Etude par fluorescence de la complexation du TNS avec la 17 β-Hydroxysteroïde deshydrogenase placentaire

BIOCHIMIE, 1973, 55, 851-857.

Etude par fluorescence de la complexation du TNS avec la 17 $-Hydroxysteroi'de deshydrogenase placentaire. J'.-C. MANI, J. DORNAND, M. MOUSSERON-CANET et F. VIAL-REVEILLON. Equipe de Recherche Photobioorganique du CNRS, Ecole Nationale Supdrieure de Chimie, 35 - Montpellier. (12-1Y~-1972). Snmmarff. - - .'2-6 TNS inhibits placental 17 t~-hydroxysteroi'd dehydrogenase : it is competitive with respect to the coenzyme and non competitive with respect to the substrate. 2-6 TNS gives a fluorescent complex with the enzyme. The intrinsic fluorescence of the enzyme is quenched by TNS or NADH. Binding site accessibility and number, TNS association constant, and pH effect on TNS binding are studied.

INTRODUCTION. L ' a p p l i c a t i o n des r6v61ateurs fluorescents hydrophobes h l'6tude des propri6t6s des enzymes solubles [1-4] ou m e m b r a n a i r e s [5] est d6velopp6e au laboratoire. Nous avons 6tudi6 n o t a m m e n t la liaison de l'acide p a r a - t o l u i d i n o 2 naphtal~ne sulfonique 6 (TNS) h l'alcool d6shydrog6nase de foie de cheval (HLADH) et montr6 que le TN,S est u n i n h i b i t e u r de cette enzyme, comp6titif vis-h-vis du coenzyme [3]. L'~tude des transferts d'6nergie 61ectroniqne, du taux de p o l a r i s a t i o n de fluorescence, et des v a r i a t i o n s du m a x i m u m d'6mission, nous a f o u r n i des r e n s e i g n e m e n t s pr6cis sur ]e site actif de l ' e n z y m e [3-4]. Dans le travail rapport6 ici, nous nous sommes propos6s une 6rude de mSme type avec la 17 ~-hydroxyst6roide deshydrog6nase (17 ~ HSDH). Cette enzyme, dont les propri6t~s sont m o i n s c o n n u e s que celles de HLADH, peut 8tre m a i n t e n a n t obtenue suffisamment pure, et des t r a v a u x r6cents [6-7] out p e r m i s d'~tablir son poids mol6culaire et sa c o m p o s i t i o n en acides amin6s. Nous avions 6tudi6 la sp6cificit6 de cette enzyme p o u r divers substrats st6roides fluor6s [8] pr6s e n t a n t u n e nette activit6 cestrog6ne. MATERI.t~L E T M.ETHOI)ES. --- Purification de l'enzyme 17 f~ HSDH : elle est r6alis6e d'apr6s u n e modification des m6thodes de Karavolas [9] et Descomps [10j. Toutes les op6rations sont r6alis6es ~ 4°C. U n p l a c e n t a est plac6, sit6t apr6s la d6livrance, darts u n t a m p o n p h o s p h a t e 30 mM (pH 7,2) conte-

n a n t 20 p. cent de glyc6rol et 7 mM ~-mercaptoethanol (tampon T1), et utilis6 i m m 6 d i a t e m e n t . Le tissu p l a c e n t a i r e (4.00 g) d6barrass6 des m e m b r a nes foetales et du tissu c o n j o n c t i f est d6coup6 et homog~n6is6 au m i x e r darts 800 ml de t a m p o n T~, et filtr6 sur bas. On centrifuge le filtrat 30 m i n u tes h 9 0'00 g (Sorvall RC 2B) ct le culot est 6Itrain6. Les prot6ines du s u r n a g e a n t sont ensuite pr6cipit6es au sulfate d ' a m m o n i u m . On ~limine la fraction p r e c i p i t a n t entre 0 et 30 p. cent de la saturation en sulfate. L'activit6 17 ~-st6roide deshydrog6nase est r6cup6r6e darts la f r a c t i o n p r 6 c i p i t a n t entre 30 et 50 p. cent de saturation. An cours de la p r 6 c i p i t a t i o n de cette fraction p a r a d d i t i o n de sulfate d ' a m n m n i u m cristallis$, le p H e s t m a i n t e n u h 7,2 en ajoutant u n e solution d ' h y d r o x y d e d ' a m m o n i u m 3 M. Apr6s 30 m i n u t e s d'agitation, la s u s p e n s i o n est centrifug6e 20 m i n u t e s h 8 000 g. Le pr6cipit6 cst dissout darts u n e quantit6 m i n i m a l e de t a m p o n phosphate 30 mM (pH 7,2) c o n t e n a n t 50 p. cent de glyc6rol et 7 mM 8-Mercapto~thanol ( T a m p o n T2). Cette solution est filtr6e r a p i d e m e n t sur 30 g de gel Sephadex G 25 p r 6 a l a b l e m e n t gonfl6 clans une solution aqueuse de glyc6rol 50 p. cent. La fraction ainsi obtenue est i n t r o d u i t e au soremet d ' u n e c o l o n n e (50 X 2,8 cm) de gel Sephadex DEAE A-50 p r 6 a l a b l e m e n t 6quilibr6e avec u n tamp o n phosphate 60 mM (pH 7,2) c o n t e n a n t 20 p. cent de glyc6rol et 7 mM ~-mercapto6thanol (Tampon Ta). La c o l o n n e est reli6e ~ u n dispositif LKB (collccteur de f r a c t i o n et Uvicord). Les fractions prot6iques, c o n t e n a n t l'h6moglobine, 61u6es avec le t a m p o n Ta sont 61imin6es. On 61ue alors la c o l o n n e avec u n gradient lin6aire en c h l o r u r e de

