorte Eva (Ernte 1965), verwendet. D-Galaktose wurde von der Firma "VEB Berlin-Chemie", Berlin-Adlershof und D-Glucose von der Firma "Merck", Darmstadt, bezogen. D-Galaktase-1-uC lieferte die Firma "Radiochemical Centre", Amersham, England.

Methoden Anzucht des Versuchsmaterials Karyopsen von Zea mays wurden 4 h in Leitungswasser bei Zimmertemperatur angequollen, anschlieBend in feuchten Sand eingesteckt und im Keimschrank bei 25 °C und hoher Luftfeuchtigkeit belassen. Wurzeln von 1-4 cm Lange lagen nach 44 h, Koleoptilen von 3 cm Lange nach 4 d vor. Die Samen von Cucumis sativus wurden sofort in feuchten Sand gesteckt und verweilten im Keimschrank bei 25 °C fiir 30 h, die Wurzelliinge betrug dann 1-3 cm. 6·

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H. GORING und Eo RECKI", unter Mitwirkung von R. KAISER

Messung des Liingenwachstums Von den gewaschenen Keimpflanzen wurden 3 mm lange Wurzelspitzen abgeschnitten und in vorbereitete Erlenmeyerkolben gegeben (10 Wurzelspitzen/10 ml Niihrlosung). Koleoptilen wurden dekapitiert (3 mm) und 5 mm lange Segmente (4.-8. mm) nach Entfernung des Primiirblattes fiir die Versuche verwendet (5 Segmente/10 ml Niihrlosung). Niihrlosung: mineralische Losung nach WHITE (modifiziert nach KANDLER 1950) + verschiedene Substratkonzentrationen. Bei einer Schiittelfrequenz von etwa 130 pro Min. wurden die mit Watte verschlossenen Kolben im Thermostaten bei 25°C 16 h lang im Dunkeln geschiittelt. Messung der Zuckeraufnahme Jeweils 90 isolierte Wurzelspitzen von Zea mays bzw. 200 von Cucumis sativus wurden in W ARBURG-GefiiBen mit 2 ml WHITE-Losung bei einer Schiittelfrequenz von 130 pro Min: bei 25°C im Dunkeln 30 Min. lang zur Entfernung der Zucker aus dem "Freien Raum" gewaschen (KURSANOV u. a. 1964). Danach wurden die Wurzelspitzen mit Filterpapier leicht abgetrocknet, mit einer Torsionswaage gewogen und in WARBURG-GefiiBe, die je 2 ml Niihrlosung enthielten, gebracht. Nach Ende der Inkubation (s. 0.) gelangte 1 ml Medium direkt oder verdiinnt zur Zuckerbestimmung. Die Galaktose-Aufnahme wurde indirekt iiber die Galaktose-Abnahme im AuBenmedium ermittelt. Die kolorimetrische Bestimmung erfolgte mittels der modifizierten Methode von TING (GOHRING u. DREIER 1967). Versuchsansatz mit 14C-markierter Galaktose 0,5 ml Galaktose-l-14C (5,um C) + 5,0 ml unmarkierte Galaktose (in WHITE-Losung) dienten als Galaktose-Ausgangsmedium. Von der Ausgangslosung wurden zweimal je 0,5 ml zur besseren Benetzung auf je 1,0 ml verdiinnt und auf MeBschiilchen eingedampft. Zweimal 2,0 ml dienten fiir die Untersuchung der Zuckeraufnahme (s. 0.) Nach der Inkubation wurden aus jedem WARBURGGefiiB 3 Proben zu je 0,5 ml (auf je 1 ml verdiinnt) zum Eindampfen auf MeBschiilchen gegeben. Das im Verlaufe des Stoffwechels gebildete 14C0 2 wurde mit 0,2 ml10 % KOH (im Zentralzylinder des WARBURG-GefiiBes) aufgefangen und anschlieBend unter zweimaligem lIfachwaschen quantitativ auf ein MeBschiilchen iibertragen. Nach der Fiillung des 14C02 als Ba14 C0 3 durch Zugabe von gesiittigter BaC1 2 -Losung erfolgte das Eindampfen der Probe bei 80°C.

Extraktion und Fraktionierung der Kohlenhydrate Die Aufarbeitung des pflanzlichen Gewebes ist nebenstehendem Schema (in Anlehnung an ORDIN u. a. 1955) zu entnehmen. Papierchromatographische Bestimmung der Zucker Die Zucker und Zucker derivate des alkoholischen und wiiBrigen Extraktes werden papierchromatographisch getrennt und identifiziert (GORING 1966a und b). Nach Galaktose-Applikation tritt auf den Chromatogrammen ein zusiitzlicher Zucker auf, dessen Wanderungsgeschwindigkeit ungefiihr derjenigen der Raffinose entspricht. Es miiBte sich dabei urn Galaktose-1-phosphat handeln. Zu seiner Identifizierung wurden Parallelchromatogramme mit Ammoniummolybdat-Reagens (5 ml 60% Perchlorsiiure, 10 ml1 n Salzsiiure, 25 ml 4 % Ammoniummolybdatlosung, mit aqua dest. auf 100 ml aufgefiillt) bespriiht und bei 85°C (7 Min.) entwickelt. Es lieB sich naehweisen, daB es sich bei dem erwiihnten Fleck tatsiichlich urn ein Zuckerphosphat handelt. Da unter unseren Versuchsbedingungen mit einem Auftreten eines anderen Zuckerphosphates in soleh groBer Menge nicht zu rechnen war, eriibrigt sich eine weitere Identifizierung des zusiitzliehen Zuekers.

