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Évaluation de quatre tests immunoenzymatiques (ELISA IgG et IgM) pour le diagnostic des infections à Mycoplasma pneumoniae
Pathologie Biologie 50 (2002) 530–537 www.elsevier.com/locate/patbio
Article original
Évaluation de quatre tests immunoenzymatiques (ELISA IgG et IgM) pour le diagnostic des infections à Mycoplasma pneumoniae Evaluation of four commercial immunoglobulin G (IgG)– and IgM– specific enzyme immunoassays for diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections J. Petitjean *, A. Vabret, S. Gouarin, F. Freymuth Laboratoire de virologie humaine et moléculaire, hôpital universitaire, avenue G. Clémenceau, 14033 Caen, France
Résumé Au cours d’une étude rétrospective, nous avons voulu évaluer les performances de 4 trousses ELISA (EIA-Platelia, EIA-Bmd, EIA-Sorin et EIA-Biotest) pour la détection des anticorps anti-Mycoplasma pneumoniae de type IgG et IgM et définir la place de la sérologie dans le diagnostic des infections aiguës à M. pneumoniae. L’étude a porté sur 3 groupes de sérums : groupe I : 52 sérums (13 paires) provenant de 39 patients présentant une infection active à M. pneumoniae (PCR positive) ; groupe II : 61 sérums témoins (40 enfants et 21 adultes) ; groupe III : 20 sérums positifs pour le FR, en auto-anticorps antinucléaires ou IgM positive pour divers virus. Les tests ont été effectués selon les recommandations techniques du fournisseur. La spécificité évaluée sur les sérums du groupe III se chiffre à 100 % pour EIA-Platelia, 90 % EIA-Bmd, 65 % EIA-Biotest et 25 % EIA-Sorin. La sensibilité de détection des IgM au sein du groupe I montre une bonne concordante chez les 27 enfants (89 à 92 %) mais une forte discordance chez les adultes : EIA-Sorin (58 %), EIA-Biotest (50 %), EIA-Bmd et EIA-Platelia (16 %). La sensibilité de détection des IgG est plus grande avec les trousses EIA-Biotest et EIA-Bmd, surtout à l’examen du sérum précoce (S1) : 61 % pour EIA-Bmd et EIA-Biotest versus 15 % EIA-Platelia et 31 % EIA-Sorin. Chez la population témoin, on retrouve la même discordance pour les IgM EIA-Sorin et de façon moindre pour EIA-Biotest, confirmant le manque de spécificité de ces 2 tests ELISA et les rendant inutilisables pour le diagnostic d’infections aiguës dans l’état actuel des procédures techniques. Une haute séroprévalence IgG est retrouvée chez les adultes par les 4 trousses (43–70 %) ; chez les enfants, la séroprévalence IgG est plus élevée avec les trousses EIA-Bmd et EIA-Biotest qu’avec EIA-Sorin et EIA-Platelia (45 % versus 17 et 20 %). Chez les enfants, la haute prévalence des IgM sur un premier sérum confirme l’utilité de leur recherche pour le diagnostic précoce des infections à M. pneumoniae, à condition d’utiliser un test spécifique. Chez l’adulte, les difficultés d’interprétation sérologique liées à la cicatrice sérologique ne permettent pas la différentiation entre une infection récente et une infection ancienne ; elle oblige à l’examen parallèle de 2 sérums prélevés à 15 jours ou, mieux, à la recherche de M. pneumoniae par PCR à partir de sécrétions respiratoires à un stade précoce de l’infection. © 2002 E´ditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés. Abstract The four following commercially available enzyme immunoassays (EIAs) were assessed and compared for their performance in detecting Mycoplasma pneumoniae specific IgG and IgM antibodies: EIA-Platelia, EIA-Bmd, EIA-Sorin and EIA-Biotest. Three groups of patients were investigated: 39 patients (27 children and 12 adults) with respiratory infections and a M. pneumoniae PCR-positive in respiratory specimens (group I; 52 sera), 61 healthy children and adults (group II; 61 sera) and 20 patients with rheumatoid factor, antinuclear antibodies or positive antiviral IgM (group III; 20 sera). In group III, the IgM specificity for the EIA-Platelia, EIA-Bmd, EIA-Biotest and EIA-Sorin was 100%, 90%, 65% and 25%, respectively. In the children from group I, the four EIAs had similar IgM sensitivity (89 to 92%) but a
* Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (J. Petitjean). © 2002 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés. PII: S 0 3 6 9 - 8 1 1 4 ( 0 2 ) 0 0 3 4 9 - 8
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striking difference in IgM sensitivity was observed in adult patients: 16% EIA-Platelia and EIA-Bmd, 50% EIA-Biotest, 58% EIA-Sorin. The sensitivity for IgG was greater with EIA-Bmd and EIA-Biotest, especially in detection of IgG in acute-phase serum : 61% EIA-Bmd and EIA-Biotest, 15% EIA-Platelia and 31% EIA-Sorin. Discrepant and unexpected results were observed in IgM detection from control healthy patients using EIA-Sorin and EIA-Biotest, confirming the lack of specificity of these two EIA-tests and making them inaccurate for routine diagnosis. A high IgG seroprevalence were found in healthy adults by the four EIAs (43–70%). In healthy children, EIA-Bmd and EIA-Biotest gave a higher IgG seroprevalence than EIA-Sorin and EIA-Platelia (45% each for the former as compared to 17% and 20%, respectively, for the latter). These results confirm that the IgM EIA serology test is a valuable tool for the early diagnosis of M. pneumoniae infections in children, as long as the EIA test used is specific. In adults, the difficult interpretation of EIA tests suggests that paired sera, combined with PCR detection on respiratory tract specimens collected on admission of patient, should be required for accurate diagnosis. © 2002 E´ ditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. All rights reserved. Mots clés: Mycoplasma pneumoniae; Diagnostic précoce; Sérologie ELISA; PCR Keywords: Mycoplasma pneumoniae; Early diagnosis; ELISA serology; PCR
1. Introduction Mycoplasma pneumoniae est un des principaux agents bactériens responsables d’atteintes bronchopulmonaires chez l’enfant et l’adulte jeune allant des infections respiratoires hautes bénignes à la pneumopathie primaire atypique [1-3]. Les infections à M. pneumoniae évoluent sous une forme endémique avec de petites poussées épidémiques tous les 3 à 5 ans, le plus souvent dans les collectivités. Des formes extrapulmonaires inaugurales, contemporaines ou compliquant les formes pulmonaires, peuvent apparaître avec une moindre fréquence [4-6]. L’existence de réinfections et coinfections bactériennes et virales, l’existence de nombreuses formes asymptomatiques ou paucisymptomatiques font que la fréquence des infections à M. pneumoniae est probablement sous-estimée et nécessite des techniques de diagnostic fiables et rapides. L’apparition d’agglutinines froides étant non spécifique et non constante, le diagnostic des infections à M. pneumoniae repose sur le diagnostic bactériologique ; il utilise classiquement la mise en évidence de l’agent infectieux à partir de prélèvements respiratoires par culture et le diagnostic sérologique avec la recherche d’anticorps anti-M. pneumoniae. La culture est difficile, lente et peu sensible ; les méthodes sérologiques classiques de réaction de fixation du complément (RFC), utilisant un antigène glycolipidique, manquent de spécificité et de sensibilité [7,8]. Des techniques alternatives développées récemment ont permis d’améliorer la sensibilité et spécificité du diagnostic à un stade précoce de l’infection : les techniques sérologiques immuno-enzymatiques de type ELISA utilisant des antigènes purifiés (protéine membranaire ou glycolipide) et mesurant séparement les immunoglobulines G (IgG) et IgM [9-13] et les techniques d’amplification génique (PCR) permettant la détection de taux faibles de M. pneumoniae directement à partir des prélèvements respiratoires en moins de 24 heures [14-19]. Quant aux techniques immunoenzymatiques utilisant des anticorps
monoclonaux anti-P1 pour la détection directe des antigènes bactériens, elles permettent également un diagnostic rapide, mais leur manque de sensibilité et spécificité les rend inutilisables à l’heure actuelle. Avec la très grande sensibilité des trousses sérologiques ELISA, des problèmes de spécificité sont apparus lors de la détection des IgG et IgM, liés à l’antigène utilisé, au traitement préalable des sérums et à la définition du cut-off. Aussi, au cours d’une étude rétrospective, nous avons voulu évaluer les performances de 4 trousses de sérologie ELISA disponibles sur le marché pour la détection d’anticorps spécifiques de type IgG et IgM, chez des patients présentant une PCR positive M. pneumoniae et définir la place de la sérologie dans le diagnostic des infections aiguës à M. pneumoniae.
