Études sur une protéase élastinolytique des plaquettes sanguines humaines

A therosclevosis Elsevier Publishing

Company,

BTUDES

UNE

suR

SANGUINES

Amsterdam

451

- Printed in The Netherlands

PROTI~ASE

IZLASTINOLYTIQUE

DES

PLAQUETTES

HUMAINES

Y. LEGRAND,

B. ROBERT,

M. SZIGETI,

G. PIGNAUD,

J. CAEN ET L. ROBERT

Laboratoive de Biochimie du Tissu Conjonctif, Equipe de Recherche du C.N.R.S. No. 53, et Laboratoive d’Hbmostase, Institut de Recherches WY les Maladies du Sang (Directeur: Prof. J. Bernavd), HBpital Saint-Louis. Paris (France) (Revi&,

resu le 4 mai 1970)

SUMMARY

Elastinolytic

protease ilz human blood platelets

Experiments elastinolytic aration

are described

protease

devised

in order

to study

from human blood platelet

of these proteases

the

suspensions

from the acid-cathepsins,

their

“liberation”

of

as well as the sep-

partial

purification

and

characterization. ADP, adrenaline, lytic activity

in the supernatant.

Triton-X-100

on Sephadex

60%

activity

of 21,400

peak

(approx. 5% of total protein,

to render possible

precipitated

fraction

of y-globulins.

from carrageenine remained Part

of total

protein;

Its behaviour

granuloma

of it (approx. on Sephaclex

8%)

extractss,s.

having

penetrating

a specific activity

sulfate

precipitated

at

G-200 in two peaks;

charged)

second,

was still heterogenous,

was not activated

in the 60% ammonium

proteins

the

most of

purified by gel-filtration

with the mobility

N 1.2 mg) having

min/mg protein. The first fraction

sufficiently

saturation

purified acid-cathepsin

90%

counts/min/mg

of two

and “liberation”.

could be further

purified.

(approx.

This suggested the existence

activity

sulfate and was further separated

the first, excluded

and a

at 40%

activity

and was not further

ammonium

sulfate

C isolated

About half of the elastinolytic

a strong activation

“activation”

This activity

and migrated

produced

activity.

the elastinolytic

G 200. The partially

reminds that of the cathepsin supernatant

of this activity

and sonication

Ammonium

activity.

by mercaptoethanol

of the elastino-

mechanisms:

stabilised

purification.

the acid-catheptic

activation

as well as a partial “liberation”

of the elastinolytic

and independent

its partial

suspension

Triton-X-100

near lOOo/oliberation different

and collagen produced a significant

of the platelet

a specific

the

column

of 144,000

counts/

with a major band migrating

Travail effect& avec l’aide de la D.G.R.S.T. (Contrat Nos. 68 01 476 et 68 01 317) et du C.E.A. (Contrat Nos. 75 710 L2 et 11 664 II/BG) et du C.N.R.S. Atherosclerosis,

1970, 12: 451-465

452

Y. LEGRAND,

B. ROBERT,

M. SZIGETI,

G. PIGNAUD,

J. CAEN, L. ROBERT

with the albumins. Its pH optimum is near 8.0, it is strongly inhibited by Gas+ which precipitates it. The other agents of platelet aggregation (ADP, adrenaline, EDTA, Shydroxytryptamine) had only a weak activating or inhibiting action. These experiments confirm the presence of several proteolytic enzymes in human blood platelet preparations and show that the elastolytic protease is distinct from the major acid-catheptic enzymes. The elastolytic enzymes may be present in several protein fractions or they may have several forms differing in molecular weight. Further experiments should clarify this point.

Key words:

Agrigation

plaquettaire

-

D&gradation

artt%elle

- Elastase

Athtkome

Purification

des cathepsines

-

- Elastine

Cathepsines - Plaquettes

plaquettaires - Prote’ases

-

INTRODUCTION

Nous avons decrjt dans une note precedente comment la theorie autoimmunitaire de l’atherosclerose nous a fait postuler qu’une enzyme agissant lentement sur les fibres elastiques de la paroi arterielle pourrait Ctre l’un des premiers maillons produisant de “l’elastine soluble” ainsi que d’autres peptides derives des macromolecules de la paroi arterielle qui, a leur tour, agiraient comme antigene autoimmunisantrps. Un tel mecanisme est en accord avec nos connaissances actuelles sur les processus autoimmunitaires. Par une methode t&s sensible, nous avons dCcelC la presence d’une protease elastinolytique dans les plaquettes sanguines humainesa. Nous avons determine son pH optimum qui est aux environs de 8.6 et CtudiC sa liberation a partir des plaquettes intactes par des agents qui produisent l’agregation et la metamorphose visqueuse des plaquettes, comme l’ADP, l’adrenaline et le collagene*. Dans cette note, nous decrirons la liberation de l’enzyme elastinolytique plaquettaire

par d’autres agents, comme le Triton X-100 et la sonication. Nous de-

crirons Cgalement sa purification et sa separation des autres enzymes plaquettaires, surtout des cathepsines. MATkRIEL

ET MkTHODES

Les plaquettes on &C obtenues du sang d’un donneur humain. La suspension plaquettaire, debarrasde des globules rouges par des centrifugations rCpCtCes dans les conditions d&rites anterieurement a CtC finalement reprise dans un tampon Tris-citrate pH 7.6 (ref. 3). La purification de l’enzyme elastinolytique plaquettaire necessite une grande quantite de plaquettes. Pour obtenir lo-12 1 de sang du mCme donneur, nous avons eu recours a la technique de plasmapherese. Atherosclerosis,

1970, 12: 451-465

PROTBASE

BLAsTIN~L~TIQ~E

DES

PLAQUETTES

SANGUINES

HU~~AINES

453

Le plasma riche en plaquettes d’un seul donneur volontaire a 6tC obtenu par centrifugation differentielle du sang total dans le systeme de circulation extracorporel d’un separateur de cellules IBM. Le sujet re$oit au prealable une injection de 100-150 mg d’heparine. Le sang preleve a la veine cubitale droite est centrifuge dans le separateur a une vitesse de 1500 tours/min, et les plaquettes sont recueillies en continu sous forme de plasma riche en plaquettes (PRP) dans 3 triples poches en plastique steriles (Laboratoires Medicoplast, Paris) de 400 ml renfermant 15 ml d’ACD (acide citrique, citrate, dextrose). Au total, 12 litres de sang circulent dans l’appareil. Le PRP tres concentre, est immediatement centrifuge (1200 x g, 15 min) afin de pouvoir reinjecter t&s rapidement le plasma pauvre en plaquettes (PPP) avec les hematies et les leucocytes, apres circulation dans un bain-marie a 37°C au niveau de la veine cubitale gauche. A la fin du prelevement, le sujet est perfuse par 20 mg de gluconate de calcium. L’ensemble de l’operation dure 4-5 h. Prtfparation des plaquettes