EinfluB der D-Galaktose auf den Kohlenhydratstoffwechsel pflanzlicher Gewebe

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Wurzelspitzen (etwa 200 mg FG) 60 und 30 min mit je 10 ml extrah., 2 x nachwaschen mit je 2 ml

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(6) 17,5% NaOH 22 °C

3 x30 min mit je 10 ml extrah., 2 x nachwaschen mit je 5ml (7)

Cellulose Die auf den Chromatogrammen entstandenen Farbkomplexe waren liingere Zeit bestiindig und konnten daher quantitativ densitometrisch erfaBt werden. In Vorversuchen konnte eine ausreichende Proportionalitiit zwischen Konzentration und Farbintensitiit fiir die betreffenden Bereiche festgestellt werden. Das verwendete Laufmittel brachte keine Trennung von Galaktose und Glucose, die auf einem gemeinsamen Fleck zwischen Saccharose und Fruktose lagen. Galaktose befand sich auf Grund des etwas kleineren RF -Wertes am unteren Rand des Galaktose-GlucoseFleckes. Bestimmung der Radioaktivitiit der Proben und Chromatogramme Die bereits beschriebenen Fraktionen wurden radiometrisch mit dem "Kleinen StrahlungsmeBgeriit, VA-M-14 Vakutronik" yom VEB Vakutronik Dresden analysiert (Ziihlrohr-Typ VAZ-310). 1m Hinblick auf die zu erwartenden Aktivitiiten wurden auf den MeBschiilchen eingedampft: 0,5 ml Galaktose-Ausgangsmedium, 0,5 ml Galaktose-Medium nach der Inkubation,10% des Alkohol-Extraktes, 50 % des HeiBwasser- Extraktes, 50 % des NH 4 -Oxalat-Extraktes, 10 % des 4 % NaOH-Extraktes, 5 % des 17,5 % NaOH-Extraktes. Die Cellulose-Fraktion wurde quanti-

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H. GORING und E. RECKI?>, unter Mitwirkung von R. KAISER

tativ mit 1 ml Wasser auf ein Schalchen iiberfiihrt und eingedampft. Da es bei diesen Untersuchungen nur auf einen Vergleich zwischen den Versuchsserien ankam, konnte die Selbstabsorption durch hiihere Konzentrationen der Kohlenhydrate und Salze vernachlassigt werden. Die zu untersuchenden in 3 cm breite Streifen geschnittenen Chromatogramme wurden auf einer beweglichen Trommel aufgeklebt und im Abstand von 0,2 cm an einem Glockenzahlrohr mit einer Geschwindigkeit von 0,25 mm/s vorbeigefiihrt (SpaltiiUnung 0,2 cm).

Ergebnisse

Das Wachstum kurzfristig isolierter Wurzelspitzen und Koleoptilsegmente bei Applikation von Galaktose bzw. Glucose Das Wachs tum der Koleoptilsegmente und Wurzelspitzen von Zea mays wird bereits durch die geringe Konzentration von 0,05 % Galaktose gehemmt (Abb. 1). Dieser Effekt nimmt bei den Koleoptilsegmenten mit steigender Galaktose-Konzentration zu.1 %Galaktose hemmen das Wachs tum nach 16 Stunden urn 50 %. Da Glucose sich als geeignetes Substrat erweist, das besonders das Wachstum der Wurzelspitzen fiirdert (Abb. 1 B), wurden in einem weiteren Versuch Langenmessungen an Wurzelspitzen von Zea mays bei gleichzeitigem Angebot von Glucose und Galaktose durch-

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Abb. 1. Langenzuwachs isolierter Koleoptilen (A) und Wurzelspitzen (B) von Zea mays in Abhangigkeit von der Galaktosekonzentration im Medium. Abkiirzungen in dieser und in folgenden Abbildungen: K = ohne Zucker, Glu = Glucose, Gal = Galaktose, Fru = Fruktose, Sa = Saccharose, Gal-p = Galaktosephosphat.

BinfluB der D-Galaktose auf den Kohlenhydratstoffwechsel pflanzlicher Gewebe

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geflihrt (Abb_ 2). Je hoher hierbei der Glucoseanteil ist, um so haher ist die Zuwachsrate, d. h. desto geringer ist die Wachstumshemmung. Unsere Versuche an kurzfristig isolierten Wurzelspitzen von Gucumis sativus (Abb. 3) bestatigen die Angaben von STENLID und DANCKWARDT-LILLIESTROM(1961), nach denen Galaktose flir Wurzelspitzen von Gucumis sativus ein geeignetes Substrat darstellt, denn bei Konzentrationen von 0,06-2,0 % ist eine gleichbleibend hohe Wachstumsrate zu verzeichnen. Galaktose ist flir Gucumis sativus demnach als Substrat fast ebenso geeignet wie Glucose (maximaler Langenzuwachs bei optimaler Glucose-Konzentration ca. 260 bis 280%).

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Abb. 3. Langenzuwachs isolierter Wurzelspitzen von Cucumis sativus in Abhangigkeit von der exogenen Galaktosekonzentration.

