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El tratamiento con propionil-L-carnitina mejora el estrés oxidativo asociado a la hipertensión arterial
ORIGINALES El tratamiento con propionil-L-carnitina mejora el estrés oxidativo asociado a la hipertensión arterial L. Gómez-Amoresa, A. Mate Barreroa, E. Revilla Torresb, C. Santa-María Pérezb y C. M. Vázquez Cuetoa Departamentos de a Fisiología y Zoología y b Bioquímica, Bromatología y Toxicología. Facultad de Farmacia. Universidad de Sevilla. Sevilla. España
Introducción. El trabajo trata de evaluar la acción antioxidante de la propionil-L-carnitina (PLC) en el hígado y corazón de ratas hipertensas (spontaneusly hypertensive rats [SHR]) y normotensas (Wistar-Kyoto [WKY]). Además, estudiamos su acción hipolipidemiante. Material y métodos. Ratas WKY y SHR de 4 semanas se tratan con PLC (200 mg/kg de peso corporal) 8 semanas. Las ratas WKY y SHR sin tratar se usan como controles. Resultados. La actividad glutatión peroxidasa disminuyó en el hígado y corazón de ratas SHR con respecto a las ratas WKY. La PLC restituyó los valores, acercándolos a los de las ratas WKY. La glutatión reductasa aumentó en ambos tejidos de ratas SHR. La PLC no modificó estos valores. No hubo diferencias en la superóxido dismutasa entre los cuatro grupos de animales. La actividad catalasa aumentó en el hígado de las ratas SHR. La PLC aumentó aún más esta actividad, no observándose cambios en el corazón entre los cuatro grupos de ratas. Los niveles de malondialdehído, índice de la peroxidación lipídica, aumentan en las ratas SHR, disminuyendo con el tratamiento con PLC. La peroxidación lipídica disminuye en las ratas normotensas con PLC con respecto a las WKY no tratadas. El tratamiento con PLC reduce los niveles séricos de triglicéridos en ratas WKY y SHR, no modificando los niveles de colesterol total y sus fracciones. No se observaron modificaciones en las presiones arteriales diastólicas y sistólicas como consecuencia de la administración de la PLC. Discusión. La hipertensión arterial cursa con cambios en la actividad antioxidante endógena en el hígado y corazón de ratas SHR, conduciendo a un daño oxidativo. La PLC mejora el estrés oxidativo observado en las ratas hipertensas, demostrado mediante una protección peroxidativa en estos tejidos. Además, la PLC mejora el daño oxidativo en ratas normotensas, mostrando un efecto beneficioso per se con actividad antioxidante. Se muestra la capacidad hipotrigliceridimiante de la PLC tanto en ratas normotensas como hipertensas.
Treatment with propionyl-L-carnitine improves oxidative stress associated to high blood pressure
Palabras clave: propionil-L-carnitina, hipertensión arterial, estrés oxidativo, enzimas antioxidantes, peroxidación lipídica, triglicéridos, colesterol.
Key words: propionyl-L-carnitine, high blood pressure, oxidative stress, antioxidant enzymes, lipid peroxidation, triglycerides, cholesterol.
Correspondencia: C. M. Vázquez Cueto. Departamento de Fisiología. Facultad de Farmacia. C./ Profesor García González, 2. 41012 Sevilla. Correo electrónico: [email protected] Recibido: 4 de octubre de 2004. Aceptado: 27 de diciembre de 2004.
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Introduction. Assess the antioxidant action of propionyl-L-carnitine (PLC) in liver and heart of hypertensive (spontaneously hypertensive rats [SHR]) and normotensive (Wistar-Kyoto [WKY]) rats. Furthermore, we studied its lipid lowering action. Material and methods. Four week old WKY and SHR rats were treated with PLC (200 mg/kg of body weight) for eight weeks. WKY and SHR rats without treatment were used as controls. Results. Glutation peroxidase activity decreased in liver and heart of SHR rats versus WKY ones. The PLC reestablished the values, approaching them to those of the WKY. Glutation reductase increased in both tissues of SHR. PLC did not change these values. There were no differences in the superoxide dismutase among the four animal groups. Catalase activity increased in the SHR liver. PLC increased this activity even more, no changes being observed in the heart among the four rat groups. Malondialdehyde levels, a lipid peroxidation index increased in SHR, decreasing with PLC treatment. Lipid peroxidation decreased in normotensive rats with PLC in regards to untreated WKY. Treatment with PLC reduced serum levels of triglycerides in WKY and SHR rats, not modifying the total cholesterol levels and their fractions. No changes were observed in diastolic and systolic blood pressure as a consequence of PLC administration. Discussion. High blood pressure occurs with changes in endogenous antioxidant activity in the liver and heart of SHR rats, leading to oxidative damage. PLC improves oxidative stress observed in hypertensive rats, demonstrated by peroxidative protection in these tissues. Furthermore, PLC improves oxidative harm in normotensive rats, showing a beneficial effect per se with antioxidant activity. The triglyceride lowering capacity of PLC in both normotensive and hypertensive rats is demonstrated.
Introducción Numerosas evidencias indican que el estrés oxidativo desempeña un papel importante en la fisiopatología de las enfermedades cardiovasculares como la hipertensión arterial1,2. Se ha propuesto que un incremento en la producción de especies reactivas de oxígeno en el endotelio vascular, principalmente aniones superóxido, poHipertensión. 2005;22(3):109-16
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dría constituir un importante mecanismo implicado en la disfunción endotelial observada en dicha enfermedad3, 4. El anión superóxido reacciona con el óxido nítrico formando peroxinitritos, dando lugar a una reducción en la disponibilidad de óxido nítrico5. Además se ha demostrado que la hipertensión arterial no sólo se asocia con un aumento del estrés oxidativo en el endotelio vascular, sino también con cambios en el estado oxidativo hepático y cardíaco6. La L-carnitina (β-hydroxy-γ-N-trimethylammonium-butyrato) es un cofactor esencial en el transporte de ácidos grasos de cadena larga desde el citosol a la mitocondria, donde sufren la β-oxidación con la consiguiente producción de energía. Está presente en el plasma y en los tejidos, bien como carnitina libre, bien unida a ácidos grasos formando derivados de acilcarnitina, tales como propionil-L-carnitina (PLC). La PLC muestra una alta afinidad por la enzima carnitina aciltransferasa mediante la cual se convierte en propionil-coenzima A y carnitina libre7, incrementando el pool intracelular de L-carnitina. Estudios realizados en seres humanos8 y en ratas9 han mostrado que el tratamiento con PLC aumenta la relajación del endotelio, aunque el(los) mecanismo(s) responsable(s) de esta acción no está(n) bien establecido(s). Recientemente se ha sugerido que la L-carnitina y la PLC actúan como “secuestradores” de radicales libres10-12 protegiendo a las células de las especies reactivas de oxígeno13-15. Otros estudios han puesto de manifiesto las propiedades antioxidantes de la L-carnitina y de la PLC en ratas viejas11,12,16 y ateroscleróticas17, en conejos con hipercolesterolemia18, en individuos infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)19, así como evitando el deterioro de la función renal provocado por la isquemia/reperfusión15. Por consiguiente, la PLC podría contribuir a la protección del endotelio vascular en la hipertensión arterial inducida por el daño oxidativo. Por otro lado, existen estudios que muestran la capacidad hipolipidemiante de la L-carnitina18, barajándose como uno de los mecanismos de acción en el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares. Teniendo en cuenta todas estas consideraciones, el objetivo del presente estudio ha sido determinar la capacidad antioxidante de la PLC en ratas espontáneamente hipertensas (SHR). Para ello se han determinado las actividades de las enzimas antioxidantes glutatión peroxidasa (GSH-Px), glutatión reductasa (GSH-Red), superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT), así como los niveles de malondialdehido (MDA), como medida de la peroxidación lipídica, en el hígado y corazón de ratas hipertensas y normotensas controles y tratadas con PLC. Además hemos estudiado el efecto hipolipidemiante de la PLC en las mismas condiciones experimentales. 110
Material y métodos Animales Este estudio se ha realizado utilizando ratas machos consanguíneas hipertensas (SHR) y normotensas (WKY) procedentes de Harlan Ibérica, S. A. (Barcelona, España), con cuatro semanas de edad. Los animales se mantuvieron en condiciones estándar (23±1o C, ciclos de 12 horas de luz/ 12 horas de oscuridad) y se alimentaron ad libitum con una dieta estándar con libre acceso al agua de bebida. Tanto las ratas SHR como las WKY se distribuyeron en dos grupos. A uno de los grupos se le suministró 0,2 g de PLC/kg de peso por día, en el agua de bebida, durante 8 semanas; el otro grupo sin tratamiento sirvió de control. Los estudios se realizaron de acuerdo con los “principios de cuidados de animales en el laboratorio” (National Institutes of Health Publication No. 86-23, revisado 1985). Durante el tiempo que duró el tratamiento se realizó un seguimiento semanal de las presiones arteriales diastólicas y sistólicas, empleando el método indirecto de oclusión en la cola, usando un medidor de presión NIPREM 645 (Cibertec, España). Las señales recogidas se tradujeron a través de un sistema de adquisición de datos acoplado al medidor de presión y con soporte informático. Los valores de presiones arteriales de cada rata se calcularon a partir de la media aritmética de 3-4 mediciones sucesivas, realizadas siempre a la misma hora de la mañana y evitando crear situaciones de estrés en el animal durante el proceso. Al terminar el tratamiento las ratas se sacrificaron bajo anestesia con dietiléter, obteniéndose la sangre mediante punción cardíaca. Para minimizar las variaciones diurnas las ratas se sacrificaron entre las 9:00 y las 10:00 horas. Se extrajeron los hígados y corazones rápidamente, se lavaron de restos de sangre con solución salina fría al 0,9% y a continuación se pesaron y se guardaron a –70o C. Para la obtención del suero la sangre se centrifuga a 3.500 × g durante 15 minutos, procediendo a continuación al estudio del perfil lipídico usando kits comerciales: colesterol total (Spinreact, España), colesterol HDL (Wiener, Argentina), colesterol LDL (Human, Alemania) y triglicéridos (BioSystems, España). Para la determinación de las actividades enzimáticas y de los niveles de MDA los tejidos se homogeneizaron en tampón Tris HCl (pH 7,4) conteniendo sacarosa 250 mM y DL-ditiotreitol 1 mM usando un homogeneizador de vidrio Potter Elvehjem (Selecta, Barcelona, España). Cada homogeneizado se centrifugó durante 20 minutos a 800 g. El sobrenadante resultante se utilizó para realizar las determinaciones antes
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citadas. La concentración de proteína en el sobrenadante se determinó por el método descrito por Lowry et al20.