Les plaquettes des differentes poches reunies sont la&es par 100 ml de serum physiologique, la suspension est centrifugee 15 min a 1200 x g B + 4°C. Le liquide surnageant est rejete; le culot plaquettaire est remis en suspension dans 100-200 ml de tampon Tris-citrate 0.1 M, pH 7.6. La plupart des methodes utilisees ont CtP:d&rites precedemmenta. L’activite elastinolytique a CtCsuivie par la liberation des peptides solubles d’elastine marquee a 1251(ref. 5). L’activite specifique des Cchantillons d’elastine utilises dans ces experiences variaient entre 17 * lo3 et 43 * lo3 coups/min/mg. L’activite des cathepsines a etC mesuree par une modification de la methode d’ANsoN6, avec l’hemoglobine bovine comme substrat. Une solution d’hemoglobine a 2.5%, melangee avec l’extrait plaquettaire et completee a 5 ml avec un tampon acetate 0.1 M A pH 3.5 ou 5.0, ou bien avec un tampon phosphate a pH 7.5, a 6tC incubee a 37°C pendant 2 h sous agitation. On a effectue des prelevements de 1 ml qui, apres precipitation par l’acide trichloracetique (TCA) a 5% (1 ml) ont subiune centrifugation. Les proteines solubles dans le TCA a 2.5% ont etC dosees dans les et al.‘. surnageants par la methode de LOWRY Comme temoin, nous avons utilise un melange d’incubation

comprenant la

solution d’hemoglobine et les tampons a differents pH, sans extrait plaquettaire. Lors des calculs des resultats, nous avons tenu compte de la lyse d’hemoglobine. La methode de l’azocaseines a Cte Cgalement essayee pour la determination de l’activite proteasique a pH 7.5. Libhatiox

de l’activite’ dastinolytique

Une suspension de plaquettes, contenant environ 10 mg de proteines par ml a et6 distribuee a raison de 1 ml dans des tubes a centrifuger, mise a incuber en presence des substances capables de liberer l’elastase plaquettaire (ADP : 1 mg; adrenaline : 0.050 mg; collagene: 0.2 mg et Triton X-100: 20-40 mg) pendant 15 min a 30°C en presence de tampon Tris-HCl 0.1 M, pH 7.5 dans un volume de 5 ml. Un tube de Atherosclerosis, 1970, 12: 451-465

454

Y. LEGRAND,

B. ROBERT,

M. SZIGETI,

controle

contenant

rajoutee.

Une autre partie de la m&me suspension

la mCme quantite

dans un sonicateur

MSE pendant

G. PIGNAUD,

de plaquettes

a CtC incube

plaquettaire

sans substance

a subi une sonication

30 set a 0°C . 1.5 ml de cette

melangee avec le tampon Tris-HCl

J. CAEN, L. ROBERT

suspension

soniquke

a pH 7.5 a CtC garde au frigidaire a + 4°C pendant

15 min. A la fin de la periode de p&incubation, centrifugees Tris-HCl

a 3000 tours/min,

les suspensions

les culots plaquettaires

0.1 M a pH 8.6 et repris dans le m&me tampon.

6th Plgalement rajuste et des surnageants,

on a effect&

marquee

le dosage des proteines

une suspension

controle

contenant

a 1251 dans un tampon

une incubation

plaquettaire

l’elastine

aliquote

a

des culots

par la methode

au biuret;

et des culots a Cte mise a incuber a 37°C en presence de

a 6 ml. La serie des melanges d’incubation exemple

ont et6

Le pH des sumageants

a pH 8.6 avec du Tris 1 M. Sur une certaine

l’autre aliquote des surnageants 10 mg d’elastine

plaquettaires

laves 2 fois avec un tampon

n’ayant

marquee

Tris-HCl

comportait

comme par

pas subi la p&incubation

a 1251 sans extrait

de 2 h, nous avons effect&

0.1 M pH 8.6, complete

aussi des controles

et aussi un

plaquettaire

des prelevements

ajoute.

Aprils

de 1 ml et determine

la

radioactivite. Purification

de l’enzyme

Pour obtenir suivante: trait&

pendant

rapidite

l’enzyme

dans un &at

les 100 ml de la suspension

1 h a 4°C avec le Triton

dans le deroulement

de l’enzyme suspension experience

a 30%,

precipite

un precipite

flottant

du sulfate

d’ammonium

a 50 ou 60%

centrifuge

a20,OOO

On obtient

sedimente

bien.

Les precipites

a 40%

Spinco.

de saturation,

de proteines

&ant

determine

En vue de s&parer I’enzyme effect& cipites

des fractionnements a 40 et a 60%

avec un tampon

Clastinolytique

1970, 12: 451-465

en percant

est reprecipite

les avec re-

qui, cette fois-ci,

sont disperses

dans le

contre de l’eau distill&e. Le taux on procede a la mesure de l’acti-

des cathepsines

de Sephadex

de sulfate

acides, nous avons

G-100 et G-200 sur des pre-

d’ammonium.

L’elution

des colonnes

0.05 M a pH 7, a 6tC suivie par enregistrement

a 280 m,u et par le dosage des proteines

Atherosclerosis.

Aprbs un

x g pendant 30 min.

