Récepteurs des facteurs de croissance fibroblastique et anomalies héréditaires de la croissance osseuse

Arch P&dim

Sbance plCni6re : Ghes du dkveloppement

1997;4(Suppl

2):112s-I 17s 0 Elsevier. Paris

et anomalies

RCcepteurs des facteurs de croissance fibroblastique et anomalies h&ditaires de la croissance osseuse J Bonaventure, F Rousseau, L Legeai-Mallet, (irut6 de recherche

SW les handicaps

gtfnitiques

de

C Benoist-Lasselin, M Le Merrer, A Munnich

l’mfant, Insem

Les facteurs de croissance fibroblastique (FGF), au nombre de neuf, rtgulent la prolif&ation et la diff&enciation de cellules d’origine mCsenchymateuse et neuroectodermique [ 11. Ce sont les ligands d’une famille de rtcepteurs & haute affinitC codCs par quatre gbnes : les rCcepteurs des facteurs de croissance fibroblastique (FGFR) l-4 localis% respectivement sur les chromosomes 8, IO,4 et 5 (fig 1). Les FGFR appartiennent ?Ilafamille des rCcepteurs ?I activitt tyrosine-kinase de classe IV qui se caractkrise par la prCsence de trois boucles de type pseudo-immunoglobuline(Ig) dans le domaine extracellulaire [2]. Les isoformes les plus frtquentes cornportent, outre la partie extracellulaire, un domaine

U 393, Institut

Necker,

149, rue de S.+res,

75015 Paris, France

transmembranairehydrophobe composCde 22 acides amin& et un domaine tyrosine kinase intracellulaire comportant deux sous-unit& TKl et TK2 (fig 1). La boucle Ig II, le segmentreliant cette dernibreg la boucle Ig III et la premikre moitiCde la boucle Ig III sont responsablesde l’interaction avec le ligand. La seconde moitiC de la boucle Ig III est soumise2 un tpissage alternatif qui peut g6nCrerdeux isoformesILIb et 111~ d’expression tissulaire diffkrente et qui semblent induire, aumoinspour FGFR-2, une sp&ificit6 de liaison du ligand.La liaisondu ligand &sonrkcepteurd&lenche unedimkrisationdu ricepteur qui provoque l’autophosphotylation dessous-domainestyrosine kinase [3].

COO”

NH2

S Rkepteurs

lgl

A

Ig II

Localisation

Ig Ill

TM

chromosomique

lsoformes

FGFR-1

ken

Mb, lllc

FGFR-2

1 Oq26

lllb (exon K), lllc (exon B)

FGFR-3

4~16

Illb, Ilk

FGFR-4

5q35

lllc

Fig 1. Structure des rkepteurs des FGF (FGFR) et localisation chromosomique. La rkgion variable de la troiskme boucle immunoglobuline est sour&e ?Iun Cpissage alternatif sauf dans le cas de FGFR-4. S = peptide signal ; A = boite acide ; Ig I-III = boucles pseudo-immunoglobulines ; TM = domaine transmembranaire ; TK 1.2 = domaines ?I activitk tyrosine kinase. Dans le ghe FGFR-2, deux exons K et B sent exprimks de facon mutuellement exclusive. L’isoforme Illb correspond au rtkepteur qui lie spkifiquement le KGF (kerutinocyte growth ,facrur). L’isoforme IIIb est exprimk dans les ostioblastes.