te 10 minutos y se determinó la absorbancia de la fase orgánica (superior) a 532 nm. Para la curva estándar se utilizó 1,1,3,3-tetraethoxipropano.
Actividades enzimáticas
Métodos estadísticos
La actividad GSH-Px se ensayó mediante un sistema en el que la reducción del glutatión oxidado (GSSG) se acopla a la oxidación de NADPH por la glutatión reductasa21. La mezcla de ensayo contenía fosfato potásico, 50 mM (pH 7,5); EDTA, 1 mM; NaN3, 1 mM; glutatión reducido (GSH), 1 mM; NADPH, 0,2 mM; 1 U de glutatión reductasa y 0,05-0,2 mg de muestra de tejido. Después de 5 minutos de preincubación a 20-25o C la reacción se inició con la adición de H2O2 0,25 mM. La disminución de la absorbancia a 340 nm se siguió espectrofotométricamente. La actividad GSH-Red se determinó espectrofotométricamente midiendo la oxidación de NADPH a 340 nm22. La mezcla de reacción contenía fosfato potásico, 0,1 M (pH 7,5); EDTA, 0,5 mM; KCl, 200 mM; NADPH, 0,1 mM, y muestras de los tejidos. Después de 5 minutos de preincubación a 37o C la reacción se inició añadiendo 1 mM de GSSG. La actividad SOD se midió usando el método de la xantina-oxidasa-citocromo c descrito por McCord y Fridovich23. Las concentraciones finales en las cubetas fueron: fosfato potásico (pH 7,8), 50 mM; EDTA, 0,1 mM; citocromo c, 10 mM; xantina, 50 mM; cianuro, 2 mM; 1 U de catalasa y muestra de tejido 0,05-1 mg. La reacción se inició por la adición de 1 U de xantina-oxidasa. La actividad CAT se ensayó según el método descrito por Beers y Sizer24. Las concentraciones finales en las cubetas fueron: fosfato potásico, 500 mM (pH 7); H202, 100 mM, y muestra de tejido (0,05-0,1mg). Se siguió espectrofotométricamente la disminución de la absorbancia a 240 nm después de la adición del sustrato. Todas las medidas se realizaron en un espectrofotómetro Shimadzu 160 A en cubetas de cuarzo de 1,0 ml con un paso de luz de 1 cm.
Los resultados se expresan como medias ± ESM (error estándar de la media). Para la comparación estadística de los resultados se empleó un análisis de varianza (ANOVA). Para determinar las diferencias entre medias de los valores se utilizó la prueba de la “t” de Student y se consideraron las diferencias significativas a partir de una p<0,05.
Los niveles de peroxidación lipídica se valoraron mediante la determinación de MDA utilizando la técnica del ácido tiobarbitúrico (TBA) descrito por Esterbauer y Cheeseman25. Se tomaron 0,5 ml de tejido homogeneizado, previamente tratado con 25 μl de butilhidroxitolueno al 1% v/v en ácido acético glacial, y se mezclaron con 0,2 ml de laurilsulfato sódico (8%), 1 ml de ácido acético glacial (20% v/v) y 1 ml de ácido tiobarbitúrico al 0,8%. La mezcla se calentó a 95o C durante 30 minutos y el cromógeno resultante se extrajo con 3 ml de butanol. Posteriormente se centrifugó a 4.000 rpm duran00
Efecto de la PLC sobre la presión arterial y el perfil lipídico La figura 1 muestra la evolución de las presiones arteriales diastólicas y sistólicas a lo largo del período de estudio. Como era de esperar, ambas presiones aumentan con el tiempo en todos los grupos de animales estudiados, observándose
Presión arterial diastólica (mmHg)
A 180 160 140 120 100 80 2 WKY B Presión arterial sistólica (mmHg)
Determinación de los niveles de peroxidación lipídica
Resultados
4
6 8 Edad (semanas) WKYPLC SHR
10
4
10
12
SHRPLC
240 220 200 180 160 140 120 100 80 2 WKY
6 8 Edad (semanas) WKYPLC SHR
12
SHRPLC
Fig. 1. Presiones parciales diastólicas (A) y sistólicas (B) de los cuatro grupos experimentales de animales. WKY: ratas normotensas sin tratar con PLC; SHR: ratas hipertensas sin tratar con PLC; WKYPLC: ratas normotensas tratadas con PLC; SHRPLC: ratas hipertensas tratadas con PLC.
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WKY
Colesterol total (mg/dl) Colesterol HDL (mg/dl) Colesterol LDL (mg/dl) Triglicéridos (mg/dl)0
SHR
WKYPLC
SHRPLC
78 ± 4 56 ± 2*** 82 ± 2
53 ± 1***
26 ± 1 19 ± 1*** 25 ± 1
18 ± 1***
27 ± 2 18 ± 1*** 30 ± 1
19 ± 1**
53 ± 2 45 ± 1** 44 ± 4* 35 ± 2***
25 mU/mg proteína
TABLA 1 Niveles séricos de colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL y triglicéridos en los cuatro grupos experimentales de animales: WKY, SHR, WLYPLC y SHRPLC
WKY: ratas normotensas sin tratar con PLC; SHR: ratas hipertensas sin tratar con PLC; WKYPLC: ratas normotensas tratadas con PLC; SHRPLC: ratas hipertensas tratadas con PLC; ** p < 0,01; *** p < 0,001 frente al grupo normotenso WKY; # p > 0,01 frente al grupo hipertenso SHR.
un aumento significativo de las mismas en las ratas hipertensas con respecto a las normotensas. El tratamiento con PLC no modifica ambas presiones ni en las ratas normotensas ni en las hipertensas con relación a sus respectivos grupos controles, lo que indica que en nuestras condiciones experimentales la PLC no previno la instauración de la hipertensión arterial. El perfil lipídico de los cuatro grupos experimentales de animales se muestra en la tabla 1. Las ratas SHR tienen disminuidas las concentraciones de colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL y triglicéridos con respecto a las ratas normotensas controles. El tratamiento con PLC sólo afecta a los niveles de triglicéridos, observándose una disminución de los mismos tanto en las ratas normotensas como hipertensas, siendo el efecto más pronunciado en estas últimas.
*
15 10
*
*
5 0
,#
*
20
WKY
SHR
WKYPLC
SHRPLC
Fig. 3. Actividad de la glutatión reductasa (GSH-Red) en el hígado (barras oscuras) y el corazón (barras claras) de los cuatro grupos experimentales de animales. * p < 0,05 frente al grupo normotenso WKY. WKY: ratas normotensas sin tratar con PLC; SHR: ratas hipertensas sin tratar con PLC; WKYPLC: ratas normotensas tratadas con PLC; SHRPLC: ratas hipertensas tratadas con PLC.
Efecto de la PLC sobre la actividad de las enzimas antioxidantes La figura 2 muestra las actividades de la GSH-Px en el hígado y corazón de las ratas WKY y SHR tratadas y sin tratar con PLC. La actividad GSH-Px en hígado y corazón fue significantemente menor (57% y 22%, respectivamente) en las ratas SHR respecto a las ratas WKY. El tratamiento con PLC aumentó la actividad GSH-Px en las ratas SHR, alcanzándose valores similares a los observados en las ratas normotensas sin tratar. No se observaron cambios en las ratas WKY tratadas con PLC. Las actividades GSH-Red se muestran en la figura 3. Se observó un incremento de la actividad, tanto en el hígado como en el corazón, de ratas hipertensas (36% y 18%, respectivamente) con relación a las encontradas en las ratas WKY. El tratamiento con PLC no modificó la actividad de esta enzima ni en ratas SHR ni en ratas WKY. Las actividades SOD de los cuatro grupos experimentales de animales se muestran en la figura 4.
