Etude descriptive fondamentale et modelisation de la croissance d'un film biologique—I. Etude descriptive fondamentale de la croissance d'un film biologique

Wat. Res. Vol. 22, No. I, pp. 59~9, 1988 Printed in Great Britain. All rights reserved

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ETUDE DESCRIPTIVE FONDAMENTALE ET MODELISATION DE LA CROISSANCE D'UN FILM BIOLOGIQUE--I. ETUDE DESCRIPTIVE FONDAMENTALE DE LA CROISSANCE D'UN FILM BIOLOGIQUE F U N D A M E N T A L DESCRIPTIVE STUDY A N D MODELIZATION OF BIOLOGICAL FILM GROWTH--I. F U N D A M E N T A L DESCRIPTIVE STUDY OF BIOLOGICAL FILM GROWTH R. BELKHADIR,l B. CAPDEVILLE2. et H. ROQUES2 ~Ecole Mohammedia d'Ing6nieurs, Agdal Rabat, Morocco et 2Laboratoire de Chimie et G6nie de rEnvironnement, D6partement de G6nie des Proc6d6s Industriels, I.N.S.A., Avenue de Rangueil, 31077 Toulouse Cedex, France (Refu novembre 1986) Rrsumr----Dans la prrsente publication, nous avons mis en 6vidence, puis drcrit les diffrrentes phases caractrristiques de la croissance d'un film biologique sur un support. Ces phases sont au nombre de six: une phase de latence suivie d'une phase dynamique de croissance correspondant ~i la mise en place et :i l'accumulation d'une biomasse active. Au cours de ces prriodes, il est montr6 que la fraction de surface disponible joue un r61e d&erminant; une phase linraire caractrristique d'une accumulation :i taux constant ,d'une biomasse drsactivre, ne participant pas de manirre directe ~i la drgradation du substrat. Au cours de cette &ape, la masse et l'rpaisseur du biofilm augmentent proportionnellement au temps, tandis que les vitesses d'rpuisement de substrat ou d'61aboration des produits sont constantes et maximales; une phase de ralentissement suivie d'une phase de stabilisation puis de drcrochage lires ~ des phrnomrnes physiques drpendant surtout de l'hydrodynamique et dont les actions deviennent prrpondrrantes devant celles du processus biologique. D'autre part, nous avons montr6 que les mesures d'aetivit6 en terme d'ATP n'rtaient pas significatives des potentialites intrinsrques des seuls micro-organismes actifs. I1 est done nrcessaire pour caraetrriser de fa¢on prrcise ces potentialitrs, de drterminer la vitesse sprcifique d'rpuisement ou de drgradation du substrat, Pour cela, nous proposons une nouvelle approche de modrlisation faisant intervenir une cinrtique de drsactivation. Cet aspect du problrme sera examin6 dans une prochaine publication. Mots-cl~s--traitement biologique, biomasses fixres, cinrtique de croissance, modrlisation Abstraet-4)ptimization of fixed biomass biological reactors depends notably upon a better knowledge of growth and degradation substrate kinetics. Previous authors working on the subject of biofilms have introduced the concept of "active thickness" which is the thickness beyond which the essential growth substrates becomes a limiting factor. The "active thickness", in general, is evaluated with mathematical models, associating diffusional transport with more or less complex kinetics. In the framework of this particular research, the purpose was to verify the principal hypotheses of previous models by investigating, in particular, the evaluation of the biofilm (structure) and its purifying capacities as a function of time. For this purpose, a particular ring reactor was conceived (Fig. 1) and, observation and characterization methods of the biofilm were formulated (Fig. 2), taking into account different methodologies proposed by the literature (Table 3). The experimental results obtained demonstrated that the growth of an anaerobic biological film follows six stages (Fig. 7): a latent phase corresponding to the implantation of small dispersed bacterial colonies (Fig. 8) and an accelerated or dynamic phase in which the colonies multiply and spread until the total occupation of the support. At the same time, substrate degradation and product elaboration rates tend towards maximum values, which indicates the achievement of a stationary regime corresponding to the maximum active biomass quantity, while the total biomass of the biofilm (Mb) continues to grow. To explain this phenomenon, two types of bacterium constituting the biofilm should be distinguished (Fig. I0): --active bacteria (Ma) responsible for the degradation of the substrate; --inactive bacteria (Md) no longer involved in the degradation of the substrate but still conserving certain enzymatic activities. *Author to whom all correspondence should be addressed. 59

60

R. BELKHADIRet al. To model the phenomenon, the foundation of a new model was proposed associating the intrinsic growth kinetic of the active bacteria, the inactivation kinetic by confined effect and the accumulation of toxic products: ( d M a / d t )acc = # o M a - k i . 1. M a.

This expression can be rearranged in two other forms: (dMa/dt)a ~

-- p0Ma(l - ( M ~ ) / ( M a ) m a x )

and ( d M ~ / d t )acc = l~oMafl(A o -- a / Ao).

