- Email: [email protected]
Enzymatische reduktion von sulfat zu sulfid
650
PRELIMINARY NOTES
VOL. 3 0 ( I 9 5 8 )
R. E. BASFORD, H. D. TISDALE, J. L. GLENN AND D. E. GREEN, Biochim. Biophys, Acta, 24 (1957) lO7. R. E. BASFORD AND D. E. GREEN, Biochim. Biophys. Acta, in the press. 3 C. WIDMER AND F, L. CRANE, Biochim. Biophys. Acta, 27 (1958) 203. 4 R. E. BASFORD, s u b m i t t e d to Biochim. Biophys. Acta. 5 F. L. CRANE, Y. HATEFI, R. L. LESTER AND C. "VVIDMER, Biochim. Biophys. Acta, 2.5 (19.57) 220. 6 y . HATEFI, R. L. LESTER, F. L. CRANE AND C. V~TIDMER, Biochim. Biophys. Acta, in the press. 7 y . HATEFI, Biochim. Biophys. Acla, in the press. s y . HATEFI, in preparation. 9 \V. \'V. XcVAINIOAND J. GREENLEES, Science, ~28 0958) 87. Received A u g u s t 8th, I958 z
Enzymatische Reduktion yon Sulfat zu Sulfid E x t r a k t e aus Biickerhefe, welche nach der Methode yon SCHLOSSMANN UND LYNEN 1,2 dargestellt u n d t5 Min bei I4,OOO U/Min zentrifugiert wurden, verm6gen Sulfat his zur Stufe des Sehwefelwasserstoffs zu reduzieren, w e n n sie u n t e r a n a e r o b e n Bedingungen m i t verschiedenen Cofaktoren verstttrkt werden. Die T e s t m e t h o d i k u m f a s s t den Einsatz yon asS-Sulfat, Isolierung yon H2S durch Ableiten im Stickstoitstrom, Ausfitllen des Schwefelwasserstoffs nlit C a d m i u m a c e t a t u n d E r m i t t lung der R a d i o m a r k i e r u n g im CdS. Tabelle I v e r m i t t e l t einen Uberblick fiber das Cofaktorenbedfirfnis der H2S-Bildung. U n t e r den im Ansatz beschriebenen Bedingungen ist n u r eine geringe R e d u k t i o n zu beobachten. D P N - u n d T P N - Z u s a t z zeigen, auch in V e r b i n d u n g m i t G-6-P, eine H e m m u n g . Dagegen erweist sich ATP ats s t a r k e r Aktivator. K o m b i n a t i o n des ATP mit den P y r i d i n - C o f e r m e n t e n gibt eine weitere Stimulierung. Schliesslich fiihrt der Zusatz yon G-6-P z u s a m m e n m i t den drei Cofaktoren zu einer m e h r als zehnfachen Steigerung der Reduktionsrate. U n t e r solchen optimalen B e d i n g u n g e n unterdriicken Sulfit (0.004 M) wie auch Thiosulfat vollstttndig die Bildung yon m a r k i e r t e m H2S. Da a~S-Sulfit durch zellfreie H e f e e x t r a k t e in Cystein eingebaut wird 3, radioaktives Sulfit aus einem R e d u k t i o n s a n s a t z nach l n k u b a t i o n mit Na2SO a isoliert werden k a n n und dieses Sulfit stets eine h6here Aktivitgt aufweist als ein u n t e r gleichen Bedingungen gebildetes H2S, da schliesslich die Bildung yon m a r k i e r t e m Sulfit ein ganz tthnliches Cofaktorenbedfirfnis zeigt wie die H2S-Bildung (mit A u s n a h m e yon TPN), scheint dem Sulfit die Rolle eines Z w i s c h e n p r o d u k t e s der S u l f a t r e d u k t i o n zuzukonlmen. TABELLE I COFAKTORENBED(?RFNIS DER HgS-BILDUNG
Zusiit~e -I)PN TPN G-6-P G-6-P + T P N G-6-P + T P N + D P N ATP ATP + D P N ATP + T P N ATP + D P N + T P N A T P + G-6-P + D P N + T P N
i~Mole -0.7 0.4 IO io + 0. 4 IO + 0. 4 + 0. 7 7.5 7.5 + 0.7 7-5 + o-4 7.5 + o.7 + 0.4 7.5 + lo + o.7 + o.4
Cd.q." I np 3lin 266 59 43 222 lO3 II8 798 1,o95 1,345 1,36o 2,81o
Jedes Gefgss enthielt 250 ttMole P h o s p h a t p u f f e r p H 6.8, 50/,Mole MgC12, 2.5/zMole t(2SO 4, etwa i o / , M o l e K H S , 1.5o ml Zentrifug. Hefeextrakt, etwa 5 l*C Na2aSso4, u n d die angegebenen Zus/itze in 3 ml. Anaerobe I n k u b a t i o n ffir 3 tl bei 3 oQ, H2S nach Ans~iuern als CdS abgefangen. Abkfirzungen: D P N = D i p h o s p h o p y r i d i n n u c l e o t i d ; T P N = T r i p h o s p h o p y r i d i n n u c l e o t i d ; A T P = A d e n o s i n t r i p h o s p h a t ; G-6-P = Glukose-6-phosphat; P A P S = 3 ' - P h o s p h o a d e n o s i n - 5 ' p h o s p h o s u l f a t ; P A P = 3',5'-Adenosindiphosphat.