600
###
15
450 300
**
##
**
150 0
WKY
SHR
WKYPLC
SHRPLC
U/mg proteína
mU/mg proteína
750
12 9 6 3 0
Fig. 2. Actividad de la glutatión peroxidasa (GSH-Px) en el hígado (barras oscuras) y el corazón (barras claras) de los cuatro grupos experimentales de animales. **p < 0,01 frente al grupo normotenso WKY; ## p < 0,01; ### p < 0,001 frente al grupo hipertenso SHR. WKY: ratas normotensas sin tratar con PLC; SHR: ratas hipertensas sin tratar con PLC; WKYPLC: ratas normotensas tratadas con PLC; SHRPLC: ratas hipertensas tratadas con PLC.
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WKY
SHR
WKYPLC
SHRPLC
Fig. 4. Actividad de la superóxido dismutasa (SOD) en el hígado (barras oscuras) y el corazón (barras claras) de los cuatro grupos experimentales de animales. WKY: ratas normotensas sin tratar con PLC; SHR: ratas hipertensas sin tratar con PLC; WKYPLC: ratas normotensas tratadas con PLC; SHRPLC: ratas hipertensas tratadas con PLC.
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No se observaron cambios significativos en las actividades SOD entre las ratas WKY y SHR. El tratamiento con PLC tampoco modificó estas actividades. Los animales hipertensos expresaron en el hígado una mayor actividad CAT que en las ratas WKY (14%). El tratamiento con PLC incrementó la actividad CAT hepática tanto en ratas WKY como en ratas SHR con respecto a las ratas controles sin tratar (9% y 20% para WKY y SHR, respectivamente). Por otro lado, en el corazón las actividades CAT no mostraron diferencias significativas entre las ratas SHR y WKY, y sus actividades no se modificaron tras la administración crónica de PLC (fig. 5). Efecto de la PLC en la peroxidación lipídica Se observó un aumento significativo de los niveles de MDA tanto en hígado como en el corazón de ratas hipertensas con respecto a los niveles observados en ratas normotensas (34% y 40%, respectivamente). El tratamiento con PLC produjo una disminución en estos valores de un 40% en el hígado y un 34% en el corazón de ratas hipertensas. Además se observó una disminución en el hígado y en el corazón de los niveles de MDA en ratas normotensas después del tratamiento con PLC (25% y 23% para el hígado y el corazón, respectivamente) con relación a los niveles encontrados en ratas WKY no tratadas (fig. 6).
Discusión Son muchos los estudios que implican al estrés oxidativo en la fisiopatología de la hipertensión
**, # 500 *
U/mg proteína
400
*
300 200 20 15 10 5 0
WKY
SHR
WKYPLC
SHRPLC
Fig. 5. Actividad de la catalasa (CAT) en el hígado (barras oscuras) y el corazón (barras claras) de los cuatro grupos experimentales de animales. * p < 0,05; ** p < 0,01 frente al grupo normotenso WKY; # p < 0,05 frente al grupo hipertenso SHR. WKY: ratas normotensas sin tratar con PLC; SHR: ratas hipertensas sin tratar con PLC; WKYPLC: ratas normotensas tratadas con PLC; SHRPLC: ratas hipertensas tratadas con PLC.
00
nmol/30 min/mg proteína
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0,5
** **
0,4 *
0,3
* *
##
###
0,2 0,1 0
WKY
SHR
WKYPLC
SHRPLC
Fig. 6. Niveles de peroxidación lipídica en el hígado (barras oscuras) y el corazón (barras claras) de los cuatro grupos experimentales de animales. * p < 0,05; ** p < 0,01 frente al grupo normotenso WKY; ## p < 0,01; ### p < 0,001 frente al grupo hipertenso SHR. WKY: ratas normotensas sin tratar con PLC; SHR: ratas hipertensas sin tratar con PLC; WKYPLC: ratas normotensas tratadas con PLC; SHRPLC: ratas hipertensas tratadas con PLC.
arterial1-3, y por ello el uso terapéutico de sustancias antioxidantes en el tratamiento de la misma26. Por otro lado, la capacidad antioxidante de la PLC y de la L-carnitina se ha puesto de manifiesto mediante diferentes estudios10-14. Por todo ello, en el presente trabajo hemos estudiado algunos de los parámetros implicados en el estado oxidativo del organismo, tanto en la hipertensión arterial como tras el tratamiento con PLC, siendo el primer trabajo que aborda un posible efecto antioxidante de la PLC en la hipertensión arterial. Los resultados muestran que la administración crónica de PLC a ratas hipertensas, a pesar de no prevenir la instauración de la hipertensión arterial, mejora el estrés oxidativo asociado a la misma. El análisis de las actividades de las enzimas antioxidantes en hígado y corazón nos indica una disminución de la actividad de la GSH-Px en ratas hipertensas con respecto a las normotensas. Estos resultados están en concordancia con los mostrados en los estudios realizados en el hígado6,27-31 y corazón27. Sin embargo, Yuan et al32 no encontraron modificaciones en la actividad de esta enzima en el corazón de ratas hipertensas con respecto a las normotensas. Además, la disminución en la actividad enzimática de la GSHPx se correspondía con una reducción en los niveles de ARNm de la enzima en el hígado33, aunque su expresión aumentaba en el corazón de ratas SHR33, 34 con respecto a los niveles obtenidos en ratas WKY. La actividad GSH-Red aumentó en el hígado y el corazón de ratas SHR cuando se comparó con los resultados obtenidos en las ratas normotensas. Estos resultados concuerdan con estudios anteriores que mostraron un aumento de la actividad GSH-Red en el hígado6, 29, 31.
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La enzima GSH-Px cataliza la reducción de H2O2 para dar H2O y O2, utilizando como cofactor el GSH. Por tanto, la disminución de la actividad de la enzima GSH-Px encontrada en las ratas hipertensas podría deberse a una disminución en la concentración de GSH, como previamente se ha descrito en el hígado6, 35 y en el corazón32, 36 de ratas hipertensas, al comparar con sus controles normotensas WKY. El aumento de la actividad de la GSH-Red, enzima responsable de la regeneración del GSH a partir del GSSG en el hígado y corazón de ratas hipertensas, podría ser el resultado de una respuesta compensatoria a la disminución en la actividad de la GSH-Px para de esa forma producir una mayor cantidad del cofactor GSH6, 29. La actividad de la enzima CAT aumenta en el hígado de ratas hipertensas, no observándose modificaciones en el corazón de estas mismas ratas, todo ello cuando se compara con los resultados obtenidos en sus controles normotensas WKY. Estos resultados coinciden con estudios previos en el hígado y en el corazón29, 31, 33 de ratas hipertensas. Sin embargo, estudios realizados con ratas hipertensas de mayor edad a las de nuestro estudio (22-24 semanas) también mostraron un aumento de la actividad CAT en el corazón con respecto a sus controles normotensas28. Según nuestros resultados, la actividad SOD no se modificó ni en el hígado ni en el corazón de las ratas WKY y SHR. Resultados similares se observaron en el hígado de ratas hipertensas29, 33. Sin embargo, los resultados encontrados en la bibliografía en cuanto a la actividad de la SOD en el corazón de ratas hipertensas son contradictorios. Para algunos autores los resultados obtenidos coinciden con los nuestros31, 33, mientras que para otros la actividad SOD en corazón aumenta32 o disminuye28. La enzima SOD cataliza la dismutación del O2– · para formar H2O2 y O2. La CAT, al igual que la GSH-Px, cataliza la reducción del H2O2 para dar H2O y O2, pero, a diferencia de la GSH-Px, no precisa ningún cofactor. Cuando determinamos la relación GSH-Px/SOD en el hígado y el corazón de ratas SHR, observamos una disminución de la misma (52% y 21%, respectivamente) frente a sus valores en WKY, lo que implica una mayor producción de H2O2 por la SOD, junto con una eliminación menor de la misma por la GSH-Px, conduciendo todo ello a una mayor acumulación de H2O2 en las ratas hipertensas. Por otro lado, el aumento en la actividad CAT observado en el hígado de ratas hipertensas nos sugiere, al igual que a otros autores37, que se trata de una respuesta compensatoria a la disminución de la actividad de la enzima GSH-Px para de esa forma evitar la acumulación excesiva de H2O2. Por ello, cuando determinamos la 114
relación CAT/SOD en el hígado de ratas SHR observamos un aumento de un 19% con respecto a las ratas WKY, indicando una mayor contribución de la CAT en la eliminación del H2O2, que podría estar compensando la acumulación del H2O2 debida a la disminución de la actividad GSH-Px. Como consecuencia de estos cambios observados en la defensa antioxidante del organismo encontramos que los niveles de malondialdehido, marcador de la peroxidación lipídica, aumentan en un 35% y un 40% en el hígado y el corazón, respectivamente, de ratas hipertensas cuando se comparan con los resultados obtenidos en las ratas WKY. Estudios anteriores mostraron resultados similares6, 27-29. Una vez realizado el tratamiento crónico con PLC, observamos que la actividad de la GSH-Px aumentaba en el hígado y en el corazón de las ratas SHR, alcanzando valores encontrados en las ratas WKY. Por el contrario, la PLC no modificó la actividad GSH-Red ni en ratas normotensas ni hipertensas con respecto a sus respectivos controles. Estudios anteriores demostraron que la administración de L-carnitina producía un aumento en los niveles de GSH en ratas de edad avanzada11, 12, 16, en pacientes hemodializados38 y en conejos hipercolesterolémicos18. La síntesis de GSH se realiza en dos etapas que son dependientes de ATP, por lo que el aumento en la producción de energía promovido por la PLC podría facilitar la síntesis del glutatión reducido38, que a su vez conduciría a un incremento en la actividad de la GSH-Px11, 17, 35 y, consecuentemente, a un aumento en la cantidad de GSH tras la administración de PLC, mejorando el estado antioxidante del organismo. Cuando determinamos la relación GSH-Px/SOD, observamos que aumenta en las ratas hipertensas tratadas con PLC al compararlas con sus hipertensas controles SHR, tanto en el hígado (83%) como en el corazón (11%), indicando una menor acumulación de H2O2 en las ratas hipertensas tras el tratamiento con PLC. Esta menor acumulación de H2O2 también podría deberse al aumento observado en la actividad CAT después del tratamiento con PLC, donde en este caso un aumento en la actividad CAT va acompañado de un aumento de la actividad GSH-Px. Estos resultados podrían indicar que la PLC presenta un efecto directo sobre la actividad de ambas enzimas, hecho que se observa para la CAT, ya que igualmente aumenta en las ratas normotensas tratadas con PLC, pero no para la GSH-Px. También podría pensarse que ante situaciones que conllevan a una mayor producción de radicales libres (hipertensión arterial) el organismo responde mediante la puesta en marcha de todos los mecanismos posibles para la eliminación de estas sustancias tóxicas para el organismo.