La Fig. 1 montre le schema de fractionnement.

sur colonne

de saturation

phosphate

dans une premiere

de precipite

apres les relargages

La

residuelles

et apres une nuit d’attente,

une faible quantite

dans chaque fraction,

et catheptique.

heures

cellulaires).

du surnageant

Le surnageant

NaCl a 0.9% et mis & dialyser comme les surnageants vite Clastinolytique

quelques

de saturation.

a 20,000

qu l’on &pare

obtenus

survient

au sulfate d’ammonium

experience

La

car l’inactivation

30 min, les plaquettes

est centrifugee

tubes de celluloide de l’ultracentrifugeuse

finale de 1%.

les gros agregats

pendant

x g

12 h, la suspension

x g.

en concentration intactes

de la facon

de 12 1 de sang, ont CtC

est tres importante

disparaitre

dans une deuxieme

sejour a 4°C pendant On obtient

fait

a 3000

et le surnageant

nous avons pro&de provenant

dans les plaquettes

(ce detergent

a CtC centrifugee

Ctant conservees

X-100,

de ces experiences

elastinolytique

apres le prelevement

purifie,

plaquettaire,

par la methode

de

LOWRY

et al.7.

continu

PK~TBAsE

DES PLAQUETTES SANGUINES

BLA~TIN~I.YTIQuE

455

HUMAINES

Suspension plaquettaire dans Trisscitrate 0.1 M, pH 7.4 + Triton X-100 1 y0 (concentration finale) 60 min, 4”C, agitation centrifugation 1 h, 3000 x g

I

I

Plaquettes

Extrait Triton + (NH4)sSOd & 40% de saturation 12 h, 4°C centrifugation 20,000 x g

residuelles

I

I

I

Precipite (NH&S0440%

Surnageant + (NHd)sSOa 60% de saturation 12 h, 4°C centrifugation 20,000 x g

I

P&pit& (NH4)2SO4 60%

Fig. 1 Fig. 1. Schema d’extraction

et de fractionnement

Surnageant (NH4)2S04 60%

des plaquettes.

L TABLEAU ~crrvr~fi

1 ~~LAsTIN~LYTIQUE

DES

EXTRAITS

PLAQUETTAIRES

1251 AYANT UNE ACTIVITY SP~CIFIQUE 37°C; TAMPON TRIS-HCl 0.1 M pH 8.6

MARQUP

h

D~TERMIN~E

AVER

43.000 coups/min/mg;

2 h

ONE

~LA~TINE

D'INCUBATION

A

Radioactivitt des peptides solubilisds (coups/min/mg prot.)

Prbparations plaquettaires

Suspension plaquettaire non incubee Extrait Tris-HCl pH 7.5 d’une suspension plaquettaire incubee 15 minutes & 30” Extrait Tris-HCl pH 7.5 d’une suspension plaquettaire incubee 15 minutes & 30” en presence d’ADP 1.0 mg Extrait Tris-HCl pH 7.5 d’une suspension plaquettaire incubee 15 minutes a 30” en presence de Triton-X-100 40 mg Extrait Tris-HCl pH 7.5 d’une suspension plaquettaire trait6 aux ultrasons

Les Clectrophoreses un tampon

DE

1,380 13,150

19,400

28,850 24,130

sur cellogel sur bandes

Chemetron

ont CtC effect&es

Verona1 0.05 M pH 6.6 avec 2 mA par bande pendant

dans

1.5 h.

RI%ULTATS

Le Tableau plaquettaire

1 montre

fait augmenter

qu’une l’activite

incubation

de courte

elastinolytique

duree

dans l’extrait

par rapport a celle du non-incube.

En presence de Triton X-100,

soumises

cette augmentation

aux vibrations

Sur le Tableau

sonores,

2, nous avons represente

de la suspension soluble

10 fois

ou avec les plaquettes

est encore plus grande.

la distribution

de l’activite

Atherosclerosis,

Clastino-

1970, 12: 451-465

456 TABLEAU

Y. LEGRAND,

B. ROBERT,

M. SZIGETI,

G. PIGNAUD,

J. CAEN, L. ROBERT

2

DISTRIBUTION DE L’ACTIVIT~ ~LASTIN~LYTI~UE

RNTRE

LES

EXTRAITS

SOLUBLES

RT

LES

RBsIDUS

PLAQUETTAIRES

mg Ajoutk

Agent re’vklateur

Collagkne ADP AdrCnaline Triton X-100

(a) (b)

0.2 1.0 0.05 20 40

Sonication

Augmentation de l’activite’totale ( %)

oA de l’activitd totale dans la fraction sCdimentable

extractible

214 35 32 174 416 425

54 50 18 7 16 3

46 50 82 93 84 97

-_

lytique entre la fraction sCdiment6e et la fraction extractible des plaquettes prCincubCes en prksence de diffkrents agents. La deuxikme colonne de ce tableau indique l’augmentation de l’activite enzymatique totale, somme des activitks do&es dans le r6sidu plaquettaire et dans l’extrait plaquettaire. Cette augmentation est calculke par rapport aux dbterminations effect&es sur le rCsidu et le surnageant plaquettaire d’une suspension incubke sans r6vClateur ou activateur. Les rCsultats rapport& dans cette colonne indiquent une augmentation considkrable de 1’activitC totale (rCsidu + surnageant) aprks action du collaghe, du Triton ou aprhs sonication. I’ADP et l’adrb naline ne produisent qu’une faible augmentation de l’activitk enzymatique. La troisikme colonne indique la distribution de l’activitk enzymatique entre le rCsidu plaquettaire et son extrait. Nous notons une diffkrence intkressante entre l’action du collaghe et des deux autres agents activateurs (Triton et sonication). Seuls ces deux derniers provoquent une libkration presque totale de l’enzyme dans le surnageant. Avec le collagkne, la moitiC de l’activitk totale reste associee avec le sCdiment. Si 1’011 compare l’effet mod&ment activateur de l’adrhaline et de l’ADP, on constate que si, pour l’adrhaline l’augmentation se trouve principalement dans la partie extractible, elle est mieux partagCe pour 1’ADP entre partie sbdimentable et extractible. Ainsi, l’adrhaline et le collagkne, r&Glateurs connus de facteurs intraplaquettairesg par un mfkanisme encore inconnulO entrainent Cgalement une libkration de l’activitk Clastinolytique. Les rhsultats reprksenth sur les Tableaux 1 et 2 montrent que ces agents capables de provoquer l’agrkgation plaquettaire n’ont pas la m&me action sur la “lib& ration” de l’enzyme klastinolytique. Ces substances modifient deux facteurs diffkents: 1’activitC enzymatique totale rCcupCrCe(voir colonne 2, Tableau 2) et sa distribution entre l’extrait soluble et le rCsidu plaquettaire (voir colonne 3, Tableau 2). de 1‘enzyme Un extrait plaquettaire obtenu en prhence de Triton X-100, a PM fractionnk par relargage au sulfate d’ammonium, comme dCcrit dans les M~THODES. Sur le Tableau 3, nous avons repr&entC la distribution des protkines entre les fractions ainsi que leur activitk klastinolytique. Environ la moitiC des protkines Purification

Atherosclerosis,

1970, 12: 451-465

PRoTk4sE TABLEAU

BLA~TINOLYTIQUE

DES PLAQUETTES

s.4NGur~Es

457

HUM_~INES

3

FRACTIONNEMENT DISTRIBUTION

DE DES

L’EXTRAIT

PROThNES

mg Prote’ine

PLAQUETTAIRE

PAR

RELARGAGE

AU

SULFATE

D’AMMONIUM.

