Évaluation de quatre trousses immunoenzymatiques pour le dépistage de la syphilis

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vaiuation

de quatre troussesimmunoenzymatiques pour le d6pistage de ia syphilis

M.-L. N O R T H

et Ph. GUNTZ *

RESUMe:

SUMMARY

En France, six trousses immunoenzymatiques (EIA) sont, a notre connaissance, soit commercialis&es (Behring, Immunotech), soit en cours d'enregistrement d l'Agence du m&dicament (Biokit Instrumentation Laboratory, Murex et Organon Teknika). Elles d&pistent les anticorps anti-tr~pon~miques totaux (Behring, Biokit, Murex, Organon Teknika), ou uniquement des anticorps de type IgG (Captia Syphilis-G Mercia Diagnostics Immunotech) ou de type IgM (Captia Syphilis-M Mercia Diagnostics Immunotech). L'objet de ce travail a &t& de comparer les performances de sensibilitY, de specificitY, de reproductibilit& et de praticabilit& des quatre trousses de d&pistage des anticorps anti-tr&pon&miques totaux (IgG et IgM). L'&tude comparatire de sensibilitY, &tudi&e avec deux panels, a montr& une bonne correlation des quatre trousses de d&pistage EIA entre elles et avec le TPHA. La sp&cificit& des quatre trousses EIA, d&termin&e dans une population non s&lectionn&e de donneurs de sang, a &galement fourni des r&sultats tout d fait acceptables. La sp&cificit& varie de 99,87 ~ 100 % selon les trousses. De plus, il a ~t~ not~ une bonne praticabilit& de ces quatre tests Elisa ; les coefficients de variation sont tout ~ fait acceptables : CV des contr61es n&gatifs : 4,5-5,8 % et CV des contr61es positifs : 12,5-16,6 % pour les trousses EIA par competition (Behring, Biokit IL et Organon Teknika) ; CV des contr61es n&gatifs : 12,8 % et CV des contr61es positifs : 4, 7 % pour la trousse par immunocapture Murex. Ces quatre trousses de d&pistage des anticorps antiTreponema pallidum totaux ont montr&, au cours de cette &tude comparative, des performances sensiblement &quivalentes. Elles pr&sentent l'avantage d'une lecture objectire et d'une possibilit& d'automatisation. Elles constituent une alternative int&ressante aux tests manuels d'agglutination TPHA couramment utilis&s tant en biologie clinique qu'en biologie transfusionneUe.

In France, six immunoenzymatic kits are either commercialized (Behring, Immunotech), or in the course of registration with the National Drug Agency (Biokit Instrumentation Laboratory, Murex and Organon Teknika). These kits detect either total anti-treponemic antibodies (Behring, Biokit, Murex, Organon Teknika), or only IgG (Captia Syphilis-G Mercia Diagnostics Immunotech) or IgM antibodies (Captia Syphilis-M Mercia Diagnostics Immunotech). The object o f this work was to compare the sensitivity, specificity, reproductibility and practicality of four kits detecting total anti-treponemic antibodies (IgG and IgM). A comparative study of sensitivity using two panels showed good correlation between the four kits and with the manual TPHA agglutination test. The specificity of the four EIA kits, determined in a random population of blood donors, was likewise entirely acceptable, varying from 99.87 to 100 % according to the kit. Moreover, all four tests showed good practicality and the coefficients of variation were most acceptable : CV of negative controls 4.5-5.8 % and CV of positive controls 12.5-16.6 % for the Elisa competition kits (Behring, Biokit IL et Organon Teknika) ; CV of negative controls 12.8 % and CV of positive controls 4.7 % for the Elisa imrnunocapture kit (Murex). In this comparative study, the four detection kits for total anti-Treponema pallidum antibodies displayed essentially equivalent performances. Since these kits present the advantages of objective interpretation and possible automation, they constitute an interesting alternative to the manual TPHA agglutination tests currently employed in clinical and transfusional biology.

MOTS-CLf=S

KEY-WORDS

syphilis - s&rodiagnostic - anticorps anti-tr&pon&miques totaux - r&actifs immunoenzymatiques.

syphilis - serological diagnosis - total anti-treponemic antibodies - immunoenzymatic reagents.