VOL. 3 0
(1958)
PRELIMINARY NOTES
65I
W i c h t i g ist die s t a r k e A k t i v i e r u n g des S y s t e m s d u r c h ATP. D a s c h o n i m rein c h e m i s c h e n Bereich die R e d u k t i o n des SO4-2 n u t schwierig d u r c h z u f f i h r e n ist, w ~ h r e n d d a s A n h y d r i d der SchwefelsAure, SOa, g e r a d e z u als s t a r k o x y d i e r e n d e s A g e n s wirkt, d r ~ n g t sich d a s a k t i v e Sulfat (PAPS)4,5 als b i o c h e m i s c h e s A n a l o g o n auf. E s 15.sst sich als ein (gemischtes) A n h y d r i d der Schwefels~iure m i t d e m P h o s p h o r s ~ u r e r e s t a u f f a s s e n u n d sollte d e m n a c h d a s ideale S u b s t r a t der Sulfatr e d u k t i o n darstellen. F o l g e n d e B e f u n d e s c h e i n e n diese A n s i c h t zu best~itigen. I n h i b i t o r e n der S u l f a t a k t i v i e r u n g 6 b e e i n t r A c h t i g e n a u c h die R e d u k t i o n s r a t e . So h e m m t W O 4 2 (o.oo5 M) die E n t s t e h u n g v o n H2S zu 7 6 0 , u n d a u c h die Sulfitbildung wir e t w a d u r c h SeO4 -2 zu 8 1 % , d u r c h MoO4-2 zu 95 % u n t e r d r f i c k t . U m g e h t m a n die direkte, d u r c h A T P erfolgende A k t i v i e r u n g des Sulfats, i n d e m m a n P A P S a u s aSS-p-Nitrophenylsulfat u n d P A P m i t d e m E n z y m Sulfokinase sich bilden l~tsst (vergl. 7 !), d a n n wird ebenfalls r a d i o a k t i v e s Sulfid gebildet. ~Vie Tabelle II zeigt, wird die fiber A T P + Sulfat l a u f e n d e R e d u k t i o n d u r c h die S u l f o k i n a s e f r a k t i o n g e h e m m t , w a s teilweise w e n i g s t e n s d u r c h I s o t o p e n v e r d i i n n u n g erkliirt w e r d e n k a n n . Die ('rbertragung des Sulfatrestes v o m p - N i t r o p h e n y l s u l f a t a u f P A P d a g e g e n wird erst n a c h Z u g a b e des a u s R a t t e n l e b e r g e w o n n e n e n E n z y m s m 6 g l i c h u n d d a m i t a u c h fiir die R e d u k t i o n verffigbar. TABELLE AKTIVES
SULFAT
PAPS erzeugendesSystem
UND
II H2~-BILDUNG
Sul/okinase
CdS: lmp.'Min
S + ATP
-+
1,55o 460
p-Nitrophenylsulfat + PAP
-+
lO 3 I ,o5o
Der A n s a t z w a r wie in Tabelle I, inclusive D P N , T P N , G - 6 - P u n d ATP. Bei " p - N i t r o p h e n y l s u l f a t + P A P " anstelle v o n A T P u n d Na2aSSOa : 15/~Mole 3 5 S - p - N i t r o p h e n y l s u l f a t (etwa 4 pC) + i t, Mol P A P . Die S u l f o k i n a s e f r a k t i o n w a r a u s R a t t e n l e b e r e t w a z e h n f a c h a n g e r e i c h e r t . E t w a 5 m g P r o t e i n wurden zugesetzt, wenn angegeben. Die H e m m w i r k u n g v o n T h i o s u l f a t (s.o.) 1/isst sich a u f d i e s e m H i n t e r g r u n d leicht erkliiren. Dieses " T h i o - a n a l o g o n " des Sulfats w i r k t als H e m m s t o f f bei der A k t i v i e r u n g s r e a k t i o n - - w a s sich a u c h direkt i m E n z y m t e s t zeigen l~isst - - u n d verliert d e m e n t s p r e c h e n d seine i n h i b i t o r i s c h e n Eigens c h a f t e n , w e n n P A P S im R e d u k t i o n s a n s a t z a u s p - N i t r o p h e n y l s u l f a t + P A P e r z e u g t wird. D a m i t aber s c h e i d e t es als m 6 g l i c h e s I n t e r m e d i i i r p r o d u k t der S u l f a t r e d u k t i o n aus. M6glicherweise ist a u c h a - L i p o n s ~ u r e b e i m R e d u k t i o n s p r o z e s s beteiligt, d a in vielen E x t r a k t e n d u r c h L i p o n s ~ u r e z u s a t z (und a u c h d u r c h B A L ) eine bis dreifache S t i m u l i e r u n g des a n s o n s t i g e n C o f a k t o r e n gesS~ttigten S y s t e m s erreicht w e r d e n k a n n , wiihrend Arsenit i n h i b i e r e n d wirkt. Die D e u t s c h e F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t u n t e r s t t i t z t e Beihilfen.