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Como era de esperar, de los resultados obtenidos en cuanto a la actividad de las enzimas antioxidantes en las ratas SHR tras el tratamiento con PLC, los niveles de MDA, índice de la peroxidación lipídica, se normalizan en el hígado y el corazón de las ratas hipertensas, igualándose a los valores obtenidos en las ratas normotensas WKY. Pero, además, esta disminución en la peroxidación lipídica fue también observada en las ratas normotensas WKY tras el tratamiento con PLC al comparar con sus respectivos controles WKY sin tratamiento. Estos resultados coinciden con estudios anteriores que habían puesto de manifiesto una disminución de la peroxidación lipídica tras la administración de L-carnitina en el hígado, el corazón y otros tejidos35, 37, así como habían mostrado las propiedades antioxidantes de la PLC en condiciones donde existía un incremento en el proceso oxidativo sistémico15, 39. Junto con el estudio de la capacidad antioxidante de la PLC hemos evaluado el efecto de la PLC sobre el perfil lipídico. Nuestros resultados muestran una capacidad hipotrigliceridimiante de la PLC, que no solamente es denotado en las ratas hipertensas, sino también en las ratas normotensas. Estudios anteriores mostraron un efecto hipotrigliceridimiante de la L-carnitina en ratas hipertensas40 y diabéticas41, así como en conejos hipercolesterolémicos18. Sin embargo, habría que indicar que en estos estudios, a diferencia del nuestro, también se observaron disminuciones en los niveles de colesterol total, así como de sus fracciones. La disminución en los niveles séricos de triglicéridos que presenta la PLC podría deberse al papel fundamental que tiene en el metabolismo de los ácidos grasos. En conclusión, nuestros datos ponen en evidencia que existe daño oxidativo en el hígado y en el corazón de ratas hipertensas con respecto a las ratas normotensas que conduce a un aumento en la peroxidación lipídica en estos tejidos. La suplementación con PLC mejora el estrés oxidativo observado en las ratas hipertensas, mostrado mediante una protección peroxidativa en estos tejidos. Además, la PLC también actuó sobre el estado oxidativo en ratas normotensas, indicando un efecto benefecioso per se de la PLC como actividad antioxidante. Por otro lado, se demuestra la actividad hipotrigliceridimiante de la PLC en ratas normotensas y de forma más pronunciada en las ratas hipertensas. Todos estos resultados no fueron suficientes para prevenir la instauración de la hipertensión arterial, ya que no se observaron cambios en los valores de presiones arteriales diastólicas y sistólicas entre las ratas tratadas y no tratadas, indicando que la PLC actúa directamente sobre el sistema antioxidante y el perfil lipídico del organismo con independencia de las modificaciones en las presiones arteriales. 00
Agradecimientos Este trabajo ha sido posible gracias a las ayudas FIS PI020179 del Fondo de Investigación Sanitaria, Ministerio de Sanidad y Consumo, así como al Proyecto de Investigación financiado por los Laboratorios Sigma-Tau España, S. A. Bibliografía 1. Zalba G, San José G, Moreno MU, Fortuño MA, Fortuño A, Beaumont FJ, et al. Oxidative stress in arterial hipertensión. Role of NAD(P)H oxidase. Hypertension. 2001;38:1395-9. 2. Hülker S, McMaster D, McKeown PP, Bayraktutan U. Impaired activities of antioxidant enzymes elicit endothelial dysfunction in spontaneous hypertensive rats despite enhanced vascular nitric oxide generation. Cardiovasc Res. 2003;59:488-500. 3. Wu R, Millette E, Wu L, Champlain J. Enhanced superoxide anion formation in vascular tissues from spontaneously hypertensive and desoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats. J Hypertens. 2001;19:741-8. 4. Zalba G, Beaumont FJ, San José G, Fortuño A, Fortuño MA, Etayo JC, et al. Vascular NADH/NADPH oxidase is involved in enhanced superoxido production in spontaneously hypertensive rats. Hypertension. 2000;35:1055-61. 5. Drexler H. Nitric oxide and coronary endotelial dysfunction in humans. Cardiovasc Res. 1999;43:572-9. 6. Cediel E, Sanz-Rosa D, Oubina MP, de las Heras N, González Pacheco FR, Vegazo O, et al. Effect of AT1 receptor blockade on hepatic redox status in SHR: possible relevance for endothelail function? Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2003;285:R674-81. 7. Wiseman LR, Brodgen RN. Propionyl-L-carnitine. Drugs Aging. 1998;12:243-8. 8. Cipolla MJ, Nicoloff A, Rebello T, Amato A, Porter JM. Propionyl-L-carnitine dilates human subcutaneous arteries through an endothelium-dependent mechanism. J Vasc Surg. 1999;29:1097-103. 9. Mauriello A, Sangiorgi G, Orlandi A, Schiaroli S, Perfumo S, Spagnoli LG. Effect of long-term treatment with propionylL-carnitine on smooth muscle cell polyploidy in Spontaneously Hypertensive Rats. Hipertensión. 1996;28:177-82. 10. Vanella A, Russo A, Acquaviva R, Campisi A, Di Giacomo C, Sorrenti V, et al. L-propionyl-carnitine as superoxide scanveger, antioxidant, and DNA cleavage protector. Cell Biology Toxicol. 2000;16:99-104. 11. Arockia Rani PJ, Panneerselvam C. Carnitine as a free radical scavenger in aging. Exp Gerontol. 2001;36:1713-26. 12. Kalaiselvi T, Panneerselvan C. Effect of L-carnitine on the status of lipid peroxidation and antioxidants in aging rats. J Nutr Biochem. 1998;9:575-81. 13. Bertelli A, Conte A, Ronca G. L-propionyl carnitine protects erythrocytes and low density lipoproteins against peroxidation. Drugs Exp Clin Res. 1994;20:191-7. 14. Palmieri L, Ronca F, Malengo S, Bertelli A. Protection of beta-thalassaemic erythrocytes from oxidative stress by propionyl carnitine. Int J Tissue React. 1994;16:121-9. 15. Mister M, Noris M, Szymczuk J, Azzollini N, Aiello S, Abbate M, et al. Propionyl-L-carnitine prevents renal function deterioration due to ischemia/reperfusion. Kidney International. 2002;61:1064-78. 16. Hariri R, Alonso DR, Hajjar DP, Cobetti D, Weksler ME. Ageing and atherosclerosis. J Exp Med. 1986;164:1171-8. 17. Dayanandan A, Kumar P, Panneerselvam, C. Protective role of L-carnitine on liver and heart lipid peroxidation in atherosclerotic rats. J Nutr Biochem 2001; 12: 254-257. 18. Sayed-Ahmed MM, Khattab MM, Gad MZ, Mostafa N. L-carnitine prevents the progression of atherosclerotic lesions in hypercholesterolaemic rabbits. Pharmacological Res. 2001;44:235-42. 19. Moretti S, Famularo G, Boschini A, Santini G, Trinchieri V, Luccci L, et al. L-carnitine reduces lymphocyte apoptosis
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Introducción. El trabajo trata de evaluar la acción antioxidante de la propionil-L-carnitina (PLC) en el hígado y corazón de ratas hipertensas (spontaneusly hypertensive rats [SHR]) y normotensas (Wistar-Kyoto [WKY]). Además, estudiamos su acción hipolipidemiante. Material y métodos. Ratas WKY y SHR de 4 semanas se tratan con PLC (200 mg/kg de peso corporal) 8 semanas. Las ratas WKY y SHR sin tratar se usan como controles. Resultados. La actividad glutatión peroxidasa disminuyó en el hígado y corazón de ratas SHR con respecto a las ratas WKY. La PLC restituyó los valores, acercándolos a los de las ratas WKY. La glutatión reductasa aumentó en ambos tejidos de ratas SHR. La PLC no modificó estos valores. No hubo diferencias en la superóxido dismutasa entre los cuatro grupos de animales. La actividad catalasa aumentó en el hígado de las ratas SHR. La PLC aumentó aún más esta actividad, no observándose cambios en el corazón entre los cuatro grupos de ratas. Los niveles de malondialdehído, índice de la peroxidación lipídica, aumentan en las ratas SHR, disminuyendo con el tratamiento con PLC. La peroxidación lipídica disminuye en las ratas normotensas con PLC con respecto a las WKY no tratadas. El tratamiento con PLC reduce los niveles séricos de triglicéridos en ratas WKY y SHR, no modificando los niveles de colesterol total y sus fracciones. No se observaron modificaciones en las presiones arteriales diastólicas y sistólicas como consecuencia de la administración de la PLC. Discusión. La hipertensión arterial cursa con cambios en la actividad antioxidante endógena en el hígado y corazón de ratas SHR, conduciendo a un daño oxidativo. La PLC mejora el estrés oxidativo observado en las ratas hipertensas, demostrado mediante una protección peroxidativa en estos tejidos. Además, la PLC mejora el daño oxidativo en ratas normotensas, mostrando un efecto beneficioso per se con actividad antioxidante. Se muestra la capacidad hipotrigliceridimiante de la PLC tanto en ratas normotensas como hipertensas.
