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Facteurs de virulence des staphylocoques coagulase-negatifs
M~decine et Maladies Infectieuses - 1 9 9 0 - H o r s ~ r i e Mars - 4 1 ~ 4 5
FACTEURS DE VIRULENCE DES STAPHYLOCOQUES COAGULASE-NEGATIFS* par E S C H U M A C H E R - P E R D R E A U * * et G. PETERS** RESUME
Malgr~ leur faible virulence clans les modules animaux, les staphylocoques coagulase n~gative (SCN) poss~dent un potentiel invasif et destructif comme on l'observe clans certains cas d'endocardites sur valves naturelles. Les caract~res de virulence de ces souches ne sont pas bien ~lucid~s. Une propri~t~ remar~ quable des SCN est d'une part leur forte adhesion aux biomateriaux, ce qui favoriserait leur colonisation, d'autre part l'~laboration d'une substance appel~e "slime" qui pertur~ berait les syst~mes de d~fense immunitaire et l'antibioth~rapie. Ces organismes produisent ~galement toute une gamme d'exoprot~ines tels prot~ases, est~rases, lipases, nucl~ases ainsi que des hemolysines dont le pouvoir pathog~ne peut ~tre anticip~. Mots ch~s : ModUles animaux, Virulence, Adherence, Slime, Toxines, Enzymes
A l'heure actuelle, on recense 24 esp~ces de staphyIocoques coagulase-n~gatifs souvent d~nomm~s par l'abr~viation SCN. 12 esp~ces colonisent la peau et les muqueuses humaines : S. epidermiclis, S. hae-
(9, 21, 27, 37). Une autre situation, entrainant une sensibilit~ accrue aux infections ~ SCN est l'implantation de corps ~trangers les plus divers tels protheses, catheters vasculaires, stimulateurs cardiaques, shunts de d~rivation du LCR etc. (12, 38).
molyticus, S. horninis, S. warneri, S. capitis, S. sirnulans, S. auricularis, ,9. schleiferi, S. lugclunensis, S. saprophyticus, S. xylosus et S. cohnii. Le r01e physiologique des SCN en tant que microflore de la peau et des muqueuses n'est pas encore suffisamment ~lucid~. On leur attribue un r01e dans le m~tabolisme des corps gras, ainsi que de barri~re primaire ~ l'invasion de microbes pathog~nes.
VIRULENCE DES SCN DANS LES MODELES A N I M A U X
La virulence de ces organismes a ~t~ ~valu~e dans diff~rents modules d'infections animales (1, 2, 3, 5, 13, 22, 24). En g~n~ral, la dose n~cessaire pour produire de telles infections est tr~s ~lev~e, ce qui indique que les SCN ne sont pas d'embl~e virulents. La plupart des modules d'infection exp~rimentales SCN n~cessitent soit la presence d'un corps ~tranger, soit des animaux nouveau-n~s. Par exemple, Namavar et al. (23) doivent injecter intrac~r~bralement entre 106 et 108 cfu chez les souris pour obtenir un effet l~thal chez 50% des animaux (LD55). Lowy et al. (22) utilisent 3,5 x 109 cfu ip en presence de mucine (hog gastric mucine) chez des souris nouveau-n~s pour d~clencher une p~ritonite. Christensen et al. (5) doivent injecter 109 cfu, en presence de corps ~tranger implant~ sous-cutanement pour obtenir la formation d'abc~s, lls y parviennent
S. epiclerrniclis est l'esp~ce pr~pond~rante des SCN trouv~s dans la colonisation et la pathologie humaine (21, 28). S. epiderrnidis, comme les autres SCN, est principalement un germe commensal et l'on suppose que la presence de certains facteurs de virulence encore mal connus est n~cessaire pour crier des infections chez l'hOte dit "normal" (23, 26). Un autre facteur favorisant les infections ~ SCN est l'~tat "immunocompromis". II existe chez le nouveau-n~ pr~matur~ ou le canc~reux neutrop~nique ou le patient souffrant d'affections h~matologiques * Communication pr~sent~e au colloque Pharmuka sur le th~me : ULes staphylococlues coagulase-n~gatifs et leur pathologie". Paris, 16 Mars 1990. ** Institut f/Jr Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der universit~t zu K61n. 5000 K61n 41, Goldenfelsstrasse 19 - 21, R.F.A.