RCcepteurs

de facteurs de croissance

FGFR-3 : Gi3NE RESPONSABLE DE L’ACHONDROPLASIE Jusqu’en 1993, le role des FGF et de leurs recepteurs dans la croissance osseuse Ctait meconnu, en depit d’une etude d’hybridation in situ ayant montre une expression marquee du gene FGFR-3 dans les ebauches cartilagineuses de la souris embryonnaire [4]. La localisation du gene de l’achondroplasie dans la partie telomerique du bras court du chromosome 4 [5] a rtvele une implication possible du gene FGFR-3 dans les anomalies de lacroissance. L’achondroplasie est une affection hereditaire transmise de faGon dominante qui se caracterise par des membres courts, une macrodphalie, une hyperlordose lombaire et des mains courtes en for-me de trident. Sa frequence est estimee a l/15 000, mais il faut souligner le fort pourcentage de formes sporadiques (85-90 %) qui sont souvent associees a un age ClevC du pbre. L’analyse de la partie codante du gene FGFR-3 a permis a notre tquipe [6] et a une Cquipe amtricaine [7] de demontrer qu’une mutation heterozygote recurrente au nucleotide 1138 est responsable de la totalite des cas d’achondroplasie Ctudits. La glycine en position 380 du domaine transmembranaire est convertie en arginine, introduisant ainsi un acide amine charge dans une region hydrophobe. Des travaux ulterieurs ont confirme l’unicitt quasi absolue de cette mutation G380R, retrouvee dans plus de 99 % des cas CtudiCs, faisant de la guanosine mutee qui appartient a une paire CpG le nucleotide le plus sensible aux mutations de tout le genome humain. Ntanmoins, une seconde mutation beaucoup moins frequente a CtC identifiee au codon glycine 375 qui est converti en cysteine (fig 2). Cette homogeneitt genetique reflete bien I’homogentite clinique de cette affection. FGFR3, HYPOCHONDROPLASIE ET NANISME THANATOPHORE La forme homozygote de l’achondroplasie est gedralement l&ale et ressemble radiologiquement a une entitt clinique d&rite par Maroteaux sous le nom de nanisme thanatophore. Cette chondrodysplasie est lCtale et se caracterise par un nanisme extremement marque, une platyspondylie avec des vertbbres en forme de U et des &es courtes. Elle est exclusivement sporadique et associte a des mutations faux-sens du gene FGFR-3 a I’Ctat heterozygote, mais sit&es en dehors du domaine transmembranaire. Alors que dans la forme radiologique la plus frequente (TD I) une Cquipe am&Caine a identifie une mutation (R248C) dans le domaine extracellulaire [8], nous avons mis en

fibroblastique

113s

evidence trois substitutions touchant l’une des bases du codon de terminaison de la traduction et entrainant sa disparition [9]. Celle-ci a pour consequence la poursuite de la traduction de 1’ARNm jusqu’au codon stop suivant. Dans le gene FGFR-3, celui-ci se trouve 423 bases en aval du codon stop normalement utilise, ce qui conduit a une proteine allongee de 141 acides amines et contenant un domaine riche en residus hydrophobes. Recemment, nous avons tgalement identifit deux nouvelles mutations c&ant des residus cysteines au niveau du domaine extracellulaire jouxtant le domaine transmembranaire (fig 2). 11faut souligner que les anomalies radiologiques et histologiques de ces formes likes 9 des mutations extracellulaires ne peuvent Ctre distingdes de celles resultant de la perte d’un codon terminaison [lo]. A l’inverse, une mutation htterozygote au sein du domaine tyrosine kinase TK 2, dans laquelle une lysine est convertie en acide glutamique a la position 650 de la chaine peptidique, est associee a une forme clinique legerement moins severe (TD II) avec des femurs presque rectilignes et un crane en trbfle [9]. Une troisibme entite clinique proche de I’achondroplasie, mais de sCvCrite moindre, l’hypochondroplasie, rtsulte Cgalement de mutations du gene FGFR-3. 11 s’agit d’une mutation heterozygote recurrente qui touche le domaine TK 1 et convertit un residu asparagine a la position 540 en lysine. Cependant, elle n’est retrouvee que dans 65 a 75 % des cas. L’identification, par des etudes de liaison, de familles d’hypochondroplases non bees au locus FGFR-3 sugg&e une heterogeneite genetique. DES MUTATIONS DES FGFR RESPONSABLES DE CERTAINES CRANIOSTkNOSES Alors que l’ossification enchondrale est un phenombne specifique de la croissance des OSlongs, la croissance des OS plats du crane fait intervenir une ossification differente, de type membranaire, n’impliquant pas les chondrocytes, mais uniquement les osteoblastes qui dtrivent de cellules d’origine mesenchymateuse. Les craniostenoses constituent un groupe cliniquement t&s hCtCrogbne d’anomalies de l’ossification membranaire se traduisant par une fusion prCmatur& des sutures osseuses. 11en resulte des deformations craniofaciales plus ou moins marquees auxquelles peuvent s’ajouter des anomalies des pieds et des mains. Condcutivement a l’identitication du gene de l’achondroplasie, un second membre de la famille des FGFR, le gene FGFR-2, a ete associe au syndrome de Crouzon [ 111, entite caracteriste par une brachyctphalie et une faciostenose responsable d’un proptosis et d’un enfoncement de I’Ctage moyen de la face, sans anomalie des extremites des membres. Des