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sodium, de 0 ~ 600 mM darts ]e t a m p o n T s (variation de 1 mM p a r ml) et des f r a c t i o n s de 10 ml sont r e c u e i l l i e s et test6es p o u r leur activit6 17 HSDH. Les f r a c t i o n s actives sont obtenues entre 250 et 350 mM ClNa ; elles sont stock6es h 4°C et c o n s e r v e n t ainsi l e u r activit6 p e n d a n t p l u s i e u r s semaines. P o u r o b t e n i r de m e i l l e u r e s activit6s sp6cifiques, ces f r a c t i o n s sont purifi~6es a v a n t leur utilisation p a r c h r o m a t o g r a p h i e sur gel S e p h a d e x G-200.5 ml d ' u n e f r a c t i o n p r 6 c 6 d e n t e sont i n t r o d u i t s sur la TABLEAU I.

Activit~ sp~ci~ique des fractions de la chromatographie

sur G-200.

NOdes tubes

7

8

9

Activit6 (U) par ml . . . .

30

34

13

0,21

Concentration m g / m l . . Activit~ spdciflqne . . . .

143

0,14 243

0,09 145

c o l o n n e (50 × 1 cm) p r 6 a l a b l e m e n t 6quilibr~e avec le t a m p o n T~. On blue avec T~ et r e c u e i l l e des f r a c t i o n s de 4 ml. L ' a c t i v i t 6 e n z y m a t i q u e se r e t r o u v e dans le deuxi~me p i c p r o t 6 i q u e isol6 ; elle est c o n c e n t r ~ e en 3 f r a c t i o n s (tableau I).

- - M e s u r e de l'activitd 17 ~ - h g d r o x g s t d r o ' i d e deshgdrogdnase : L'activit~ est mesur6e & 25°C p a r l ' a u g m e n t a t i o n de la densit~ o p t i q u e ~ 340 nm, c o r r e s p o n d a n t la f o r m a t i o n de c o e n z y m e r6duit NADH. P e n d a n t quelques m i n u t e s cette densit6 o p t i q u e augmente l i n 6 a i r e m e n t avec le t e m p s e t l a vitesse i n i t i a l e est calcul~e ~ p a r t i r de la p e n t e de cette droite. La cuve c o n t i e n t dans un v o l u m e total de 3 ml : 100 ~1 d ' u n e solution d'eestradiol darts le p r o p y l~ne glycol (0,4 m g / m l ) , 6,0,0 ul d ' u n e solution NAD* (1 m g / m l ) dans un t a m p o n p h o s p h a t e 30 mM (pH 7,2) c o n t e n a n t 7 mM ~-mercapto6thanol (tamp o n T4), 2,25 m l t a m p o n ]'4, et 50 ul de solution e n z y m a t i q u e dont l ' a d d i t i o n initie la r6action. L'unit6 d'activit6 est d6finie ici c o m m e 6tant la quantit6 d ' e n z y m e c o r r e s p o n d a n t h la f o r m a t i o n d ' u n e c o n c e n t r a t i o n 10 -6 M NADH p a r m i n u t e dans les c o n d i t i o n s e x p 6 r i m e n t a l e s ci-dessus. L'activit~ sp6cifique est le n o m b r e d'unit~s p a r mg de prot~ine. Les c o n c e n t r a t i o n s prot~iques sont d~termin6es p a r la m~thode de L o w r y I l l ] .