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H. GORING und E. REOKIN, unter Mitwirkung von R. KAISER

Galaktose-Aufnahme durch isolierte Wurzelspitzen in Abhangigkeit von Zeit und Konzentration Durch Wurzelspitzen von Zea mays wird Galaktose tiber langere Zeit (mindestens 4 Stunden) mit gleichbleibender Geschwindigkeit aufgenommen (Abb. 4), obwohl dieser Zucker in dem verwendeten Konzentrationsbereich (0,05; 0,2 und 0,5 %) bereits toxisch wirkt. Offensichtlich ist die Aufnahme von der Konzentration im Au13enmedium insofern abhangig, als bei hiiheren Konzentrationen in der gleichen Zeit eine gro13ere Galaktosemenge aufgenommen wird, worauf bereits GRANT und BEEVERS (1964) hinweisen. Es besteht jedoch zwischen der aufgenommenen Galaktose-Menge und der angebotenen Konzentration keine Proportionalitat.

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Abb. 4. Galaktoseaufnahme durch isolierte Wurzelspitzen von Zea mays in Abhangigkeit von der Zeit ( . - - - . 0,5 %, X - - - x 0,2 %, 0---00,05 % Galaktose).

Innerhalb der ersten 90 Minuten nehmen Gurkenwurzelspitzen annahernd die gleiche Galaktose-Menge auf (Abb. 5). Die Aufnahme erfolgt linear. In einer weiteren Versuchsserie sollte festgestellt werden, ob bei einer Inkubation mit hoheren GalaktoseKonzentrationen Sattigungserscheinungen bei der Aufnahme auftreten. Die in Abb. 6 dargestellten Ergebnisse weichen bis zu einer Konzentration von 0,5 % Galaktose von den ftir eine Diffusionskurve (eine vom Ursprung ansteigende Gerade) zu erwartenden Werten ab und lassen Sattigungskinetik erkennen. Bei Konzentrationen tiber 0,5 % folgt die Aufnahme den Gesetzen der Diffusion. Ahnliche Erscheinungen wurden bei Applikation von Saccharose an Ricinus-Keimpflanzen (KRIEDEMANN und BEEVERS 1967), von Glucose an Maiswurzelspitzen (GORING und GERLACH unverijHentlicht) sowie am Dtinndarm der lebenden Ratte (FORSTER und MEHNERT 1965) beobachtet. Dabei zeigen die Aufnahmekurven der Monosaccharide bereits ab etwa 0,5 % einen der Au13enkonzentration proportionalen Verlauf, wahrend bei Disacchariden wie der Saccharose erst bei hoheren Konzentrationen die Kurve einer Diffusionskurve nahekommt.

EinfluB der D-Galaktose auf den Kohlenhydratstoffwechsel pflanzlicher Gewebe

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Abb. 5. Galaktoseaufnahme dnrch isolierte Wurzelspitzen von Cucumis sativus in Abhiingigkeit von der Zeit (Galaktosekonzentration: 0,1 %).

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Abb. 6. Galaktoseaufnahme durch isolierte Wurzel spitz en von Cucumis sativus in Abhiingigkeit von der exogenen Galaktosekonzentration (Inkubationszeit: 1 h).

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Aufnahme und Veratmung von Galaktose-1- 14 C In Wurzelspitzen von Zea mays ist die Aufnahmegeschwindigkeit unmittelbar nach Versuchsbeginn am hOchsten. Sie sinkt mit zunehmender Versuchsdauer und betragt nach 16 Stunden ungefahr nur noch 1/6 derjenigen, die nach 30 Minuten gemessen wird (Abb. 7). Dabei waren nahezu 2/3 der Galaktoseausgangsmenge nach • 16 Stun den aufgenommen. Nach 2stiindiger Applikation beginnt die Aufnahmegeschwindigkeit jedoch abzusinken. Da nach 2 und 4 Stunden Versuchszeit bei Wurzel-

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Abb. 7. Aufnahme von Galaktose-l-14C durchisolierte Wurzelspitzen von Cucumis sativus (x- -x) und Zea mays (e--e) in Abhiingigkeit von der Zeit (Galaktosekonzentration: 0,1 % bei Cucumis sativus und 0,2 % bei Zea mays).

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Abb.8. Abgabe von 14C0 2 durch isolierte Wurzelspitzen von Cucumis sativus (x- - -x) und Zea mays (e---e) bie Inkubation mit Galaktose-p4C (Galaktosekonzentration: 0,2 %).

spitzen von Cucumis sativus die Aufnahmegeschwindigkeit unverandert ist, kann ein starker und kontinuierlicher Umsatz der Galaktose im Gewebe angenommen werden. Entsprechend ist auch die Veratmung der aufgenommenen Galaktose-14 C bei Cucumis sativus urn ein Mehrfaches hoher als bei Zea mays (Abb. 8). Diese unterschiedliche 14C02-Abgabe bei beiden Objekten dtirfte auf einen verstarkten Durchsatz der Galaktose bei Cucumis sativus zurtickzuftihren sein.