2. Population et méthodes 2.1. Patients et sujets témoins Une étude sérologique rétrospective a été menée de janvier 1997 à décembre 2000 sur des sérums provenant de patients appartenant à 3 groupes distincts : • groupe I : 52 sérums provenant de 39 patients (27 enfants et 12 adultes) hospitalisés à l’hôpital de Caen pour une infection respiratoire aiguë haute ou basse et pour lesquels la recherche de l’ADN génomique du M. pneumoniae par la méthode d’amplification enzymatique (PCR) était positive dans un prélèvement respiratoire collecté à l’admission. Un sérum précoce (S1) et un prélèvement respiratoire ont été collectés à l’admission et un second sérum (S2) a été obtenu à la phase de convalescence chez 13 des 39 patients. Ces 52 sérums ont été testés à leur réception pour la recherche d’anti corps anti-M. pneumoniae avec le test EIA-Platelia IgG
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et IgM (Diagnostica Pasteur Sanofi) et ensuite conservés congelés à –20 °C. • groupe II : 61 sérums témoins provenant de sujets sains (40 enfants et 21 adultes), de répartition âge-sexe identique au groupe I. • groupe III : 16 sérums de sujets présentant une infection virale évolutive (sérums positifs en IgM cytomégalovirus, virus Epstein Barr, virus de l’hépatite A, virus herpes simplex, virus varicelle-zona, virus des oreillons et de la rougeole), 2 sérums positifs en anticorps antinucléaires et 2 sérums positifs en facteur rhumatoïde (FR). Les sérums de ces 3 groupes ont été décongelés et testés avec les 4 trousses ELISA, les 13 paires de sérum du groupe I ont été testées en parallèle dans la même série. 2.2. Détection de M. pneumoniae par PCR Chez les 39 patients du groupe I, 14 prélèvements de gorge, 5 lavages bronchoalvéolaires (LBA) et 20 aspirations nasales ont été analysés pour la recherche d’ADN M. pneumoniae. Les ADN sont extraits par la procédure Chelex. Deux cent cinquante µl de prélèvements respiratoires recueillis sur milieu de transport (200 mM sucrose phosphate pour les prélèvements de gorge et milieu MEM pour les aspirations nasales et LBA) sont vortexés avec 150 µl d’une suspension de résine Chelex 100 (Biorad, Marnes-laCoquette, France) en milieu détergent (0,1 % SDS, 1 % Noninet P-40 et 1 % Tween 20), chauffés 15 minutes à 100 °C et centrifugés 10 minutes à 12 000 g. Le surnageant est directement utilisé pour réaliser une réaction PCR à l’aide des amorces spécifiques MP-P11 et MP-P12 situées dans le gène P1 de M. pneumoniae [16]. Les produits d’amplification sont détectés par hybridation en milieu liquide (GEN-ETI-K DEIA, Sorin) au moyen d’une sonde spécifique biotinylée MP-I [16]. Le signal d’hybridation (index = DO échantillon / DO cut-off) est considéré comme positif quand l’index est ≥ 2. Lors de chaque manipulation, l’introduction de différents contrôles permet de valider les résultats de la PCR M. pneumoniae : contrôle positif, contrôles négatifs (introduits à chaque étape de traitement de l’échantillon) et contrôle d’amplification (amorces GH20 et PCO4 du gène β globine) permettant de vérifier l’absence d’inhibiteurs dans chaque prélèvement [20]. Enfin, la circulation dans 3 secteurs séparés de manipulation est respectée afin de pallier tout risque de contamination. 2.3. Les tests ELISA Pour le diagnostic sérologique, 4 trousses Elisa format microplaque ont été testées : EIA-Platelia (PLATELIAt EIA Sanofi Diagnostica Pasteur), EIA-Bmd (ImmunoWELLt bmd s.a), EIA-Sorin (ETI-MPTM DiaSorin, An-
thony, France), EIA-Biotest (Biotest anti-M. pneumoniae IgG et IgM ELISA, Biotest AG, Buc, Germany). Toutes ces techniques sont des tests ELISA indirects utilisant comme antigène soit un ultrasonicat purifié riche en protéines membranaires, en particulier en cytoadhésine P1 (EIA-Platelia, EIA-Sorin, EIA-Biotest), soit un glycolipide purifié d’une souche FH de M. pneumoniae (EIA-Bmd). Afin de pallier toute interférence par le FR ou la présence d’IgG résiduelles au cours du dosage des IgM, les techniques utilisent soit une méthode d’immunocapture (EIAPlatelia), soit une absorption préalable des sérums avec une solution anti-IgG humaine (EIA-Bmd, EIA-Sorin). EIABiotest utilise une technique ELISA indirecte classique, sans traitement préalable des sérums. Pour les 4 trousses ELISA, nous avons appliqué les protocoles opératoires, les critères de validation et les critères d’interprétation des résultats fournis par le fabricant.
3. Résultats Les valeurs de cut-off établis pour chacune des trousses ont été utilisées pour l’interprétation des résultats IgG et IgM des 4 tests EIA. Devant les difficultés d’interprétation d’un cut-off fixé le plus souvent de façon arbitraire, une zone « équivoque » a été définie pour l’interprétation des IgG et des IgM dosées avec les trousses EIA-Bmd et EIA-Biotest, ainsi que pour l’interprétation des IgM avec la trousse EIA-Platelia. Cette zone « équivoque » a été considérée comme négative sur un sérum isolé et positive sur le premier sérum d’une paire de sérums lorsque le second sérum devient positif. 3.1. Spécificité des tests Elisa La spécificité de détection des IgM a été évaluée sur les sérums du groupe III. Les résultats sont présentés dans le Tableau 1. Le test EIA-Platelia immunocapture apparaît le plus spécifique avec une spécificité de 100 %, celle des autres tests étant respectivement de 90 % pour EIA-Bmd, 65 % pour EIA-Biotest et 25 % pour EIA-Sorin. 3.2. Anticorps spécifiques IgG et IgM chez les 39 patients présentant une infection à M. pneumoniae La sensibilité des 4 trousses ELISA pour la détection des IgG et IgM spécifiques a été réalisée au sein du groupe I (39 patients infectés PCR M. pneumoniae positive) sur le sérum S1 prélevé à l’admission et pour 13 d’entre eux sur le sérum S2 prélevé à la phase de convalescence. Les performances diagnostiques des 4 trousses ELISA sont montrées dans le Tableau 2.
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Tableau 1 Étude de la spécificité des 4 trousses EIA-IgM sur les 20 sérums des patients du groupe III positifs en FR, AAN et IgM anti-virale Groupe III
Nombre de sérum n=20
Nombre de patients positifs en IgM EIA-Platelia
EIA-Sorin
EIA-Bmd
EIA-Biotest
Mononucléose infectieuse
5
0
5
0
3
IgM positive : Cytomégalovirus Epstein barr virus VCAa Hépatitis A Virus Herpès simplex Virus Varicella-zona Virus de la rougeole Virus des oreillons
2 2 2 2 1 1 1
0 0 0 0 0 0 0
1 1 1 2 1 1 1
0 0 0 0 0 1 1
0 1 1 0 0 0 1
FRb positif
2
0
1
0
0
2
0
1
0
1
100 %
25 %
90 %
65 %
c
Anticorps AAN positifs Spécificité : . a
VCA : viral capsid antigen. FR : Facteur Rhumatoïde. c AAN : Anticorps anti-noyaux. b
Tableau 2 Sensitivité des 4 trousses ELISA pour la détection des IgG et IgM chez les 39 patients PCR M. pneumoniae positive (groupe I) Patients PCR M. pneumoniae +
Nombre de sérums
Ig
Enfants
27
Adultes
12
Total
39
IgG IgM IgG IgM IgG IgM
. a
Nombre de sérums positifs (%)a EIA-Platelia
EIA-Sorin
EIA-Bmd
EIA-Biotest
15 (55) 24 (89) 10 (83) 2 (16) 25 (64) 26 (66)
14 (52) 25 (92) 9 (75) 7 (58) 23 (59) 32 (82)
18 (66) 25 (92) 9 (75) 2 (16) 27 (69) 27 (69)
21 (78) 24 (89) 9 (75) 6 (50) 30 (77) 30 (77)
sérums précoce (S1) et tardif (S2) confondus.