DE L'ACTIVITR kLASTINOLYTIQUEDANS LES FRACTIONS

ET

Rendement ( %) Activitd coups/min/mg

Actiuite’totale Rendement ( %) coups/min . 1O-6

100

21,400

2.1

70

3,500

0.32

15

28 4

5,700 22,400

0.17 1.1

8.3 52

-Extrait Triton 122.6 Plaquettes rksiduelles 118.4 Prkcip. (NHd)sSOd 40% 86.0 PrBcip. (NHd)sSOh 60% 34.0 Surnageant 60 % 5.0

TABLEAU

100

4

DISTRIBUTION DE L'ACTLVITB CATHEPTTQUEET ~LASTTNOLYTTQUEDANS LES FRACTIONSDE L'RXTRAIT PLAQUETTAIREOBTENUES PAR RELARGAGE AU SULFATE D'AMMONIUM

Extrait Triton-X-100 PrCcip.(NHg)zS04 40% PrBcip.(NHa)sS0460% Surnageant (NH&SO4 60%

Activitt tlastinolytique (coups/min/mg pr0t.i

$$ de l’activitd totale

ActivitC catheptique ripH 3.5 (mg Hblmg prot.)

yOde l’activitd totale

21,400 3,500 5,700

100 15 8.3

3.0 2.67 0.62

100 63 5.8

22,400

52

0

0

plaquettairespeut Ctre extraiteavec le Triton. La majeure partiede ces proteines precipitea 40%

de saturationau sulfated'ammonium.

Moins de 4%

des proteines

plaquettairestotalessont retrouves dans le surnageant apres la precipitationau sulfated'ammonimu

a 60%. Or, cettefractioncontientenvironla moitie del'activite

elastinolytique initiale et possede l'activite specifiquela plus elevee.Une partienon negligeablede l'activite elastinolytique totale (environ23%) est precipiteeavec le sulfated'ammonium. Le Tableau 4 permet de comparerla distribution del'activite catheptiqueapH

optimum

acide avec cellede l'activite elastinolytique. Nous voyons que la majeure

partiedes cathepsinesacidesse trouve dansle precipitea 40% que plus de 60%

de saturationtandis

de I'activite Clastinolytique sont retrouves dans le surnageant de

cettefraction. Le surnageantobtenu apresprecipitation 560%

desaturation contient

l'activite elastinolytique la plus ClevCe.11 faut remarquer toutefoisque ces activites specifiques ne depassent pas les valeurs trouvees dans l'extrait au Triton X-100. Ce faitpourraitCtreattribueBl'effet stabilisateur du Triton X-100 quis'elimineensuite au tours de la purification. Atherosclerosis,

1970, 12: 451-465

458

Y. LEGRAND, B. ROBERT, M. SZIGETI, G. PIGNAUD, J. CAEN, L. ROBERT SEPHAOEX

6200

PO, QOSM pli ZO

tampon

Pricip.

40s’.

0

5erum Pricip

30%

Am504

Sephodex

G-100

P&p

ExkTrilon

4WaPrkcp 4OCh

Prkip60Y. pit II. pit I.

PIG I.

AmSOd

Fig. 2. A gauche en haut: profil d’elution d’une colonne de Sephadex G-200 des fractions de l’expr&ipitC au sulfate d’ammonium B 60% dissout dans NaCl trait plaquettaire. ler graphique: O.S%, 20.6 mg appliquks sur la colonne de 30 x 1 cm 81~6 avec un tampon PO4 0.05 M, pH 7.0 & 4°C. Fractions de 2 ml. 2e graphique: profil d’klution du pr&ipitC k 40% de sulfate d’ammonium, 16 mg chargb, Clution avec le meme tampon. A gauche en bas: profil d’klution d’un prbcipitk & 30% sulfate d’ammonium sur Sephadex G-100. Colonne chargee avec 36 mg de protkines. Elution avec le m&me tampon. A droite: Clectrophorkse sur cellogel des fractions 81u6es, par rapport & un s&urn humain.

La fraction precipitation

ayant l’activite

a 60%

que 5 mg de proteines l’enzyme

elastinolytique

de sulfate d’ammonium.

la plus ClevCe est le surnageant Mais comme cette fraction

pour un volume de 400 ml, pour la purification

elastinolytique,

nous avons eu recours au precipite

a 60%

apres

ne contient

plus poussee de de sulfate d’am-

monium. Sur la Fig. 2 nous avons represente colonne

de Sephadex

(une experience successives

des precipites

&pa&e)

d’un extrait

elastinolytique sur le Tableau

et des precipites au Triton

et catheptique

a 40%

contient

pas d’activite

d’ammonium (precipitations

La distribution

de l’activite

pits est representee

nous

12: 451-465

ClevCe aux trois pH essay&,

Le fait que nous trouvons

a trois pH differents,

dans l’extrait

leur migration 1970,

catheptique

elastinolytique.

l’hemoglobine

ces experiences,

Atherosclerosis,

des plaquettes).

de saturation

qui sort de la colonne avec le volume exclu a partir du

a une activite

sortes de cathepsines Dans

a 40 et 60%

obtenus par passage sur de sulfate

5.

precipite

mais d’apres

X-100

de saturation

a plusieurs pH dans ces differents

Le premier pit important

hydrolysant

les profils d’elution

a 30%

plaquettaire.

n’avons

pas

suggbre la presence

de plusieurs

On d&Ye aussi une activite

caracterise

electrophoretique

mais il ne

des cathepsines

d’avantage

sur cellogel,

a pH 7.5.

ces cathepsines,

nous pensons

qu’elles

459

PROTBASE BLA~TIN~LYTIQ~E DES PLAQ~ETTES SANG~INES HUMAINES TABLEAU

5

FRACTIONNEMENT

D'UN

1 cm, TAMPON

EXTRAIT

PLAQUETTAIRE

mg Prote’ine

PrCcip. (NHb)zSOa 40% pit I PrCcip. (NHd)zS04 60% pit I pit II

appartiennent d’autres

sortant

des cathepsines

par contre, substrat

est environ

a don&

une activite

s’echelonne

d’un grand

nombre

nium, et surtout

proteolytique

5.8 2.1 1.9

CtudiCes dans

sur Sephadex

G-200 un pit

l/lOe du premier elastinolytique

au premier.

non negligeable

L’activite

nuile. LE premier avec l’hemoglobine

sur cellogel de ces differents

Triton

contient

distinctes

son premier

et de la prealbumine.

dans les lysats

des plaquettes.