The latter translates the influence of the available fixation surface (biological space concept); the linear growth phase corresponding to the accumulation, at a constant rate, of the inactive biomass, and the linear evolution of the biofilm thickness with time, while the active biomass stays constant and maximal [(dMJdt)~ = 0]; the decreasing phase followed by a stabilization phase and finally the detachment of the biofilm, all three linked to the physical phenomena depending principally on the hydrodynamics of the reactor, which becomes the most dominating action compared to those of the biological process. From a practical point of view, the accelerated growth phase is fundamental, as it translates the essentials of the biological process. On the other hand, it should be noted that in the course of this phase, the active biological mass is not distributed in a uniform film, but appears as a juxtaposition of microcolonies, and, in fact, the observed thickness constitutes an apparent outer layer. On the contrary, in the other phases, the biofilm notion seems correct, but for an aerobic system, the appearance of a filamentous outgrowth is however observed. On the other hand, activity measurement in terms of ATP did not signify the biofilm's potentiality in degrading the substrate. It is thus necessary to modelize the phenomenon in order to determine the intrinsic degradation rate of this substrate. This will be the purpose of part II. Key words--biological

treatment, attached cultures, growth kinetic, modelization

INTRODUCTION L'optimisation des r6acteurs biologiques fi biomasse fix6e b6n6ficierait entre autre, d'une meilleure connaissance des cin6tiques de croissance et d'6puisement du substrat. Or, bien que de nombreux travaux sur les biofilms aient 6t6 publi6s, et plus particuli6rement en milieu a6robie, peu d'6tudes fondamentales de ces ph6nom6nes ont 6t6 faites. D'autre part, la recherche de fondements biologiques n6cessite une bonne connaissance du processus de croissance qui doit s'appuyer notamment sur l'observation exp6rimentale. A cet effet, nous avons men6 en parall6le, deux recherches sur les films a6robies et ana6robies et dont les principaux objectifs ont 6t6 les suivants: ~ t u d e s de divers crit6res permettant de caract6riser un biofilm (structure, 6paisseur: masse, activi t , s . . . ); ~ t u d e s en fonction du temps de divers param6tres li6s ~ la croissance (concentration en substrat, en biomasses fixees, en p r o d u i t s . . . ); ~tudes de l'influence de divers facteurs dont d6pend la croissance (concentration initiale en substrat (So), temps de passage, contraintes hydraul i q u e s . . . ). POSITION DU PROBLEME

La litt6rature fait apparaitre depuis plusieurs ann6es le concept selon lequel les biofilms sont caract6ris6s par une "6paisseur active" au delgt de laquelle un substrat de base de la croissance devient limitant. En g~n6ral, celle-ci est ~valu~e fi partir de mod61es

math6matiques associant au transport diffusif une cin+tique plus ou moins complexe (Atkinson, 1974; HarremoEs, 1977; La Motta, 1976; Williamson et McCarty, 1976; Rittmann, 1981; Grady et Lim, 1980). On doit alors rappeler ici les principales hypoth6ses du fondement de ces mod61es s'appuyant sur des observations locales: le biofilm se d6veloppe de mani6re uniforme sur toute la surface; le biofilm se caract6rise par une 6paisseur homog6ne sur toute la surface. Ces deux crit6res impliquent que le biofiim peut fitre d6crit selon une surface plane et r6guli6re: le transport des substrats dans le biofiim se fait uniquement par diffusion mol6culaire: la cin&ique de croissance ou d'6puisement de substrat, ainsi que les concentrations seuils sont connues ou fix6es. L'association de ces hypoth6ses conduit alors h une formulation purement math6matique du transfert de mati6re d6crivant le fonctionnement en r6gime permanent du r6acteur d6fini par rapport fi l'6paisseur ou la masse du biofilm. D'autre part, cette d6marche fait abstraction des r6alit6s exp6rimentales, notamment de la structure externe du biofilm. En cons6quence, notre approche sur l'6tude de la croissance de biofilms fixes a 6t6 dans un premier temps orient6e vers la caract6risation physique du ph6nom6ne, afin de v6rifier les hypoth6ses pr6c6demment cities.

METHODES EXPERIMENTALES

Ces m&hodes concernent le choix du r6acteur biologique et des techniques de caract6risation de la biomasse fix6e (~paisseur, masse, activit6s...).

Mod61isation d'un film biologique--I

I

L .

Fig 1. Sch6ma de principe du pilote exp6rimental. 1--R6acteur; 2--disques mobiles; 3--r6serve de substrat; 4--pompe d'alimentation; 5---entrainement disque; 6-8--r6gulation de temp6rature; 9--sortie effluent; 10-13--syst6me de pr616vement de gaz. Fig. 1. Diagram of the experimental pilot.

61

Pour pallier ces inconv6nients, nous avons mis au point une m6thode de pr616vement, de conditionnement et d'observation du biofilm, bas6e sur le montage exp6rimental repr6sent6 eta Fig. 2. C¢ dispositif, de m6m© diam6tre que celui du cylindre, permct de conserver un biofilm d a m des conditions tr6s voisines de celles existant dans le r6acteur grace ~i une circulation continue d'eau. Ainsi, on peut visualiser correctement sa structure exteme et d6duire ~. partir d'une exploitation statistique d'un trds grand nombre d'observations (100), son 6paisseur moyenne et r6eart type (m6thode de Student). Masse du biofilrn. Contrairement ~t la plupart des montages exp6rimentaux propos6s dans la litt6rature, notre dispositif permet d'acc6der plus facilement ~. ce param6tre. Ainsi, ~i partir du disque pr61ev6, le biofilm est recueilli par simple raclage, puis s6eh6 ~i l'6tuve et pes6. La surface du disque 6tant suffisamment grande, on peut r6eup6rer soit une fraction importante du biofilm, soit plusieurs fractions. L'&ude statistique fare pr6alablement sur l'ensemble des disques (chacun 6tant divis6 en quatre parties), nous a permis d'6valuer la pr6eision des mesures qui d6pend en particulier de l'6tat d'avancement de la croissance (30% en phase de latence pour des masses de l'ordre de 10o20 mg MST disque-~; 5% en phase d'accumulation correspondant fi des masses de 1000150 mg M ST disque-t), la surface d'un disque 6tant de 188,5 crn 2 (Belkhadir, 1986).