* Laboratoire de d~pistage des maladies transmissibles F-.tablissement de transfusion sanguine de Strasbourg 10, rue Spielmann - B.P. 36 67065 STRASBOURG CEDEX Revue franqaise des laboratoires, juin 1997, N ° 294

TIRff:S A P A R T : Mine le D r M.-L. N O R T H

article regu ie 28 janvier, accept6 le 5 mars 1997. 63

Introduction

- a u t o m a t e BEP III Behring pour l'~valuation des r4actifs Enzygnost Syphilis Behring, - incubateur Dynamic Incubateur Abbott, - laveurs pour microplaques Columbus Ortho et LP5 Sanofi Diagnostics, - lecteurs MR 7 0 0 0 Dynex et Titertek MK II Labsystems. Ces trois derniers appareils ont 6t~ utilises pour ~valuer les reactifs Biokit Instrumentation Laboratory (IL), Murex et Organon Teknika.

La nomenclature de la Securite sociale exige que le depistage de la syphilis se fasse par deux reactions : V D R L et T P H A ou EIA ou FTA Abs. En cas de reaction positive ou dissociee, un titrage est & pratiquer sur chacune des deux reactions (JO du 27 octobre 1994). C'est la premiere fois que les reactifs immunoenzymatiques (EIA) sont cites dans un texte officiel concernant le serodiagnostic de la syphilis. Les trousses EIA actuellement commercialisees ou en voie de l'etre en France sont, & notre connaissance, au nombre de six : trois trousses utilisant une technique EIA par competition (Behring, Biokit-lnstrumentation Laboratory, Organon Teknika) et trois trousses une technique EIA par immunocapture (Murex, lmmunotech). Elles depistent soit les anticorps anti-treponemiques totaux (Behring, Biokit, Murex, Organon Teknika), soit uniquement les anticorps de type IgG (Captia Syphilis-G Mercia Diagnostics immunotech) ou de type lgM (Captia Syphilis-M Mercia Diagnostics Immunotech). Les trousses Behring et Captia lmmunotech sont commercialisees ; pour les trois autres, les dossiers sont en cours d'enregistrement h l'Agence du medicament pour la France. L'objet de cette etude a ete de comparer les performances de sensibilite, de specificite, de reproductibilite et de praticabilite des quatre trousses de depistage des anticorps anti-treponemiques totaux (IgG et IgM) et d'analyser la possibilite de leur utilisation en biologie clinique et en biologie transfusionneile comme alternative aux techniques T P H A communement employees.

2. R&actifs Les principes, les modes op~ratoires et les presentations des quatre trousses immunoenzymatiques de depistage des anticorps anti-treponemiques totaux, 6valuees dans cette etude, sont rappeles dans le tableau I. Cette 6tude comparative a 6t6 realisee avec les lots suivants : - Enzygnost Syphilis Behring : lots 2 7 5 4 7 et 28268, - BioElisa Syphilis Biokit IL : lot J 3696, - ICE Syphilis Murex : lot F 0 2 5 9 1 0 , - T r e p a n o s t i k a TP Organon Teknika : lots CH-B 053 et 038/A.

3. l~tude comparative de sensibilit~ Elle a 6t6 faite ~ l'aide de deux panels. - Panel de 39 6chantillons fourni par l'Institut Fournier. Sa composition est r6sumee ci-dessous : TPHA negatif 9 6chantillons TPHA 80 U 8 6chantillons TPHA 160 U 5 6chantillons TPHA 640 U 8 6chantillons TPHA 1280 U 8 &chantillons TPHA 10240 U 1 6chantillon La reaction TPHA a 6t6 realisee avec les reactifs TPHA Seratek Bayer. - Panel interne du laboratoire de 14 6chantillons : VDRL NEG • TPHA DTX 2 6chantillons VDRL NEG ; TPHA 80 U 2 6chantillons VDRL NEG ; TPHA 160 U 2 6chantillons VDRL POS ; TPHA 80 U 1 6chantillon VDRL DTX ; TPHA 160 U 1 6chantillon VDRL POS ; TPHA 640 U 1 6chantillon