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dans 53% des cas, si ils utilisent une souche productrice de slime, mais seulement dans 13% des animaux si la souche utilis~e n'est pas productrice de slime.
t~re promulgant l'adh6rence est un crit~re de virulence. Les m~canismes de l'adh~sion des SCN semblent diff~rents sl l'on consid~re, l'adh~sion in vitro ~ des surfaces inertes par rapport a l'adh~sion in vivo. L'adh6sion in vitro est surtout influenc6e par des facteurs hydrodynamiques (hydrophobie, charge de surface). Dans ce cas, seules les propri6t6s physico-chimiques du polym~re et de la souche sont d~terminants (16, 31). L'adh~sion in vivo r~pond des interactions sp~cifiques. Chez les staphylocoques dor~s on a d~montr~ la pr6sence de r~cepteurs pour la fibronectine ainsi que le fibrinog~ne (clumping factor) (34). Une affinit~ des SCN pour la fibronectine a ~galement ~t~ dC~montr6e chez la plupart des souches (15). Un nombre moindre de souches a une affinit~ pour le collag~ne, la laminine et m~me pour le fibrinog~ne (15, 33 - 35). II semble bien que la nature, la r~partition et la quantit~ des prot~ines s~riques recouwant le corps ~tranger d~pendent de la nature du polym~re ins~r~. Certaines observations ont d6montr~ que le nombre de bact6ries adh~rentes d~pendait proportionneUement de la quantit6 de fibrinonectine d6pos~e in vitro ou in vivo sur les polym~res (34).
Dans le module d'endocardite exp~rimentale du lapin, les doses requises varient entre 10 ~ et 109 (1). Chez le rat, l'inoculum n~cessaire est de l'ordre de 6 x 1@ (Christensen et al.), m~me module dans lequel les auteurs ne purent d6montrer une virulence accentube des souches productrices de slime (2). Dans un autre module mesurant le retard de prise de poids (19), Gunn a ~tudi¢~ la virulence de souches appartenant ~ huit esp~ces de SCN (13). 11 a conclu d'une part que seuls S. haemolyticus, S. epidermidis et S. saprophyticus ~taient des esp~ces virulentes, d'autre part clue le slime jouait un r~le primordial dans cette virulence. Une grande diff6rence de virulence rut n~hanmoins observ~e entre plusieurs souches d'une m@me esp@ce. Tous ces modules ont d6montr~ que, m@me dans des conditions "compromises", la dose infectieuse n~cessaire ~ une infection cliniquement apparente ~tait beaucoup plus ~lev~e pour les staphylocoques dor~s, ces derniers pouvant d~clencher une infection avec 100 cfu seulement (35).
ACTIVITE ENZYMATIQUE et VIRULENCE DES SCN FACTEURS DE VIRULENCE DES SCN
Jusqu'a present, peu de travaux se sont consacr~s syst~matiquement aux propriC~t~s biologiques des substances excr~t~es par les SCN (10, 11). De plus, la diff~renciation des SCN en de nouveUes esp~ces rend l'analyse de crit~res utilis~s dans les ~tudes plus anciennes difficile (23, 11). Les SCN produisent toute une gamme de prot~ines (30) dont l'h6te reconnait certaines comme antig~nes mis en ~vidence par une technique dites d'immunoblot" (resultats non-publi~s). Ces prot~ines jouent probablement un r~le important dans les propri~t~s biologiques que l'on attribuait au slime Iorsqu'il n'~tait purifi@ que partiellement (26). Les SCN produisent au moins deux h~molysines, alpha et delta (10, 20). Cette dernitre lyse non seulement les ~rythrocytes humains mais aussi les cultures de fibroblastes embryonnaires. Son r~le dans le developpement de l'ent~rocolite du nouveau-n~ est discut~. L'activit~ prot~olytique des SCN varie selon l'esp~ce (r~sultats non-publi~s). La Figure I montre la r~partition de l'activit~ prot~olytique parmi des SCN isol~es de catheters. La pr~sence d'est~rases et de lipases se retrouve dans la plupart des esp~ces (11) : elle est raise en rapport avec le r61e commensal de ces micoorganismes. Leurs r61es dans les l~sions cutan~es est real d~fini (32). Certaines souches produisent de la d~soxyribonucl~ase, du lysozyme (10, 11, 23). La production de ces enzymes n'est pas sp~cifique et leur r61e dans le m~canisme de virulence n'est pas ~lucid~.