Treatment with propionyl-L-carnitine improves oxidative stress associated to high blood pressure
Palabras clave: propionil-L-carnitina, hipertensión arterial, estrés oxidativo, enzimas antioxidantes, peroxidación lipídica, triglicéridos, colesterol.
Key words: propionyl-L-carnitine, high blood pressure, oxidative stress, antioxidant enzymes, lipid peroxidation, triglycerides, cholesterol.
Correspondencia: C. M. Vázquez Cueto. Departamento de Fisiología. Facultad de Farmacia. C./ Profesor García González, 2. 41012 Sevilla. Correo electrónico: [email protected] Recibido: 4 de octubre de 2004. Aceptado: 27 de diciembre de 2004.
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Introduction. Assess the antioxidant action of propionyl-L-carnitine (PLC) in liver and heart of hypertensive (spontaneously hypertensive rats [SHR]) and normotensive (Wistar-Kyoto [WKY]) rats. Furthermore, we studied its lipid lowering action. Material and methods. Four week old WKY and SHR rats were treated with PLC (200 mg/kg of body weight) for eight weeks. WKY and SHR rats without treatment were used as controls. Results. Glutation peroxidase activity decreased in liver and heart of SHR rats versus WKY ones. The PLC reestablished the values, approaching them to those of the WKY. Glutation reductase increased in both tissues of SHR. PLC did not change these values. There were no differences in the superoxide dismutase among the four animal groups. Catalase activity increased in the SHR liver. PLC increased this activity even more, no changes being observed in the heart among the four rat groups. Malondialdehyde levels, a lipid peroxidation index increased in SHR, decreasing with PLC treatment. Lipid peroxidation decreased in normotensive rats with PLC in regards to untreated WKY. Treatment with PLC reduced serum levels of triglycerides in WKY and SHR rats, not modifying the total cholesterol levels and their fractions. No changes were observed in diastolic and systolic blood pressure as a consequence of PLC administration. Discussion. High blood pressure occurs with changes in endogenous antioxidant activity in the liver and heart of SHR rats, leading to oxidative damage. PLC improves oxidative stress observed in hypertensive rats, demonstrated by peroxidative protection in these tissues. Furthermore, PLC improves oxidative harm in normotensive rats, showing a beneficial effect per se with antioxidant activity. The triglyceride lowering capacity of PLC in both normotensive and hypertensive rats is demonstrated.
Introducción Numerosas evidencias indican que el estrés oxidativo desempeña un papel importante en la fisiopatología de las enfermedades cardiovasculares como la hipertensión arterial1,2. Se ha propuesto que un incremento en la producción de especies reactivas de oxígeno en el endotelio vascular, principalmente aniones superóxido, poHipertensión. 2005;22(3):109-16
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dría constituir un importante mecanismo implicado en la disfunción endotelial observada en dicha enfermedad3, 4. El anión superóxido reacciona con el óxido nítrico formando peroxinitritos, dando lugar a una reducción en la disponibilidad de óxido nítrico5. Además se ha demostrado que la hipertensión arterial no sólo se asocia con un aumento del estrés oxidativo en el endotelio vascular, sino también con cambios en el estado oxidativo hepático y cardíaco6. La L-carnitina (β-hydroxy-γ-N-trimethylammonium-butyrato) es un cofactor esencial en el transporte de ácidos grasos de cadena larga desde el citosol a la mitocondria, donde sufren la β-oxidación con la consiguiente producción de energía. Está presente en el plasma y en los tejidos, bien como carnitina libre, bien unida a ácidos grasos formando derivados de acilcarnitina, tales como propionil-L-carnitina (PLC). La PLC muestra una alta afinidad por la enzima carnitina aciltransferasa mediante la cual se convierte en propionil-coenzima A y carnitina libre7, incrementando el pool intracelular de L-carnitina. Estudios realizados en seres humanos8 y en ratas9 han mostrado que el tratamiento con PLC aumenta la relajación del endotelio, aunque el(los) mecanismo(s) responsable(s) de esta acción no está(n) bien establecido(s). Recientemente se ha sugerido que la L-carnitina y la PLC actúan como “secuestradores” de radicales libres10-12 protegiendo a las células de las especies reactivas de oxígeno13-15. Otros estudios han puesto de manifiesto las propiedades antioxidantes de la L-carnitina y de la PLC en ratas viejas11,12,16 y ateroscleróticas17, en conejos con hipercolesterolemia18, en individuos infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)19, así como evitando el deterioro de la función renal provocado por la isquemia/reperfusión15. Por consiguiente, la PLC podría contribuir a la protección del endotelio vascular en la hipertensión arterial inducida por el daño oxidativo. Por otro lado, existen estudios que muestran la capacidad hipolipidemiante de la L-carnitina18, barajándose como uno de los mecanismos de acción en el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares. Teniendo en cuenta todas estas consideraciones, el objetivo del presente estudio ha sido determinar la capacidad antioxidante de la PLC en ratas espontáneamente hipertensas (SHR). Para ello se han determinado las actividades de las enzimas antioxidantes glutatión peroxidasa (GSH-Px), glutatión reductasa (GSH-Red), superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT), así como los niveles de malondialdehido (MDA), como medida de la peroxidación lipídica, en el hígado y corazón de ratas hipertensas y normotensas controles y tratadas con PLC. Además hemos estudiado el efecto hipolipidemiante de la PLC en las mismas condiciones experimentales. 110
Material y métodos Animales Este estudio se ha realizado utilizando ratas machos consanguíneas hipertensas (SHR) y normotensas (WKY) procedentes de Harlan Ibérica, S. A. (Barcelona, España), con cuatro semanas de edad. Los animales se mantuvieron en condiciones estándar (23±1o C, ciclos de 12 horas de luz/ 12 horas de oscuridad) y se alimentaron ad libitum con una dieta estándar con libre acceso al agua de bebida. Tanto las ratas SHR como las WKY se distribuyeron en dos grupos. A uno de los grupos se le suministró 0,2 g de PLC/kg de peso por día, en el agua de bebida, durante 8 semanas; el otro grupo sin tratamiento sirvió de control. Los estudios se realizaron de acuerdo con los “principios de cuidados de animales en el laboratorio” (National Institutes of Health Publication No. 86-23, revisado 1985). Durante el tiempo que duró el tratamiento se realizó un seguimiento semanal de las presiones arteriales diastólicas y sistólicas, empleando el método indirecto de oclusión en la cola, usando un medidor de presión NIPREM 645 (Cibertec, España). Las señales recogidas se tradujeron a través de un sistema de adquisición de datos acoplado al medidor de presión y con soporte informático. Los valores de presiones arteriales de cada rata se calcularon a partir de la media aritmética de 3-4 mediciones sucesivas, realizadas siempre a la misma hora de la mañana y evitando crear situaciones de estrés en el animal durante el proceso. Al terminar el tratamiento las ratas se sacrificaron bajo anestesia con dietiléter, obteniéndose la sangre mediante punción cardíaca. Para minimizar las variaciones diurnas las ratas se sacrificaron entre las 9:00 y las 10:00 horas. Se extrajeron los hígados y corazones rápidamente, se lavaron de restos de sangre con solución salina fría al 0,9% y a continuación se pesaron y se guardaron a –70o C. Para la obtención del suero la sangre se centrifuga a 3.500 × g durante 15 minutos, procediendo a continuación al estudio del perfil lipídico usando kits comerciales: colesterol total (Spinreact, España), colesterol HDL (Wiener, Argentina), colesterol LDL (Human, Alemania) y triglicéridos (BioSystems, España). Para la determinación de las actividades enzimáticas y de los niveles de MDA los tejidos se homogeneizaron en tampón Tris HCl (pH 7,4) conteniendo sacarosa 250 mM y DL-ditiotreitol 1 mM usando un homogeneizador de vidrio Potter Elvehjem (Selecta, Barcelona, España). Cada homogeneizado se centrifugó durante 20 minutos a 800 g. El sobrenadante resultante se utilizó para realizar las determinaciones antes
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citadas. La concentración de proteína en el sobrenadante se determinó por el método descrito por Lowry et al20.