Mesures indirectes Elles concernent les d6terminations d'un constituant du

Choix du Rbacteur Les crit6res de conception du r6acteur ont 6t6 les suivants: maitrise des contraintes hydrauliques qui doivent s'exercer de mani6re uniforme et constante sur le biofilm; contr61e de l'agitation du milieu de fag:on fi. avoir un 6eoulement parfaitement m61ang6; facilit6s de pr616vement des 6chantillons et de mesures des grandeurs caract6ristiques du biofilm et en particulier sa masse. Les deux premiers points sont r6solus dans un r6acteur de type annulaire constitu6 de deux cylindres coaxiaux dont l'un est mobile, tel que ceux utilis6s par Korgenay et Andrews (1968), La Motta (1976), Williamson et McCarty (1976), Trulear et Characklis (1982). Le troisi6me crit6re peut ~tre r6alis6 en utilisant un empilement de disques en PVC parfaitement rectifi6 qui constituera le cylindre interne mobile sur lequel se fixera le biofilm. A partir de ce montage, la croissance de la biomasse fix6e peut &re suivie en fonction du temps par pr61dvements successifs des disques, le rapport volume/surface, et le temps de passage 6rant maintenus constants par simples adjustements du volume et du d6bit d'alimentation. Les caract6ristiques du r6acteur sont pr6sent6es darts la Fig. 1 et le Tableau 1. D'autre part, le r6acteur est aliment6 par une pompe piston, en substrat synth6tique complexe pr6par6 ~i partir d'eau du robinet et dont la composition est donn6e dans le Tableau 2.

Choix des Techniques:

Techniques Caractdristiques du Biofilm

Characklis et al. (1982), proposent une classification faisant apparaitre deux groupes selon que les mesures sont directes ou indirectes.

Mesures directes Epaisseur du biofilm. ,~ partir de la litt6rature, il apparait que les techniques d'6valuation de cette grandeur sont tr6s diversifi6es et parfois ambigfies. D'autre part, le conditionnement de l'6chantillon (biofilm) peut modifier consid6rablement les mesures. Le Tableau 3 indique la disparit6 des diff6rentes m&hodes. W.R. 22/I--E

Tableau 1. Principales caract6ristiques du r6acteur Table 1. Principal characteristics of the reactor Description Caracteristiques Rb.acteur volume r6actionnel (variable) surface de contact biofilm liquide (variable) Cylindrc externe hauteur totale diam6tre interne

4,95-1,59 liter 1760-565 cm2 30,8 cm 25 cm

Cylindre interne (¢mpilement de disques en PVC rvctifi6*) nombre de disques servant au pr616vement 7 diam6trc d'un disque 20 cm 6paisseur d'un disque 3 cm surface de contact par disque 188,5 cm2 hauteur totale de I'empilement 29,5 cm *L'empilement des disques est aussi constitu6 d'un disque inf6rieur servant de support (el)= 5cm), et d'un disque sup6rieur (ep = 2 cm) permcttant l'ajustement du niveau du liquide). Tableau 2. Composition du substrat synth6tique correspondant ~i un SOde 100mgCOTI i Table 2. Composition of the synthetic substrate, corresponding to a So of 100 mg TOC I-i Elements Sources de carbone glucose lait en poudre extrait de levures peptone

Concentration (mg l- T) 250 35 17,5 17,5

Oligo 616ments

(NH4)2SO( K2HPO4 Na3PO4, 12 H20 MgSO4, 7 H20 CaCI2 FeCI2, 6 H 20 CuCI3

50 I0 10 l0 l0 5 5

R. BELKHADIR et al.

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References Sanders (1967) Charaeklis et al. (1980)

Tableau 3. Differentes methodes d'6valuation de l'epaisseur d'un biofilm Table 3. The different methodologies in the evaluation of the biofilm thickness Conditionnement de l'echantillon Techniques de mesure D6shydratation ~i Fair libre (1 min) Par diff6rence de focalisation au microscope entre le biofilm et le support. Echantillon pla~ horizontaternent, 4-5 mesures

Kornegay et Andrews (1968) Williamson et McCarty (1976) La Motta (1976) Kristensen et Christensen (1982) Hoehn et Ray (1973) Normann et al. (1977) Grasmick (1982)

D+shydratation fi l'air libre (duree non contr616e)

Microscope dot6 d'un microm6tre objet. Echantillon plac6 vertiealement; 10 mesures

Cong61ation ~i -25"C apres conservation au formald6hyde D6shydratation non contr616e, mais < 15 rnin