Physiologisch-chemisches
d a n k e n s w e r t e r w e i s e diese Arbeit d u r c h
[nstitut der Universitat, Hamburg (Deutschland)
HELMUTH HILZ I~ARGRID KITTLER
1 K. SCHLOSSMANN, Dissertation, Mtinchen, 1957. 2 I~. SCHLOSSMANN UND F. LYNEN, Biochem. Z., 328 (1957) 591. 3 F. LYNEN UND A. LEZlUS, pers. Mitteilung. 4 H. HILZ UND F. LIPMANN, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 41 (1955) 88o. 5 p. W. ROBBINS UND F. LIPMANN, J. Biol. Chem., 229 (1957) 837. 6 t{. S. BANDURSKI, L. G. WILSON UND C. SQUIRES, J. Am. Chem. Soc., 78 (1957) 64o8. 7 j . D. GREGORY UND F. LIPMANN, J. Biol. Chem., 229 (1957) lO81. E i n g e g a n g e n d e n 16. S e p t e m b e r 1958
PRELIMINARY NOTES
VOL. 3 0 ( I 9 5 8 )
R. E. BASFORD, H. D. TISDALE, J. L. GLENN AND D. E. GREEN, Biochim. Biophys, Acta, 24 (1957) lO7. R. E. BASFORD AND D. E. GREEN, Biochim. Biophys. Acta, in the press. 3 C. WIDMER AND F, L. CRANE, Biochim. Biophys. Acta, 27 (1958) 203. 4 R. E. BASFORD, s u b m i t t e d to Biochim. Biophys. Acta. 5 F. L. CRANE, Y. HATEFI, R. L. LESTER AND C. "VVIDMER, Biochim. Biophys. Acta, 2.5 (19.57) 220. 6 y . HATEFI, R. L. LESTER, F. L. CRANE AND C. V~TIDMER, Biochim. Biophys. Acta, in the press. 7 y . HATEFI, Biochim. Biophys. Acla, in the press. s y . HATEFI, in preparation. 9 \V. \'V. XcVAINIOAND J. GREENLEES, Science, ~28 0958) 87. Received A u g u s t 8th, I958 z
Enzymatische Reduktion yon Sulfat zu Sulfid E x t r a k t e aus Biickerhefe, welche nach der Methode yon SCHLOSSMANN UND LYNEN 1,2 dargestellt u n d t5 Min bei I4,OOO U/Min zentrifugiert wurden, verm6gen Sulfat his zur Stufe des Sehwefelwasserstoffs zu reduzieren, w e n n sie u n t e r a n a e r o b e n Bedingungen m i t verschiedenen Cofaktoren verstttrkt werden. Die T e s t m e t h o d i k u m f a s s t den Einsatz yon asS-Sulfat, Isolierung yon H2S durch Ableiten im Stickstoitstrom, Ausfitllen des Schwefelwasserstoffs nlit C a d m i u m a c e t a t u n d E r m i t t lung der R a d i o m a r k i e r u n g im CdS. Tabelle I v e r m i t t e l t einen Uberblick fiber das Cofaktorenbedfirfnis der H2S-Bildung. U n t e r den im Ansatz beschriebenen Bedingungen ist n u r eine geringe R e d u k t i o n zu beobachten. D P N - u n d T P N - Z u s a t z zeigen, auch in V e r b i n d u n g m i t G-6-P, eine H e m m u n g . Dagegen erweist sich ATP ats s t a r k e r Aktivator. K o m b i n a t i o n des ATP mit den P y r i d i n - C o f e r m e n t e n gibt eine weitere Stimulierung. Schliesslich fiihrt der Zusatz yon G-6-P z u s a m m e n m i t den drei Cofaktoren zu einer m e h r als zehnfachen Steigerung der Reduktionsrate. U n t e r solchen optimalen B e d i n g u n g e n unterdriicken Sulfit (0.004 M) wie auch Thiosulfat vollstttndig die Bildung yon m a r k i e r t e m H2S. Da a~S-Sulfit durch zellfreie H e f e e x t r a k t e in Cystein eingebaut wird 3, radioaktives Sulfit aus einem R e d u k t i o n s a n s a t z nach l n k u b a t i o n