- - Electrophor~se : Les f r a c t i o n s e n z y m a t i q u e s purifi~es sur S e p h a d e x G-200 ont 6t6 6tudi~es p a r 61ectrophor~se sur gel de p o l y a c r y l a m i d e , darts un t a m p o n tris-glycine pH 8,5, avec l ' a p p a r e i l Pleug e r - A c r y l o p h o r , 6quip6 de la cuve c h e m a t r o n T a n k module 2 PAC/S. U n e tension de 80 volts est

1

3

3

2

0

1

10-5 M-1 2

( NAD + )

~

~°-4M-I ( cestradiol)

o 5 ~o Fro. 1-2. - - Cin~tiques de l'inhibition de 17 ~-HSDH par le TNS h 25 ° (M~thode de Lineweaver-Burk). Le m~lange r~actionnel est soit 0,55 ~t~M en 17 ~-HSDH et 177 ~M en 17 ~-cestradiol, dans le tampon T1 (fig. 1) soil 0,23 RM en 17 ~)-HSDH et 200 ~M en NAD÷dans le m~me tampon (fig. 2). Les concentrations en TNS sont 0 ( b - - A ) , 130 RM ( o - - o ) , 210 I~M ( m - - m ) . Les vitesses V sont exprim~es en unit~s arbitraires.

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55, n ° 8.

Fluorescence du complexe TNS-17 ~ HSDH. m a i n t e n u e p e n d a n t 40 m i n u t e s , p u t s u n e t e n s i o n de 160 volts p e n d a n t 20 m i n u t e s . T r o i s t y p e s de r d v d l a t i o n ont 6t6 utilis6s : l ' a m i d o - s c h w a r t z le m d l a n g e b l e u de p a r a - n i t r o t d t r a z o l i u m - p h 6 n a z i n e m d t h o s u l f a t e ( r d v d l a t e u r s p 6 c i f i q u e des d e s h y d r o g d n a s e s ) ; le rdv61ateur fluorescent 2 - 6 TINS. D a n s les t r o i s cas on o b s e r v e u n e b a n d e u n i q u e , m i g r a n t v e r s la c a t h o d e de 27,5 ram. La rdv61ation au TNS est effectude en c h a m b r e n o i r e , h l ' a i d e d ' u n e l a m p e Camag, ()~,xe = 350 n m ) .

- - R ~ a c t i f s : Le 2-6 T N S a 6t6 p r 6 p a r d s e l o n la t e c h n i q u e de Mc C l u r e et E d e l m a n [121 et p u r i fi6 p a r c h r o m a t o g r a p h i e [3]. ,Les c o e n z y m e s NA,D ÷, NAD,P +, N A D H et N A D P H p r o v i e n n e n t des l a b o r a t o i r e s B o e h r i n g e r et o n t 6t6 utilisds sans p u r i f i c a t i o n ; l e u r s c o n c e n t r a t i o n s s o n t d d t e r m i n 6 e s p a r a b s o r p t i o n UV. L e 17 ~ oest r a d i o l p r o v i e n t des l a b o r a t o i r e s R o u s s e l - U c l a f . T o u s les a u t r e s r d a c t i f s s o n t de la p l u s g r a n d e purer6 possible commercialement.

z y m e , substrat, TNS. On n o t e que le T N S i n h i b e cette activit6.

- - C o m p ~ t i t i v i t ~ vis-~t-vis du c o e n z y m e : On 6tudie la v i t e s s e i n i t i a l e de la r 6 a c t i o n p o u r des c o n c e n t r a t i o n s c r o i s s a n t e s en c o e n z y m e s (les c o n c e n t r a t i o n s en s u b s t r a t et en e n z y m e 6 t a n t c o n s tantes) en a b s e n c e et en p r 6 s e n c e de d i f f d r e n t e s c o n c e n t r a t i o n s en TNS. U n e r e p r 6 s e n t a t i o n s e l o n L i n e w e a v e r - B u r k [13~ des rdsultats e x p 6 r i m e n t a u x (fig. 1) n m n t r e q u e t o u t e s les d r o i t e s se coup e n t s u r l ' a x e des o r d o n n 6 e s ; ce qui i m p l i q u e le TNS est un i n h i b i t e u r c o m p d t i t i f vis-fi-vis du c o e n z y m e NAD ÷.