Malgr~ leur faible virulence dans les modules animaux, on constate que n~anmoins chez certains patients le potentiel invasif et destructif de souches SCN est bien r~el, en particulier certains cas d'endocardites sur valves natureUes. La pathologie postmortem de ces affections a souvent montr~ la pr~sence de multiples l~sions des orifices mitraux et triscuspides, plus des abc~s annulaires ou du myocarde (4). Dans ces cas d'endocardites, l'esp~ce ,9. epidermidis sensu stricto n'a repr~sent~ qu'~ peine plus du tiers des staphylocoques impliqu~s (4) S. lugdunensis, une esp~ce r~cemment d~crite a ~t~ impliqu~e dans ce type d'infection. (8).
CARACTERES DE VIRULENCE ASSOCIES A LA SURFACE DES SCN
Une propri~t~ tr~s remarquable des SCN est leur forte adhesion ~ des biomat~riaux polymC~riques, biomat@riaux, m~talliques ou m~me a des ciments orthop~diques ce qui favoriserait leur colonisation par l'61aboration d'une substance appel~e slime (voir revue 25 et 30). L'adh~ion bact~rienne est considC~r~e comme la premiere ~tape de l'~tablissement d'un processus infectieux (12), ce qul laisse supposer que tout carac-
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Facteurs extracellulaires
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positif
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FIGURE 1 Hydrolyse de caseine + gelatine
Staphylocoques coagulase-negatifs SCN, d'agglutiner les ~rythrocytes de moutons. Cette r~action peut ~tre bloqu~e par la presence d'oligosaccharides contenant la structure terminale [13.D.Galp-(1-4)-~.D.GlucNAcp-] (14). Ceci laisse supposer la presence de r~cepteurs sp~cifiques. De plus, des appendices sous formes de filaments (6) et plus rec~mment des structures ressemblant aux fimbriae des bact~ries Gram-n~gative ont ~t~ d~montr~s ~ la surface de ces organismes (29). De plus, cette espYce produit une ur~ase, dont la presence est reconnue comme un facteur de virulence chez d'autres microorganismes entrainant une alkalinisation de l'urine et facilitant ainsi la formation de calculs (17). La virulence des SCN clans un contexte clinique est sans doute multifactorielle. Diff~rentes analyses r~trospectives cliniques comparant l'~tat du patient et les propri~t~s des souches isol~es, ont d~montr~ une association significative entre la propri~t~ de production du slime et l'aptitude ~ causer une infection en particulier chez des patients porteurs de mat~riaux ~trangers (7, 38, 18). II reste cependant ddinir le r61e des diff~rents facteurs enzymatiques s~cr~t~s par les SCN Iors de colonisation des surfaces solides (25). Ces propri~t~s sont sans doute responsables de la virulence de certaines souches ; de plus, elles entra~nent souvent des ~checs de l'antibioth~rapie et perturbent peut-~tre les syst~mes de ddense immunitaire •
FACTEURS SPECIFIQUES
A S. SAPROPHYTICUS Cette esp~ce se distingue des autres SCN au niveau des facteurs de surface. S. saprophyticus adhere de prd~rence aux cellules ur~theliales et p~riur~thales (17). En temps que pathog~ne on ne la rencontre que clans le syst~me urogenital (17, 36). La majorit~ des souches sont capables, contrairement aux autres
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SUMMARY
V I R U L E N C E FACTORS O F COAGULASEoNEGATIVE STAPHYLOCOCCI
Despite their low virulence in animal models, coagulase negative staphylococci (CNS) have a potency to invade and destroy tissues, as can be seen in some cases of native valve endocarditis. Virulence factors of CNS have not been clearly identified so far. The ability to adhere to and colonise solid surface as well as to produce an extracellular slime substance which might interfere with the imrnunsystem of the host, as well as with therapy, has been related to virulence. The organisms also produce a wide variety of potential toxins and enzymes such as proteases, esterases, lipases, nuclease and haemolysins which might be important factors in infection developpemen t. K e y - w o r d s : Animal models, Virulence, Adherence, Slime, Toxines, Enzymes.
B1BLIOGRAPHIE
I.