Photographic sous microscope Echantillon plac6 verticalelement

I~shydratation fi l'air libre (4 min)

biofilm caract6ristiques d'une activit6 biologique (ATP, d+shydrog6nases, etc... ) ou de sa constitution (exopolym~res... ). Dans le cadre de cette 6tude, nous nous sommes int6ress6s plus particuli+rement aux mesures d'ATP dans le but de superposer aux courbes de croissance type (~paisseur, masse) I'ATP total ou sp6cifique. Parmi les nombreuses m6thodes propos6es, la technique d'extraction au DMSO s'av+re la plus fiable (Patterson et al., 1970; Statham et al., 1975; Levin et al., 1975; Colin 1976; Martin et al., 1980). La m6thodologie retenue est la suivante: extraction immediate sur l'6chantillon pr61ev~ et homog6n~is6 aux ultrasons pendant 15 s; cong61ation de l'extrait; mesure de I'ATP par bioluminescence (Nucl6otim~tre Interbio L.V.C.), de tous les 6chantillons d6congel6s dans les m~mes conditions. L'incertitude relative calculee a partir de trois extractions faites sur un m~me 6chantillon est environ de 10% (I'ATP de chaque extrait 6tant par la suite mesur6 trois fois). Techniques caractbristiques de la fermentation

Ces techniques sont conventionnelles et concernent le substrat (mesure du COT) et les produits de fermentation (&hanoi, AGV). Dans le cas de cette &ude, on doit souligner que le substrat r6siduel fi la sortie du r6acteur, en terme de COT, est 6valub par difference entre le COT global mesur6 (COTmetre lonics) et le COT calcul6 /t partir des concentrations des diff6rents produits dos+s par chromatographic en phase gazeuse. I1 est not6 COT s , la pr6cision est d'environ 15%. RESULTATS EXPERIMENTAUX S t r u c t u r e s d ' u n biofilm

D a n s une premi6re serie d'exp6riences, n o u s n o u s

Par jauge de pen6tration. Echantillon place horizontalement; 30 mesures Pied a coulisse. Echantillon place verticalement; 20 mesures

s o m m e s interesses ~i 1'6volution de la s t r u c t u r e externe d u biofilm en f o n c t i o n du temps. Si o n d~finit le biofilm c o m m e une c o u c h e de structure u n i f o r m e et c o n t i n u e p r 6 s e n t a n t une c e r t a i n e 6paisseur, alors celui-ci n'appara~t q u ' a p r ~ s un c e r t a i n t e m p s de contact e n t r e le s u p p o r t et le milieu nutritif. Ces figures n o u s i n d i q u e n t , q u ' a u del/t d ' u n e certaine p6riode ( f o n c t i o n des c o n d i t i o n s exp6rimentales), le biofilm ne se pr6sente plus sous la f o r m e d ' u n e c o u c h e c o n t i n u e et u n i f o r m e , et qu'il appara~t des excroissances de type filamenteux en m o u v e m e n t d a n s la p h a s e liquide. D a n s ce cas, on ne peut plus p r e m i 6 r e m e n t caract6riser le film bact6rien p a r une 6paisseur m o y e n n e , et d e u x i + m e m e n t , les h y p o t h 6 s e s d ' u n t r a n s p o r t diffusionnel de s u b s t r a t fi travers u n e surface p l a n e ne s o n t plus correctes. D a n s ce cas, on rel6ve une croissance b e a u c o u p plus u n i f o r m e d u film bact6rien que l ' o n peut caract6riser p a r une 6paisseur m o y e n n e ; la Fig. 6 m o n t r e toutefois, que le biofilm est t o u j o u r s constitu6 d ' e x c r o i s s a n c e s c o r r e s p o n d a n t fi des colonies bact6riennes. L ' 6 p a i s s e u r ainsi m e s u r 6 e fi p a r t i r des vue de profil c o r r e s p o n d fi une e n v e l o p p e m o y e n n e de l ' e n s e m b l e de ces colonies. En c o n c l u s i o n de ces o b s e r v a t i o n s de biofilms au m i c r o s c o p e , o n p e u t dire que l'6paisseur n ' e s t q u ' u n e g r a n d e u r qualitative de la c r o i s s a n c e et d ' a u t r e part, d a n s certains cas de figure, il n ' e s t m ~ m e plus possible de parler d'6paisseur.

Fig. 2. Schema du montage exp/~rimental de caract6risation d'un biofilm. 1--Microscope st6r6oscopique Wild, muni d'un microm6tre objet; 2--sources lumineuses; 3--bac d'immersion du disque; 4-~iisque observ6, pouvant &re d6plac6 par simple rotation; 5--biofilm. Fig. 2. Diagram of the experimental assembly of the characterization of a biofilm.

Mod61isation d'un film biologique--I

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Description de la croissance d'un biofilm anaerobie Les p a r a m 6 t r e s suivis au cours de la croissance d u biofilm sont: - - l a c o n c e n t r a t i o n en s u b s t r a t (COT)s ~i la sortie d u f e r m e n t e u r ou la vitesse globale d'6puisement d u s u b s t r a t fi la travers6e d u r6acteur [ Q ( S 0 - S ) / V ] [Fig. 7(a)]; - - l e s c o n c e n t r a t i o n s en m i c r o o r g a n i s m e s fix6s (Mb) et en suspension (Xs) et l'6volution de l'6paisseur [Fig. 7(b)];

Fig. 6. Biofilm ana6robie de 66 h e n vue de face ( x 130). Fig. 6. Front view of an anaerobic biofilm after 66 h ( x 130). - - l e s c o n c e n t r a t i o n s en produits de f e r m e n t a t i o n (6thanol, acide ac6tique) [Fig. 7(c)].

ta)

(~

200 Fig. 3. Profil d'un biofilm a6robie de 33 h ( x 130) Fig. 3. Side view of an aerobic biofilm after 33 h ( x 130)

O. o

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.'°° (b) L

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E

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500

A

Fig. 4. Profil d'un biofilm a6robie de 46 h ( x 130). Fig. 4. Side view of an aerobic biofilm after 46 h ( x 130).