I. Materiels et m thodes 1. l ~ q u i p e m e n t L'4tude comparative des performances et de la praticabilit6 des quatre trousses a 6t~ faite avec l'~quipement suivant : - automate de distribution Microlab AT+ Hamilton pour la distribution des serums de donneurs de sang,

TABLEAU ! Description des quatre trousses EIA de d~pistage

Behring

Instrumentation Laboratory

Murex

Organon Teknika

EIA par competition 1 6tape

EIA par competition 1 6tape

EIA immunocapture 2 ~tapes

EIA par competition 1 ~tape

Microplaque Proteines recomb. T. pallidum + Ac antiqgG et IgM humaines

Microplaque Ag T. pallidurn inactiv~

Microplaque Ag T. pallidum inactiv~

Co

Fraction d'IgG (humaines)

Ig (humaines)

Anti-T.pallidum/peroxydas~ Anti-T.pallidum/peroxydase TMB

:_

64

Microplaque Ag T. pallidurn inactiv~

TMB

Proteines recomb.

Ig (humaines)

T.pallidum/peroxydase

Anti-T.pallidurn/peroxydase

TMB

TMB

30 ~

50 ~

90 min ~ 37 °C 30 min &18-25 °C

90 min ~ 37 °c 20 min &20-25 °C

30 rain &37 °C 60 min ~ 37 °C 30 rain ~ 37 °C

90 min ~ 37 °C 15 rain &18-25 °C

DO neg x 0,7

DO n~g x 0,7

DO neg + 0,200

DO n&g x 0,7

25

30

450 nm

450 nm

450 nm

450 nm

__DO n4g x 0,6

non

non

non

192 tests / 960 tests

96 tests / 480 tests

96 tests / 480 tests

192 tests

Revue franqaise des laboratoires, juin 1997, N ° 294

VDRL POS ; TPHA 1280 U 2 echantillons VDRL POS ; TPHA 2 5 6 0 U 2 echantillons VDRL POS ; TPHA 5 1 2 0 U 1 echantillon Les reactifs utilises dans la constitution de ce panel ont ete : VDRL Latex Sanofi Diagnostics Pasteur, TPHA Seratek Bayer, FTA (Abs et IgM) bioMerieux et IgM Captia. Les echantillons des deux panels ont ete conserves congeles 30 °C. -

4. l~tude comparative de sp4cificit4 Elle a ete realisee, pour les quatre trousses, avec des serums frais non inactives, differents mais preleves de faqon identique dans une population de donneurs de sang non selectionnes de I'ETS de Strasbourg : trousse Enzygnost Syphilis Behring 1 500 echantillons trousse BioElisa Syphilis Biokit IL 792 echantillons trousse ICE Syphilis Murex 968 echantillons trousse Trepanostika TP Organon Teknika 792 echantillons Tous ces echantillons ont ete etudies en simple parallelement la trousse de depistage utilisee au laboratoire (Wellcosyph HA 1000 screening Kit Murex). Les echantillons positifs initiaux ont ete contr61es en double avec les m@mes reactifs dans une nouvelle serie. Les 6chantillons positifs repetables avec un reactif ont ete etudies avec les reactifs VDRL Latex Sanofi Diagnostics Pasteur, Seratek Bayer, FTA (Abs et IgM) bioMerieux et Captia Syphilis-M Mercia Diagnostics.

5. Contr61es de reproductibilit4 Ces contreles ont 6t6 faits en utilisant les contr61es positifs et negatifs contenus dans chaque trousse de depistage, sauf pour la trousse Trepanostika Organon Teknika qui n'en contient pas. Pour cette derniere, c'est le contrele positif de la trousse Seratek Bayer qui a ete utilise.