Pour les IgM, la sensibilité est concordante chez les 27 enfants (89 à 92 %), mais fortement discordante chez les adultes : 58 % avec la trousse EIA-Sorin, 50 % avec EIABiotest, 16 % avec EIA-Bmd et EIA-Platelia. Pour les IgG, on retrouve la même sensibilité chez les adultes (75–83 %) ; chez les enfants, elle est supérieure avec les tests EIA-Biotest (78%) et EIA-Bmd (66 %) versus 55 % pour EIA-Platelia et 52 % pour EIA-Sorin. L’analyse des résultats obtenus sur les paires de sérums (Tableau 3) montre une meilleure sensibilité pour la détection des IgG sur le sérum S1 avec les trousses EIA-Bmd et EIA-Biotest (61 %) comparée à celle obtenue avec EIASorin (31 %) et EIA-Platelia (15 %), ceci aussi bien chez les enfants que les adultes. Sur les sérums S2 prélevés à la phase de convalescence, la sensibilité est identique pour les 4 trousses. La sensibilité de détection des IgM à la phase aiguë (S1) est globalement plus sensible avec EIA-Sorin et EIA-Biotest (46 et 61 %) qu’avec EIA-Platelia et EIA-Bmd
(15 et 31 %), mais elle se différencie grandement entre les enfants et les adultes. Alors qu’une concordance des résultats est observée chez les enfants, chez les adultes la sensibilité, nettement plus élevée avec les tests EIA-Sorin et EIA-Biotest, doit être discutée au vu des résultats de spécificité. Bien qu’une bonne concordance des résultats soit observée entre la PCR et la sérologie, 6 patients (5 adultes et 1 enfant) PCR M. pneumoniae positive ne présentent pas de réponse sérologique (Tableau 4). Chez les 4 patients ayant une paire de sérums (patients 1, 2, 3 et 4), aucune séroconversion, ou augmentation significative des IgG n’est observée. Les résultats obtenus chez les 2 autres patients montrent la présence d’IgM « équivoque » avec EIA-Bmd (patient 5) et la présence d’IgG « équivoque » (EIA-Biotest) ou faible (EIA-Bmd) ; ces résultats sont ininterprétables en l’absence d’un second sérum prélevé à la phase de convalescence.
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Tableau 3 Sensibilité comparée des 4 trousses ELISA pour la détection d’IgM et IgG sur les sérums précoces et tardifs de 13 patients PCR M. pneumoniae positive ( groupe I) Patients PCR M. pneumoniae +
Nombre de sérums
Enfants
6
Adultes
7
Total
13
.
Ig
IgG IgM IgG IgM IgG IgM
Nombre de sérums positifs (%) EIA-Platelia
EIA-Sorin
EIA-Bmd
EIA-Biotest
Phase aigüe
Phase de convalescence
Phase aigüe
Phase de convalescence
Phase aigüe
Phase de convalescence
Phase aigüe
Phase de convalescence
0 2 (33) 2 (29) 0 2 (15) 2 (15)
4 (66) 4 (66) 6 (86) 1 (14) 10 (77) 5 (38)
2 (33) 4 (66) 2 (29) 2 (29) 4 (31) 6 (46)
5 (83) 5 (83) 6 (86) 4 (57) 11 (84) 9 (69)
3 (50) 4 (66) 5 (71) 0 (0) 8 (61) 4 (31)
5 (83) 5 (83) 5 (71) 1 (14) 10 (77) 6 (46)
3 (50) 4 (66) 5 (71) 4 (57) 8 (61) 8 (61)
5 (83) 5 (83) 6 (86) 5 (71) 11 (85) 10 (77)
Tableau 4 Résultats obtenus chez 6 patients PCR M. pneumoniae positive sans réponse sérologique avec les 4 trousses ELISA Patient No
Sexe, Âge
Diagnostic
1
F, 5mois
bronchite asthmatiforme
2
S2 + Xj
Ig
EIA-Plateliaa
EIA-Sorinb
EIA-Bmdc
EIA-Biotestd
Phase aigüe
Phase de Phase convalescence aigüe
Phase de Phase convalescence aigüe
Phase de Phase convalescence aigüe
Phase de convalescence
+ 8j
IgG IgM
< 10 Neg
< 10 Neg
< 10 < 10
< 10 < 10
< 200 < 770
< 200 < 770
< 75 < 65
< 75 < 65
M, pneumonie 56 ans SIDA
+ 5j
IgG IgM
51 Neg
48 Neg
39 32
33 30
657 < 770
475 < 770
774 205
491 150
3
F, pneumonie 67 ans détresse respiratoire
+ 17j
IgG IgM
< 10 Neg
< 10 Neg
< 10 < 10
< 10 20
< 200 < 770
< 200 < 770
< 75 < 65
< 75 115e
4
M, pneumonie + 9j 21 ans transplanté rénal
IgG IgM
28 Neg
21 Neg
17 < 10
19 < 10
1129 920e
1343 908e
898 < 65
801 < 65
5
F, fièvre 47 ans
nd
IgG IgM
17 Neg
nd nd
< 10 < 10
nd nd
< 200 903e
nd nd
< 75 < 65
nd nd
6
M, pneumonie 71 ans cachexie
nd
IgG IgM
< 10 Neg
nd nd
13 < 10
nd nd
342 < 770
nd nd
91e < 65
nd nd
.
IgG négative : < 10 Ua/ml, IgM négative : DO malade < 0,8 x DO cutoff. IgG négative et IgM négative : < 10 UA/ml. c IgG négative : < 200 UA/ml, équivoque : 200 ≤ X< 320, positive : ≥ 320 ; IgM négative : < 770 UA/ml, équivoque 770 ≤ X < 950, positive : ≥ 950. d IgG négative : < 75 U/ml, équivoque : 75 < X < 125, positive: > 125 ; IgM négative : < 65 U/ml, équivoque : 65 < titre < 135, positive : > 65. e Résultat équivoque ou « titre bas ». a
b
3.3. Séroprévalence du groupe témoin
4. Discussion
Chez les 61 sujets en bonne santé constituant le groupe témoin (groupe II), la séroprévalence varie en fonction du test utilisé entre 28 % et 54 % pour les IgG et entre 1,6 % et 74 % pour les IgM (Tableau 5). Une bonne concordance de la séroprévalence IgG est observée chez l’adulte, alors que, chez les enfants, elle est plus élevée avec les tests EIA-Bmd et EIA-Biotest (45 %) versus 17 % et 20 % pour EIA-Sorin et EIA-Platelia. Concernant les IgM, on retrouve la même séroprévalence incroyablement élevée (57 % chez les adultes et 82 % chez les enfants) avec la trousse EIA-Sorin.
Le diagnostic biologique des infections à M. pneumoniae se pose essentiellement devant un tableau d’infections respiratoires basses, isolées ou associées à d’autres atteintes ; le diagnostic formel se fera en cas de mise en évidence de la bactérie (culture, PCR) et/ou en cas d’une séroconversion ou d’une élévation significative du titre des anticorps. La culture des prélèvements respiratoires en milieux liquides et gélosés complexes présente une excellente spécificité, mais elle est lente et peu sensible. Aucune technique sérologique n’est vraiment définie comme « gold standard » pour la détection des anticorps anti- M. pneumoniae. La
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Tableau 5 Détection des IgG et IgM anti-Mycoplasma pneumoniae au sein de la population témoin (groupe II) Groupe témoin II n = 61
Nombre de sérums
Enfants
40
Adultes
21
Total
61
.