Einflutl der D-G
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Umwandlung der Galaktose in andere Zucker In Vorversuchen konnte festgestellt werden, daB nach Applikation von 2 % Galaktose in Wurzelspitzen von Zea mays bereits nach wenigen Stun den ein maximaler Gehalt an Galaktosephosphat erreicht wird. Der Fruktosegehalt ist nach Applikation von Galaktose auffallend gering. We it ere Versuche wurden mit einer GalaktoseKonzentration von 0,2 % durchgefUhrt. 'rabelle 1

Endogener Zuckerspiegel isolierter Wurzelspitzen von Zea mays (SCHINDELMEISER 1966) nach Applikation von 0,2 % G
Versuehsdauer (h)

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Aus Tabelle 1 ist zu ersehen, daB auch bei Applikation einer geringen GalaktoseKonzentration bereits nach 4 Stunden ein maximaler Galaktosephosphatspiegel erreicht wird. Der Saccharosegehalt nimmt zunachst zu, nach langerer Versuchsdauer jedoch stark abo Ebenso ist eine Abnahme des Monosaccharidgehaltes festzustellen. Die nach 16 Stun den beobachtete starke Abnahme des Zuckergehaltes diirfte auf den toxischen Effekt der Galaktose zuriickzufiihren sein. Insbesondere interessierte nun die Umwandlung applizierter Galaktose-1-14C in andere Zucker. Diesbeziigliche Untersuchungen ergaben (Abb. 9), daB nach einer Versuchsdauer von 1/2 Stunden nur geringe Radioaktivitaten in den endogenen Zuckern meBbar sind. Sie treten nach 2 Stunden starker auf, wobei die Impulsrate von Galaktosephosphat Mher liegt als diejenige der anderen Zucker. Auf den Chromatogrammen konnen noch weitere Radioaktivitaten gemessen werden, die zwischen Startpunkt und Galaktosephosphat und zwischen Galaktose + Glucose und Frontbereich liegen, im Rahmen dieser Untersuchung aber noch nicht identifiziert wurden. Es konnte sich hierbei urn andere Zuckerphosphate mit geringeren Rf-Werten, urn Aminosauren und Zwischenprodukte der Glykolyse handeln (HASSID u. a. 1956). Nach 4 Stunden ist mit Sicherheit im Bereich des Fruktoseflecks eine Markierung festzustellen, die Impulsraten in denjenigen der Saccharose und Galaktose + Glucose nehmen zu, dagegen zeigt Galaktosephosphat eine unveranderte Radioaktivitat. 1m Vergleich zur 4-stiindigen ist nach einer 16stiindigen Inkubation die Markierung des Galaktosephosphates etwas geringer, der Saccharose gleich, der Galaktose + Glucose auffallig erhoht, wahrend Fruktose keine Markierung zeigt. Die zwischen dem Bereich der Zucker und der Front liegenden Radioaktivitaten sind erheblich vermehrt.

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Abb.9. Radioaktivitat papierchromatographisch getrennter Fraktionen eines alkoholischen(80 %) Wurzelextraktes von Zea mays nach Applikation von Galaktose-l-14C in Abhangigkeit von der Zeit; fraktionierter Anteil des Gesamtextraktes: 12 %.

Die waBrigen Extrakte aus Maiswurzelspitzen cnthalten ncben Galaktosephosphat noch einen geringen Rest an Zuckern (Abb. 10). Einc betrachtliche Menge markierter Substanz bleibt gleich am Startpunkt oder unmittelbar dahinter liegen. Nach 30 Minuten tritt eine deutliche Markierung im Galaktosephosphat auf, die nach 2 Stun den zwar erhoht ist, aber bei langerer Versuchsdauer nicht wciter gesteigert

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EinfluB der D-Galaktose auf den Kohlenhydratstoffwechsel pflanzlicher Gewebe /

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Abb. 10. Radioaktivitat papierchromatographisch getrennter Fraktionen eines waBrigen Wurzelextraktes von Zea mays nach Applikation von Galaktose-1-14C in Abhangigkeit von der Zeit (fraktionierter Anteil des Gesamtextraktes: 60 %).

wird. Damit stehen diese Ergebnisse in nbereinstimmung mit denjenigen, die mit alkoholischen Extrakten gewonnen wurden. Beriicksichtigt man die aufgetragenen Mengen (60 % des waf3rigen und 12 % des alkoholischen Extraktes), so kann man aus der GroBenordnung der Impulsraten schlieBen, daB die groBte GalaktosephosphatMenge in 80 % Alkohol extrahiert wird. Bei Wurzelspitzen von Cucumis sativus liegen die Zucker (bei ungefahr gleicher Ausgangsmenge wie beim Mais) in densitometrisch nicht meBbaren Konzentrationen vor. Die radiometrische Bestimmung fiihrte zu folgenden Ergebnissen (Abb. 11). Die nach 2stiindiger Inkubation mit 0,1 % Galaktose-l-14C gewonnenen alkoholischen Extrakte enthalten geringe Markierungen im Galaktosephosphat, in der Saccharose und in Galaktose + Glucose. Nach 4 Stunden nimmt die Radioaktivitat besonders in

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H. GORING und E. RECKIN, unter Mitwirkung von R. KAISER Imp/O.3mi/?

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Abb.11. Radioaktivitat papierchromatographisch getrennter Fraktionen eines waBrigen (A) und eines alkoholischen Wurzelextraktes (B) von Cucumis sativus nach Applikation von Galaktose-l-14C in Abhangigkeit von der Zeit (fraktionierter Anteil des waBrigen Extraktes - 60 % und des alkoholischen Extraktes - 12 %).