te 10 minutos y se determinó la absorbancia de la fase orgánica (superior) a 532 nm. Para la curva estándar se utilizó 1,1,3,3-tetraethoxipropano.
Actividades enzimáticas
Métodos estadísticos
La actividad GSH-Px se ensayó mediante un sistema en el que la reducción del glutatión oxidado (GSSG) se acopla a la oxidación de NADPH por la glutatión reductasa21. La mezcla de ensayo contenía fosfato potásico, 50 mM (pH 7,5); EDTA, 1 mM; NaN3, 1 mM; glutatión reducido (GSH), 1 mM; NADPH, 0,2 mM; 1 U de glutatión reductasa y 0,05-0,2 mg de muestra de tejido. Después de 5 minutos de preincubación a 20-25o C la reacción se inició con la adición de H2O2 0,25 mM. La disminución de la absorbancia a 340 nm se siguió espectrofotométricamente. La actividad GSH-Red se determinó espectrofotométricamente midiendo la oxidación de NADPH a 340 nm22. La mezcla de reacción contenía fosfato potásico, 0,1 M (pH 7,5); EDTA, 0,5 mM; KCl, 200 mM; NADPH, 0,1 mM, y muestras de los tejidos. Después de 5 minutos de preincubación a 37o C la reacción se inició añadiendo 1 mM de GSSG. La actividad SOD se midió usando el método de la xantina-oxidasa-citocromo c descrito por McCord y Fridovich23. Las concentraciones finales en las cubetas fueron: fosfato potásico (pH 7,8), 50 mM; EDTA, 0,1 mM; citocromo c, 10 mM; xantina, 50 mM; cianuro, 2 mM; 1 U de catalasa y muestra de tejido 0,05-1 mg. La reacción se inició por la adición de 1 U de xantina-oxidasa. La actividad CAT se ensayó según el método descrito por Beers y Sizer24. Las concentraciones finales en las cubetas fueron: fosfato potásico, 500 mM (pH 7); H202, 100 mM, y muestra de tejido (0,05-0,1mg). Se siguió espectrofotométricamente la disminución de la absorbancia a 240 nm después de la adición del sustrato. Todas las medidas se realizaron en un espectrofotómetro Shimadzu 160 A en cubetas de cuarzo de 1,0 ml con un paso de luz de 1 cm.
Los resultados se expresan como medias ± ESM (error estándar de la media). Para la comparación estadística de los resultados se empleó un análisis de varianza (ANOVA). Para determinar las diferencias entre medias de los valores se utilizó la prueba de la “t” de Student y se consideraron las diferencias significativas a partir de una p<0,05.
Los niveles de peroxidación lipídica se valoraron mediante la determinación de MDA utilizando la técnica del ácido tiobarbitúrico (TBA) descrito por Esterbauer y Cheeseman25. Se tomaron 0,5 ml de tejido homogeneizado, previamente tratado con 25 μl de butilhidroxitolueno al 1% v/v en ácido acético glacial, y se mezclaron con 0,2 ml de laurilsulfato sódico (8%), 1 ml de ácido acético glacial (20% v/v) y 1 ml de ácido tiobarbitúrico al 0,8%. La mezcla se calentó a 95o C durante 30 minutos y el cromógeno resultante se extrajo con 3 ml de butanol. Posteriormente se centrifugó a 4.000 rpm duran00
Efecto de la PLC sobre la presión arterial y el perfil lipídico La figura 1 muestra la evolución de las presiones arteriales diastólicas y sistólicas a lo largo del período de estudio. Como era de esperar, ambas presiones aumentan con el tiempo en todos los grupos de animales estudiados, observándose
Presión arterial diastólica (mmHg)
A 180 160 140 120 100 80 2 WKY B Presión arterial sistólica (mmHg)
Determinación de los niveles de peroxidación lipídica
Resultados
4
6 8 Edad (semanas) WKYPLC SHR
10
4
10
12
SHRPLC
240 220 200 180 160 140 120 100 80 2 WKY
6 8 Edad (semanas) WKYPLC SHR
12
SHRPLC
Fig. 1. Presiones parciales diastólicas (A) y sistólicas (B) de los cuatro grupos experimentales de animales. WKY: ratas normotensas sin tratar con PLC; SHR: ratas hipertensas sin tratar con PLC; WKYPLC: ratas normotensas tratadas con PLC; SHRPLC: ratas hipertensas tratadas con PLC.
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WKY
Colesterol total (mg/dl) Colesterol HDL (mg/dl) Colesterol LDL (mg/dl) Triglicéridos (mg/dl)0
SHR
WKYPLC
SHRPLC
78 ± 4 56 ± 2*** 82 ± 2
53 ± 1***
26 ± 1 19 ± 1*** 25 ± 1
18 ± 1***
27 ± 2 18 ± 1*** 30 ± 1
19 ± 1**
53 ± 2 45 ± 1** 44 ± 4* 35 ± 2***
25 mU/mg proteína
TABLA 1 Niveles séricos de colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL y triglicéridos en los cuatro grupos experimentales de animales: WKY, SHR, WLYPLC y SHRPLC
WKY: ratas normotensas sin tratar con PLC; SHR: ratas hipertensas sin tratar con PLC; WKYPLC: ratas normotensas tratadas con PLC; SHRPLC: ratas hipertensas tratadas con PLC; ** p < 0,01; *** p < 0,001 frente al grupo normotenso WKY; # p > 0,01 frente al grupo hipertenso SHR.
un aumento significativo de las mismas en las ratas hipertensas con respecto a las normotensas. El tratamiento con PLC no modifica ambas presiones ni en las ratas normotensas ni en las hipertensas con relación a sus respectivos grupos controles, lo que indica que en nuestras condiciones experimentales la PLC no previno la instauración de la hipertensión arterial. El perfil lipídico de los cuatro grupos experimentales de animales se muestra en la tabla 1. Las ratas SHR tienen disminuidas las concentraciones de colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL y triglicéridos con respecto a las ratas normotensas controles. El tratamiento con PLC sólo afecta a los niveles de triglicéridos, observándose una disminución de los mismos tanto en las ratas normotensas como hipertensas, siendo el efecto más pronunciado en estas últimas.
*
15 10
*
*
5 0
,#
*
20
WKY
SHR
WKYPLC
SHRPLC
Fig. 3. Actividad de la glutatión reductasa (GSH-Red) en el hígado (barras oscuras) y el corazón (barras claras) de los cuatro grupos experimentales de animales. * p < 0,05 frente al grupo normotenso WKY. WKY: ratas normotensas sin tratar con PLC; SHR: ratas hipertensas sin tratar con PLC; WKYPLC: ratas normotensas tratadas con PLC; SHRPLC: ratas hipertensas tratadas con PLC.
Efecto de la PLC sobre la actividad de las enzimas antioxidantes La figura 2 muestra las actividades de la GSH-Px en el hígado y corazón de las ratas WKY y SHR tratadas y sin tratar con PLC. La actividad GSH-Px en hígado y corazón fue significantemente menor (57% y 22%, respectivamente) en las ratas SHR respecto a las ratas WKY. El tratamiento con PLC aumentó la actividad GSH-Px en las ratas SHR, alcanzándose valores similares a los observados en las ratas normotensas sin tratar. No se observaron cambios en las ratas WKY tratadas con PLC. Las actividades GSH-Red se muestran en la figura 3. Se observó un incremento de la actividad, tanto en el hígado como en el corazón, de ratas hipertensas (36% y 18%, respectivamente) con relación a las encontradas en las ratas WKY. El tratamiento con PLC no modificó la actividad de esta enzima ni en ratas SHR ni en ratas WKY. Las actividades SOD de los cuatro grupos experimentales de animales se muestran en la figura 4.