9

IF

- - Spectroscopie UV el fluorescence : L ' a p p a r e i l l a g e et les t e c h n i q u e s de m e s u r e o n t 6t6 d 6 c r i t s p r 6 c 6 d e m m e n t [3].

I 1

• 6

Rl~SULTATS ET DISCUSSION.

1 o) INHIBITION DE 17 ~ H S D H PAR LE TNS. L ' a c t i v i t 6 e n z y m a t i q u e de 17 (5 H S D H a 6t6 mesur6e p o u r d i f f 6 r e n t e s c o n c e n t r a t i o n s en c o e n IF 300

400

Fro. 4. - - Spectres de fluorescence de mdlanges 17 6" HSDH-TNS (excitation fi 290 nm). Chaque cuTe contient 4,2 ~M d'enzyme dans le tampon T1 et du TNS aux concentrations suivantes : 0 (courbe 1), 0,52 i~M (courbe 2), 1,56 ~M (courbe 3), 3 ~M (courbe 4), 4,52 ~tM (courbe 5), 5,95 ~tM (courbe 6), 9,90 p~M (courbe 7), 20,7 ttM (courbe 8), 44,5 ~M (courbe 9) et 67,5 tiM (courbe 10). Intensitds de fluorescence I~ en unit6s arbitraires.

- - comp~titivitd vis-d-vis du substrat : Le m ~ m e t y p e d ' e x p d r i e n c e , e n f a i s a n t T a r t e r la c o n c e n t r a t i o n en NAD ÷, c o n d u i t fi u n n o u v e a u f a i s c e a u de d r o i t e s q u i se c o u p e n t c e t t e fois s u r l ' a x e des a b s c i s s e s (fig. 2). L e T N S est u n i n h i b i t e u r n o n c o m p 6 t i t i f v i s - a - v i s du 17 ~ cestradiol. 450

500

550

Fro. 3. - - Spectres de fluorescence du TNS 27 ~M dans lc Tampon T1 (excitation h 366 nm). a) cn absence d'enzyme. b) en prdsence de 2 ~M 17 ~J-HSDH. Intensitds de fluorescence Iv en unitds arbitraires.

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2 °) FLUORESCENCE DU TNS EN PP~SENEE DE 17 HSDH. La figure 3 r e p r 6 s e n t e les s p e c t r e s d ' d m i s s i o n du T N S seul d a n s le t a m p o n T 1 (a) et d u T N S en

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pr6sence d ' e n z y m e darts le m6me t a m p o n (b), darts des c o n d i t i o n s c o r r e s p o n d a n t h la s a t u r a t i o n de l'enzyme. On note u n d6placement du m a x i m u m d'6mission de 5,0'3 h 450 n m et u n e a u g m e n t a t i o n de l'intensit6 de fluorescence. Parall61ement le taux de p o l a r i s a t i o n de fluorescence du TNS passe de 0,19 p o u r le TNS libre h 0,34 en pr6sence d'enzyme. I1 se forme doric u n complexe entre Fenzyme et le TNS qui sc trouvc plac6 darts u n envir o n n e m e n t h y d r o p h o b e , ce qui explique les modifications de son spectre d'6mission. 3 °) EXTINCTION DE LA FLUORESCENCE INTRINS~QUE DE L'ENZYME PAR I.,E TNS. Lorsque la 17 .~ HSDH en solution dans le tamp o n T 1 est excit6e h 290 nm, on observe u n e fluorescence dont le m a x i m u m d'intensit6 est situ6 348 nm. Cette fluorescence est due presque exclus i v e m e n t aux r6sidus t r y p t o p h a n e s de l'enzyme, comme le p r o u v e l ' a b s e n c e de v a r i a t i o n du spectre d'6mission l o r s q u ' o n fait v a r i e r la l o n g u e u r d ' o n d e d ' e x c i t a t i o n de 275 h 295 nm.

Sur la fig. 5 nous avons port6 la r e p r 6 s e n t a t i o n selon Stern-Volmer [14] de l ' e x t i n c t i o n de la fluorescence de 17 I~-HSDH p a r le TNS. Les intensit6s de fluorescence sont corrig6es p o u r l'effet de filtre i n t e r n e selon la m6thode de P a r k e r [13]. P o u r les c o n c e n t r a t i o n s en TNS i n f 6 r i e u r e s /~ 10 ~M on observe u n e droite, dont la p e n t e est u n e mesure de la constante d'6quilibre du complexe enzyme TNS. KE.TNs = 7 × 104 M"1. P o u r les fortes c o n c e n t r a t i o n s en TNS les points e x p 6 r i m e n t a u x s'6cartent de la droite. Les r6sultats obtenus p o u r ces fortes c o n c e n t r a tions en TNS sugg6rent l'hypoth6se de sites de