Galaktose + Glucose und Fruktose zu. In den wa13rigen Extrakten der Gurkenwurzelspitzen ist lediglich in der Markierung der unmittelbar dem Start folgenden Zonen ein Unterschied sichtbar, wahrend der Gehalt an Galaktosephosphat unverandert bleibt. In Gurkenwurzelspitzen kommt es in dieser Zeit somit nicht zu einer wesentlichen Akkumulation von markiertem Galaktosephosphat. Einbau des 14C von Galaktose-l-14C in Polysaccharide In Wurzelspitzen von Zea mays und Cucumis sativus tritt nach Applikation von Galaktose-1-14C eine unterschiedliche Radioaktivitat in den Polysaccharid-Fraktionen auf (Abb. 12). Bei Cucumis sativus ist in der NH4-oxalat-lOslichen Fraktion und in dem Cellulose enthaltenden Riickstand die starkste Markierung festzustellen, die weiterhin in der Reihenfolge Pektin, Hemicellulose, nichtcellulosel1rtige Polysaccharide abnimmt. Samtliche untersuchte Fraktionen von Maiswurzelspitzen haben nach 4 Stunden eine Impulsrate unter 800 Imp./Min .. 200 mg FG, dagegen wei sen diejenigen der Gurkenwurzelspitzen (mit Ausnahme der nichtcelluloseartigen Polysaccharide) erheblich hOhere Impulsraten auf.

EinfluB der D-Galaktose auf den Kohlenhydratstoffwechsel pflanzlicher Gewebe

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Abb. 12. Einbau von HC in Polysaccharidfraktionen isolierter Wurzelspitzen von Cucumis sativus (- - -) und Zea mays (---) nach Applikation von Galaktose-1-HC. C = Cellulose; H = Hemicellulose; P = Pektinstoffe; Po = nichtcelluloseartige Polysaccharide.

Diskussion

Obwohl die Galaktose in Verbindungen pflanzlicher und tierischer Gewebe weit verbreitet ist, liegt sie nur in wenigen pflanzlichen Geweben in nachweisbarer Menge (ca. 1 % TG) frei vor (STENLID 1957b, JEREMIAS 1964, LUDLOW u. a. 1966). Es ist nicht ausgeschlossen, daB Galaktose haufiger in freier Form vorliegt, jedoch infolge zu geringer Konzentrationen mit den tiblichen Mitteln der Chromatographie nicht erfaBt werden kann. Wird nun pflanzlichen Geweben Galaktose exogen zugefUhrt, so kommt es in den meisten Objekten zu einer Wachstumshemmung. Bis jetzt sind nur wenige Pflanzenarten bekannt geworden, fUr die Galaktose ein wachstumsforderndes Substrat darstellt (Tabelle 2). Mit der Aufklarung der Toxizitat der Galaktose beschaftigen sich zahlreiche Arbeiten. BURSTROM (1948) konnte eine Wachstumshemmung als Folge von Verunreinigungen der Galaktose-Praparate ausschlieBen, da Galaktose auf das Wachstum von Sonnenblumen- und Leinwurzeln ohne EinfluB ist. Die Annahme, daB ein

96 Tabelle 2

H. GORING und E. RECKIN, unter Mitwirkung von R. KAISER EinfluB von Galaktose auf das pflanzliche Wachstum

Pflanzenart

Organ o. Gewebe

Forderung + Literatur Hemmung ohne Einfl.

±

Chlorella, 3 Arten Scenedesmus Prototheca Fungi imperfecti Pinus silvestris Triticum aestivum

Zea mays

Avena sativa

Hordeum vulgare Orchis spec. Lycopersicon esculentum

Nicotiana tabacum

isol. Hauptwurz. isol. Nebenwurz. into Wurzeln isol. Wurzeln Endospermkultur into Wurzeln isol. Wurzeln isol. Koleoptilen isol. Koleoptilen into Wurzeln isol. Stengel into Wurzeln Keimpflanzen into Wurzeln isol. Wurzeln

M edicago sativa Brassica oleracea Brassica napus

Keimpflanzen into Wurzeln into Pflanzen isol. Wurzeln isol. Stengel into Pflanzen into Wurzeln into Wurzeln

Sinapis alba

into Wurzeln

Lepidium sativum

isol. Wurzeln

Pisum sativum

into Wurzeln

I satis tinktoria

isol. Wurzeln into Wurzeln

Papaver rhoeas

+ + + + + ±

into Wurzeln

+

DANFORTH 1962 DANFORTH 1962 DANFORTH 1962 KLEIN 1965 SLANKIS 1948 SLANKIS 1948 KNUDSON 1917, FARKAS 1954, STENLID 1957 a BURSTROM 1948 STRAUS u. LARuE 1954 FARKAS 1954 GORING u. GERLACH 1966 GORING u. GERLACH 1966 ORDIN u. BONNER 1957, BAKER u. RAY 1965 FARKAS 1954 KAUFMANN u. a. 1962 FARKAS 1954 WYND 1933 WHITE 1940 STREET u. LOWE 1950, FERGUSON u. a. 1958a STEINBERG 1947 FARKAS 1954 KNUDSON 1917 BONNER u. ADDICOTT 1937 BERTSCH u. HILLMANN 1961 FERGUSON u. a. 1958b FARKAS 1954 STENLID u. DANCKWARDTLILLIESTROM 1961 STENLID u. DANCKWARDTLILLIESTROM 1961 STENLID u. DANCKWARDTLILLIESTROM 1961 STENLID u. DANCKWARDTLILLIESTROM 1961 STENLID u. DANCKWARDTLILLIESTROM 1961 STENLID u. DANCKWARDTLILLIESTROM 1961 FARKAS 1954

EinfluB der D-Galaktose auf den Kohlenhydratstoffwechsel pflanzlicher Gewebe

97

'fabelle 2 (Fortsetzung) Pflanzenart

Organ o. Gewebe

P. somniferum

into Wurzeln into Wurzeln into Wurzeln into Wurzeln isol. Wurzeln into Pflanzen into Pflanzen into Wurzeln into Wurzeln isol. Wurzeln isol. Wurzeln into Wurzeln into Wurzeln into Wurzeln

Taraxacum koh-s. Hieracium pi los. Helianthus annuus Daucus carota Foeniculum vulg. Linum usit.