Les proprietes

C et D extraite

Le precipite proteines,

obtenu

de l’activite

fraction

electrophoretiques

du granulome a 60%

(pit I). 11 n’est pas impossible

comme

dans la fraction qu’elle corresponde

a celles

d’ammonium

de la serumalbumine. dans

acide,

purifiees de la

et de la ratela.

au sulfate

la mobilite

Comme

a pH optimum

semblables

a carrageeninerrJ2

immunologiques

Cette m&me bande est retrouvee

a Cte de-

comporte

une des cathepsines

sont

de saturation

dont une ayant

par des methodes

plaquettaires

catheptique

represente

dont

La presence

qui migre dans la zone des y-globulines.

possede la quasi totalite que cette

plaquet-

a 40% de sulfate d’ammo-

pit clue de la colonne de Sephadex,

une proteine

il n’est pas improbable

extraits

un grand nombre de proteines

entre celle de la y-globuline

de proteines

predominante

cette fraction

retrouvee

4.0 5.8 0 -

et du deuxieme

montree et CtudiCe par plusieurs auteurs 15-18. Le precipite

plusieurs

4.5 5.6 0.62 0.18 0

& pH 7.5.

On peut voir que l’extrait

cathepsine

7.5

7 fois superieur

pit est faible

La Fig. 2 montre l’electrophorese

fraction

5.0

dans le gel (voir Fig. 2). Les deux pits ont une activite mais le deuxieme

la mobilite

pH 3.5

C ou D precedemment

a 60% de sulfate d’ammonium

a pH 3.5 du premier

taires.

x

cathe#ique

avec le volume exclu et un pit plus faible, environ

importante,

comma

Activitd

3,500 0 5,700 21,400 144,000

catheptique presente,

30

tissulairesrl-14.

Le precipite qui penetre

SUR SkPHADEX-G-200,

Activitt! Blastinolytique (coups~min~mg)

16 16 20.6 19.5 1.2

aux groupes

extraits

majeur,

TRITON-X-100

AU

0.05M, pH 7.0,+ 4°C

PO4

les extraits

contient

Celle-ci a CtC

plaquettairesrsJ6.

exclue de la colonne de Sephadex 8. la protease

a activiti:

Clastino-

lytique. Stabilitti de l’enzyme L’activite est peu stable. fraction.

elastinolytique

d’une suspension

Apres 24 h de conservation

plaquettaire

fraichement

a 4”C, on n’en retrouve

11 en est de m&me en ce qui concerne

les extraits

qu’une

plaquettaires

Atherosclerosis,

p&pa&e faible

prepares

1970, 12: 451-465

460

Y. LEGRAND, B. ROBERT, M. SZIGETI, G. PIGNAUD, J. CAEN, L. ROBERT

I

20

jours

Fig. 3. Conservation de la protease Clastinolytique plaquettaire. En abscisses: jours de conservation & 4°C. En ordonkes: activitk dlastinolytique en c/min/mg prothne. ?? --0: Extrait Triton-X-100 des plaquettes; O--O: pit I du prkipite au sulfate d’ammonium 60% (Fig. 1). TABLEAU 1iiHIm~1oN

6 ET

PARTIELLEMENT

ACTIVATION PURIFIfE

DE

L'ACTIVIT~

(PIG 1 DU

I%LAsTII~OLYTIQUE

PRdCIPITd

b

60%

DE

D'UNE SATURATION

Activation Adrenaline ADP 6-Hydroxytryptamine Triton X-100 CaCls EDTA

0.5 1.0 2.0 20 30 pM 30 ,uM

29 0 29 28

( %)

PRBPARATION AU

PLAQuETTAIRE

SULFATE

Inhibition

D'AMMONIUM)

(%)

13 0 73 -

avec differents tampons, comme par exemple avec le tampon Tris-HCl pH 7.5. Le Triton X-100 parait stabiliser l’enzyme, car l’activite elastinolytique de l’extrait plaquettaire prepare avec le Triton X-100 est stable. Son activite non seulement ne decline pas, mais elle augmente avec le temps de conservation (voir Fig. 3). L’enzyme partiellement purifiee (pit I du precipite a 60% de sulfate d’ammonium) garde son activite pendant dix jours, mais apres trois semaines de conservation, son activite decline rapidement. 11 est possible que sa meilleure conservation au debut soit due a la presence de faibles quantites de Triton. Inhibition

et activation de l’enzyme @.&Zfide

Nous avons tent6 d’activer ou d’inhiber l’enzyme Clastinolytique purifie par des agents qui sont capables de “liberer” cette enzyme des plaquettes intactes. Sur le Tableau 6, nous voyons les resultats d’une telle experience, Le chlorure de calcium inhibe l’enzyme 2. 73%) inhibition qui est due probablement a la precipitation de l’enzyme par les ions de calcium, car la solution devient lactescente apres addition du calcium. L’ADP, le Triton X-100 et 1’EDTA produisent une leg&e activation, l’adrenaline et le 5-hydroxytryptamine sont sans effet notable. Atherosclerosis,

1970, 12: 451-465

PR~TBA~E

DES PLAQuETTES

BLA~TIN~LYTIQuE

461

sANGUINES HUMAINES

40

IP

P,O-

.c

a

E

*; 20. ‘x to -

0

8

I

6

-Tk-

9

6

7

PH

Fig. 4. Activitd Clastinolytique en fonction du pH. Tampon PO4 de pH 5.5-7.0 et Tris-HCl pH 7.5-9.5. Enzyme: pit I du pr&ipitG & 60% au sulfate d’ammonium (voir Fig. 1).

de

Effets du PH En examinant constatk

l’activitk

klastinolytique

que le pH optimum

6Oo/o)(voir Tableau

de l’enzyme

persiste

du pH (Fig. 4), nous avons purifiCe (pit I du prCcipitC

5) se situe aux environs de pH 8 et non pas ?I pH 8.6 comme c’ktait

le cas pour 1’activitC dastinolytique geable

en fonction partiellement

cependant

des plaquettes

intactes3.

Une activite

non nCgli-

k pH 9 aussi.

DISCUSSION

Plusieurs

auteurs

ont mis en Cvidence la prksence

quettes

sanguineslg-22.

11 parait

drique.