6. Modes op~ratoires Le depet des 6chantillons de serum des donneurs de sang a ete effectue en simple & l'aide de l'automate de prelevement Hamilton Microlab AT+. Les panels ont ete deposes manuellement. Avec les reactifs Behring, le depistage des anticorps antiTreponema pallidum a ete fait sur l'automate BEP III suivant le protocole defini par le fabricant. Pour les reactifs Biokit IL, Murex et Organon Teknika, le depistage a ete effectue manuellement suivant le mode operatoire preconise par chaque fabricant. L'interpretation des resultats (validation, valeur seuil) a ete realisee pour les quatre trousses & l'aide du logiciel LISA (I2S Sante). Les resultats ont ete exprimes par le rapport valeur seuil/DO de l'echantillon pour les reactifs Behring, Biokit IL et Organon Teknika et par le rapport DO echantillon/valeur seuil pour la trousse Murex. Un rapport _> 1 correspond ~ un resultat positif ; un rapport < 1 ~ un resultat negatif. II n'a ete tenu compte d'une zone grise que pour les reactifs Behring comme le demande le fabricant.

2. R sultats 1. Performances de sensibilit~ vis-&-vis des panels • Panel de l'lnstitut Fournier Les resultats obtenus avec les quatre trousses de depistage EIA vis-a-vis de ce panel de 39 echantillons sont rapportes en detail dans le tableau II. Ils montrent que : - les 9 echantillons TPHA negatifs ont ete retrouves negatifs Revue frangaise des laboratoires, juin 1997, N ° 294

TABLEAU !I R~sultats des quatre trousses EIA vis-&-vis du panel de l'Institut Fournier

1545224 1545277 1545279 1545280 1545373 1548156 1545478 1544332 1544898 1544102 1545378 1544523 1545379 1544684 1545725 1545934 1545993 1545434 1545639 1444225 1451442 1491792 1544103 1544386 1544371 1451195 1443610 1449935 1451678 1450016 1544541 1287249 ]288815 1287356 1287650 1420178 1283263 1421903

0,666 0,573 0,557 0,618 0,649 0,618 0,704 0,652 0,629 2,729 1,202 2,739 1,286 2,259 2,418 2,664 3,000 5,535 3,261 4,570 2,720 4,010 7,081 7,018 7,081 5,006 5,867 5,311 6,093 5,822 13,322 7,278 9,357 7,415 11,229 9,470 5,822 8,317

1421889

19,650

0,904 ~ i ~ i ~ ! ~ !.:!,:-iii i 0,809 0,24

0,85 0,73

0,708

0,25

0,73

0,716 0,792 0,739 0,768 0,652 0,816 1,565 1,075 3,00 1,421 1,861 1,603 2,771 2,401 2,086 3,143 3,612 1,910 2,679 2,461 2,621 5,001 3,361 2,988 3,156 2,565 2,939 5,007 4,427 4,196 3,576 5,077 5,186 3,54 4,776

0:;24 0,23 0,23 0,24 0,24 0,25 5,91 4,75 6,75 5,39 5,63 3,92 6,56 4,78 6,84 6,89 6,73 6,18 6,34 6,70 6,67 6,67 6,85 6,76 6,81 6,33 6,69 6,61 6,68 6,84 6,91 6,74 6,79 6,35 6,67

0,71 0,77 0,72 0,75 0,63 0,76 1,57 1,06 2,58 1,32 1,76 1,62 2,43 2,03 2,24 2,62 3,12 1,93 3,21 3,01 2,92 4,66 3,50 3,41 3,35 2,84 2,96 6,03 4,66 6,39 4,06 5,52 6,93 4,07 6,84

8,250

6,60

9,31

avec les trousses Behring, Biokit IL et Organon Teknika. Un des 9 6chantillons a 6t4 trouve positif repetable avec la trousse ICE Murex (n ° 1545224) ; - les 30 4chantillons TPHA positifs ont fourni des reponses positives avec les quatre trousses EIA. • Panel interne du iaboratoire Les resultats detailles figurent dans le tableau IlL lls montrent que : - l'6chantillon 1 (VDRL NEG ; TPHA DTX) est nettement negatif avec les quatre reactifs EIA ; - tous les 6chantillons dont le TPHA titre plus de 80 U (n ° 5 14) sont retrouves franchement positifs avec les quatre trousses EIA quel que soit le resultat du VDRL ; - l'echantillon 2 (VDRL NEG ; TPHA DTX) est nettement negatif avec les trousses Behring, Biokit IL et Organon Teknika ; positif repetable avec la trousse Murex. Les TPHA et FTA sont sans evolution chez ce patient depuis 1991 ; le resultat obtenu avec les reactifs ICE Murex peut &tre considere comme une r@onse non specifique ; - les 6chantillons 3 et 4 (VDRL NEG ; TPHA 80 U) ont 6te trouves l'un (4ch. 3) positif avec trois des quatre trousses EIA mais la trousse Biokit fournit un rapport proche de 1 ; l'autre