2.
3.
4.
6.
7.
8. 9.
10. 11.
12. 13. 14.
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2 8 PF
iiF. M, HERWALDT L
rato , clinical and ep e
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of fibronectin as a ligand for the adherence of Staphylococcus
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4,4,~
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FACTEURS DE VIRULENCE DES STAPHYLOCOQUES COAGULASE-NEGATIFS* par E S C H U M A C H E R - P E R D R E A U * * et G. PETERS** RESUME
Malgr~ leur faible virulence clans les modules animaux, les staphylocoques coagulase n~gative (SCN) poss~dent un potentiel invasif et destructif comme on l'observe clans certains cas d'endocardites sur valves naturelles. Les caract~res de virulence de ces souches ne sont pas bien ~lucid~s. Une propri~t~ remar~ quable des SCN est d'une part leur forte adhesion aux biomateriaux, ce qui favoriserait leur colonisation, d'autre part l'~laboration d'une substance appel~e "slime" qui pertur~ berait les syst~mes de d~fense immunitaire et l'antibioth~rapie. Ces organismes produisent ~galement toute une gamme d'exoprot~ines tels prot~ases, est~rases, lipases, nucl~ases ainsi que des hemolysines dont le pouvoir pathog~ne peut ~tre anticip~. Mots ch~s : ModUles animaux, Virulence, Adherence, Slime, Toxines, Enzymes
A l'heure actuelle, on recense 24 esp~ces de staphyIocoques coagulase-n~gatifs souvent d~nomm~s par l'abr~viation SCN. 12 esp~ces colonisent la peau et les muqueuses humaines : S. epidermiclis, S. hae-
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molyticus, S. horninis, S. warneri, S. capitis, S. sirnulans, S. auricularis, ,9. schleiferi, S. lugclunensis, S. saprophyticus, S. xylosus et S. cohnii. Le r01e physiologique des SCN en tant que microflore de la peau et des muqueuses n'est pas encore suffisamment ~lucid~. On leur attribue un r01e dans le m~tabolisme des corps gras, ainsi que de barri~re primaire ~ l'invasion de microbes pathog~nes.
VIRULENCE DES SCN DANS LES MODELES A N I M A U X
La virulence de ces organismes a ~t~ ~valu~e dans diff~rents modules d'infections animales (1, 2, 3, 5, 13, 22, 24). En g~n~ral, la dose n~cessaire pour produire de telles infections est tr~s ~lev~e, ce qui indique que les SCN ne sont pas d'embl~e virulents. La plupart des modules d'infection exp~rimentales SCN n~cessitent soit la presence d'un corps ~tranger, soit des animaux nouveau-n~s. Par exemple, Namavar et al. (23) doivent injecter intrac~r~bralement entre 106 et 108 cfu chez les souris pour obtenir un effet l~thal chez 50% des animaux (LD55). Lowy et al. (22) utilisent 3,5 x 109 cfu ip en presence de mucine (hog gastric mucine) chez des souris nouveau-n~s pour d~clencher une p~ritonite. Christensen et al. (5) doivent injecter 109 cfu, en presence de corps ~tranger implant~ sous-cutanement pour obtenir la formation d'abc~s, lls y parviennent
S. epiclerrniclis est l'esp~ce pr~pond~rante des SCN trouv~s dans la colonisation et la pathologie humaine (21, 28). S. epiderrnidis, comme les autres SCN, est principalement un germe commensal et l'on suppose que la presence de certains facteurs de virulence encore mal connus est n~cessaire pour crier des infections chez l'hOte dit "normal" (23, 26). Un autre facteur favorisant les infections ~ SCN est l'~tat "immunocompromis". II existe chez le nouveau-n~ pr~matur~ ou le canc~reux neutrop~nique ou le patient souffrant d'affections h~matologiques * Communication pr~sent~e au colloque Pharmuka sur le th~me : ULes staphylococlues coagulase-n~gatifs et leur pathologie". Paris, 16 Mars 1990. ** Institut f/Jr Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der universit~t zu K61n. 5000 K61n 41, Goldenfelsstrasse 19 - 21, R.F.A.