Ig
IgG IgM IgG IgM IgG IgM
Nombre de sérums positifs (%) EIA-Platelia
EIA-Sorin
EIA-Bmd
EIA-Biotest
8 (20) 0 (0) 9 (43) 1 ( 4.7) 17 (28) 1 (1.6)
7 (17) 33 (82) 14 (66) 12 (57) 21 (34) 45 (74)
18 (45) 3 (7.5) 14 (66) 1 (4.7) 32 (52) 4 (6.5)
18 (45) 6 (15) 15 (71) 3 (14) 33 (54) 9 (15)
RFC, pratiquée avec un antigène glycolipidique, reste encore couramment utilisée ; elle détecte à la fois IgM et IgG, présente des réactions non spécifiques (réactions croisées entre l’antigène glycolipidique et des antigènes similaires de différentes origines) et manque de sensibilité, en particulier chez le jeune enfant [21]. Récemment, plusieurs tests ELISA ont été développés ; détectant séparément les IgG et IgM spécifiques [9,10,12,13,22], et plusieurs auteurs ont démontré que la détection d’IgM spécifique par un test ELISA immunocapture présentait une plus grande sensibilité et spécificité que la RFC, permettant un diagnostic précoce des infections à M. pneumoniae [23-26]. Toutefois, la réponse IgM peut être non spécifique [8,27,28,29] ou absente, particulièrement chez les adultes présentant des réinfections [10,12,24,25,30,31,32]. Il a également été montré que les personnes indemnes d’infections respiratoires présentaient une cicatrice sérologique avec un taux relativement élevé d’IgG anti- M. pneumoniae, témoin d’infections anciennes [9,10,13,22,30,31,33]. Seule une augmentation significative du titre des anticorps sur deux sérums prélevés à 8 jours-3 semaines permettra d’affirmer une réinfection chez l’adulte. Plus récemment, la mise en évidence de la bactérie par les méthodes sensibles et spécifiques de PCR a amélioré les performances diagnostiques en terme de rapidité (délai de réponse en 24 h) et de précocité (dès le début de l’infection) [14,15,17,18,19]. Cependant, l’existence de portage sain au niveau du tractus respiratoire ne permet pas d’utiliser cette technique comme méthode de référence. L’association PCR et test ELISA IgM semble être une stratégie efficace pour un diagnostic précoce des infections à M. pneumoniae [34] et par conséquent est fortement encouragée auprès des cliniciens. L’analyse des résultats obtenus avec les 4 tests EIA a permis de montrer : • que seulement deux trousses (EIA-Platelia et EIABmd) présentaient une bonne spécificité pour la détection des IgM, la meilleure spécificité étant obtenue avec la trousse EIA-Platelia qui utilise une technique d’immunocapture. La spécificité très basse des 2 autres trousses (EIA-Biotest et EIA-Sorin) ne permet pas de les utiliser pour le dosage des IgM sur un sérum isolé. • au sein de la population malade (groupe I du Tableau 2) :
„ une bonne concordance entre les résultats sérologiques obtenus avec les 4 trousses ELISA et les résultats PCR (85 %) ; „ une bonne sensibilité de détection des IgM chez les enfants avec une concordance entre les 4 trousses. La détection d’IgM permet un diagnostic d’infection active à M. pneumoniae chez 89 à 92 % des enfants, avec une sensibilité de 81 à 89 % dès le premier sérum (S1). Les enfants inclus dans cette étude sont des enfants hospitalisés, ce qui souligne l’importance d’une recherche spécifique d’IgM pour le diagnostic d’infection à M. pneumoniae à un stade précoce. Chez les adultes, on observe une très forte discordance et les pourcentages élevés obtenus avec EIASorin et EIA-Biotest confirment leur manque de spécificité observée avec le groupe III. Des antigènes non purifiés (lysats cellulaires), de nature glycolipidique, ont été impliqués comme responsables de réactions croisées avec d’autres antigènes cellulaires ou tissulaires [8,27,28] conduisant à l’utilisation d’antigènes purifiés de nature protéique, plus spécifiques [9-11]. Cependant, d’autres travaux ont démontré la qualité des antigènes de nature glycolipidique purifiés par extraction chloroforme-méthanol [35]. Au cours de notre évaluation, la spécificité du test EIA-Bmd (antigène glycolipidique purifié) est en effet supérieure à celle des tests EIA-Biotest et EIA-Sorin utilisant un ultrasonicat cellulaire ; „ une sensibilité de détection des IgG légèrement supérieure avec les trousses EIA-BMD et EIABiotest, retrouvée de façon plus nette à l’examen du sérum précoce S1 des 13 patients ayant une paire de sérums : 61 % pour EIA-Bmd et EIA-Biotest versus 15 % pour EIA-Platelia et 31 % EIA-Sorin (Tableau 3). • dans la population témoin (groupe II) : „ on retrouve une séroprévalence IgG relativement élevée (Tableau 5). Elle est plus élevée avec la trousse EIA-Bmd et EIA-Biotest, confirmant leur plus grande sensibilité observée au sein de la population infectée. Ces différences de sensibilité peuvent s’expliquer par l’hétérogénéité des antigènes utilisés
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Tableau 6 Effet des lavages sur la spécificité de détection des IgM avec la trousse EIA-Sorin IgM positive
Groupe III (n = 20) Spécificité % Groupe II – enfants (n = 40) – adultes (n = 21) – total ( n = 61) .
3 lavages
5 lavages
15 25
4 80
30 11 41
12 4 16
pour coater les microplaques et l’hétérogénéité de la réponse anticorps à l’infection, la cinétique des anticorps produits étant liée à la nature de l’antigène [10]. Vu la haute fréquence des infections à M. pneumoniae dans la population générale et de réinfections chez l’adulte, il n’est pas surprenant de trouver une séroprévalence IgG élevée [9,10,30,31]. Toutefois, la définition du cut-off des tests EIA IgG et IgM est délicate et primordiale pour différencier les patients infectés des sujets en bonne santé : il devra être suffisamment haut pour éviter des résultats faussement positifs, mais pas trop haut pour assurer une bonne sensibilité. L’introduction d’une zone « équivoque » dans les trousses EIA-Bmd et EIA-Biotest permet, en partie, de résoudre ce problème ; „ plus surprenante est la forte séroprévalence des IgM observée avec les trousses EIA-Sorin et EIA-Biotest, appuyant les problèmes de spécificité de ces tests. Autant ce problème peut s’expliquer avec la trousse EIA-Biotest qui ne préconise aucun traitement préalable des sérums avant le dosage des IgM, autant celui particulièrement aiguë de la trousse EIA-Sorin a fait envisager un problème de lavage au cours des différentes étapes. Ainsi, l’addition de 2 lavages supplémentaires a-t-elle permis de réduire considérablement le nombre de faux positifs (Tableau 6), améliorant considérablement la spécificité du test (25 % à 85 %). • malgré une bonne concordance entre les résultats sérologiques et PCR, 6 patients infectés (PCR M. pneumoniae positive) ont une sérologie négative. Plusieurs auteurs ont suggéré que M. pneumoniae puisse être détecté chez des personnes en bonne santé ou pouvait persister après une infection [17,18,36,37,38,39]. Cette hypothèse à l’absence de réponse immune paraît peu probable, car nos 6 patients présentaient des signes respiratoires à l’admission (Tableau 4) : un patient présentait une pneumopathie améliorée cliniquement et radiologiquement sous macrolides, 2 patients étaient immunodéprimés (transplanté rénal et SIDA), 1 patient de 71 ans présentait une pneumonie et 1 nouveau-né de 5 mois avait une bronchite asthma-
tiforme. Les résultats sérologiques sembleraient plus en faveur d’une absence de réponse immune (patients 1, 2, 3 et 4) et/ou d’un prélèvement sérique trop précoce (patients 1, 2, 5 et 6). Plusieurs auteurs ont rapporté des discordances PCR M. pneumoniae positive/sérologie négative aux âges extrêmes de la vie, chez des patients immunodéprimés ou chez des patients prélevés trop précocément dans la maladie [17,34,40]. L’observation de règles très strictes de manipulation de la technique PCR et l’obtention d’un index d’hybridation élevé permettent d’exclure la possibilité de faux positifs par contamination.
5. Conclusion Chez l’enfant, la détection d’IgM spécifique anti-M. pneumoniae est un bon marqueur d’infection récente sur un sérum isolé, à condition d’utiliser un test spécifique. Les 4 trousses ELISA présentent une bonne sensibilité pour la détection des IgM, mais la très mauvaise spécificité des trousses EIA-Sorin et EIA-Biotest les rend inutilisables pour le diagnostic d’une infection aiguë dans l’état actuel des procédures. Les trousses EIA-Bmd et EIA-Biotest présentent une bonne sensibilité pour la détection des IgG permettant un diagnostic plus précoce, toutefois la présence élevée d’IgG au sein de la population témoin remet en question la définition du cut-off. En fait, chez l’adulte, la présence d’IgG sur un premier sérum dans 75 à 83 % des cas (IgM 16 %) ne permet pas la différenciation entre une infection récente et une infection ancienne ; elle oblige à l’examen parallèle de 2 sérums prélevés à 15 jours ou, mieux, à la recherche de M. pneumoniae par PCR à partir de sécrétions respiratoires à un stade précoce de l’infection.