114s

J Bonaventure

0-

Pfeiffer

et al

ERSPHRPIL

FGFR-1

o Apert

ERSPHRPIL

FGFR-2

@ Crouzon 0

Pfeiffer

FGFFIJ

G 370 C

G 37

TDI

Fig 2. Mutations des genes FGFR-I, FGFR-2 et FGFR-3 identifiees chez I’humain. La region comprise entre la deuxieme et la troisteme boucle Ig est extremement conservte. La mutation la plus fmquente dans FGFR-2 enualne la disparition de la cysteine 342 qui est imphquee dans la formation du pont disulfure de la boucle lg. La substitution de cette cysteine peut se traduire par un syndrome de Crouzon, de Jackson-Weiss ou de Pfeiffer. Les mutations de FGFR-3 sont responsables de uois types de nanisme : achondroplasie (ACH), hypochondroplasie (HCH) et nanisme thanatophore (TD I, Ii).

mutations du geneFGFR-2 ont d’abord Ctt identifites dans la secondemoitit de la troisieme boucle Ig du recepteurcodee par l’exon B qui est soumisa un epissagealtematif (fig 2). Des etudescompltmentairesont montre que desmutationsdansla premieremoitie de la troisiemeboucle Ig (IIIa) qui estcodeepar un exon non soumisa Cpissagealternatif rendent Cgalementcompte du phenotype. Dans la majorite descas,la mutation fait apparaitreou disparaitreun codoncysdine. Une forme cliniquement proche du syndromede Crouzon, le syndromede Jackson-Weissqui s’en distingue par la pre-

senced’anomaliesdespieds, resulte Cgalementd’une mutation dansla troisiemeboucle Ig de FGFR-2. Dans le syndromed’Apert, dont la sCvCritCclinique est plus marqueeque celle dessyndromesprecedentsavec notamment des syndactylies (fusion osseuseet cutade) au niveau desmainset despieds,les mutationshtttrozygotes de FGFR-2 affectent le segmentqui relie la deuxieme boucle Ig a la troisieme (fig 2). 11s’agit de substitutionsrecurrentestouchantdesrtsidus adjacents en position 252 et 253 du recepteur dans un domaine extremement conserve au sein de la famille FGFR

RCcepteursde facteursde croissancefibroblastique

115s

Recepteur normal et ligand

Fig 3. Moditlesde dimkrisationd’un FGFR. Dans un r&epteur normal,la stimulationpar un liganddela familledes FGF induitla dimtrisation et I’autophosphorylation du rtcepteur.Lorsquele rCcepteurPorteune mutation&ant unecystt5inesurnumkrairedansle domaineextracellulaire (comme dans certains cas de nanisme thanatophore), la dimkrisation du rkcepteur se fait ind+endamment du l&and par formation d’un pant disulfure entre deux monom5res mu&.. HSPG = hepurun sulfate profeoglycan (rkepteur accessoire de basse affmitk). puisqueces r&idus strine et proline occupent une position Cquivalentedanstous les FGFR. Des mutations du g5ne FGFR-I touchant l’acide amint en position 252 ont CtCidentifites chez despatients atteints d’une autre forme de CraniostCnose, le syndrome de Pfeiffer [121qui, aux anomalies crdniennes (brachycCphalie ou plagiocCphalie), associedesdCformationsdes extrt5mids, notammentun &rgissement du gros orteil et une diviation des autresorteils. UNE MUTATION, DEUX SYNDROMES DISTINCTS On s’estaperqurapidementque le syndromedePfeiffer peut Cgalementr&ulter de mutationsdu gbneFGFR-2 [ 131et que,de surcroit, deux desmutationsresponsables du syndromede Pfeiffer (C342R et C342Y) s’observent 6galementchez des patients souffrant d’un syndrome de Crouzon typique suggCrantqu’une secondeanomalie gCnCtique(un polymorphismepar exemple), au seindu gbneFGFR-2 ou dansun desg&nescodantpour un FGF, pourrait modulerle phtnotype. La demike surprisea CtC la dt5couverted’une mutationfaux-sensdansle domaine transmembranairedu g6ne FGFR-3 h la position 391 (fig 2) proche de celle de l’achondroplasie,dans une

forme clinique particulikre du syndrome de Crouzon associantdesanomaliesdu derme(acanthosisnigricans) & la craniostCnose[ 141. Paradoxalement,les patients porteurs de cette mutation n’ont pasd’anomalie de la taille des OSlongs. LES MUTATIONS