Euphorbia myrs. Amaranthus caud. Cucumis sativus

Forderung + Literatur Hemmungohne Einfl. ±

± ±

± +

isol. Hauptwurz.

+

isol. Nebenwurz.

+

Cucumis melo

into Wurzeln

Curcubita pepo

into Wurzeln

FARKAS 1954 FARKAS 1954 FARKAS 1954 FARKAS 1954 BURSTROM 1948 MONIEZ 1964 GAUTHERET 1959 FARKAS 1954 FARKAS 1954 FARKAS 1954 BURSTROM 1948 FARKAS 1954 FARKAS 1954 STENLID u. DANCKWARDTLILLIESTROM 1961 STENLID u. DANCKWARDTLILLIESTROM, 1961 STENLID u. DANCKWARDTLILLIESTROM 1961 STENLID u. DANCKWARDTLILLIESTROM 1961 STENLID u. DANCKWARDTLILLIESTROM 1961

vermindertes Langenwachstum der Wurzeln, Wurzel- und Koleoptilspitzen seine Ursache in einer herabgesetzten Atmungsintensitat haben kiinnte, schien nicht ausgeschlossen zu sein, konnte aber durch Untersuchungen von FARKAS (1954), ORDIN undBoNNER (1957) und GORING (1966 a) widerlegt werden. Bei einem Angebot von Galaktose-14 C schieden Avena-Koleoptilen (ORDIN und BONNER 1957), Karottenscheiben und Wurzelspitzen von Zea mays (GRANT und BEEVERS 1964) 14C02 aus, das mengenma13ig aber geringer war als unter gleichen Bedingungen bei Glucose14C-Applikati?n gebildetes 14C02 • Die von uns an Wurzelspitzen von Zea mays und Cucumis sativus durchgefiihrten Untersuchungen ergaben bei einer Inkubation mit Galaktose-l-14C ebenfalls eine Markierung im CO2 • Zu ahnlichen Feststellungen kamen auch BARTLEY u. a. (1966) bei diesbeztiglichen Untersuchungen an der Milchdrtise der Ratte. Applizierte Galaktose wird teilweise veratmet, zum anderen Teil jedoch in Laktose eingebaut. Bei gleichzeitiger Anwesenheit exogener Glucose wird Galaktose sogar bevorzugt in Laktose eingebaut. Auf die bei pflanzlichen Objekten beobachtete Umwandlung von applizierter Galaktose in Saccharose wurde bereits hingewiesen 7 Flora, Abt. A, Bd. 159.

98

H.

GORING

und E.

RECKI;';,

unter Mitwirkung von R.

KAISER

(HASSID u. a. 1956, GRANT u. BEEVERS 1964, TURKINA u. a. 1964). Diese Ergebnisse konnten wir auch an unseren Objekten bestatigen. Die toxische Wirkung der Galaktose kann somit nicht auf eine Blockierung des Energiestoffwechsels oder auf einen Substratmangel zurtickgefiihrt werden. Applizierte Galaktose wird, wie exogene Glucose, selbst bei geringer Konzentration mit relativ hoher Geschwindigkeit aufgenommen (ca. 1 mgjg FG . h). Da trotzdem freie Galaktose im Gewebe nur in gering en Mengen auftritt, ist anzunehmen, daB ein Zwischenprodukt des Galaktoseumsatzes die beobachtete Toxizitat bewirkt. Nach STENLID (1959) und ROZENFELD (1965) hemmt Galaktose-l-phosphat, sobald es in einer bestimmten Konzentration vorliegt, die Phosphoglucomutase. Durch Glucose1,6-diphosphat kann die Hemmung wieder aufgehoben werden. Die durch Galaktose bedingte Hemmung der Biosynthese der Cellulose kann auf die Blockierung dieser Enzymreaktion zurtickgeftihrt werden, zumal in Avena- Koleoptilen die Phosphoglucomutase durch Peroxyacetylnitrat und Ozon inhibiert werden kann (ORDIN und ALTMAN 1965). Dber kombinierte Gaben von Glucose oder Galaktose mit Glucose14C wiesen ORDIN und BONNER (1957) nach, daB bei Avena-Koleoptilen Galaktose bevorzugt in Pektine, Hemicellulose und andere nicht celluloseartige Polysaccharide eingebaut wird. Wahrend wir bei den Galaktose-unvertraglichen Wurzelspitzen von Zea mays zu gleichen Ergebnissen kamen, ergaben Untersuchungen an den Galaktosevertraglichen Wurzelspitzen von Cucumis sativus einen starken Einbau der Galaktose auch in die Cellulose-Fraktion. Dber die Wirkung der Galaktose in Galaktose-unvertraglichen pfJanzlichen Gpweben ware demnach folgendes bekannt: 1. Hemmung des Langenwachstums,