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Article original
Évaluation de quatre tests immunoenzymatiques (ELISA IgG et IgM) pour le diagnostic des infections à Mycoplasma pneumoniae Evaluation of four commercial immunoglobulin G (IgG)– and IgM– specific enzyme immunoassays for diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections J. Petitjean *, A. Vabret, S. Gouarin, F. Freymuth Laboratoire de virologie humaine et moléculaire, hôpital universitaire, avenue G. Clémenceau, 14033 Caen, France
Résumé Au cours d’une étude rétrospective, nous avons voulu évaluer les performances de 4 trousses ELISA (EIA-Platelia, EIA-Bmd, EIA-Sorin et EIA-Biotest) pour la détection des anticorps anti-Mycoplasma pneumoniae de type IgG et IgM et définir la place de la sérologie dans le diagnostic des infections aiguës à M. pneumoniae. L’étude a porté sur 3 groupes de sérums : groupe I : 52 sérums (13 paires) provenant de 39 patients présentant une infection active à M. pneumoniae (PCR positive) ; groupe II : 61 sérums témoins (40 enfants et 21 adultes) ; groupe III : 20 sérums positifs pour le FR, en auto-anticorps antinucléaires ou IgM positive pour divers virus. Les tests ont été effectués selon les recommandations techniques du fournisseur. La spécificité évaluée sur les sérums du groupe III se chiffre à 100 % pour EIA-Platelia, 90 % EIA-Bmd, 65 % EIA-Biotest et 25 % EIA-Sorin. La sensibilité de détection des IgM au sein du groupe I montre une bonne concordante chez les 27 enfants (89 à 92 %) mais une forte discordance chez les adultes : EIA-Sorin (58 %), EIA-Biotest (50 %), EIA-Bmd et EIA-Platelia (16 %). La sensibilité de détection des IgG est plus grande avec les trousses EIA-Biotest et EIA-Bmd, surtout à l’examen du sérum précoce (S1) : 61 % pour EIA-Bmd et EIA-Biotest versus 15 % EIA-Platelia et 31 % EIA-Sorin. Chez la population témoin, on retrouve la même discordance pour les IgM EIA-Sorin et de façon moindre pour EIA-Biotest, confirmant le manque de spécificité de ces 2 tests ELISA et les rendant inutilisables pour le diagnostic d’infections aiguës dans l’état actuel des procédures techniques. Une haute séroprévalence IgG est retrouvée chez les adultes par les 4 trousses (43–70 %) ; chez les enfants, la séroprévalence IgG est plus élevée avec les trousses EIA-Bmd et EIA-Biotest qu’avec EIA-Sorin et EIA-Platelia (45 % versus 17 et 20 %). Chez les enfants, la haute prévalence des IgM sur un premier sérum confirme l’utilité de leur recherche pour le diagnostic précoce des infections à M. pneumoniae, à condition d’utiliser un test spécifique. Chez l’adulte, les difficultés d’interprétation sérologique liées à la cicatrice sérologique ne permettent pas la différentiation entre une infection récente et une infection ancienne ; elle oblige à l’examen parallèle de 2 sérums prélevés à 15 jours ou, mieux, à la recherche de M. pneumoniae par PCR à partir de sécrétions respiratoires à un stade précoce de l’infection. © 2002 E´ditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés. Abstract The four following commercially available enzyme immunoassays (EIAs) were assessed and compared for their performance in detecting Mycoplasma pneumoniae specific IgG and IgM antibodies: EIA-Platelia, EIA-Bmd, EIA-Sorin and EIA-Biotest. Three groups of patients were investigated: 39 patients (27 children and 12 adults) with respiratory infections and a M. pneumoniae PCR-positive in respiratory specimens (group I; 52 sera), 61 healthy children and adults (group II; 61 sera) and 20 patients with rheumatoid factor, antinuclear antibodies or positive antiviral IgM (group III; 20 sera). In group III, the IgM specificity for the EIA-Platelia, EIA-Bmd, EIA-Biotest and EIA-Sorin was 100%, 90%, 65% and 25%, respectively. In the children from group I, the four EIAs had similar IgM sensitivity (89 to 92%) but a
* Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (J. Petitjean). © 2002 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés. PII: S 0 3 6 9 - 8 1 1 4 ( 0 2 ) 0 0 3 4 9 - 8
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striking difference in IgM sensitivity was observed in adult patients: 16% EIA-Platelia and EIA-Bmd, 50% EIA-Biotest, 58% EIA-Sorin. The sensitivity for IgG was greater with EIA-Bmd and EIA-Biotest, especially in detection of IgG in acute-phase serum : 61% EIA-Bmd and EIA-Biotest, 15% EIA-Platelia and 31% EIA-Sorin. Discrepant and unexpected results were observed in IgM detection from control healthy patients using EIA-Sorin and EIA-Biotest, confirming the lack of specificity of these two EIA-tests and making them inaccurate for routine diagnosis. A high IgG seroprevalence were found in healthy adults by the four EIAs (43–70%). In healthy children, EIA-Bmd and EIA-Biotest gave a higher IgG seroprevalence than EIA-Sorin and EIA-Platelia (45% each for the former as compared to 17% and 20%, respectively, for the latter). These results confirm that the IgM EIA serology test is a valuable tool for the early diagnosis of M. pneumoniae infections in children, as long as the EIA test used is specific. In adults, the difficult interpretation of EIA tests suggests that paired sera, combined with PCR detection on respiratory tract specimens collected on admission of patient, should be required for accurate diagnosis. © 2002 E´ ditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. All rights reserved. Mots clés: Mycoplasma pneumoniae; Diagnostic précoce; Sérologie ELISA; PCR Keywords: Mycoplasma pneumoniae; Early diagnosis; ELISA serology; PCR
1. Introduction Mycoplasma pneumoniae est un des principaux agents bactériens responsables d’atteintes bronchopulmonaires chez l’enfant et l’adulte jeune allant des infections respiratoires hautes bénignes à la pneumopathie primaire atypique [1-3]. Les infections à M. pneumoniae évoluent sous une forme endémique avec de petites poussées épidémiques tous les 3 à 5 ans, le plus souvent dans les collectivités. Des formes extrapulmonaires inaugurales, contemporaines ou compliquant les formes pulmonaires, peuvent apparaître avec une moindre fréquence [4-6]. L’existence de réinfections et coinfections bactériennes et virales, l’existence de nombreuses formes asymptomatiques ou paucisymptomatiques font que la fréquence des infections à M. pneumoniae est probablement sous-estimée et nécessite des techniques de diagnostic fiables et rapides. L’apparition d’agglutinines froides étant non spécifique et non constante, le diagnostic des infections à M. pneumoniae repose sur le diagnostic bactériologique ; il utilise classiquement la mise en évidence de l’agent infectieux à partir de prélèvements respiratoires par culture et le diagnostic sérologique avec la recherche d’anticorps anti-M. pneumoniae. La culture est difficile, lente et peu sensible ; les méthodes sérologiques classiques de réaction de fixation du complément (RFC), utilisant un antigène glycolipidique, manquent de spécificité et de sensibilité [7,8]. Des techniques alternatives développées récemment ont permis d’améliorer la sensibilité et spécificité du diagnostic à un stade précoce de l’infection : les techniques sérologiques immuno-enzymatiques de type ELISA utilisant des antigènes purifiés (protéine membranaire ou glycolipide) et mesurant séparement les immunoglobulines G (IgG) et IgM [9-13] et les techniques d’amplification génique (PCR) permettant la détection de taux faibles de M. pneumoniae directement à partir des prélèvements respiratoires en moins de 24 heures [14-19]. Quant aux techniques immunoenzymatiques utilisant des anticorps
monoclonaux anti-P1 pour la détection directe des antigènes bactériens, elles permettent également un diagnostic rapide, mais leur manque de sensibilité et spécificité les rend inutilisables à l’heure actuelle. Avec la très grande sensibilité des trousses sérologiques ELISA, des problèmes de spécificité sont apparus lors de la détection des IgG et IgM, liés à l’antigène utilisé, au traitement préalable des sérums et à la définition du cut-off. Aussi, au cours d’une étude rétrospective, nous avons voulu évaluer les performances de 4 trousses de sérologie ELISA disponibles sur le marché pour la détection d’anticorps spécifiques de type IgG et IgM, chez des patients présentant une PCR positive M. pneumoniae et définir la place de la sérologie dans le diagnostic des infections aiguës à M. pneumoniae.