(c) o~

E

~, 1oo E o

g

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0 25

Fig. 5. Profil d'un biofilm ana6robie de 72 h ( x 130). Fig. 5. Side view of an anaerobic biofilm after 72 h ( x 130).

50 75 temps ( h )

100

Fig. 7. Evolution en fonction du temps, de diff6rents param6tres caract6ristiques de la croissance. Fig. 7. Evolution of the different growth parameters with time.

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R. BELKHADIRet al.

Fig. 8. Etat de la croissance en phase de latence: colonies blanchfitres dispers6es sur le support (× 130). Fig. 8. State of growth in the latent phase: dispersed white bacterial colonies on the surface structure (× 130).

Fig. 9. Phase de croissance acc616r6e (forte densit6 microbienne) ( x 130). Fig. 9. Accelerate growth phase (high microbial density) ( × 130).

Les conditions op6ratoires correspondant fi la Fig. 7 et regroupant les r6sultats de trois exp6riences, sont:

1974; Fletcher et al., 1976; Beachy, 1981), du type de substrat, de la concentration d'alimentation So, du temps de s 6 j o u r . . . ] (Belkhadir, 1986). (2) Phase de "croissance acc~lbrbe" du biofilm : correspond ~ une 6volution tr6s rapide du ph6nom6ne (de 10-20 h) qui se caract6rise par:

--concentration d'alimentation: So = 160 mg COT 1 ~; ~6bit d'alimentation du r6acteur de volume V = 4,95 liter: Q = 0,55 1 h ' (soit un temps de passage de 9 h): vitesse de rotation des disques 50rpm (vitesse periph6rique: 52 cm s- 1); --temp6rature maintenue constante fi 3 3 C . Ces figures montrent que l'on peut d6crire la croissance d'un biofilm selon six 6tapes: ( 1) Phase de latence ou d'activation : correspond ~i une induction du ph6nom6ne au cours duquel des mol6cules organiques s'adsorbent sur le support (phase passive) favorisant ainsi la fixation de bact6ries iso16es (phase active). Ceci correspond ~ la d6finition donn6e par Fletcher (1980). D'autre part, Marchall (1971), caract6rise cette &ape de r6versible car les bact6ries ne sont pas solidement fix6es au support (faible production d'expolym6res); elles peuvent ainsi &re d&ach6es facilement sous l'effet de contraintes hydrodynamiques. Au cours de cette phase (apr6s 6 h de temps de contact), on constate l'implantation dispers6e de petites colonies bact6riennes se localisant pr6f6rentiellement ~t des h&6rog6n6it6s de surface (Fig. 8). On note donc que dans cette p6riode, la croissance ne donne pas lieu ~, formation d'un biofilm uniforme. Sur le plan cin6tique, cette phase est particuli6rement difficile ~ maitriser notamment ~ partir des m6thodes classiques. Aussi, on ne rel6ve pas de variations sensibles des param6tres (COT s, Mb, e, P), par contre, on observe en g6n6ral, une production rapide de MES dans la phase liquide. Celles-ci proviennent des bact6ries qui se d6tachent du support et de la croissance dans la phase liquide. D'autre part, la dur6e de cette phase est tr6s br6ve (5-10 h); elle d6pend des conditions op~ratoires [nature du support (Zobell, 1943-1946; Wood, 1950; Maignan et al.

une diminution tres importante de la concentration en substrat; ---une forte production en produits de fermentation (&hanoi-acide ac6tique); - - u n e accumulation tr6s nette en biomasses fix6es, qui ~i la fin de cette phase forment une mince couche uniforme de l'ordre de 50-80 # m repr6sentative d'un biofiim. Sur la Fig. 9. (vue de face), le biofilm apparMt alors comme la juxtaposition d ' u n tr6s grand nombre de colonies bact6riennes, de plus ou moins grande importance. D'autre part, ~ la fin de cette phase, la concentration en substrat tend vers une valeur limite minimale tandis qu'inversement, les concentrations en

_

+

13 I _

C

m 0

F--

_

•

+

0

bact6ries d6~ctivaes Imct6ries actives

Fig. 10. Repr6sentation sch6matique du d6veloppement des colonies bact6riennes sur un support. Fig. 10. Diagrammatic representation of bacterial colony development on a surface.