Io

i

1o

i

i

30

t

t

s0

i

D

)aM TNS

FI6. 5. - - R e p r 6 s e n t a t i o n , s e l o n la m 6 t h o d e de S t e r n V o l m c r , de l ' e x t i n e t i o n de la f l u o r e s c e n c e i n t r i n s 6 q u e de 17 fS-HSDH p a r le TNS. L e s i n t e n s i t 6 s de f l u o r e s cence I h 350 n m ( e x c i t a t i o n h 290 n m ) p r o v i e n n e n t de la figure 4 et s o n t e o r r i g 6 e s p o u r l'effet de filtre i n t e r n e . Io e s t l ' i n t e n s i t ~ de f l u o r e s c e n c e e n l ' a b s e n e e de TNS.

Cette fluorescence i n t r i n s 6 q u e est repr6sent6e sur la fig. 4 (courbe 1) ; les courbes 2 h 10 corresp o n d e n t h l'6mission de m61anges enzyme-TNS obtenus en ajoutant des quantit6s croissantes de TNS h l'enzyme. On note u n e d i m i n u t i o n de la fluorescence de l ' e n z y m e et l ' a p p a r i t i o n de l'6mission caract6ristique du TNS li6 h 450 rim. I1 faut n o t e r 6galement l'existence d ' u n p o i n t iso6missif h 39,0 rim, rant que l'exc6s de TNS n'est pas trop fort : p o u r les courbes 8, 9 et 10 off la c o n c e n t r a tion en TNS est r e s p e c t i v e m e n t 5, 10 et 15 lois s u p 6 r i e u r e ~ la c o n c e n t r a t i o n en enzyme, le p o i n t iso6missif n'est plus respect6. I1 semble que le r e n d e m e n t q u a n t i q u e du TNS Ii6 soit i n d 6 p e n d a n t de la quantit6 de TNS li6, saul en pr6sencc d ' u n fort cxc6s de TNS.

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300

400

k

Fro. 6. - - S p e c t r e s d e f l u o r e s c e n c e d e s m d l a n g e s 17 I~H S D H - N A D H ( e x c i t a t i o n ~ 290 rim). C h a q u e c u v c e o n t i e n t 5 E/sM d ' c n z y m e darts le t a m p o n T1 et N A D H a u x

concentrations suivantes : 0 (courbc 1), 6,6 I~M (eourbe 2), 19,7 !ttM ( c o u r b e 3) et 32,5 lxM ( c o u r b e 4).

Intensit6s de fluorescence Ir en unit6s arbitraires.

liaison s e c o n d a i r e s ; on peut envisager 6galement u n t r a n s f e r t d'6nergie 61ectronique entre mol6cules de TNS li6es.

4 °)

EXTINCTION

DE

LA

FLUORESCENCE

DE

L'I~NZYME

PAR NADH. Comme p o u r I-ILADH [4] la fluorescence de Fenzyme p l a c e n t a i r e est 6teinte p a r le coenzyme r6duit (fig. 6). On observe parall61ement h l'ext i n c t i o n du m a x i m u m h 348 nm, l ' a p p a r i t i o n de la fluorescence de NADH li6 h 460 nm. I1 faut noter

Fluorescence du c o m p l e x e TNS-17 ~ H S D H . q u e l ' e x t i n c t i o n de la f l u o r e s c e n c e d e l ' e n z y m c par NADH n'avait pas 06 observ6e par Jarabak [16].

P o u r H L A D H n o u s a v o n s p u m o n t r e r [4] q u e le T N S li6 reste a c c e s s i b l e , alors q u e N A D H li6 ne l'6tait plus. Les r6sultats s o n t m o i n s nets a v e c Fen-

TABLEAU II.

Rapports des intensit~s de [luorescence (Imax) dans l'eau lourde D~O (68 p. cent) et dans l'eau, pour les coenzpmes rdduits et le TNS libres ou complexes i~ 17 HSDH et 5 HLADH. NADPH libre

NADPH-t7 HSDH

TNS libre

TNS- t7 HSDtl

1,30

1,19

1,42

1,34

N A D P H libre

NADPH-HLADH

TNS libre

TNS-HLADH

1,30

1,02

1,42

1,25

ID~O

17 HSDH . . . . . .

i-fi76~o ID~O ill.)0

H L A D H (17)...