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dans 53% des cas, si ils utilisent une souche productrice de slime, mais seulement dans 13% des animaux si la souche utilis~e n'est pas productrice de slime.
t~re promulgant l'adh6rence est un crit~re de virulence. Les m~canismes de l'adh~sion des SCN semblent diff~rents sl l'on consid~re, l'adh~sion in vitro ~ des surfaces inertes par rapport a l'adh~sion in vivo. L'adh6sion in vitro est surtout influenc6e par des facteurs hydrodynamiques (hydrophobie, charge de surface). Dans ce cas, seules les propri6t6s physico-chimiques du polym~re et de la souche sont d~terminants (16, 31). L'adh~sion in vivo r~pond des interactions sp~cifiques. Chez les staphylocoques dor~s on a d~montr~ la pr6sence de r~cepteurs pour la fibronectine ainsi que le fibrinog~ne (clumping factor) (34). Une affinit~ des SCN pour la fibronectine a ~galement ~t~ dC~montr6e chez la plupart des souches (15). Un nombre moindre de souches a une affinit~ pour le collag~ne, la laminine et m~me pour le fibrinog~ne (15, 33 - 35). II semble bien que la nature, la r~partition et la quantit~ des prot~ines s~riques recouwant le corps ~tranger d~pendent de la nature du polym~re ins~r~. Certaines observations ont d6montr~ que le nombre de bact6ries adh~rentes d~pendait proportionneUement de la quantit6 de fibrinonectine d6pos~e in vitro ou in vivo sur les polym~res (34).
Dans le module d'endocardite exp~rimentale du lapin, les doses requises varient entre 10 ~ et 109 (1). Chez le rat, l'inoculum n~cessaire est de l'ordre de 6 x 1@ (Christensen et al.), m~me module dans lequel les auteurs ne purent d6montrer une virulence accentube des souches productrices de slime (2). Dans un autre module mesurant le retard de prise de poids (19), Gunn a ~tudi¢~ la virulence de souches appartenant ~ huit esp~ces de SCN (13). 11 a conclu d'une part que seuls S. haemolyticus, S. epidermidis et S. saprophyticus ~taient des esp~ces virulentes, d'autre part clue le slime jouait un r~le primordial dans cette virulence. Une grande diff6rence de virulence rut n~hanmoins observ~e entre plusieurs souches d'une m@me esp@ce. Tous ces modules ont d6montr~ que, m@me dans des conditions "compromises", la dose infectieuse n~cessaire ~ une infection cliniquement apparente ~tait beaucoup plus ~lev~e pour les staphylocoques dor~s, ces derniers pouvant d~clencher une infection avec 100 cfu seulement (35).
ACTIVITE ENZYMATIQUE et VIRULENCE DES SCN FACTEURS DE VIRULENCE DES SCN
Jusqu'a present, peu de travaux se sont consacr~s syst~matiquement aux propriC~t~s biologiques des substances excr~t~es par les SCN (10, 11). De plus, la diff~renciation des SCN en de nouveUes esp~ces rend l'analyse de crit~res utilis~s dans les ~tudes plus anciennes difficile (23, 11). Les SCN produisent toute une gamme de prot~ines (30) dont l'h6te reconnait certaines comme antig~nes mis en ~vidence par une technique dites d'immunoblot" (resultats non-publi~s). Ces prot~ines jouent probablement un r~le important dans les propri~t~s biologiques que l'on attribuait au slime Iorsqu'il n'~tait purifi@ que partiellement (26). Les SCN produisent au moins deux h~molysines, alpha et delta (10, 20). Cette dernitre lyse non seulement les ~rythrocytes humains mais aussi les cultures de fibroblastes embryonnaires. Son r~le dans le developpement de l'ent~rocolite du nouveau-n~ est discut~. L'activit~ prot~olytique des SCN varie selon l'esp~ce (r~sultats non-publi~s). La Figure I montre la r~partition de l'activit~ prot~olytique parmi des SCN isol~es de catheters. La pr~sence d'est~rases et de lipases se retrouve dans la plupart des esp~ces (11) : elle est raise en rapport avec le r61e commensal de ces micoorganismes. Leurs r61es dans les l~sions cutan~es est real d~fini (32). Certaines souches produisent de la d~soxyribonucl~ase, du lysozyme (10, 11, 23). La production de ces enzymes n'est pas sp~cifique et leur r61e dans le m~canisme de virulence n'est pas ~lucid~.