mit Na2SO a isoliert werden k a n n und dieses Sulfit stets eine h6here Aktivitgt aufweist als ein u n t e r gleichen Bedingungen gebildetes H2S, da schliesslich die Bildung yon m a r k i e r t e m Sulfit ein ganz tthnliches Cofaktorenbedfirfnis zeigt wie die H2S-Bildung (mit A u s n a h m e yon TPN), scheint dem Sulfit die Rolle eines Z w i s c h e n p r o d u k t e s der S u l f a t r e d u k t i o n zuzukonlmen. TABELLE I COFAKTORENBED(?RFNIS DER HgS-BILDUNG
Zusiit~e -I)PN TPN G-6-P G-6-P + T P N G-6-P + T P N + D P N ATP ATP + D P N ATP + T P N ATP + D P N + T P N A T P + G-6-P + D P N + T P N
i~Mole -0.7 0.4 IO io + 0. 4 IO + 0. 4 + 0. 7 7.5 7.5 + 0.7 7-5 + o-4 7.5 + o.7 + 0.4 7.5 + lo + o.7 + o.4
Cd.q." I np 3lin 266 59 43 222 lO3 II8 798 1,o95 1,345 1,36o 2,81o
Jedes Gefgss enthielt 250 ttMole P h o s p h a t p u f f e r p H 6.8, 50/,Mole MgC12, 2.5/zMole t(2SO 4, etwa i o / , M o l e K H S , 1.5o ml Zentrifug. Hefeextrakt, etwa 5 l*C Na2aSso4, u n d die angegebenen Zus/itze in 3 ml. Anaerobe I n k u b a t i o n ffir 3 tl bei 3 oQ, H2S nach Ans~iuern als CdS abgefangen. Abkfirzungen: D P N = D i p h o s p h o p y r i d i n n u c l e o t i d ; T P N = T r i p h o s p h o p y r i d i n n u c l e o t i d ; A T P = A d e n o s i n t r i p h o s p h a t ; G-6-P = Glukose-6-phosphat; P A P S = 3 ' - P h o s p h o a d e n o s i n - 5 ' p h o s p h o s u l f a t ; P A P = 3',5'-Adenosindiphosphat.
VOL. 3 0
(1958)
PRELIMINARY NOTES
65I
W i c h t i g ist die s t a r k e A k t i v i e r u n g des S y s t e m s d u r c h ATP. D a s c h o n i m rein c h e m i s c h e n Bereich die R e d u k t i o n des SO4-2 n u t schwierig d u r c h z u f f i h r e n ist, w ~ h r e n d d a s A n h y d r i d der SchwefelsAure, SOa, g e r a d e z u als s t a r k o x y d i e r e n d e s A g e n s wirkt, d r ~ n g t sich d a s a k t i v e Sulfat (PAPS)4,5 als b i o c h e m i s c h e s A n a l o g o n auf. E s 15.sst sich als ein (gemischtes) A n h y d r i d der Schwefels~iure m i t d e m P h o s p h o r s ~ u r e r e s t a u f f a s s e n u n d sollte d e m n a c h d a s ideale S u b s t r a t der Sulfatr e d u k t i o n darstellen. F o l g e n d e B e f u n d e s c h e i n e n diese A n s i c h t zu best~itigen. I n h i b i t o r e n der S u l f a t a k t i v i e r u n g 6 b e e i n t r A c h t i g e n a u c h die R e d u k t i o n s r a t e . So h e m m t W O 4 2 (o.oo5 M) die E n t s t e h u n g v o n H2S zu 7 6 0 , u n d a u c h die Sulfitbildung wir e t w a d u r c h SeO4 -2 zu 8 1 % , d u r c h MoO4-2 zu 95 % u n t e r d r f i c k t . U m g e h t m a n die direkte, d u r c h A T P erfolgende A k t i v i e r u n g des Sulfats, i n d e m m a n P A P S a u s aSS-p-Nitrophenylsulfat u n d P A P m i t d e m E n z y m Sulfokinase sich bilden l~tsst (vergl. 