5 ° ) EFFETS DE L'EAU LOURDE SUR LA FLUORESCENCE DU T N S ET DE N A D P H LI~S A L'~NZYME. Le t a b l e a u l I c i - d e s s o u s p o r t e les v a l e u r s d u r a p p o r t des i n t e n s i t 6 s de f l u o r e s c e n c e Io,o/ln,o, p o u r 17 ~ H S D H et p o u r H~I,&DH ; la f l u o r e s c e n c e du T N S ou de N A D P H l i b r e s est a u g m e n t 6 e d a n s l ' e a u l o u r d e , c a r ce s o l v a n t d 6 s a c t i v e p l u s f a i b l e m e n t l'6tat excit6 de ces m o l 6 c u l e s . P o u r les mol6cules c o m p l e x 6 e s l ' e x a l t a t i o n de f l u o r e s c e n c e trad u i t d o n c l e u r degr6 d ' a c c e s s i b i l i t 6 au s o l v a n t .

100'

IF

80

60

40 5

I

I

I

I

I

6

7

8

9

10

I

II

PH

Ft6. 7. - - Intensit6s de fluorescence Iv (en unit6s arbitraires) ~ 450 nm (excitation ~ 366 nm) du m61ange TNS (10 il~M) 17 [~-HSDH (1,7 ~t~M) en fonction du pH. Les tampons utilis6s - - ac6tate (pH < 6), phosphate (pH 6 h 8) glycine (pH > 9) - - ont tous la mgme force ionique (0,1).

BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 8.

z y m e p l a c e n t a i r e . Le T N S et le c o e n z y m e s o n t p r e s q u ' a u s s i a c c e s s i b l e s au s o l v a n t que l o r s q u ' i l s sont libres. 6 °) EFFET DU p H s u n LA LIAISON 17 0 H S D H - T N S . L ' i n t e n s i t 6 de f l u o r e s c e n c e du T N S h 450 nnl est u n e m e s u r e de la c o n c e n t r a t i o n en T N S li6 et p e u t s e r v i r h d 6 t e r m i n e r la stabilit6 du c o m p l e x e e n z y m e - T N S . L o r s q u ' o n 6 t u d i e la v a r i a t i o n de l ' i n tensit6 de f l u o r e s c e n c e h 450 n m , en f o n c t i o n du pH, p o u r des c o n c e n t r a t i o n s c o n s t a n t e s c n "PNS et en e n z y m e , on o b t i e n t la c o u r b e r e p r 6 s e n t 6 e s u r la figure 7. On v o i t que l ' i n t e n s i t 6 est p r a t i q u e m e n t c o n s t a n t e e n t r e p H 6 et 9. A p H a c i d e on a u n e n e t t e a u g m e n t a t i o n q u i t r a d u i t la d 6 n a t u r a t i o n de l ' e n z y m e et la r6v61ation de n o u v e a u x sites h y d r o p h o b e s . A p H b a s i q u e , la stabilit6 du c o m p l e x e d 6 c r o i t n e t t e m e n t . La z o n e p H 6 h 9, d a n s l a q u e l l e l'affinit6 du m a r q u e u r p o u r l ' e n z y m e cst c o n s t a n t e , est la z o n e d ' i o n i s a t i o n des i m i d a z o l e s , des h i s t i d i n e s et des a m m o n i u m s l i b r e s des lysines : ces r 6 s i d u s ne s e m b l e n t p a s i m p l i q u 6 s darts la l i a i s o n du T N S h l ' e n z y m e . La p e r t e d ' a f f i n i t 6 e n t r e p H 9 et 10 i n d i q u e q u e les g r o u p e s d o n t le p K d ' i o n i s a t i o n est d a n s cette z o n e p a r t i c i p e n t h la l i a i s o n : c ' e s t le cas n o t a m m e n t des g r o u p e s SH l i b r e s des cyst6ines. On sait q u e 17 ~ H S D H p o s sbde 12 r 6 s i d u s SH [7]. Cette p a r t i c i p a t i o n de g r o u p e m e n t SH h la l i a i s o n du T N S est c o n f i r m 6 e p a r l ' 6 t u d e de la f i x a t i o n du T N S h l ' e n z y m e en p r 6 s e n c e de p a r a c h l o r o m e r c u r i p h e n y l s u l f o n a t e de s o d i u m : l ' a u g m e n t a t i o n de f l u o r e s c e n c e h 450 n m est f o r t e m e n t i n h i b 6 e p a r la p r 6 s e n c e de ce r6act i t des SH.

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J.-C. Mani et coll.