600
###
15
450 300
**
##
**
150 0
WKY
SHR
WKYPLC
SHRPLC
U/mg proteína
mU/mg proteína
750
12 9 6 3 0
Fig. 2. Actividad de la glutatión peroxidasa (GSH-Px) en el hígado (barras oscuras) y el corazón (barras claras) de los cuatro grupos experimentales de animales. **p < 0,01 frente al grupo normotenso WKY; ## p < 0,01; ### p < 0,001 frente al grupo hipertenso SHR. WKY: ratas normotensas sin tratar con PLC; SHR: ratas hipertensas sin tratar con PLC; WKYPLC: ratas normotensas tratadas con PLC; SHRPLC: ratas hipertensas tratadas con PLC.
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WKY
SHR
WKYPLC
SHRPLC
Fig. 4. Actividad de la superóxido dismutasa (SOD) en el hígado (barras oscuras) y el corazón (barras claras) de los cuatro grupos experimentales de animales. WKY: ratas normotensas sin tratar con PLC; SHR: ratas hipertensas sin tratar con PLC; WKYPLC: ratas normotensas tratadas con PLC; SHRPLC: ratas hipertensas tratadas con PLC.
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No se observaron cambios significativos en las actividades SOD entre las ratas WKY y SHR. El tratamiento con PLC tampoco modificó estas actividades. Los animales hipertensos expresaron en el hígado una mayor actividad CAT que en las ratas WKY (14%). El tratamiento con PLC incrementó la actividad CAT hepática tanto en ratas WKY como en ratas SHR con respecto a las ratas controles sin tratar (9% y 20% para WKY y SHR, respectivamente). Por otro lado, en el corazón las actividades CAT no mostraron diferencias significativas entre las ratas SHR y WKY, y sus actividades no se modificaron tras la administración crónica de PLC (fig. 5). Efecto de la PLC en la peroxidación lipídica Se observó un aumento significativo de los niveles de MDA tanto en hígado como en el corazón de ratas hipertensas con respecto a los niveles observados en ratas normotensas (34% y 40%, respectivamente). El tratamiento con PLC produjo una disminución en estos valores de un 40% en el hígado y un 34% en el corazón de ratas hipertensas. Además se observó una disminución en el hígado y en el corazón de los niveles de MDA en ratas normotensas después del tratamiento con PLC (25% y 23% para el hígado y el corazón, respectivamente) con relación a los niveles encontrados en ratas WKY no tratadas (fig. 6).
Discusión Son muchos los estudios que implican al estrés oxidativo en la fisiopatología de la hipertensión
**, # 500 *
U/mg proteína
400
*
300 200 20 15 10 5 0
WKY
SHR
WKYPLC
SHRPLC
Fig. 5. Actividad de la catalasa (CAT) en el hígado (barras oscuras) y el corazón (barras claras) de los cuatro grupos experimentales de animales. * p < 0,05; ** p < 0,01 frente al grupo normotenso WKY; # p < 0,05 frente al grupo hipertenso SHR. WKY: ratas normotensas sin tratar con PLC; SHR: ratas hipertensas sin tratar con PLC; WKYPLC: ratas normotensas tratadas con PLC; SHRPLC: ratas hipertensas tratadas con PLC.
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nmol/30 min/mg proteína
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0,5
** **
0,4 *
0,3
* *
##
###
0,2 0,1 0
WKY
SHR
WKYPLC
SHRPLC
Fig. 6. Niveles de peroxidación lipídica en el hígado (barras oscuras) y el corazón (barras claras) de los cuatro grupos experimentales de animales. * p < 0,05; ** p < 0,01 frente al grupo normotenso WKY; ## p < 0,01; ### p < 0,001 frente al grupo hipertenso SHR. WKY: ratas normotensas sin tratar con PLC; SHR: ratas hipertensas sin tratar con PLC; WKYPLC: ratas normotensas tratadas con PLC; SHRPLC: ratas hipertensas tratadas con PLC.
arterial1-3, y por ello el uso terapéutico de sustancias antioxidantes en el tratamiento de la misma26. Por otro lado, la capacidad antioxidante de la PLC y de la L-carnitina se ha puesto de manifiesto mediante diferentes estudios10-14. Por todo ello, en el presente trabajo hemos estudiado algunos de los parámetros implicados en el estado oxidativo del organismo, tanto en la hipertensión arterial como tras el tratamiento con PLC, siendo el primer trabajo que aborda un posible efecto antioxidante de la PLC en la hipertensión arterial. Los resultados muestran que la administración crónica de PLC a ratas hipertensas, a pesar de no prevenir la instauración de la hipertensión arterial, mejora el estrés oxidativo asociado a la misma. El análisis de las actividades de las enzimas antioxidantes en hígado y corazón nos indica una disminución de la actividad de la GSH-Px en ratas hipertensas con respecto a las normotensas. Estos resultados están en concordancia con los mostrados en los estudios realizados en el hígado6,27-31 y corazón27. Sin embargo, Yuan et al32 no encontraron modificaciones en la actividad de esta enzima en el corazón de ratas hipertensas con respecto a las normotensas. Además, la disminución en la actividad enzimática de la GSHPx se correspondía con una reducción en los niveles de ARNm de la enzima en el hígado33, aunque su expresión aumentaba en el corazón de ratas SHR33, 34 con respecto a los niveles obtenidos en ratas WKY. La actividad GSH-Red aumentó en el hígado y el corazón de ratas SHR cuando se comparó con los resultados obtenidos en las ratas normotensas. Estos resultados concuerdan con estudios anteriores que mostraron un aumento de la actividad GSH-Red en el hígado6, 29, 31.
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La enzima GSH-Px cataliza la reducción de H2O2 para dar H2O y O2, utilizando como cofactor el GSH. Por tanto, la disminución de la actividad de la enzima GSH-Px encontrada en las ratas hipertensas podría deberse a una disminución en la concentración de GSH, como previamente se ha descrito en el hígado6, 35 y en el corazón32, 36 de ratas hipertensas, al comparar con sus controles normotensas WKY. El aumento de la actividad de la GSH-Red, enzima responsable de la regeneración del GSH a partir del GSSG en el hígado y corazón de ratas hipertensas, podría ser el resultado de una respuesta compensatoria a la disminución en la actividad de la GSH-Px para de esa forma producir una mayor cantidad del cofactor GSH6, 29. La actividad de la enzima CAT aumenta en el hígado de ratas hipertensas, no observándose modificaciones en el corazón de estas mismas ratas, todo ello cuando se compara con los resultados obtenidos en sus controles normotensas WKY. Estos resultados coinciden con estudios previos en el hígado y en el corazón29, 31, 33 de ratas hipertensas. Sin embargo, estudios realizados con ratas hipertensas de mayor edad a las de nuestro estudio (22-24 semanas) también mostraron un aumento de la actividad CAT en el corazón con respecto a sus controles normotensas28. Según nuestros resultados, la actividad SOD no se modificó ni en el hígado ni en el corazón de las ratas WKY y SHR. Resultados similares se observaron en el hígado de ratas hipertensas29, 33. Sin embargo, los resultados encontrados en la bibliografía en cuanto a la actividad de la SOD en el corazón de ratas hipertensas son contradictorios. Para algunos autores los resultados obtenidos coinciden con los nuestros31, 33, mientras que para otros la actividad SOD en corazón aumenta32 o disminuye28. La enzima SOD cataliza la dismutación del O2– · para formar H2O2 y O2. La CAT, al igual que la GSH-Px, cataliza la reducción del H2O2 para dar H2O y O2, pero, a diferencia de la GSH-Px, no precisa ningún cofactor. Cuando determinamos la relación GSH-Px/SOD en el hígado y el corazón de ratas SHR, observamos una disminución de la misma (52% y 21%, respectivamente) frente a sus valores en WKY, lo que implica una mayor producción de H2O2 por la SOD, junto con una eliminación menor de la misma por la GSH-Px, conduciendo todo ello a una mayor acumulación de H2O2 en las ratas hipertensas. Por otro lado, el aumento en la actividad CAT observado en el hígado de ratas hipertensas nos sugiere, al igual que a otros autores37, que se trata de una respuesta compensatoria a la disminución de la actividad de la enzima GSH-Px para de esa forma evitar la acumulación excesiva de H2O2. Por ello, cuando determinamos la 114
relación CAT/SOD en el hígado de ratas SHR observamos un aumento de un 19% con respecto a las ratas WKY, indicando una mayor contribución de la CAT en la eliminación del H2O2, que podría estar compensando la acumulación del H2O2 debida a la disminución de la actividad GSH-Px. Como consecuencia de estos cambios observados en la defensa antioxidante del organismo encontramos que los niveles de malondialdehido, marcador de la peroxidación lipídica, aumentan en un 35% y un 40% en el hígado y el corazón, respectivamente, de ratas hipertensas cuando se comparan con los resultados obtenidos en las ratas WKY. Estudios anteriores mostraron resultados similares6, 27-29. Una vez realizado el tratamiento crónico con PLC, observamos que la actividad de la GSH-Px aumentaba en el hígado y en el corazón de las ratas SHR, alcanzando valores encontrados en las ratas WKY. Por el contrario, la PLC no modificó la actividad GSH-Red ni en ratas normotensas ni hipertensas con respecto a sus respectivos controles. Estudios anteriores demostraron que la administración de L-carnitina producía un aumento en los niveles de GSH en ratas de edad avanzada11, 12, 16, en pacientes hemodializados38 y en conejos hipercolesterolémicos18. La síntesis de GSH se realiza en dos etapas que son dependientes de ATP, por lo que el aumento en la producción de energía promovido por la PLC podría facilitar la síntesis del glutatión reducido38, que a su vez conduciría a un incremento en la actividad de la GSH-Px11, 17, 35 y, consecuentemente, a un aumento en la cantidad de GSH tras la administración de PLC, mejorando el estado antioxidante del organismo. Cuando determinamos la relación GSH-Px/SOD, observamos que aumenta en las ratas hipertensas tratadas con PLC al compararlas con sus hipertensas controles SHR, tanto en el hígado (83%) como en el corazón (11%), indicando una menor acumulación de H2O2 en las ratas hipertensas tras el tratamiento con PLC. Esta menor acumulación de H2O2 también podría deberse al aumento observado en la actividad CAT después del tratamiento con PLC, donde en este caso un aumento en la actividad CAT va acompañado de un aumento de la actividad GSH-Px. Estos resultados podrían indicar que la PLC presenta un efecto directo sobre la actividad de ambas enzimas, hecho que se observa para la CAT, ya que igualmente aumenta en las ratas normotensas tratadas con PLC, pero no para la GSH-Px. También podría pensarse que ante situaciones que conllevan a una mayor producción de radicales libres (hipertensión arterial) el organismo responde mediante la puesta en marcha de todos los mecanismos posibles para la eliminación de estas sustancias tóxicas para el organismo.