Malgr~ leur faible virulence dans les modules animaux, on constate que n~anmoins chez certains patients le potentiel invasif et destructif de souches SCN est bien r~el, en particulier certains cas d'endocardites sur valves natureUes. La pathologie postmortem de ces affections a souvent montr~ la pr~sence de multiples l~sions des orifices mitraux et triscuspides, plus des abc~s annulaires ou du myocarde (4). Dans ces cas d'endocardites, l'esp~ce ,9. epidermidis sensu stricto n'a repr~sent~ qu'~ peine plus du tiers des staphylocoques impliqu~s (4) S. lugdunensis, une esp~ce r~cemment d~crite a ~t~ impliqu~e dans ce type d'infection. (8).
CARACTERES DE VIRULENCE ASSOCIES A LA SURFACE DES SCN
Une propri~t~ tr~s remarquable des SCN est leur forte adhesion ~ des biomat~riaux polymC~riques, biomat@riaux, m~talliques ou m~me a des ciments orthop~diques ce qui favoriserait leur colonisation par l'61aboration d'une substance appel~e slime (voir revue 25 et 30). L'adh~ion bact~rienne est considC~r~e comme la premiere ~tape de l'~tablissement d'un processus infectieux (12), ce qul laisse supposer que tout carac-
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- r~cepteur pour le fibrinog~
Facteurs extracellulaires
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S,epid S.capiS.warnS.homi S.hae S.8aprS,cohnS.xyloS.oimu 8urnageanl (1o oulture BHl-agaroae
positif
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negatif
FIGURE 1 Hydrolyse de caseine + gelatine
Staphylocoques coagulase-negatifs SCN, d'agglutiner les ~rythrocytes de moutons. Cette r~action peut ~tre bloqu~e par la presence d'oligosaccharides contenant la structure terminale [13.D.Galp-(1-4)-~.D.GlucNAcp-] (14). Ceci laisse supposer la presence de r~cepteurs sp~cifiques. De plus, des appendices sous formes de filaments (6) et plus rec~mment des structures ressemblant aux fimbriae des bact~ries Gram-n~gative ont ~t~ d~montr~s ~ la surface de ces organismes (29). De plus, cette espYce produit une ur~ase, dont la presence est reconnue comme un facteur de virulence chez d'autres microorganismes entrainant une alkalinisation de l'urine et facilitant ainsi la formation de calculs (17). La virulence des SCN clans un contexte clinique est sans doute multifactorielle. Diff~rentes analyses r~trospectives cliniques comparant l'~tat du patient et les propri~t~s des souches isol~es, ont d~montr~ une association significative entre la propri~t~ de production du slime et l'aptitude ~ causer une infection en particulier chez des patients porteurs de mat~riaux ~trangers (7, 38, 18). II reste cependant ddinir le r61e des diff~rents facteurs enzymatiques s~cr~t~s par les SCN Iors de colonisation des surfaces solides (25). Ces propri~t~s sont sans doute responsables de la virulence de certaines souches ; de plus, elles entra~nent souvent des ~checs de l'antibioth~rapie et perturbent peut-~tre les syst~mes de ddense immunitaire •
FACTEURS SPECIFIQUES
A S. SAPROPHYTICUS Cette esp~ce se distingue des autres SCN au niveau des facteurs de surface. S. saprophyticus adhere de prd~rence aux cellules ur~theliales et p~riur~thales (17). En temps que pathog~ne on ne la rencontre que clans le syst~me urogenital (17, 36). La majorit~ des souches sont capables, contrairement aux autres
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SUMMARY
V I R U L E N C E FACTORS O F COAGULASEoNEGATIVE STAPHYLOCOCCI
Despite their low virulence in animal models, coagulase negative staphylococci (CNS) have a potency to invade and destroy tissues, as can be seen in some cases of native valve endocarditis. Virulence factors of CNS have not been clearly identified so far. The ability to adhere to and colonise solid surface as well as to produce an extracellular slime substance which might interfere with the imrnunsystem of the host, as well as with therapy, has been related to virulence. The organisms also produce a wide variety of potential toxins and enzymes such as proteases, esterases, lipases, nuclease and haemolysins which might be important factors in infection developpemen t. K e y - w o r d s : Animal models, Virulence, Adherence, Slime, Toxines, Enzymes.
B1BLIOGRAPHIE
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