CONCLUSION. La m ~ t h o d e de puri~fication de la 17 ~ H S D H d~crite iei n'est pas vraiment nouvelle puisqu'elle r e p r e n d d i v e r s e s 6tapes de p r 6 p a r a t i o n s ant~r i e u r e s (9-10). Son int6r~t p r i n c i p a l est d e f o u r n i r rapidement une enzyme 61eetrophor~tiquement p u r e , p o s s ~ d a n t u n e f o r t e a e t i v i t 6 sp6eifique, et en s o l u t i o n s u f f i s a m m e n t c o n c e n t r i c . II f a u t n o t e r q u e les a c t i v i t ~ s s p 6 e i f i q u e s r a p p o r t ~ e s d a n s la l i t t ~ r a t u r e v a r i e n t c o n s i d ~ r a b l e m e n t : en les r a m e n a n t h n o t r e d 6 f i n i t i o n de l ' u n i t ~ d ' a c t i v i t ~ (1 ~M N A D H f o r m 6 × mn-X X mg-~) on o b t i e n t 7 ~ 9 [1O] - - 80 [9] - - 150 [191 p o u r des e n z y m e s de p l a c e n t a h n m a i n , 45 [18J p o u r u n e e n z y m e d,orig i n e o v i n e . L a m e i l l e u r e a c t i v i t ~ a ~t~ o b t e n u e p a r K a r a v o l a s et E n g e l [20-21] q n i t r o u v e n t aprbs u n e double chromatographic sur hydroxyapatite, une a c t i v i t 6 s p 6 c i f i q u e de 350,0 ; les c o n c e n t r a t i o n s d ' e n z y m e s a i n s i o b t e n u e s (0,01 m g / m l ) s o n t t r o p f a i b l e s p o u r les ~tudes de f l u o r e s c e n c e q u e n o u s a v o n s envisag~es. Les d i f f 6 r e n t s r~sultats q u e n o u s r a p p o r t o n s s u r la c o m p l e x a t i o n du T N S h l ' e n z y m e , m o n t r e n t netl e m e n t que ]es sites de l i a i s o n d u T N S et du c o e n z y m e s o n t i d e n t i q u e s . Le T N S est u n i n h i b i t e u r de l ' a c t i v i t 5 de 17 0 H S D H , c o m p ~ t i t i f vis-h-vis du c o e n z y m e et n o n c o m p ~ t i t i f vis-h-vis d u s u b s t r a t (fig. 1 et 2). L a f l u o r e s c e n c e i n t r i n s ~ q n e de l ' e n z y m e est O e i n t e p a r le T N S et p a r N A D H , u n t r a n s f e r t d ' 6 n e r g i e ~ l e c t r o n i q u e se p r o d u i s a n t ent r e u n t r y p t o p h a n e de ] ' e n z y m e et le l i g a n d . L a s t o e c h i o m ~ t r i e du c o m p l e x e e n z y m e - T N S , d~term i n ~ e s p a r f l u o r e s c e n c e c o m m e p o u r H,L&DH [3~ en u t i l i s a n t la m ~ t h o d e de S c a t c h a r d , est de d e u x sites de l i a i s o n p o u r u n p o i d s m o l ~ c u l a i r e de 6 8 0 0 0 [6], c e q u i c o r r e s p o n d a u x d e u x sousu n i t 6 s de l ' e n z y m e . La c o n s t a n t e d ' a s s o c i a t i o n a i n s i o b t e n u e (KE_TN S : 13 X 104 M-D est du m S m e o r d r e de g r a n d e u r q u e c e l l e d 6 d u i t e de la m 6 t h o d e de S t e r n - V o l m e r (fig. 5) p o u r l ' e x t i n c t i o n de la f l u o r e s c e n c e de l ' e n z y m e p a r ]e T NS (KE.TN s 7 × 10 .4 M-~). Les effets de l ' e a u l o u r d e T N S et de N A D H li6s, s o n t c e u x o b s e r v 6 s en l ' a b s e n c e bilit6 au s o l v a n t du site grande.

s u r la f l u o r e s c e n c e d u v o i s i n s et p r o c h e s de d'enzyme : l'accesside l i a i s o n est assez

P a r a i l l e n r s la p o s i t i o n d u m a x i m u m d ' 6 m i s s i o n du c o m p l e x e e n z y m e - T N S (450 nm) c o r r e s p o n d h u n e p o l a r i t 6 estim6e p o u r le site de l i a i s o n [22] de 84, s e l o n l ' 6 c h e l l e e m p i r i q u e Z de K o s o v c e r [23] ; cette v a l e u r est assez p r o c h e de celle q u e n o u s a v i o n s t r o u v 6 e (1) en u t i l i s a n t la f l u o r e s c e n c e des c o e n z y m e s li~s (Z = 78). BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 8.