7 !), d a n n wird ebenfalls r a d i o a k t i v e s Sulfid gebildet. ~Vie Tabelle II zeigt, wird die fiber A T P + Sulfat l a u f e n d e R e d u k t i o n d u r c h die S u l f o k i n a s e f r a k t i o n g e h e m m t , w a s teilweise w e n i g s t e n s d u r c h I s o t o p e n v e r d i i n n u n g erkliirt w e r d e n k a n n . Die ('rbertragung des Sulfatrestes v o m p - N i t r o p h e n y l s u l f a t a u f P A P d a g e g e n wird erst n a c h Z u g a b e des a u s R a t t e n l e b e r g e w o n n e n e n E n z y m s m 6 g l i c h u n d d a m i t a u c h fiir die R e d u k t i o n verffigbar. TABELLE AKTIVES
SULFAT
PAPS erzeugendesSystem
UND
II H2~-BILDUNG
Sul/okinase
CdS: lmp.'Min
S + ATP
-+
1,55o 460
p-Nitrophenylsulfat + PAP
-+
lO 3 I ,o5o
Der A n s a t z w a r wie in Tabelle I, inclusive D P N , T P N , G - 6 - P u n d ATP. Bei " p - N i t r o p h e n y l s u l f a t + P A P " anstelle v o n A T P u n d Na2aSSOa : 15/~Mole 3 5 S - p - N i t r o p h e n y l s u l f a t (etwa 4 pC) + i t, Mol P A P . Die S u l f o k i n a s e f r a k t i o n w a r a u s R a t t e n l e b e r e t w a z e h n f a c h a n g e r e i c h e r t . E t w a 5 m g P r o t e i n wurden zugesetzt, wenn angegeben. Die H e m m w i r k u n g v o n T h i o s u l f a t (s.o.) 1/isst sich a u f d i e s e m H i n t e r g r u n d leicht erkliiren. Dieses " T h i o - a n a l o g o n " des Sulfats w i r k t als H e m m s t o f f bei der A k t i v i e r u n g s r e a k t i o n - - w a s sich a u c h direkt i m E n z y m t e s t zeigen l~isst - - u n d verliert d e m e n t s p r e c h e n d seine i n h i b i t o r i s c h e n Eigens c h a f t e n , w e n n P A P S im R e d u k t i o n s a n s a t z a u s p - N i t r o p h e n y l s u l f a t + P A P e r z e u g t wird. D a m i t aber s c h e i d e t es als m 6 g l i c h e s I n t e r m e d i i i r p r o d u k t der S u l f a t r e d u k t i o n aus. M6glicherweise ist a u c h a - L i p o n s ~ u r e b e i m R e d u k t i o n s p r o z e s s beteiligt, d a in vielen E x t r a k t e n d u r c h L i p o n s ~ u r e z u s a t z (und a u c h d u r c h B A L ) eine bis dreifache S t i m u l i e r u n g des a n s o n s t i g e n C o f a k t o r e n gesS~ttigten S y s t e m s erreicht w e r d e n k a n n , wiihrend Arsenit i n h i b i e r e n d wirkt. Die D e u t s c h e F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t u n t e r s t t i t z t e Beihilfen.
Physiologisch-chemisches
d a n k e n s w e r t e r w e i s e diese Arbeit d u r c h
[nstitut der Universitat, Hamburg (Deutschland)
HELMUTH HILZ I~ARGRID KITTLER
1 K. SCHLOSSMANN, Dissertation, Mtinchen, 1957. 2 I~. SCHLOSSMANN UND F. LYNEN, Biochem. Z., 328 (1957) 591. 3 F. LYNEN UND A. LEZlUS, pers. Mitteilung. 4 H. HILZ UND F. LIPMANN, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 41 (1955) 88o. 5 p. W. ROBBINS UND F. LIPMANN, J. Biol. Chem., 229 (1957) 837. 6 t{. S. BANDURSKI, L. G. WILSON UND C. SQUIRES, J. Am. Chem. Soc., 78 (1957) 64o8. 7 j . D. GREGORY UND F. LIPMANN, J. Biol. Chem., 229 (1957) lO81. E i n g e g a n g e n d e n 16. S e p t e m b e r 1958