2. Forderung der Saccharose-Synthese und der Zuckerakkumulation, 3. Forderung des Atmungsstoffwechsels, 4. Forderung der Chlorid- und besonders der Phosphat-Aufnahme, 5. Hemmung der Synthese der Polysaccharide, insbesondere derjenigen der Cellulose und weniger derjenigen der Pektine. Ausgehend von dies en Feststellungen laBt sich ftir die Einbeziehung der Galaktose in den Stoffwechsel Galaktose-unvertraglicher pflanzlicher Gewebe folgendes Schema auf stell en (Abb. 13). Galaktose wird tiber ein carrier-System mit relativ hoher Geschwindigkeit aufgenommen und rasch zuGalaktose-l-phosphat phosphoryliert. Dabei kommt es unter erhohtem Phosphatverbrauch zu einer Akkumulation von Galaktose-l-phosphat. Der weitere Umsatz erfolgt mit geringerer Geschwindigkeit in der UTP: Galaktose-l phosphat-Uridyltransferase-Reaktion zu UDP-Galaktose, die tiber die UDP-Glucose-4-Epimerase mit UDP-Glucose in einer Gleichgewichtsreaktion steht. Die Bildung von Glucose-I-phosphat aus UDP-Glucose und Pyrophosphat wird durch das

EinfluB der D-Galaktose auf den Kohlenhydratstoffwechsel pflanzlicher Gewebe

Stre

Celt~~r

ADP-Glu

GOP-Glu \ /

):1ceIiUlose Tlinstoffe

/ \ V \t

UDP-Xyl

UDP-Gal

t/-urrsr. \ UOP-Glu I \ -urOnSr. I

/

J

/~.--,\

,

99

\

I I

\

:::-f:-- ~c~':r~~i~:; Fru-6-P

Sa

Ga I

Abb. 13. Schema des Galaktosestoffwechsels in Galaktose-unvertraglichen pflanzlichen Geweben (Erlauterungen s. Text)

I ,

akkumulierte Galaktose-1-phosphat gehemmt. Die Einbeziehung der aufgenommenen Galaktose in den Energiestoffwechsel kann somit nur tiber die Biosynthese von Saccharose aus UDP-Glucose und Fruktose-6-phosphat bzw. Fruktose (s. NOMURA u. a. 1967) erfolgen. Dieser Reaktionsablauf dtirfte durch die rasche und intensive Umwandlung von Galaktosc in Saccharose und durch den starken Abfall des Fruktosespiegels im Gewebe nach Applikation von Galaktose belegt sein. Einer speziellen Betrachtung bedarf der Einbau der Galaktose in verschiedenn Polysaccharide. Da Pektine und Hemicellulosen tiber UDP-Galaktose bzw. UDPGlucose synthetisiert werden (HAS SID 1967), erklart sich der rasche Einbau von applizierter Galaktose in diese Polysaccharidfraktionen hinreichend. Ftir die Biosynthese der Starke wurde in den letzten J ahren ADP-Glucose als Vorstufe ermittelt CFRYDMAN u. CARDIN I 1965 u. 1966, FRYDMAN u. a. 1966, MURATA U. AKAZAWA 1966 und TSAI u. NELSON 1966 ~ bei Untersuchungen an Speichergeweben; GHOSH u_ PREISS 1965,1966, und DOl u. a.1966 ~ bei Untersuchungen an Spinatchloroplasten). Eine ADP-Glucose: Glykogen-Transglucolase ist nach PREISS und GREENBERG (1965) auch an der Biosynthese des Bakterienglykogens beteiligt. Dagegen wird das Glykogen tierischer Organism en tiber UDP-Glucose synthetisiert (s. LENTI u_ BARGONI 1966). Dber die Biosynthese der Cellulose liegen widersprtichliche Ergebnisse VOT. SO isolierten HASSID und Mitarbeiter (ELBEIN u. a. 1964, BARBER u. a. 1964) aus Wurzeln und Hypokotylen etiolierter Keimpflanzen von Phaseolus aureus ein Enzym, das aus GDP-Glucose Cellulose synthetisiert. Andere Nucleosiddiphosphat-Zucker sind als Vorstufen unwirksam. Enzymextrakte von Lupinus albus (BRUMMOND u. GIBBONS 1964 u. 1965) und Avena sativa (ORDIN u. HALL 1966 u. 1967) bilden auch aus UDPGlucose ein polymeres fJ-1,4-Glucosid. Ein entsprechendes Enzym fan den spater auch HASSID und Mitarbeiter (VILLEMEZ u. a. 1967) bei Keimpflanzen von Phaseoluli aureus. 1m Licht dieser Ergebnisse ist die starke Hemmung der Cellulosesynthese 7"

100

H.

GiiRING

und E.

RECKIN,

unter Mitwirkung von R.