II s e m b l e q u e les d i f f e r e n c e s e n t r e les sites de l i a i s o n du T N S et de N A D H s o i e n t b e a u c o u p p l u s f a i b l e s que p o u r t I L A D H , p o u r l a q u e l l e ]e site de N A D H ~tait i n a c c e s s i b l e au s o l v a n t , a l o r s , que c e l u i du T N S l'~tait [4] et ]a d i f f e r e n c e e n t r e les p o l a r i t ~ s d ~ t e r m i n 6 e s p a r les d e u x m 6 t h o d e s ~tait tr~s n e t t e (Z : 69 p o u r N A D H ; Z : 85 p o u r le TNS). A i n s i le T N S s e m b l e p a r t i c u l i ~ r e m e n t b i e n i n d i qu~ p o u r l ' 6 t u d e d u site e n z y m a t i q u e de la 17 H S D H . Les r e n s e i g n e m e n t s f o u r n i s s u r le n o m b r e , l ' ~ q u i v a l e n c e , la p o l a r i t ~ des sites, a i n s i q u e la p r e s e n c e d a n s ces sites de g r o u p e m e n t s S H et d'un r~sidu tryptophane, sont utiles pour une c o n n a i s s a n e e p l u s a p p r o f o n d i e de l ' e n z y m e . Ce travail a re~u l'aide du C.N.R.S., de I'I.N.S.E.R.M., et de la Fondation pour la Recherche M4dieale. R~.su~. Le 2-6 TNS est inhibiteur de la 17 [~-hydroxystt~roide deshydrog~nase placentairc ; il est comp~titif vis-h-vis du coenzyme et non eomp6titif vis-h-vis du substrat. Le 2-6 TNS forme avec l'enzyme un eomplexe fluorescent. La fluorescence intrins~que de l'enzyme est ~teinte par le TNS ou par NADH. L'aeeessibilit~ du site enzymatique, le hombre de Sites et la constante d'association du TNS ont ~t~ ~tudi~s, ainsi qne l'effet du pH sur la liaison du TNS. BIBLIOGRAPHIE. 1. Mani, J. C., Mousseron-Canet, M. a Dornand, J. (1970) C. R. Acad. Sci. (Paris), 270-D, 2373-2376. 2. Mani, J. C., Mousserou-Canet, M., Dornand, J. & Arnaud, M. (1970) C. R. Aead. Sci. (Paris), 270-D, 2717-2720. 3. Mani, J. C., Dornand, J., Mousseron-Canet, M. Vial-Reveillon, F. (1971) Biochimie, 53, 355-363. 4. Dornand, J., Mani, J. C., Mousseron-Canct, M. Vial-Reveillon, F. (1971) Biochimie, 53, 11811185. 5. Mani, J. C., Dornand, J. ~ Mousseron-Canet, M. (1973) Biochirnie, 55, 59-62. 6. Burns, D. J. W., Engel, L. L. a Bethune, J. L. (1971) Biochem. Biophys. Res. Comm., 44, 786-792. 7. Jarahak, J. ,t Street, M. A. (1971) Biochem., 10, 38313835. 8. Mousseron-Canet, M., Hough, D., Mani, J. C. ,¢ Arnaud, M. (1969) C. R. Acad. ScL (Paris), 269-D, 2445-2448. 9. Karavolas, H. J., Orr, J. C. ~ Engel, L. L. (1969) J. Biol. Chem., 244, 4413-4421. 10. Descomps, B., Nicolas, J. C. ~ Crastes de Paulet, A. (1968) Bull. Soc. Chim. Biol., 50, 1681-1693. 11. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. Randall, R. J. (1951) J. Biol. Chem., 193, 265-275. 12. Mc Clure, W. O. & Edelman, G. M. (1966) Biochem. J., 5, 1908-1919. 13. Lineweaver, H. a Burk, D. J. (1934) J. Am. Chem. Soc., 56, 658-666. 14. Stern, O. ~ Volmer, M. (1919) Phys. Z., 20, 183-188. 15. Parker, C. A. <> Elsevier (NY 1968). 16. Jarabak, J. a Sack, G. H. (1969) Biochem., 8, 22032212. 17. Scatchard, G. (1949) Ann. N.Y. Acacl. Sci., 51, 660672.

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