DES FGFR

Elles ont un r61e activateur. Au niveau cellulaire, le ligand (FGF) ne selie pasdirectementau FGFR, mais requiert un rCcepteuraccessoirequi est un prottoglycane de surface, 1’hCparanesulfate prott?oglycane (HSPG) ou perlecane,rkcepteur de faible affinit& permettant une interaction appropriie avec le rtcepteur de haute affinitC (FGFR). Sousl’effet du ligand, le rCcepteur est activC et sedimCrise(fig 3). Cette dimerisation ddclenchela transduction du signal Btravers la membraneplasmiquequi entrainel’autophosphorylation du rCcepteurau niveau de certains rCsidustyrosine. II en rCsulteune phosphorylation de protCinescibles g domaine SH2 (Src homology 2), suivie d’une cascade d’activationsde MAP (microtubule associatedprotein) kinasesdont la sCrine/thrConine kinaseRaf (MAPKKK) qui phosphoryleet active Mek (une MAPKK) qui ellem&mestimule une MAPK. Cette dernikre active fina-

116s

J Bonaventure

et al

zone de prolifkration zone de maturat ior zone d’ hypertrophie trabircules osseux Fig 4. Representation schematique de la plaque de croissance d’un OS long dans un cartilage normal et pathologique. a) cartilage normal ; b) expansion de la plaque de croissance chez une souris homozygote obtenue par destruction ciblee (knock-our) du gene FRfr-3 ; c) reduction et desorganisation de la plaque de croissance du cartilage d’un patient porteur d’une mutation faux-sens hetkrozygote du gene F,@r-3 (achondroplasie ou nanisme thanatophore)

lement des facteurs transcriptionnels intranucleaires. Parmi ces facteurs, les membres de la famille ATF/CRE (activating transcription factorlcAMP response element) pourraient &re impliques [ 151. Des experiences de transfection du recepteur FGFR-3 mute a la position 380 ont montre une autophosphorylation du recepteur mutant en l’absence de ligand, sugg&ant que ce dernier n’est pas ntcessaire a la dimerisation du recepteur [ 161. Sur la base d’un modele initialement ClaborC par Sternberg et Gullick, I’hypothese a ttt Cmise que l’introduction d’un rtsidu arginine dans le domaine transmembranaire aurait pour consequence la formation d’une liaison hydrogbne entre la chaine laterale de l’arginine d’un monomere mute et le groupement carboxyle de l’autre monomere, entrainant une dimerisation constitutive du recepteur independante du ligand. Un mecanisme similaire peut &tre invoque dans le nanisme thanatophore dans lequel la cysteine surnumeraire d’un recepteur mutt formerait avec la cysteine d’un autre monomere mute un pont disulfure conduisant a une dimerisation du recepteur independante du ligand (fig 3). La difference de sevtritt phenotypique entre achondroplasie et nanisme thanatophore pourrait etre like a une stabilite thermodynamique moindre de la liaison hydrogene par rapport a la liaison covalente. Ces hypotheses sont confortees par les travaux r¢s de Nielson et Friesel [ 171 qui ont montre que l’introduction d’une mutation du gene FGFR-2 responsable du syndrome de Crouzon (C332Y) induit chez le xeno-