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Como era de esperar, de los resultados obtenidos en cuanto a la actividad de las enzimas antioxidantes en las ratas SHR tras el tratamiento con PLC, los niveles de MDA, índice de la peroxidación lipídica, se normalizan en el hígado y el corazón de las ratas hipertensas, igualándose a los valores obtenidos en las ratas normotensas WKY. Pero, además, esta disminución en la peroxidación lipídica fue también observada en las ratas normotensas WKY tras el tratamiento con PLC al comparar con sus respectivos controles WKY sin tratamiento. Estos resultados coinciden con estudios anteriores que habían puesto de manifiesto una disminución de la peroxidación lipídica tras la administración de L-carnitina en el hígado, el corazón y otros tejidos35, 37, así como habían mostrado las propiedades antioxidantes de la PLC en condiciones donde existía un incremento en el proceso oxidativo sistémico15, 39. Junto con el estudio de la capacidad antioxidante de la PLC hemos evaluado el efecto de la PLC sobre el perfil lipídico. Nuestros resultados muestran una capacidad hipotrigliceridimiante de la PLC, que no solamente es denotado en las ratas hipertensas, sino también en las ratas normotensas. Estudios anteriores mostraron un efecto hipotrigliceridimiante de la L-carnitina en ratas hipertensas40 y diabéticas41, así como en conejos hipercolesterolémicos18. Sin embargo, habría que indicar que en estos estudios, a diferencia del nuestro, también se observaron disminuciones en los niveles de colesterol total, así como de sus fracciones. La disminución en los niveles séricos de triglicéridos que presenta la PLC podría deberse al papel fundamental que tiene en el metabolismo de los ácidos grasos. En conclusión, nuestros datos ponen en evidencia que existe daño oxidativo en el hígado y en el corazón de ratas hipertensas con respecto a las ratas normotensas que conduce a un aumento en la peroxidación lipídica en estos tejidos. La suplementación con PLC mejora el estrés oxidativo observado en las ratas hipertensas, mostrado mediante una protección peroxidativa en estos tejidos. Además, la PLC también actuó sobre el estado oxidativo en ratas normotensas, indicando un efecto benefecioso per se de la PLC como actividad antioxidante. Por otro lado, se demuestra la actividad hipotrigliceridimiante de la PLC en ratas normotensas y de forma más pronunciada en las ratas hipertensas. Todos estos resultados no fueron suficientes para prevenir la instauración de la hipertensión arterial, ya que no se observaron cambios en los valores de presiones arteriales diastólicas y sistólicas entre las ratas tratadas y no tratadas, indicando que la PLC actúa directamente sobre el sistema antioxidante y el perfil lipídico del organismo con independencia de las modificaciones en las presiones arteriales. 00
Agradecimientos Este trabajo ha sido posible gracias a las ayudas FIS PI020179 del Fondo de Investigación Sanitaria, Ministerio de Sanidad y Consumo, así como al Proyecto de Investigación financiado por los Laboratorios Sigma-Tau España, S. A. Bibliografía 1. Zalba G, San José G, Moreno MU, Fortuño MA, Fortuño A, Beaumont FJ, et al. Oxidative stress in arterial hipertensión. Role of NAD(P)H oxidase. Hypertension. 2001;38:1395-9. 2. Hülker S, McMaster D, McKeown PP, Bayraktutan U. Impaired activities of antioxidant enzymes elicit endothelial dysfunction in spontaneous hypertensive rats despite enhanced vascular nitric oxide generation. Cardiovasc Res. 2003;59:488-500. 3. Wu R, Millette E, Wu L, Champlain J. Enhanced superoxide anion formation in vascular tissues from spontaneously hypertensive and desoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats. J Hypertens. 2001;19:741-8. 4. Zalba G, Beaumont FJ, San José G, Fortuño A, Fortuño MA, Etayo JC, et al. Vascular NADH/NADPH oxidase is involved in enhanced superoxido production in spontaneously hypertensive rats. Hypertension. 2000;35:1055-61. 5. Drexler H. Nitric oxide and coronary endotelial dysfunction in humans. Cardiovasc Res. 1999;43:572-9. 6. Cediel E, Sanz-Rosa D, Oubina MP, de las Heras N, González Pacheco FR, Vegazo O, et al. Effect of AT1 receptor blockade on hepatic redox status in SHR: possible relevance for endothelail function? Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2003;285:R674-81. 7. Wiseman LR, Brodgen RN. Propionyl-L-carnitine. Drugs Aging. 1998;12:243-8. 8. Cipolla MJ, Nicoloff A, Rebello T, Amato A, Porter JM. Propionyl-L-carnitine dilates human subcutaneous arteries through an endothelium-dependent mechanism. J Vasc Surg. 1999;29:1097-103. 9. Mauriello A, Sangiorgi G, Orlandi A, Schiaroli S, Perfumo S, Spagnoli LG. Effect of long-term treatment with propionylL-carnitine on smooth muscle cell polyploidy in Spontaneously Hypertensive Rats. Hipertensión. 1996;28:177-82. 10. Vanella A, Russo A, Acquaviva R, Campisi A, Di Giacomo C, Sorrenti V, et al. L-propionyl-carnitine as superoxide scanveger, antioxidant, and DNA cleavage protector. Cell Biology Toxicol. 2000;16:99-104. 11. Arockia Rani PJ, Panneerselvam C. Carnitine as a free radical scavenger in aging. Exp Gerontol. 2001;36:1713-26. 12. Kalaiselvi T, Panneerselvan C. Effect of L-carnitine on the status of lipid peroxidation and antioxidants in aging rats. J Nutr Biochem. 1998;9:575-81. 13. Bertelli A, Conte A, Ronca G. L-propionyl carnitine protects erythrocytes and low density lipoproteins against peroxidation. Drugs Exp Clin Res. 1994;20:191-7. 14. Palmieri L, Ronca F, Malengo S, Bertelli A. Protection of beta-thalassaemic erythrocytes from oxidative stress by propionyl carnitine. Int J Tissue React. 1994;16:121-9. 15. Mister M, Noris M, Szymczuk J, Azzollini N, Aiello S, Abbate M, et al. Propionyl-L-carnitine prevents renal function deterioration due to ischemia/reperfusion. Kidney International. 2002;61:1064-78. 16. Hariri R, Alonso DR, Hajjar DP, Cobetti D, Weksler ME. Ageing and atherosclerosis. J Exp Med. 1986;164:1171-8. 17. Dayanandan A, Kumar P, Panneerselvam, C. Protective role of L-carnitine on liver and heart lipid peroxidation in atherosclerotic rats. J Nutr Biochem 2001; 12: 254-257. 18. Sayed-Ahmed MM, Khattab MM, Gad MZ, Mostafa N. L-carnitine prevents the progression of atherosclerotic lesions in hypercholesterolaemic rabbits. Pharmacological Res. 2001;44:235-42. 19. Moretti S, Famularo G, Boschini A, Santini G, Trinchieri V, Luccci L, et al. L-carnitine reduces lymphocyte apoptosis
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