2. Population et méthodes 2.1. Patients et sujets témoins Une étude sérologique rétrospective a été menée de janvier 1997 à décembre 2000 sur des sérums provenant de patients appartenant à 3 groupes distincts : • groupe I : 52 sérums provenant de 39 patients (27 enfants et 12 adultes) hospitalisés à l’hôpital de Caen pour une infection respiratoire aiguë haute ou basse et pour lesquels la recherche de l’ADN génomique du M. pneumoniae par la méthode d’amplification enzymatique (PCR) était positive dans un prélèvement respiratoire collecté à l’admission. Un sérum précoce (S1) et un prélèvement respiratoire ont été collectés à l’admission et un second sérum (S2) a été obtenu à la phase de convalescence chez 13 des 39 patients. Ces 52 sérums ont été testés à leur réception pour la recherche d’anti corps anti-M. pneumoniae avec le test EIA-Platelia IgG
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et IgM (Diagnostica Pasteur Sanofi) et ensuite conservés congelés à –20 °C. • groupe II : 61 sérums témoins provenant de sujets sains (40 enfants et 21 adultes), de répartition âge-sexe identique au groupe I. • groupe III : 16 sérums de sujets présentant une infection virale évolutive (sérums positifs en IgM cytomégalovirus, virus Epstein Barr, virus de l’hépatite A, virus herpes simplex, virus varicelle-zona, virus des oreillons et de la rougeole), 2 sérums positifs en anticorps antinucléaires et 2 sérums positifs en facteur rhumatoïde (FR). Les sérums de ces 3 groupes ont été décongelés et testés avec les 4 trousses ELISA, les 13 paires de sérum du groupe I ont été testées en parallèle dans la même série. 2.2. Détection de M. pneumoniae par PCR Chez les 39 patients du groupe I, 14 prélèvements de gorge, 5 lavages bronchoalvéolaires (LBA) et 20 aspirations nasales ont été analysés pour la recherche d’ADN M. pneumoniae. Les ADN sont extraits par la procédure Chelex. Deux cent cinquante µl de prélèvements respiratoires recueillis sur milieu de transport (200 mM sucrose phosphate pour les prélèvements de gorge et milieu MEM pour les aspirations nasales et LBA) sont vortexés avec 150 µl d’une suspension de résine Chelex 100 (Biorad, Marnes-laCoquette, France) en milieu détergent (0,1 % SDS, 1 % Noninet P-40 et 1 % Tween 20), chauffés 15 minutes à 100 °C et centrifugés 10 minutes à 12 000 g. Le surnageant est directement utilisé pour réaliser une réaction PCR à l’aide des amorces spécifiques MP-P11 et MP-P12 situées dans le gène P1 de M. pneumoniae [16]. Les produits d’amplification sont détectés par hybridation en milieu liquide (GEN-ETI-K DEIA, Sorin) au moyen d’une sonde spécifique biotinylée MP-I [16]. Le signal d’hybridation (index = DO échantillon / DO cut-off) est considéré comme positif quand l’index est ≥ 2. Lors de chaque manipulation, l’introduction de différents contrôles permet de valider les résultats de la PCR M. pneumoniae : contrôle positif, contrôles négatifs (introduits à chaque étape de traitement de l’échantillon) et contrôle d’amplification (amorces GH20 et PCO4 du gène β globine) permettant de vérifier l’absence d’inhibiteurs dans chaque prélèvement [20]. Enfin, la circulation dans 3 secteurs séparés de manipulation est respectée afin de pallier tout risque de contamination. 2.3. Les tests ELISA Pour le diagnostic sérologique, 4 trousses Elisa format microplaque ont été testées : EIA-Platelia (PLATELIAt EIA Sanofi Diagnostica Pasteur), EIA-Bmd (ImmunoWELLt bmd s.a), EIA-Sorin (ETI-MPTM DiaSorin, An-
thony, France), EIA-Biotest (Biotest anti-M. pneumoniae IgG et IgM ELISA, Biotest AG, Buc, Germany). Toutes ces techniques sont des tests ELISA indirects utilisant comme antigène soit un ultrasonicat purifié riche en protéines membranaires, en particulier en cytoadhésine P1 (EIA-Platelia, EIA-Sorin, EIA-Biotest), soit un glycolipide purifié d’une souche FH de M. pneumoniae (EIA-Bmd). Afin de pallier toute interférence par le FR ou la présence d’IgG résiduelles au cours du dosage des IgM, les techniques utilisent soit une méthode d’immunocapture (EIAPlatelia), soit une absorption préalable des sérums avec une solution anti-IgG humaine (EIA-Bmd, EIA-Sorin). EIABiotest utilise une technique ELISA indirecte classique, sans traitement préalable des sérums. Pour les 4 trousses ELISA, nous avons appliqué les protocoles opératoires, les critères de validation et les critères d’interprétation des résultats fournis par le fabricant.
3. Résultats Les valeurs de cut-off établis pour chacune des trousses ont été utilisées pour l’interprétation des résultats IgG et IgM des 4 tests EIA. Devant les difficultés d’interprétation d’un cut-off fixé le plus souvent de façon arbitraire, une zone « équivoque » a été définie pour l’interprétation des IgG et des IgM dosées avec les trousses EIA-Bmd et EIA-Biotest, ainsi que pour l’interprétation des IgM avec la trousse EIA-Platelia. Cette zone « équivoque » a été considérée comme négative sur un sérum isolé et positive sur le premier sérum d’une paire de sérums lorsque le second sérum devient positif. 3.1. Spécificité des tests Elisa La spécificité de détection des IgM a été évaluée sur les sérums du groupe III. Les résultats sont présentés dans le Tableau 1. Le test EIA-Platelia immunocapture apparaît le plus spécifique avec une spécificité de 100 %, celle des autres tests étant respectivement de 90 % pour EIA-Bmd, 65 % pour EIA-Biotest et 25 % pour EIA-Sorin. 3.2. Anticorps spécifiques IgG et IgM chez les 39 patients présentant une infection à M. pneumoniae La sensibilité des 4 trousses ELISA pour la détection des IgG et IgM spécifiques a été réalisée au sein du groupe I (39 patients infectés PCR M. pneumoniae positive) sur le sérum S1 prélevé à l’admission et pour 13 d’entre eux sur le sérum S2 prélevé à la phase de convalescence. Les performances diagnostiques des 4 trousses ELISA sont montrées dans le Tableau 2.
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Tableau 1 Étude de la spécificité des 4 trousses EIA-IgM sur les 20 sérums des patients du groupe III positifs en FR, AAN et IgM anti-virale Groupe III
Nombre de sérum n=20
Nombre de patients positifs en IgM EIA-Platelia
EIA-Sorin
EIA-Bmd
EIA-Biotest
Mononucléose infectieuse
5
0
5
0
3
IgM positive : Cytomégalovirus Epstein barr virus VCAa Hépatitis A Virus Herpès simplex Virus Varicella-zona Virus de la rougeole Virus des oreillons
2 2 2 2 1 1 1
0 0 0 0 0 0 0
1 1 1 2 1 1 1
0 0 0 0 0 1 1
0 1 1 0 0 0 1
FRb positif
2
0
1
0
0
2
0
1
0
1
100 %
25 %
90 %
65 %
c
Anticorps AAN positifs Spécificité : . a
VCA : viral capsid antigen. FR : Facteur Rhumatoïde. c AAN : Anticorps anti-noyaux. b
Tableau 2 Sensitivité des 4 trousses ELISA pour la détection des IgG et IgM chez les 39 patients PCR M. pneumoniae positive (groupe I) Patients PCR M. pneumoniae +
Nombre de sérums
Ig
Enfants
27
Adultes
12
Total
39
IgG IgM IgG IgM IgG IgM
. a
Nombre de sérums positifs (%)a EIA-Platelia
EIA-Sorin
EIA-Bmd
EIA-Biotest
15 (55) 24 (89) 10 (83) 2 (16) 25 (64) 26 (66)
14 (52) 25 (92) 9 (75) 7 (58) 23 (59) 32 (82)
18 (66) 25 (92) 9 (75) 2 (16) 27 (69) 27 (69)
21 (78) 24 (89) 9 (75) 6 (50) 30 (77) 30 (77)
sérums précoce (S1) et tardif (S2) confondus.