Dans les extraits

plaquettaires

protkines

equivalentes

peu probable

aux protkines

de protkases

que ces protkases

on a pu jusqu’alors plasmatiques:

le fibrinoghne,

diffkrencier

trois lignes (albumine,

.anti-plasma

bovin et dix B onze lignes contre un anti&rum

fibrinogbne

d’origine

le facteur

et y-globulines)

XIII, on a pu

contre

un anti&rum

anti-extrait

plaquettaire

16933).

A priori, il parait done peu probable avons mise en Cvidence soit d’origine plaident

aussi les expkriences

par YadrCnaline, ,quent

soient

mettre en Cviclence comme

et les y-globulines 15-18,23,24. Sur l’immunoklectrophorkse,

la skumalbumine

(rCfs.

clans les pla-

do&s

de libdration

le collaghne, le Triton

une augmentation

activitks

activitd

agents

une augmentation

provoquent

I’activitC

que nous

?I l’intkrieur

B partir des plaquettes

Certains de ces agents provototale

retroude

(somme

et dans le rksidu), mais laissent des plaquettes

(collagkne,

ADP).

de 1’activitC et une “lib&ration”

des

environ D’autres

t&s forte

de

enzymatique.

Le Triton l’activith,

enzymatique

plaquettaire

la moitiC de cette

de cette protkase

et la sonication.

de l’activitk

clans l’extrait

que la protdase Clastinolytique

skrique. En faveur de son origine plaquettaire

d0nt

X-100

et la sonication

plus de 80%

provoquent

sont retrouds

une augmentation

clans l’extrait

de 2-400%

plaquettaire.

Atherosclerosis,

de

La nature

1970, 12: 451-465

462

Y. LEGRAND,

exacte de cette “activation” nous ne connaissons

B. ROBERT,

et de cette “liberation”

nous ne pouvons

de sa liberation

par les agents

retrouvees

le precipite

d’origine

sont lies a la membrane par une barriere activeieJ-2s.

de l’enzyme.

se trouvent

pour distinguer de provoquer

a l’action

stabilicatrice

du Triton

avec le sulfate d’ammonium

avec 4-5 mg de proteines,

L’activite

representant

ces chiffres sont a considerer de proteines

d’ammonium

moins de 6% de l’activite sur Sephadex

sur les plaquettes

X-100

avec une activite

specifique a 60%;

sur l’activite

environ

catheptique

specifique

a pH 3.5 tres faible. Cette fraction, moglobine protease s’agisse

comme substrat la fraction

d’une protease

vis-a-vis

de l’elastine

11 faut

noter

exact

sur la colonne catheptique

do&e

par l’electro-

prononcee

pas encore possible mais il n’est

et

Par gel-

avec le volume exclu

char&es

proteolytique

a 60%

totale

plaquettaire.

est demontree

a la chymotrypsine

avec l’he-

d’assigner

a cette

pas inconcevable d’une certaine

qu’il

activite

aussi5. toutefois

que certaines

c’est le cas en particulier

de la cathepsine

MCDONALD

et aZ.30. Cet enzyme

d’ammonium

de 70%

de saturation,

sulphydryles.

C ou dipeptidyl

1970, 12: 451-465

precipite

necessite

11 est interessant

enzyme varie selon le substrat

cathepsines

entre aminoacides

Ctudiee par

Atherosclerosis,

Le precipite

elevee et avec une activite

dont l’heterogeneite

elevee pour les liaisons peptidiques

substances

de l’extrait

elastinolytique

des proteines

de l’albumine

semblable

totales

(4-5 mg dans plus de 400 ml) a

8% de l’activite

a pH 7.5. 11 n’est

a mobilite

a la

La presence d’une

de cette fraction.

phorese sur cellogel (Fig. 2), possede une activite

resiste

rend difficile le dosage

G-200 nous avons obtenu un pit sortant

elastinolytique

diffQent+ss. elastinolytique

dans le surnageant

comme approximatifs.

partie

un

de substances

la plus importante

acide totale de l’extrait

la majeure

soient

a partir d’un lysat plaquet-

on la retrouve

de Triton

et la purification

1) qui contient

(pit I, Fig.

la

suggerent

mecanisme

par des mecanismes

dans un grand volume

contient

in-

selon

et la liberation)

environ 4% des proteines

11 faut noter que la presence

rendu difficile la recuperation

variera

des agents experiment&

le mode d’action

avec ce polymere.

filtration

enzymes

une conformation

(l’activation

leur agregation

taire obtenu

de sulfate

souvent

D’autres

Nous voyons dans ce double

precipitation

faible quantite

probablement

apparaissent

dans

(voir Fig. 3), il a ete possible de la purifier partiellement

des proteines;

sont

et de la liberation

entre l’action

test supplementaire

plaquettairc.

acides plaquettaires

sont en tours pour elucider ce probleme.

que ces deux mecanismes

egalement Grace

de cette pro-

sur le mecanisme

a 40%

intracellulaires

de l’activation

Des travaux

mesure independants.

capables

Les cathepsines

d’ammonium

ou bien

considbables

la possibilite

dans une certaine

intraplaquettaire

cellulaire et peuvent etre empeches de reagir avec leur substrat

lipoprotidique

Les differences toutefois

n’est pas encore connue. Comme

ou a l’etat “libre” dans le cytoplasme.

Le mecanisme

localisation

experiment&.

L es peptidases

microsomale

J. CAEN, L. ROBERT

faire que des hypotheses

au sulfate

lysosomaleiz-14325.

dans la fraction

G. PIGNAUD,

pas encore le site de localisation

tease elastinolytique, dans

M. SZIGETI,

sont

d’une

aminopeptidase d’anions

affinite

et hydrophobes, I recemment

a une concentration

la presence

de noter

do&es

aliphatiques

en sulfate

halogenes

que le pH optimum

et de

de cette

utilise entre de larges limites et peut etre active m&me

PROTBASE

BLASTINOLYTIQUE

DES PLAQUETTES

a un pH de 7.5 avec des sub&rats des plaquettes stances

sanguines

sulphydryles

a la chymotrypsine a celles

de l’elastase

et la structure

possible

Le precipite

ont

comme

a 40%

environ 63% de l’activite fraction

(EC 3.4.4.7)

a la trypsine

la presence

la sequence

et6 recemment

de sulfate

de l’extrait

a pH optimum

d’activite

Ainsi, la separation

plaquettaires

plaquettaire

et possedent

par le mercaptoethanol

Elles s’apparentent

de granulome

confirment

la presence

de plusieurs

peut &tre presente mokulaires

dans plusieurs

fractions

de taille variable.