pe la formation du mesoderme de faGon independante du ligand. Les resultats des experiences d’invalidation ciblee (knock-out) du gene FGFR-3 de la souris par recombinaison homologue viennent conforter I’hypothese d’un gain de fonction des mutations humaines. Les animaux homozygotes qui n’expriment pas le gene FGFR-3 ont un allongement des OS longs avec une extension marquee de la zone de croissance du cartilage due a une augmentation des colonnes proliferatives et des chondrocytes hypertrophiques [ 181.11 faut en conclure que le recepteur FGFR-3 constitue un rtgulateur negatif de la croissance osseuse. Dans les conditions pathologiques, l’activation constitutive du recepteur en l’absence de ligand entrainerait une acceleration de l’ossification enchondrale et, par consequent, une diminution de la zone proliferative avec pour corollaire un retard de croissance (fig 4). CONCLUSION Notre connaissance des mecanismes regulant la croissance enchondrale et membranaire a rapidement progresse au tours des trois dernicres anntes grace a l’identification de genes autres que les genes de structure du cartilage et de 1’0s. Ces deux tissus apparaissent desormais comme des systemes dynamiques dans lesquels des facteurs de croissance et des rtcepteurs interagissent de faqon complexe. La nature de ces interactions reste a determiner.

Recepteurs

de facteurs

de croissance

RkFhRENCES 1 Johnson DE, Williams LT. Structural and functional diversity in the FGF receptor multigene family. Adv Cancer Res 1993;60: 14 1 2 Ulhich A. Schlessinger J. Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity. Cell 1990;61:203-12 3 Mason IJ. The ins and outs of fibroblast growth factors. Ce[l 1994;78:547-52 4 Peters K, Ornitz DM, Werner S, Williams LT. Unique expression pattern of the FGF receptor 3 gene during mouse organogenesis. Dev Bio[ 1993;155:423-30 5 Le Merrer M, Rousseau F, Legeai-Mallet L et al. A gene for achondroplasia-hypochondroplasiamaps to chromosome4p. Nar Gener 1994;6:318-21 6 Rousseau F, Bonaventure J, Legeai-Mallet L et al. Mutations in the gene encoding fibroblast growth factor receptor 3 in achondroplasia. Nafure 1994;371:252-4 7 Shiang R, Thompson LM, Zhu YZ et al. Mutations in the transmembrane domain of FGFR 3 cause the most common genetic form of dwarfism, achondroplasia. Cell 1994;78:336-42 8 Tavormina PL, Shiang R, Thompson LM et al. Thanatophoric dysplasia (types 1 and II) caused by distinct mutations in fibroblast growth factor receptor 3. Nar Gener 1995;9:321-8 9 Rousseau F, Saugier P, Le Merrer M et al. Stop codon FGFR 3 mutations in thanatophoric dwarfism type I. Naf Gene! 1995;lO:l l-2 10 Rousseau F, El Ghouzzi V. Delezoide AL et al. Missense FGFR 3

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fibroblastique

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mutations create cysteine residues in thanatophoric dwarfism type I (TD I). Hum MA Genet 1996;5:509-12 Reardon W, Winter RM, Rutland Pet al. Mutations in the fibroblast growth factor receptor 2 cause Crouzon syndrome. Nat Genet 1994;8:98-103 Muenke M, Schell U, Hehr A et al. A common mutation in the tibroblastgrowth factor receptor 1 gene in Pfeiffer syndrome. Nar Getter 1994;8:269-74 Lajeunie E, Ma HW, Bonaventure J, Munnich A, L.e Merrer M, R&tier D. FGFR 2 mutations in Pfeiffer syndrome. Nat Gene! 1995;9:108 Meyers GA, Orlow SJ, Munro IR, Przylepa KA, Jabs EW. Fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) transmembrane mutation in Crouzon syndrome with acanthosis nigricans. Nat Genef 1995;11:462-4 Reimold AM, Grusby MJ, Kosaras I3 et al. Chondrodysplasiaand neurological abnormalities in ATF-2 deficient mice. Narure 1996;379:262-5 Webster MK, Donoghue DJ. Constitutive activation of fibroblast growth factor receptor 3 by the transmembrane domain point mutation found in achondroplasia. Embo / 1996;15:52&7 Nielson KM, Friesel RE. Constitutive activation of fibroblast growth factor receptor 2 by a point mutation associated with Crouzon syndrome. J Bid Chem 1995;270:2603740 Deng C, Wynshaw-Boris A, Zhou F, Kuo A, Leder P. Fibroblast growth factor receptor 3 is a negative regulator of bone growth. Cell 1996;84:91 l-21