Pour les IgM, la sensibilité est concordante chez les 27 enfants (89 à 92 %), mais fortement discordante chez les adultes : 58 % avec la trousse EIA-Sorin, 50 % avec EIABiotest, 16 % avec EIA-Bmd et EIA-Platelia. Pour les IgG, on retrouve la même sensibilité chez les adultes (75–83 %) ; chez les enfants, elle est supérieure avec les tests EIA-Biotest (78%) et EIA-Bmd (66 %) versus 55 % pour EIA-Platelia et 52 % pour EIA-Sorin. L’analyse des résultats obtenus sur les paires de sérums (Tableau 3) montre une meilleure sensibilité pour la détection des IgG sur le sérum S1 avec les trousses EIA-Bmd et EIA-Biotest (61 %) comparée à celle obtenue avec EIASorin (31 %) et EIA-Platelia (15 %), ceci aussi bien chez les enfants que les adultes. Sur les sérums S2 prélevés à la phase de convalescence, la sensibilité est identique pour les 4 trousses. La sensibilité de détection des IgM à la phase aiguë (S1) est globalement plus sensible avec EIA-Sorin et EIA-Biotest (46 et 61 %) qu’avec EIA-Platelia et EIA-Bmd
(15 et 31 %), mais elle se différencie grandement entre les enfants et les adultes. Alors qu’une concordance des résultats est observée chez les enfants, chez les adultes la sensibilité, nettement plus élevée avec les tests EIA-Sorin et EIA-Biotest, doit être discutée au vu des résultats de spécificité. Bien qu’une bonne concordance des résultats soit observée entre la PCR et la sérologie, 6 patients (5 adultes et 1 enfant) PCR M. pneumoniae positive ne présentent pas de réponse sérologique (Tableau 4). Chez les 4 patients ayant une paire de sérums (patients 1, 2, 3 et 4), aucune séroconversion, ou augmentation significative des IgG n’est observée. Les résultats obtenus chez les 2 autres patients montrent la présence d’IgM « équivoque » avec EIA-Bmd (patient 5) et la présence d’IgG « équivoque » (EIA-Biotest) ou faible (EIA-Bmd) ; ces résultats sont ininterprétables en l’absence d’un second sérum prélevé à la phase de convalescence.
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Tableau 3 Sensibilité comparée des 4 trousses ELISA pour la détection d’IgM et IgG sur les sérums précoces et tardifs de 13 patients PCR M. pneumoniae positive ( groupe I) Patients PCR M. pneumoniae +
Nombre de sérums
Enfants
6
Adultes
7
Total
13
.
Ig
IgG IgM IgG IgM IgG IgM
Nombre de sérums positifs (%) EIA-Platelia
EIA-Sorin
EIA-Bmd
EIA-Biotest
Phase aigüe
Phase de convalescence
Phase aigüe
Phase de convalescence
Phase aigüe
Phase de convalescence
Phase aigüe
Phase de convalescence
0 2 (33) 2 (29) 0 2 (15) 2 (15)
4 (66) 4 (66) 6 (86) 1 (14) 10 (77) 5 (38)
2 (33) 4 (66) 2 (29) 2 (29) 4 (31) 6 (46)
5 (83) 5 (83) 6 (86) 4 (57) 11 (84) 9 (69)
3 (50) 4 (66) 5 (71) 0 (0) 8 (61) 4 (31)
5 (83) 5 (83) 5 (71) 1 (14) 10 (77) 6 (46)
3 (50) 4 (66) 5 (71) 4 (57) 8 (61) 8 (61)
5 (83) 5 (83) 6 (86) 5 (71) 11 (85) 10 (77)
Tableau 4 Résultats obtenus chez 6 patients PCR M. pneumoniae positive sans réponse sérologique avec les 4 trousses ELISA Patient No
Sexe, Âge
Diagnostic
1
F, 5mois
bronchite asthmatiforme
2
S2 + Xj
Ig
EIA-Plateliaa
EIA-Sorinb
EIA-Bmdc
EIA-Biotestd
Phase aigüe
Phase de Phase convalescence aigüe
Phase de Phase convalescence aigüe
Phase de Phase convalescence aigüe
Phase de convalescence
+ 8j
IgG IgM
< 10 Neg
< 10 Neg
< 10 < 10
< 10 < 10
< 200 < 770
< 200 < 770
< 75 < 65
< 75 < 65
M, pneumonie 56 ans SIDA
+ 5j
IgG IgM
51 Neg
48 Neg
39 32
33 30
657 < 770
475 < 770
774 205
491 150
3
F, pneumonie 67 ans détresse respiratoire
+ 17j
IgG IgM
< 10 Neg
< 10 Neg
< 10 < 10
< 10 20
< 200 < 770
< 200 < 770
< 75 < 65
< 75 115e
4
M, pneumonie + 9j 21 ans transplanté rénal
IgG IgM
28 Neg
21 Neg
17 < 10
19 < 10
1129 920e
1343 908e
898 < 65
801 < 65
5
F, fièvre 47 ans
nd
IgG IgM
17 Neg
nd nd
< 10 < 10
nd nd
< 200 903e
nd nd
< 75 < 65
nd nd
6
M, pneumonie 71 ans cachexie
nd
IgG IgM
< 10 Neg
nd nd
13 < 10
nd nd
342 < 770
nd nd
91e < 65
nd nd
.
IgG négative : < 10 Ua/ml, IgM négative : DO malade < 0,8 x DO cutoff. IgG négative et IgM négative : < 10 UA/ml. c IgG négative : < 200 UA/ml, équivoque : 200 ≤ X< 320, positive : ≥ 320 ; IgM négative : < 770 UA/ml, équivoque 770 ≤ X < 950, positive : ≥ 950. d IgG négative : < 75 U/ml, équivoque : 75 < X < 125, positive: > 125 ; IgM négative : < 65 U/ml, équivoque : 65 < titre < 135, positive : > 65. e Résultat équivoque ou « titre bas ». a
b
3.3. Séroprévalence du groupe témoin
4. Discussion
Chez les 61 sujets en bonne santé constituant le groupe témoin (groupe II), la séroprévalence varie en fonction du test utilisé entre 28 % et 54 % pour les IgG et entre 1,6 % et 74 % pour les IgM (Tableau 5). Une bonne concordance de la séroprévalence IgG est observée chez l’adulte, alors que, chez les enfants, elle est plus élevée avec les tests EIA-Bmd et EIA-Biotest (45 %) versus 17 % et 20 % pour EIA-Sorin et EIA-Platelia. Concernant les IgM, on retrouve la même séroprévalence incroyablement élevée (57 % chez les adultes et 82 % chez les enfants) avec la trousse EIA-Sorin.
Le diagnostic biologique des infections à M. pneumoniae se pose essentiellement devant un tableau d’infections respiratoires basses, isolées ou associées à d’autres atteintes ; le diagnostic formel se fera en cas de mise en évidence de la bactérie (culture, PCR) et/ou en cas d’une séroconversion ou d’une élévation significative du titre des anticorps. La culture des prélèvements respiratoires en milieux liquides et gélosés complexes présente une excellente spécificité, mais elle est lente et peu sensible. Aucune technique sérologique n’est vraiment définie comme « gold standard » pour la détection des anticorps anti- M. pneumoniae. La
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Tableau 5 Détection des IgG et IgM anti-Mycoplasma pneumoniae au sein de la population témoin (groupe II) Groupe témoin II n = 61
Nombre de sérums
Enfants
40
Adultes
21
Total
61
.