Mod61isation d'un film biologique---I produits sont maximales. Ceci indique que la capacit6 du biofilm ~ 6puiser le substrat tend vers une valeur limite maximale. En cons6quence, l'6volution des mati6res s6ches totales du biofilm ( M 0 ne traduit pas cet 6tat d'6quilibre, car celles-ci continuent fi s'accumuler sur le support. On doit donc pour expliquer ce ph6nom6ne, distinguer deux types de bact6ries constituant le biofilm: - - l e s bact6ries actives (M~) responsables de la d6gradation du substrat. Celles-ci constituent soit le point de d6part de nouvelles colonies ou la localisation ~ la p6riph6rie des colonies d6j~ existantes; - - l e s bact6ries inertes ou d6sactiv6es (Md) qui ne jouent plus aucun r61e dans le processus de d6gradation. Cette biomasse, situ6e ~, l'int6rieur des colonies ne peut pas m6taboliser le substrat, bien qu'elles conservent certaines activit6s enzymatiques. Ce ph6nom6ne peut &re illustr6 par rapport aux Figs 8 et 9 par le sch6rna Fig. 10. Les causes de la d6sactivation sont multiples et peuvent d6pendre: - - d e l'accumulation interne dans le biofilm ou dans la bact6rie m~me, de produits de fermentation ou de m6tabolites inhibiteurs; ---de l'effet de confinement 1i6 a r6dification de nouvelles cellules qui modifie ainsi le transport diffusionnel du substrat et des produits au voisinage de celles-ci. Cet effet de confinement peut 8tre reli6 la fraction de surface occup6e. Pour mod61iser ce ph6nom6ne, on associe h cin6tique intrins6que de croissance (rM,), une cin6tique de d6sactivation (rMd) (Belkhadir, 1986). Ces cin6tiques repr6sentent aussi des densit6s de flux. La vitesse nette d'accumulation de la biomasse globale active sur le support s'6crite alors:

[ -Ma] TTj,~

= rM, - r~,d

(1)

65

L'6quation (1) devient: - - ~ - ] a ~ = ~ ' M a - k2"M~ avec k 2 = ~k I .

En se plaqant en r6gime permanent tionnement par r a p p o r t / t M~

rM, =

FdMq L dt 1,~ = 0

rM, = ~0.M~

(2)

OU

#0 = taux de croissance maximum (T -~) M~ = masse active par unit6 de surface du support (A0) (M ou nombre de cellules.L-2). En faisant l'hypoth6se d'une d6sactivation par effet de confinement et accumulation de produits toxiques, on pose successivement:

rMd k I "I" m, =

(3)

OU

I = concentration en produits inhibiteurs (ML -3) k I = constante de d6sactivation (M-1L3T - l ) et I = ~ Ma (ct coefficient de proportionnalit6). (4)

et

de fonc-

M, = (M,)m,,

(6)

on tire k2 = soit

°-.l

Po (M,)~x

dt _la~ -- P°M"

(,

(7)

,,,

M,

On peut modifier cette expression en faisant apparaitre la fraction de surface occup6e (a/Ao). Les observations exp6rimentales confirment en effet que la masse active de micro-organismes augmente dans le temps, tant que la surface n'est pas enti6rement colonis6e. En r6alit6, il faut consid6rer que (M,) et (Ma)m,x sont respectivement proportionnelles aux surfaces d'6change liquide-biofilm correspondant un support partiellement et totalement colonis6. Ces grandeurs n'6tant pas directement accessibles fi l'exp6rience, on prond6re la fraction de surface occup6e (a/ao) par un coefficient (fl) caract6risant l'6cart entre le mod61e et la r6alit6 physique du ph6nom6ne. soit

M, = / ~ a (M~).~, Ao"

(9)

L'6quation (8) s'6crit alors:

[dM,]

avec

(5)

dt ]a~=#°'M"'fl

A0-a ~

"

(10)

Sous cette forme, on montre que raccumulation de la biomasse active d6pend notamment de la fraction de surface disponible. Ceci rappelle le concept de biological space" cit6 par Hockenhull (1968) et qui a 6t6 introduit par des botanistes afin de traduire la limitation d'espace disponible pour des cultures v6g6tales. D'autre part, r6quation (8) a d6jfi 6t6 propos6e par de nombreux auteurs il y a quelques dizaines d'ann6es, comme fonction math6matique d'ajustement de courbes de croissance sous le terme de "fonction Iogistique" (Pearl, 1940; Keshavan, 1964; Costantinides et al., 1970; Trulear et Characklis, 1982; Vavilin et al., 1985). Cette expression qui donne des allures sigmoidales telles que celles observ6es d a m les ph6nom6nes autocatalytiques, a 6t6 raise fortement en doute par Monod en 1942. Mais, actu-

66

R. BELKHADIRet al.

LnM b

4-

3-

2-

1,5

r

temps [ h ) Ira, I

25

I

50

I

75

Fig. l l. Exploitation des donn/~es dans le plan In Mb =f(t). Fig. 11. Exploitation of data in the In Mb =f(t) coordinates. ellement, elle fait l'objet de nouvelles investigations car elle traduit notamment I'arr& de la croissance par accumulation d'inhibiteurs (Thibault, 1982) et en cons6quence, l'&ablissement d ' u n &at stationnaire correspondant 5. une vitesse nette de croissance nulle (Constantinides et aL, 1970). Par ailleurs, au regard de l'6volution des mati6res s6ches totales et du biofilm (Mu), par similitude 5. la loi classique de la multiplicit6 cellulaire, cette phase a 6t6 appel6e "phase logarithmique" (Sanders, 1966; La Motta, 1976; Characklis et al., 1982). En effet, si on exploite les donn6es de trois exp&iences dans le plan semi-log (Fig. 11), on constate effectivement, dans l'intervalle de temps (15-30 h), que les points exp6rimentaux s'alignent selon une droite. On doit toutefois consid6rer ces r&ultats avec pr&aution, compte-tenu du peu de points et de la mauvaise reproductibilit6, dans certains cas, du ph6nom6ne. En conclusion, bien qu'il soit difficile de cerner avec pr6cision cette phase, car on n'a pas un acc6s direct fi la biomasse active, m6me 5. partir des mesures d'activit6 sp6cifiques, on peut parler sur le plan du comportement du biofilm d'acc616ration du processus de croissance par rapport 5. la phase de latence. D'autre part, au regard de l'6volution des autres param~tres, on montre qu'5. la fin de cette p&iode on obtient un 6tat stationnaire caract6ris6 notamment par l'&ablissement d'une quantit6 de biomasse active constante et maximale. D ' u n point de vue pratique, cette phase d'6volution du biofilm est fondamentale car elle traduit l'essentiel du processus biologique (croissance de la biomasse active, 6puisement du substrat, 6laboration des produits). On l'appellera donc "phase dynamique de croissance". (3) Phase de croissance linbaire du biofilm : correspond 5. une accumulation 5. taux constant de la biomasse sur le support. Elle se caract6rise par: - - u n e concentration en substrat 5. la sortie du fermenteur constante, ce qui traduit un r6gime permanent de fonctionnement;