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TABLEAU III R~sultats des quatre trousses EIA vis-a-vis du panel du laboratoire

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

NEG NEG NEG NEG NEG NEG <2U DTX 4U <2U <2U 4U 32 U 8U

DTX DTX 80 U 80 U 160 U 160 U 80U 160 U 640 U 1280 U 1280 U 2560 U 2560 U 5120 U

NEG DTX < 100 U NF 400 U NF 200 U 100 U 200 U 400 U 400 U 1600 U 400 U 800 U

TABLEAU IV l~tude comparative de la sp~cificit~ des quatre trousses EIA de d~pistage

test~s Nb ~chantillons positifs initiaux (%) Nb ~chantillons positifs r~p~tables (%) Nb ~chantillons positifs r~p~tables non confirm~s (% faux positifs)

0,588 0,837 1,600 0,727 4,149 3,623 2,304 2,433 9,901 8,621 8,475 17,544 13,699 6,452

0,54 0,62

0,26 4,17 0,30 6,48 6,53 6,39 6,66 6,57 6,59 6,19 6,74 6,69 6,22

0,67 2,46 1,33 1,22 1,03 2,73 1,72 2,10 5,22 7,06 2,48

0,73 0,71 1,06 0,74 2,26 1,91 1,76 1,42 3,73 3,48 3,07 5,97 5,40 4,63

tats sont rassembl~s dans le tableau IV. Les ~chantillons qui sont ~ l'origine des r~actions positives r~p~tables dans une technique et n~gatives dans toutes les autres techniques sont consid~r~s comme fournissant des r~actions non sp~cifiques ou faussement positives. Les r~sultats obtenus Iors de cette ~tude sont tout A fait acceptables. Le pourcentage de faux-positifs est ~gal ou inf~rieur 0,13 % soit une sp~cificit~ comprise entre 99,87 et 100 % dans une population de donneurs de sang.

1 500

792

968

792

14(0,93%)

6(0,76%)

1(0,10%)

14(1,77%)

7 (0,47 %)

2 (0,25 %)

1 (0,10 %)

1 (0,13 %)

2 (0,13 %)

1 (0,13 %)

0

0

3. Reproductibilit~ Les r~sultats sont r~sum~s dans le tableau V. La reproductibilit~ des contrbles positifs et n~gatifs de chaque trousse a ~t~ ~tudi~e sur 15 plaques. Les coefficients de variation (CV) obtenus avec les quatre trousses sont tout & fait acceptables : CV du contrble n~gatif = 4,5 - 5,8 % et CV du contr~le positif = 12,5 - 16,6 % pour les trousses EIA par competition (Behring, Biokit IL et Organon Teknika), CV du contrble n~gatif = 12,8 % et CV du contrble positif = 4,7 % pour I~{trousse EIA par immunocapture Murex.

TABLEAU V Reproductibilit~ des trousses de d~pistage

3. Discussion Contr61e n&gatif Rapport moyen Ecart-type cv(%)

Contr61e positif Rapport moyen

Ecart-type CV(%)

0,601 0,027 4,5

0,701 0,033 4,7

0,255 0,033 12,8

12,725 1,592 •12,5

3,573 0,582 16,3

4,225 0,197 4,7

0,702 0,04 5,8

(1) 3,219 0,533 16,6

1) Aucun contr61eposiflf n'~tant foumi avec la trousse Trepanostika Organon Teknika, c'est le contr61epositifde la trousse Seratek Bayer qui a ~t~ utilis~.