Ig
IgG IgM IgG IgM IgG IgM
Nombre de sérums positifs (%) EIA-Platelia
EIA-Sorin
EIA-Bmd
EIA-Biotest
8 (20) 0 (0) 9 (43) 1 ( 4.7) 17 (28) 1 (1.6)
7 (17) 33 (82) 14 (66) 12 (57) 21 (34) 45 (74)
18 (45) 3 (7.5) 14 (66) 1 (4.7) 32 (52) 4 (6.5)
18 (45) 6 (15) 15 (71) 3 (14) 33 (54) 9 (15)
RFC, pratiquée avec un antigène glycolipidique, reste encore couramment utilisée ; elle détecte à la fois IgM et IgG, présente des réactions non spécifiques (réactions croisées entre l’antigène glycolipidique et des antigènes similaires de différentes origines) et manque de sensibilité, en particulier chez le jeune enfant [21]. Récemment, plusieurs tests ELISA ont été développés ; détectant séparément les IgG et IgM spécifiques [9,10,12,13,22], et plusieurs auteurs ont démontré que la détection d’IgM spécifique par un test ELISA immunocapture présentait une plus grande sensibilité et spécificité que la RFC, permettant un diagnostic précoce des infections à M. pneumoniae [23-26]. Toutefois, la réponse IgM peut être non spécifique [8,27,28,29] ou absente, particulièrement chez les adultes présentant des réinfections [10,12,24,25,30,31,32]. Il a également été montré que les personnes indemnes d’infections respiratoires présentaient une cicatrice sérologique avec un taux relativement élevé d’IgG anti- M. pneumoniae, témoin d’infections anciennes [9,10,13,22,30,31,33]. Seule une augmentation significative du titre des anticorps sur deux sérums prélevés à 8 jours-3 semaines permettra d’affirmer une réinfection chez l’adulte. Plus récemment, la mise en évidence de la bactérie par les méthodes sensibles et spécifiques de PCR a amélioré les performances diagnostiques en terme de rapidité (délai de réponse en 24 h) et de précocité (dès le début de l’infection) [14,15,17,18,19]. Cependant, l’existence de portage sain au niveau du tractus respiratoire ne permet pas d’utiliser cette technique comme méthode de référence. L’association PCR et test ELISA IgM semble être une stratégie efficace pour un diagnostic précoce des infections à M. pneumoniae [34] et par conséquent est fortement encouragée auprès des cliniciens. L’analyse des résultats obtenus avec les 4 tests EIA a permis de montrer : • que seulement deux trousses (EIA-Platelia et EIABmd) présentaient une bonne spécificité pour la détection des IgM, la meilleure spécificité étant obtenue avec la trousse EIA-Platelia qui utilise une technique d’immunocapture. La spécificité très basse des 2 autres trousses (EIA-Biotest et EIA-Sorin) ne permet pas de les utiliser pour le dosage des IgM sur un sérum isolé. • au sein de la population malade (groupe I du Tableau 2) :
„ une bonne concordance entre les résultats sérologiques obtenus avec les 4 trousses ELISA et les résultats PCR (85 %) ; „ une bonne sensibilité de détection des IgM chez les enfants avec une concordance entre les 4 trousses. La détection d’IgM permet un diagnostic d’infection active à M. pneumoniae chez 89 à 92 % des enfants, avec une sensibilité de 81 à 89 % dès le premier sérum (S1). Les enfants inclus dans cette étude sont des enfants hospitalisés, ce qui souligne l’importance d’une recherche spécifique d’IgM pour le diagnostic d’infection à M. pneumoniae à un stade précoce. Chez les adultes, on observe une très forte discordance et les pourcentages élevés obtenus avec EIASorin et EIA-Biotest confirment leur manque de spécificité observée avec le groupe III. Des antigènes non purifiés (lysats cellulaires), de nature glycolipidique, ont été impliqués comme responsables de réactions croisées avec d’autres antigènes cellulaires ou tissulaires [8,27,28] conduisant à l’utilisation d’antigènes purifiés de nature protéique, plus spécifiques [9-11]. Cependant, d’autres travaux ont démontré la qualité des antigènes de nature glycolipidique purifiés par extraction chloroforme-méthanol [35]. Au cours de notre évaluation, la spécificité du test EIA-Bmd (antigène glycolipidique purifié) est en effet supérieure à celle des tests EIA-Biotest et EIA-Sorin utilisant un ultrasonicat cellulaire ; „ une sensibilité de détection des IgG légèrement supérieure avec les trousses EIA-BMD et EIABiotest, retrouvée de façon plus nette à l’examen du sérum précoce S1 des 13 patients ayant une paire de sérums : 61 % pour EIA-Bmd et EIA-Biotest versus 15 % pour EIA-Platelia et 31 % EIA-Sorin (Tableau 3). • dans la population témoin (groupe II) : „ on retrouve une séroprévalence IgG relativement élevée (Tableau 5). Elle est plus élevée avec la trousse EIA-Bmd et EIA-Biotest, confirmant leur plus grande sensibilité observée au sein de la population infectée. Ces différences de sensibilité peuvent s’expliquer par l’hétérogénéité des antigènes utilisés
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Tableau 6 Effet des lavages sur la spécificité de détection des IgM avec la trousse EIA-Sorin IgM positive
Groupe III (n = 20) Spécificité % Groupe II – enfants (n = 40) – adultes (n = 21) – total ( n = 61) .
3 lavages
5 lavages
15 25
4 80
30 11 41
12 4 16
pour coater les microplaques et l’hétérogénéité de la réponse anticorps à l’infection, la cinétique des anticorps produits étant liée à la nature de l’antigène [10]. Vu la haute fréquence des infections à M. pneumoniae dans la population générale et de réinfections chez l’adulte, il n’est pas surprenant de trouver une séroprévalence IgG élevée [9,10,30,31]. Toutefois, la définition du cut-off des tests EIA IgG et IgM est délicate et primordiale pour différencier les patients infectés des sujets en bonne santé : il devra être suffisamment haut pour éviter des résultats faussement positifs, mais pas trop haut pour assurer une bonne sensibilité. L’introduction d’une zone « équivoque » dans les trousses EIA-Bmd et EIA-Biotest permet, en partie, de résoudre ce problème ; „ plus surprenante est la forte séroprévalence des IgM observée avec les trousses EIA-Sorin et EIA-Biotest, appuyant les problèmes de spécificité de ces tests. Autant ce problème peut s’expliquer avec la trousse EIA-Biotest qui ne préconise aucun traitement préalable des sérums avant le dosage des IgM, autant celui particulièrement aiguë de la trousse EIA-Sorin a fait envisager un problème de lavage au cours des différentes étapes. Ainsi, l’addition de 2 lavages supplémentaires a-t-elle permis de réduire considérablement le nombre de faux positifs (Tableau 6), améliorant considérablement la spécificité du test (25 % à 85 %). • malgré une bonne concordance entre les résultats sérologiques et PCR, 6 patients infectés (PCR M. pneumoniae positive) ont une sérologie négative. Plusieurs auteurs ont suggéré que M. pneumoniae puisse être détecté chez des personnes en bonne santé ou pouvait persister après une infection [17,18,36,37,38,39]. Cette hypothèse à l’absence de réponse immune paraît peu probable, car nos 6 patients présentaient des signes respiratoires à l’admission (Tableau 4) : un patient présentait une pneumopathie améliorée cliniquement et radiologiquement sous macrolides, 2 patients étaient immunodéprimés (transplanté rénal et SIDA), 1 patient de 71 ans présentait une pneumonie et 1 nouveau-né de 5 mois avait une bronchite asthma-
tiforme. Les résultats sérologiques sembleraient plus en faveur d’une absence de réponse immune (patients 1, 2, 3 et 4) et/ou d’un prélèvement sérique trop précoce (patients 1, 2, 5 et 6). Plusieurs auteurs ont rapporté des discordances PCR M. pneumoniae positive/sérologie négative aux âges extrêmes de la vie, chez des patients immunodéprimés ou chez des patients prélevés trop précocément dans la maladie [17,34,40]. L’observation de règles très strictes de manipulation de la technique PCR et l’obtention d’un index d’hybridation élevé permettent d’exclure la possibilité de faux positifs par contamination.
5. Conclusion Chez l’enfant, la détection d’IgM spécifique anti-M. pneumoniae est un bon marqueur d’infection récente sur un sérum isolé, à condition d’utiliser un test spécifique. Les 4 trousses ELISA présentent une bonne sensibilité pour la détection des IgM, mais la très mauvaise spécificité des trousses EIA-Sorin et EIA-Biotest les rend inutilisables pour le diagnostic d’une infection aiguë dans l’état actuel des procédures. Les trousses EIA-Bmd et EIA-Biotest présentent une bonne sensibilité pour la détection des IgG permettant un diagnostic plus précoce, toutefois la présence élevée d’IgG au sein de la population témoin remet en question la définition du cut-off. En fait, chez l’adulte, la présence d’IgG sur un premier sérum dans 75 à 83 % des cas (IgM 16 %) ne permet pas la différenciation entre une infection récente et une infection ancienne ; elle oblige à l’examen parallèle de 2 sérums prélevés à 15 jours ou, mieux, à la recherche de M. pneumoniae par PCR à partir de sécrétions respiratoires à un stade précoce de l’infection.
Références [1]
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