- - u n e cinetique de croissance des MST, constituant le biofilm, d'ordre 0 par rapport 5, sa concentration (dM b/dr = constante); ~ i e s concentrations en produits (&hanoi, acide ac&ique), constantes. Cette phase a d6ja ~t~ mentionn6e dans la litt&ature par Trulear et Characklis (1982), mais fi partir de mesures d'6paisseur. La Fig. 3 montre effectivement que l'6paisseur du biofilm croh aussi de mani6re lin6aire en fonction du temps. Nos exp6riences indiquent d'ailleurs que la notion d'6paisseur d'un biofilm ne devient effective qu'au cours de cette phase; au cours des p&iodes pr6c6dentes, la colonisation du support ne se faisant que de mani&e ponctuelle ou localis6e (Figs 12 et 13). Les zones en blanc indiquent la fraction du support non encore colonis&, les zones pointill6es correspondent 5. l'apparition de colonies de petites tailles). Du point de vue du concept, l'bvolution lin6aire des MST du biofilm en fonction du temps, indique un ralentissement du processus par rapport 5. la phase pr&bdente. Les causes de ce ralentissement li6es 5_ la saturation du support sont multiples et d6pendantes les unes des autres (limitations diffusionnelles au voisinage des cellules, effets d'inhibition dus fi la densit6 cellulaire ou • l'accumulation de loxiq u e s . . . ). L'ensemble de ces effets peut &re regroul~ sous le terme de "confinement". La vitesse d'6volution de la masse du biofilm peut alors &re repr6sent6e par 1'6quation suivante: dM dt

b _

K = [ +~-~ -9/2~-] [d M d 1 L dt _],,: + L dt Ja¢¢

(11)

avec

I

dM. 1

--~-J,c+ = 0

et

M, = (Ma)m, x

(a)

++,+. + . .+ • .0. ..+. 0o:.o, vue

en plon

profil

(b)

vue en plon

profi[

Fig. 12. Colonisation du support (a) en phase acc616r6e et (b) en phase lin6aire. Fig. 12. Colonization of surface (a) during the accelerated phase and (b) during the linear phase.

Mod61isation d'un film biologique---I

vue de face

67

vue de profit

Fig. 13. Colonisation du support en phase de croissance lin~aire ( x 130) Fig. 13. Colonization of the support during linear growth phase (× 130).

et

lentissement, on fait apparaitre un taux de d6crochage du biofilm Rd, et la vitesse d'accumulation du biofilm s'6crit:

rMa -~- rMd

soit

dMb dMb dt - (rMd)ma, = g =/20(ga)ma x.

- -

(12)

Cette 6quation indique que l'accumulation du biofilm au cours de cette phase correspond fi l'accumulation de la biomasse d6sactiv6e, la biomasse active &ant constante et maximale. (4) Phase de ralentissement: cette &ape constitue une transition entre l'accumulation fi taux constant du biofilm et sa stabilisation ~ des valeurs maximales en masse et en 6paisseur. Elle traduit donc un ralentissement lid aux contraintes hydrodynamiques (cisaillement) dont les effets augmentent avec l'hpaisseur du biofilm, ce qui emp~che des accumulations additionnelles. Le syst6me tend alors vers un r6gime permanent par rapport au biofilm (masse et 6paisseur constantes). Pour traduire ce ra-

dt

=

]~0(Ma)max

--

R d .

Rd traduit donc l'influence des ph~nomdnes physiques sur le processus en pond6rant l'accumulation de nouvelles cellules. (5) Phase de stabilisation: carte phase appel6e aussi "plateau" (Characklis et al., 1982) est caract6ris6e par des valeurs constantes et maximales de la masse et de l'~paisseur du biofilm, ce qui correspond fi l'&ablissement d'un r6gime permanent par rapport au biofilm (dMb/dt = 0). A c e niveau, il s'6tablit un 6quilibre (bref et instable) entre la perte en biomasse due aux contraintes physiques et la croissance de nouvelles cellules a la p6riph6rie du biofilm [K = #0(Ma)ma x = R~]. (6) Phase de dbcroehage: elle se caract6rise par une perte totale ou sous forme de lambeaux, du biofilm

? ::

vue de face

(13)

vue de profit

Fig. 14. Vue de face et de profil de bulles de gaz pi6g6es dans un biofilm ( x 130). Fig. 14. Front and side view of gas bubbles trapped in the biofilm (x 130).