KAISER

Gajl ATP Galakto- ( kinase

ADP

Gai-l-P

Glu-l-P

UDP-Glucose: 0(. -D-Galaktosel-phosphat-Urid Itransferase

UDP -Glucose-4-Epimerase

Abb. 14. Einbeziehung der Galaktose in den Stoffwechsel pflanzlicher Gewebe iiber die UDPGlucose: Galaktose-1-phosphat- Uridyltransferase.

nachApplikation von Galaktose von besonderem Interesse. Die vorliegenden Befunde zwingen zu der Annahme, daB Cellulose in vivo tiber andere Vorstufen synthetisiert wird als Pektine oder Hemicellulosen. Da die Starkesynthese bei Akkumulation von Galaktose-l-phosphat ebenfalls gehemmt wird (GORING, unveroffentlicht), muI3 geschluBfolgert werden, daB durch die Blockierung Glucose-l-phosphat-umsetzender Enzyme die Bildung von Nuc1eosid-diphosphat-Zuckern inhibiert ist. Das nach Applikation von Galaktose akkumulierte Galaktose-l-phosphat stellt somit einen intrazellular gebildeten spezifischen Inhibitor der Starke- und Cellulosesynthese dar. Ob die teilweise Bildung der Cellulose in unseren Versuchen auf eine unvollstandige Hemmung der Synthese oder auf das Vorhandensein eines zweiten Syntheseweges fUr Cellulose bzw. fUr p-l,4-Glucane (tiber UDP-Glucose, s. VILLEMEZ u. a. 1967) zurtickzuftihren ist, muB in speziellen Untersuchungen geklart werden. Die Aufnahme und Phosphorylierung der Galaktose bei Galaktose-vertraglichen Pflanzen (z. B. Cucumis sativus) erfolgt in gleicher Weise wie bei den Galaktoseunvertraglichen. Es tritt jedoch keine erhebliche Akkumulation von Galaktose-lphosphat ein, da es mittels der UDP-Glucose:Galaktose-l-phosphat-Uridyltransferase rasch zu Glucose-I-phosphat umgesetzt wird (Abb. 14). Alle Synthesen der Polysaccharide, die von Glucose-I-phosphat ihren Ausgang nehmen, konnen somit ablaufen. 1m tierischen und menschlichen Organismus ist bei Galaktosamie die Aktivitat der UDP-Glucose: Galaktose-l-phosphat- Uridyltransferase sehr gering und es kommt zu einer Akkumulation von Galaktose-l-phosphat (ROZENFELD 1965). Mit zunehmendem Alter wird beim Saugling ein weiteres Galaktose-l-phosphat-umsetzendes Enzym gebildet (UTP: Galaktose-l-phosphat-Uridyltransferase), welches zwar nur eine geringere Aktivitat aufweist, aber dennoch eine Abnahme der Unvertraglichkeit fUr Galaktose bei der Galaktosamie bewirkt. Obwohl es naheliegt, daB in

EinfluJ3 der D-Galaktose auf den Kohlenhydratstoffwechsel pfh1nzlicher Gewebe

101

Galaktose-unvertraglichen Pflanzen der teilweise Umsatz von Galaktose-l-phosphat liber die UTP: Galaktose-1-phosphat-Uridyltransferase erfolgt (Abb. 13), konnen schllissige Beweise erst tiber den direkten Nachweis der Enzymaktivitat erbracht werden. Zusammenfassung Auf Wurzelspitzen von Zen rrwys wirkt Galaktose toxisch, wahrend es fiir diejenigen von Cucumis sntivus ein giinstiges Substrat darstellt. Von beiden Objekten wird Galaktose, wie es fiir Glucose der Fall ist, mit relativ hoher Geschwindigkeit aufgenommen. Jedoch wird Galaktose-114C von Cucumis sntivus um ein Vielfaches starker veratmet als von Zen mnys. Bei Zen rnnys werden nach Applikation von Galaktose-l-14C sehr rasch Galaktose-1-phosphat, Saccharose, Glucose und Galaktose markiert. Es kommt insbesondere zu einer starken Akkumulation von Galaktose-1-phosphat. Von Cucumis sntit,us wird Galaktose-1-phosphat nicht akkumuliert. N eben Saccharose, Glucose und Galaktose erscheint auch Fruktose stark markiert. Der Einbau von Galaktose in die Polysaccharid-Fraktionen erfolgt bei Cucumis sntivus bedeutend starker als bei Zen mnys. Besonders groJ3 sind die Markierungsunterschiede innerhalb der Cellulose-Fraktionen. Die m6g1ichen Reaktionen des Galaktoseumsatzes werden an Hand eines Schemas diskutiert. Als Folge der Akkumulation von Galaktose-1-phosphat bei Zen mnys, kommt es zu einer Hemmung der Glucose-1-phosphat-umsetzenden Enzyme und die Biosynthese von Starke und Cellulose wird spezifisch gehemmt. Die Synthesewege der Polysaccharide werden im Zusammenhang mit den Versuchsergebnissen dikutiert.

Summary Galactose has a toxical effect on root tips of Zen mnys, whilst it is a favourable substrate for those of Cucumis sntivus. Galactose is taken up by both objects with a relatively high speed as it is the case with regard to glucose. But galactose-l-14 C is respirated much more strongly by Cucumis sntivus than by Zen mnys. After an application of galactose-l-HC to Zen mnys galactose-1-phosphate, sucrose, glucose, and galactose are very quickly marked. Especially a strong accumulation of galactose-1-phosphate is to be observed. By Cucumis sntivus galactose-1-phosphate is not accumulated. Besides sucrose, glucose, and galactose also fructose is strongly marked. The incorporation of galactose into the polysaccharide fractions takes place in cucumber roots in a considerably higher proportion than in corn roots. Particulary large are the differences in marking within the cellulose fractions. The possible reactions of the metabolism of galactose are discussed. In consequence of the accumulation of galactose-1-phosphate the enzymes transposing glucose-1-phosphate are inhibited, and the biosynthesis of starch ,tnd cellulose is specifically inhibited. The ways of synthesis taken by the polysaccharides are discussed in connection with the results of experiments.

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