de la suspension

la metamorphose

plaquettaire

visqueuse

faible action inhibitrice

ou activatrice

Seuls,

provoquent

les ions calcium

temps la solution proteique.

proteases

Son pH optimum c’etait

3. La plupart

et/au l’agregation sur I’elastase

partiellement

une forte inhibition,

necessaires

pour elucider ce mecanisme

“liberation” quettaire.

partielle

sur la “liberation”

des plaquettes plaquettaires

sanguines

La sonication

en m&me

et le Triton

de l’enzyme, D’autres

sur le double

travaux

sont

provoquent

elastinolytique X-100

d’une (ou des) enzyme(s)

humaines

partielle

a pH optimum

l’adrenaline

de la protease

de

purifiee (Tableau 5).

et de la liberation

ainsi que la purification

le collagene,

capables

ainsi que la nature exacte des liaisons rompues.

des experiences

des cathepsines

L’ADP,

partielle-

n’ont qu’une

mais precipitent

que nous avons CvoquC au debut de cette discussion.

a partir

a l’etat

le cas pour l’activite

des effecteurs

mecanisme

et physiques

ou bien sous la

Nous ne pouvons done pas encore nous prononcer

detail16 de l’activation

Nous presentons

dans l’extrait

plaquettaire,

mokulaire

paration

des

Cette “elastase

proteiques

mecanisme

chimiques

a celle des

isolees a partir

elastinolytique.

est plus pres du 8.0 que de 8.6 comme

Clastinolytique(s)

semblable

done aux cathepsines

plaquettaire”

provoquer

acide”

acides ainsi purifiees ne sont pas

dont une au moins possede une activite

elastinolytique

a pH optimum

une migration

plaquettairesr

purifie

3).

forte a pH

a carrageenineii~is.

Ces experiences

forme d’agregats

de cette

(Tableau

proteolytique

des “catheptines

Les cathepsines

extraits

G-200

peut &tre realisee par relargage au sulfate d’ammonium

activables

seriques.

contient

a pH 7.5. Elle ne possede pas par contre

a 40 et 60% suivie de gel-filtration. y-globulines

et

a ces

riches en

acide. La quasi totalite

purifiee possede une activite non negligeable

elastinolytique.

SHOTTON

affinite pour des proteines

d’ammonium

3.5 et 5.0 et une activite et des “elastases”

par

du site actif confere

l’elastine.

catheptique

partiellement

et

semblables

en aminoacides

elucidees

similaire

de sub-

a la trypsine

et quaternaire

dont

une certaine

elastinolytique

apparentees

est CluCe avec le volume exclu d’une colonne de Sephadex

Cette fraction

ment

necessiter

tertiaire

qu’une conformation

aliphatiques

La protease

Les proteases

une structure

pancreatique

apparentees

aminoacides

pas par contre

tri-dimensionnelle

~1.32-34. 11 parait

proteases

ne semble

463

HUMAINES

comme le glucagonai.

pour son activite. possedent

SANGUINES

par differents

de cette enzyme

agents et sa SC-

acide. une activation

a partir

provoquent

nette

et une

d’une suspension

une forte activation

Atherosclerosis.

pla(aug-

1970, 12: 451-465

464

Y. LEGRAND, B. ROBERT, M. SZIGETI, B. PIGNAUD, J. CAEN, L. ROBERT

mentation

de l’activitk

et une “libkration” dans

l’extrait

dkpendants

plaquettaire). (activation

Le relargage tique

Nous en concluons

klastinolytique:

catheptique

cifique de 21,400 une activitk

90%

de 144,000 en d&ail.

chargkes

en blectrophorkse

et par gel-filtration

comme les cathepsines

plaquettaires

certaines

paraissent

Clastinolyti-

a une activitk

Cette deuxihme

Elle n’est que faiblement

dont la principale

et se cornportent dont

la

migrent

Plusieurs

Ctre diffkrentes

une activitC

sur Sephadex

ou

G-200.

Elles

ne

des y-globulines

a carrageenine. dans les extraits

klastinolytique.

des cathepsines

activke

protCines sont

purifikes par prkipitation

avec la mobilit

C du granulome

fraction a 8.0, est

migre avec les albumines.

la prksence de plusieurs protkases

possi?dent

spB

(environ 5% des protCines) a

acide ont CtC partiellement

d’ammonium

confirment

sur la colonne)

de 1’agrCgation plaquettaire.

par le mercaptokthanol,

quettaires

cathep-

de saturation,

G-200. L’activitC

coups/min/mg protkines.

sont pas activkes Ces travaux

& 40%

Le premier pit poss&de un pH optimum

sur cellogel

B pH optimum

de sulfate

l’activit6

de saturation.

le deuxikme

par le Ca2f qui le precipite.

inhibke par les autres effecteurs

?I 40%

in-

totale) sort de la colonne en deux pits: le premier le plus

spkcifique

Les cathepsines

de &parer

prkcipite

sur Sephadex

des protkines

n’a pu stre caracthiske

visibles

de l’enzyme

de mkcanismes

a pu &tre en grande partie CliminCe du pr6cipitC & 60%

coups/min/mg protCines;

inhib6 fortement

permet

B 60%

par gel-filtration

que (environ 8% de l’activitk (environ

k la prkence

la premikre

que partiellement

de sulfate d’ammonium important

et dans l’extrait)

(prksence de la quasi totalit

et liberation).

ne prkipite

L’activitk

totale dans le rCsidu plaquettaire

avec le sulfate d’ammonium

de l’activitk

deuxiirme

enzymatique

totale de cette enzyme

pla-

Ces “blastases”

B pH optimum

acide.

REMERCIEMENT

Nous remercions la fourniture

Mme la Docteur A. Bussel pour sa prkieuse

collaboration

pour

des plaquettes.