68

R. BELKHADIR et al.

due ~i la lyse cellulaire dans les couches profondes et la destruction des cellules responsables de la fixation. D'autre part, nous avons pu mettre en 6vidence pour une s~rie d'exl~riences, l'apparition de bulles de gaz pi6g6es entre le biofilm et le support (Fig. 14). En conclusion, la description de la croissance d'un biofilm ana~robie peut &re sch~matis~e par les diffCrentes 6tapes d~crites dans la Fig. 15. Si l'on superpose maintenant h la courbe de croissance, 1'6volution des activitCs totales et sp~cifiques mesurCes en terme d'ATP, nous observons que I'ATP augmente de la m~me maniCre que la masse du biofilm, ce qui conduit ~ une activit¢ sp6cifique constante jusqu'fi la phase de stabilisation (Fig. 16). Ces r6sultats appellent quelques commentaires. On constate tout d'abord que les mesures d'ATP ne permettent pas de d6finir l'existence du r6gime permanent de fonctionnement mis en 6vidence ~ partir de l'6puisement du substrat et de l'~laboration des produits. Ceci indique que ce param~tre n'est pas uniquement repr6sentatif de la biomasse active, mais qu'il fait aussi intervenir une quantit6 d'ATP li6e /t des r6actions biologiques "secondaires" existant en g6n6ral au sein du biofilm mais qui ne concernent plus directement la transformation du substrat principal de croissance par M a. L'ATP apparait donc comme une mesure globale des diverses activit6s biologiques existant au sein du biofilm. Ainsi, fi ce niveau, on relive toute i'importance des d6finitions des deux types de biomasse telles qu'elles ont 6t6 pr6cis6es dans l'etude de la phase de croissance acc~16r6e: --biomasse active: biomasse responsable de la d6gradation directe du substrat: --biomasse d~sactiv6e: biomasse ne pouvant pas d6grader le substrat, bien qu'elle conserve certaines activit6s enzymatiques. I1 faut aussi noter que des r~sultats simitaires ont 6t6 obtenus ~i partir d'un biofilm a6robie par La Motta (1976) qui montre que I'ATP par unit6 de masse du biofilm croit en fonction de l'6paisseur de celu6ci jusqu'd environ 320 # m alors que l'~paisseur active calcul6e est nettement inf~rieure. En conclusion, il appar~it d'apr6s ces exp6riences, que la mesure de I'ATP total d'un biofilm est aussi une grandeur globale et apparente du processus biologique. En fait, la seule activit~ sp~cifique representative des potentialit~s des micro-organismes d~grader le substrat est la vitesse intrins~que d'6puisement de ce substrat (rs). Pour atteindre ce param~tre, il est donc n~cessaire de mod61iser le processus, ceci fera l'objet d'une prochaine publication. CONCLUSIONS

Dans cette premi6re publication, nous avons abord6 l'aspect descriptif de la croissance d'un

--~oMb . . . . . .

K

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-K- R

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phase L_ phQse de croissonce du btofiim stoblhsa •.-J--~ _ tion du Iatencedet..lScc~dr/~e _,_-q- lin~olre ~?alentie'q biofilm - pf",~-~e - - i dynamique phose stohonnaire de Ma J de MO : trans,to,re / ; o W

rt=9,rne p. . . . nentl MO

Fig. 15. Repr6sentation des differentes phases de la croissance d'un film biologique ana~robie. Fig. 15. Representation of the different growth phases of an anaerobic biological film.

biofilm ana6robie et donne les principales hypoth6ses d'un nouveau fondement biologique. Nous avons mis en 6vidence que la croissance d'un film biologique se faisait selon six 6tapes: - - u n e phase de latence suivie d'une phase dynamique de croissance correspondant ~ l'implantation

_Otis

i

,of,:o,o

-,

Fig. 16. Evolution de l'activit~ en terme d'ATP en fonction du temps. Fig. 16. Evolution of the activity calculated by ATP measurements, with time.

Modrlisation d'un film biologique--I et l'accumulation de la biomasse active (Ma). Ces deux phases constituent ie rrgime transitoire par rapport ~ la masse active qui est relire exprrimentalement ~i ia fraction de surface disponible; - - u n e phase linraire caractrristique d'une accumulation fi taux constant du biofilm qui est la consrquence directe de l'accumulation d'une biomasse drsactivre (Md). Parallrlement, la biomasse active reste constante et maximale ce qui correspond /~ 1'rtablissement d'un rrgime permanent de fonctionnement, par rapport aux diffrrents paramrtres caractrristiques de la fermentation (Ma, Sv, P); - - u n e phase de ralentissement suivie d'une stabilisation de la masse et de l'rpaisseur du biofilm lires des p h r n o m r n e s physiques (cisaillement). Cette dernirre 6tape correspond au rrgime permanent de fonctionnement observ6 par rapport ~ Mb; - - u n e phase de drcrochage au cours de laquelle le biofilm se drtache de manirre alratoire du support et qui drpend de facteurs biologiques (lyse cellulaire, bulles de g a z . . . ) intervenant au niveau de la surface de fixation, et de facteurs physiques. D u point de vue cinrtique, on peut modrliser ce p h r n o m r n e en superposant fi une cin&ique intrins~que de croissance de la biomasse active, une cinrtique de drsactivation. Ce dernier aspect sera trait6 dans la deuxirme partie de cette publication.

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