(~ch. 4) est nettement n~gatif avec les quatre trousses EIA. Dans le premier cas (~chantillon ~galement faiblement positif avec les r~actifs FTA bioM~rieux) les r~actifs EIA confirment le TPHA ; dans le second cas, les r~actifs EIA permettent de conclure ~ une r~action non sp~cifique en TPHA. 2 . Sp~cificit~ des q u a t r e trousses E I A La sp~cificit~ des quatre trousses EIA a ~t~ ~valu~e dans une population de donneurs de sang non s~lectionn~s. Les r~sul66

L'~tude comparative de sensibilit~ (tableaux II et Ill) a montr~ une bonne correlation des quatre trousses de d~pistage EIA entre elles et avec le TPHA. Les ~chantillons TPHA positifs du panel de l'Institut Fournier ont ~t~ trouv~s positifs avec les quatre trousses EIA. Des r~sultats comparables ont ~t~ obtenus avec le panel interne. D'autre part, il n'a pas ~t~ observ~ de ph~nom~ne de zone avec les trousses EIA quel que soit le titre TPHA des ~chantillons des panels test~s. La sp~cificit~ des quatre trousses EIA, d~termin~e clans une population non s~lectionn~e de donneurs de sang, a ~galement fourni des r~sultats tout ~ fait acceptables. La specificitY, dans cette population & faibles risques et en bonne sant~, varie de 99,87 & 100 % selon les trousses (tableau IV). II est noter que dans l'~tude des deux panels, compos~s d'~chantillons pr~lev~s chez des sujets & risques, les r~actifs EIA Murex ont fourni une r~ponse positive dans un des 9 ~chantillons n~gatifs du panel Fournier (tableau II) et une r~ponse positive non confirm~e par les trois autres trousses EIA avec les ~chantillons du panel interne du laboratoire (tableau 111"). Dans nos conditions op~ratoires et avec les lots de r~actifs mis notre disposition, nous n'avons rencontr~ aucune difficult~ dans la r~alisation de ces quatre tests Elisa. Ces tests sont d'utilisation simple ; leur reproductibilit~ est tout ~ fait satisfaisante (CV contrble n~gatif : 4,5 % - 12,8 % ; CV contrble positif : 4,7 % - 16,6 %). lls peuvent @tre r~alis~s sur s~rum Revue frangaise des laboratoires, juin 1997, N ° 294

e t / o u sur plasma. Les prises d'essais des &chantillons sont correctes ; elles varient de 25 & 50 I~I (tableau I) et peuvent etre d~posees soit manuellement soit & l'aide d'un automate. La r&action se fait en une &tape pour trois des quatre trousses &valu&es. La dur~e moyenne du test est de 2 heures. Les quatre r~actifs EIA sont adapt&s ~ des analyses en s~rie, leur utilisation peut &tre programm&e sur automate mais peut &galement ~tre realis&e manuellement. Deux trousses (Biokit et Murex) ont introduit un code couleur dans leurs r&actifs, ce qui facilite leur utilisation en routine.

Conclusion Ces quatre trousses de d~pistage des anticorps antiTreponema pallidum totaux, enregistr~es ou en cours d'enregistrement par l'Agence du m~dicament pour la France, ont montr~, au cours de cette ~tude comparative, des performances de sensibilitY, de specificitY, de reproductibilit~ et de praticabilit~ sensible-

Revue frangaise des laboratoires, juin 1997, N ° 294

ment ~quivalentes. Elles d~pistent les anticorps anti° tr~pon~miques de type IgG et IgM. Elles sont adapt~es & des analyses en s~rie. Elles pr~sentent I'avantage d'une lecture objective et d'une possibilit~ d'automatisation sans appareillage sp~cifique pour les laboratoires d~j& ~quip~s d'automates d'immunoanalyse. Elles peuvent ~tre utilis~es tant en biologie clinique qu'en biologie transfusionnelle. Elles constituent une alternative int~ressante aux tests manuels d'agglutination TPHA couramment utilis~s dont l a lecture automatique reste d~licate. Elles pourraient @tre envisag~es & l'avenir comme test de d~pistage unique & condition que ieur prix reste comp~titif avec les autres tests de d~pistage de la syphilis et que soit envisag~ un test de confirmation.

REMERCIEMENTS Nous remercions Mmes Mich#le H O C H E N E D E L , Nicole BRONN E R et Pascale R E D E L S P E R G E R pour leur collaboration technique ainsi que M m e Nathalie R A H M pour son travail de frappe et de la mise en page de cet article (ETS de Strasbourg).

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