BIBLIOGRAPHIE 1 ROBERT, L., F. STEIN, M. P. PEZESS ET N. POULLAIN, Propri&& immunochimiques del’klastine. Leur importance dam l’athCromatose, Arch. Mal. Coeur, 1966, 8: Suppl. 3: 121. 2 ROBERT, B. ET A. M. ROBERT, MCcanismes immunologiques dans l’athkosclkose. Etat actuel de nos connaissances, Med. Hw., __ 1969, 27: 822. 3 ROBERT, B., Y. LEGRAND, G. PIGNAUD, J. CAEN ET L. ROBERT, Activitk Clastinolytique associke aux plaquettes sanguines, Pathol. Biol., 1969, 17: 615. 4 ROBERT. B. I%.~ZKETI. L. ROBERT. Y. LEGRAND.G. PIGNAUD ET 1. CAEN, Release of elastino_ lytic act& from blooh platelets, Nature, 1970; 227: 1248. 5 ROBERT, B. ET L. ROBERT, Determination of elastinolytic activity with 1251 and 1311 labelled elastin, Euro@zn J. Biochem., 1969, 11: 62. 6 ANSON, M. L., Estimation of pepsin, trypsin, papain and cathepsin with hemoglobin, J. Gen. Physiol., 1938, 22: 79. 7 LOWRY, 0. H., N. J. ROSEBROUGH,A. L. FARR ET R. J. RANDALL, Protein measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem., 1951, 193: 265. Atherosclerosis,

1970, 12: 451-465

~nok4sE

BLA~TIN~LYTIQuE

DES PLAQUETTES

SANGUINES

465

HUMAINES

HUMMEL, B. C. W., J. M. SCHON, F. F. BUCH, E. BOGGIANI ET E. C. DERENZO, Quantitative enzymic assay of human plasminogen and plasmin with azocasein as substrate, Analyt.

B&hem.,

1965, 11: 532.

HOLMSEN, H.,

H. J. DAY ET H. STORMORKEN, The blood platelet release reaction,

Scand. J,

Hernatal., 1969, Suppl. 9. HOLMSEN, H. ET H. J. DAY, The selectivity of the trombin-induced platelet release reaction. Subcellular localization of released and retained constituents, J. Lab. CZin. Med., 1970, 75:

840. ROBERT, B. ET D. CAMBIER, Etudes sur les cathepsines du granulome provoque par la carrageenine, Bull. Sot. Chim. Biol., 1963, 46: 283. ROBERT, B., D. CAMBIER ET L. ROBERT, Role of cathepsins in the regression of the carrageenine granuloma. Dans: Structure and Function of Connective and Skeletal Tissue, NATO Symposium, St. Andrew, Scotland, Butterworth, London, 1965, p. 453. MCMASTER, P. B. ET T. WEBB, Purification et proprietes de la cathepsine D de la rate humaine,

Ann. Inst. Pasteur,

1963, 104: 90.

BOUMA, J. W. M. AND M. GRUBER, Intracellular distribution of cathepsin B and cathepsin C in rat liver, Biochim. Biophys. Acta, 1966, 113: 350. BEZKOROVAINY, A. ET M. E. RAFELSON, Characterization of some proteins from normal human platelets, J. Lab. Clin. Med., 1964, 64: 212. CAEN, J., H. VAINER, S. LEVY-T• LEDANO ET Y. SULTAN, Effet de I’ADP et de la thrombine sur les proteines plaquettaires normales, Nouv. Rev. Fvang. He’matol., 1967, 7: 663. NACHMAN, R. L., Platelet proteins, Seminars in Hematology, 1968, 5: 18. GANGULY, P. AND R. MOORE, Studies on human platelet protcins, Clin. Chim. Acta, 1967,

17: 153. BEESE, J., W. FARR, E. GRUNER ET R. J. HASCHEN, Proteolytische menschlichen Blutplittchen, Klin. Wochschr., 1966, 44: 1049. KOCFOLEETY, W., Peptidase activity in human platelets, Thrombos.

Enzyme

in normalen,

Diathes. Haemorrhag.,

1962, 7: 295. des Plaquettes Sanguines chez I’Homme Normal, Grande 1962.

PLAT, P. M., Activitds Enzymatiques

Imprimerie

Nouvelle,

Montluqon,

KIESSELBACH, T. H. ET R. H. WAGNER, Fibrin stabilizing factor: a thrombin-labile platelet protein, Am. J. Physiol., 1966, 211: 1472. LOPACIUK, S. ET N. 0. SOLUM, Bovine platelet protein, Partie 1 (Soluble proteins studied by immunoelectrophoresis and polyacrilamide disc electrophoresis), Thrombos. Diathes. Hae-

morrhag., 1969, 21: 409. KOWALSKI, E. ET S. NIEWIAROWSKI, Biochemistry

New York,

of Blood Platelets, Academic

Press. London,

1966, p. 192.

MARCUS, A. J., D. ZUCKER-FRANKLIN, L. B. SAFIER ET H. L. COLLMAN, Studies on human platelet granules and membranes, J. Clin. Invest., 1966, 45: 14. DE DUVE, C., The lysosome concept. Dans: A. V. S. DE REUCK ET M. P. CAMERON (Reds.), L~sosonzes, Ciba Foundation Symposium, Little, Brown, Boston, 1963, p. 1. and inactivation of milk xanthineoxidase by ROBERT, L. ET J. POLONOVSRI, Activation physicochemical means, Faraday Sot., Discussions, 1955, 20: 54. in viva. Dans: M. JAVILLIER, ROBERT, L., Cinetique heterogene, reactions enzymatiques M. POLONOVSRI et al. (Eds.), TraitB de Biochimie Ge’ndrale, Tome 2, Fax. 2, Masson, Paris,

1964, p. 158. KUBISZ, P., S. LEVY-T• LEDANO, S. CRONBERG, J. PINKHAS ET J. CAEN, Effect of phentolamine, an alpha-receptor blocking agent, on epinephrine, ADP and collagen induced platelet factor 4 release and platelet aggregation, Rev. Europ. Et. Clin. Biol., 1970, 15: 429. MCDONALD, J. K., B. B. ZEITMAN, T. J. REILLY ET S. ELLIS, New observations on the substrate specificity of cathepsin C (dipeptidyl aminopeptidase I), J. Biol. Chem., 1969, 244: 2693. MCDONALD, J. K., P. CALLAHAN, B. B. ZEITMAN ET S. ELLIS, Inactivation and degradation of glucagon by dipeptyl aminopeptidase I (cathepsin C) of rat liver, J. Biol. Chem., 1969,

244: 6199. SHOTTON, D. M. ET H. C. WATSON, Three dimensional

structures of tosylelastase, Nature. 1970. 225: 811. SHOTTON, D. M. ET B. S. HARTLEY, Amino acid sequence of porcine pancreatic elastase and its homologies with other serine proteinases, Nature, 1970, 225: 802. WATSON, H. C., D. M. SHOTTON, J. M. Cox ET H. MUIRHEAD, Three dimensional synthesis of tosylelastase at 3.5 A resolution, Nature, 1970, 225: 806.

Atherosclerosis,

Fourier

1970, 12: 45 l-465