Fractionnement d'extraits lipidiques ciguatoxiques en milieu alcalin

BIOCHIMIE, 1976, 58, 479-484.

Fractionnement d'extraits lipidiques ciguatoxiques en milieu alcalin. J. P. VERNOUX (~) ~ et R. BAONIS ( * ' ) .

Inslitut de Recherches Mgdicales Louis Malard~, B.P. 30 - - Papeete Tahiti ..... Polyndsie frvncaise. (22-3-1975). Summary. - - A modification of the extraction procedure for obtaining ciguatoxic substances from the tissues of various poisonous reef fish has been developed. Rapid alkali treatment of the residue obtained at an early stage is efficient in separating the ciguatoxic fraction from toxic impurities which interfere with pharmacological tests. It is thus possibles to carry out a more precise dosage of the material separated in this way. Alkali treatment does not affect either the physiological activity in cats and mice of the ciguatoxic substances nor their behaviour in a preparative thin layer chromatography in a benzene-butanol system.

INTRODUCTION. En r6gion i n s u l a i r e t r o p i c a l e s6vit un s y n d r o m e c l i n i q u e d ' i n t o x i c a t i o n a l i m e n t a i r e cons6cutif la c o n s o m m a t i o n de poissons de r6cifs c o r a l l i e n s en p a r f a i t 6tat de f r a i c h e u r a p p a r t e n a n t h des esp6ces h a b i t u e l l e m e n I comestibles !1] : c'est la ciguatera. A l ' o r i g i n e de ce ph6nom6ne, p l u s i e u r s toxines dont l'une liposoluble, la ciguatoxine, a 6t6 r e t r o u v 6 e dans des espbces de n i v e a u x irop h i q u e s vari6s p r o v e n a n t de diverses r6gions du Pacifique t r o p i c a l [2]. Vu la c o m p l e x i t 6 a p p a r e n t e de sa structure, aucun test c h i m i q u e sp6cifique ne lui est ~ ce j o u r applicable. Son i d e n t i f i c a t i o n et son dosage duns les tissus p i s c i a i r e s passent d o n c p a r l ' u t i l i s a t i o n de tests p h a r m a c o l o g i q u e s i m p l i q u a n t l ' o b s e r v a t i o n des effets c l i n i q u e s induits p a r les extraits l i p i d i q u e s c o r r e s p o n d a n t s . P o u r o b t e n i r ces extraits, diverses m6thodes assez longues ant 616 propos6es [3, 4]. P a r souci de simplification, nous avons essay6 de s6parer pr6c o c e m e n t les i m p u r e t 6 s t o x i q u e s des p r o d u i t s s p 6 c i f i q u e m e n t ciguatoxiques. Les modalit~s du f r a c t i o n n e m e n t utilis6 et son int6r6t font l'objet du pr6sent travail. M A T E R I E L ET METHODES. L~s POISSONS. Ils ant 6t6 p6ch6s en m i l i e u r 6 c i f o - l a g u n a i r e clans d i v e r s e s zones toxicogbnes de Polyn6sie Fran~aise. Ils a p p a r t i e n n e n t tous h des esp6ces h p o t e n t i e l ciguat6rig6ne connu. Nous avons choisi deux poissons m i c r o p h a g e s , un c h i r u r g i e n (Cteno(') Ing~nieur-biochimiste I.N.S.A. ( " ) M~decin du Service de Sant6 des ArmSes --Docteur 6s Sciences biologiques. A qui route correspondance doit ~tre adress~e.

chaetus striatus), un p e r r o q u e t (Scarus gibbus) et deux p r 6 d a t e u r s i c h t y o p h a g e s , un lutjan (Lutjanus bohar), et une 1ache (Plectropomus leopardus). Le poisson t6moin est une d a u r a d e p61agique de l'esp6ce Corgphenus hippurus, jamais ciguatoxique. Selon leur taille, les poissons sont c o n d i t i o n n6s soit i n d i v i d u e l l e m e n t , soit en lots de p l u s i e u r s i n d i v i d u s de la m6me esp6ce p o u r o b t e n i r un poids de mat6riel de d6part constant. La pr6par a t i o n des 6 c h a n t i l l o n s ob6it aux modalit6s suivantes : s6paration des muscles et des viscbres digestifs, cuisson p e n d a n t une h e u r e h la v a p e u r d ' e a u clans un a u t o c u i s e u r h 112°C, homog6n6isation au h a c h e - v i a n d e (Braun, K G Z 2) et cong6lation h - - 2 0 ° C jusqu'h ntilisation. LES ANIMAUXTESTS.

Le chat. La c h a i r cuite des poissons, h l ' e x c l u s i o n des visc6res, a ~t6 test~e chez des a n i m a u x de 1 kg e n v i r o n p a r vote orale s u i v a n t une t e c h n i q u e d6jh d~crite [5]. Certains r6sidus obtenus lors du trait e m e n t c h i m i q u e sont in]ect6s p a r vote i n t r a p 6 r i ton6ale chez le c h a t o n de 6.0'0 g.

La sonris. La toxicit6 des r6sidus d ' e x t r a c t i o n est test6e s y s t 6 m a t i q u e m e n t apr6s solubilisation pr6a]able dans l ' h u i l e d ' o l i v e v i e r g e sur des souris b l a n c h e s de 20 g. On r6alise une s6rie de dilutions de facteur 0,838. C h a c u n e d ' e n t r e elles est inject6e p a r vote i n t r a p 6 r i t o n 6 a l e h deux a n i m a u x . On d6finit la dose l~tale m i n i m a l e (D.L.M.) c o m m e 6rant ]a plus faible dose c a p a b l e de tuer les d e u x souris en 24 heures. Nous avons e m p l o y 6 ce crit6re plut6t que la D.L. 50 p o u r des raisons d ' 6 c o n o m i e

480

J. P. V e r n o u x el R. Bagnis.

et p a r c e que des 6tudes c o m p a r a t i v e s ant6rieures nous avaient m o n t r 6 n n e fiabilit6 s;fffisante. On e x p r i m e la D.L.M. en mg de p r o d u i t p a r oo de souris. Afin de c o m p a r e r la toxicit6 de divers 6chantillons tissulaires, on d 6 t e r m i n e le poids m a x i m a l de souris tu6 r a p p o r t 6 ~ 1 g de tissu c o r r e s p o n Poids R6sidu (rag) dant trait6, h savoir Ie r a p p o r t 1000 D.L.M. e x p r i m 6 en unit6s-Souris, U.S. (1 g de souris tu6 6quivalent h 1 U.S). PIiEPARATION D'EXTHAITS LIPIDIQUES.

Aprbs d6cong6lation, le tissu cuit est extrait p a r les solvants organiques j u s q u ' a u stade r6sidu m6t h a n o l c o m m e i n d i q u 6 d6jh par L e t o u r n e u x et Bagnis [6]. Voici le protocole pr6cis des diff6rentes op6rations r4alis6es : -le tissu p i s c i a i r e cuit (1 kg) est homog6n6is6 trois lois p e n d a n t trois m i n u t e s dans un m i x e u r i n d u s t r i e l avec la m6me quantit6 (en volume) d'ac6tone ; apr6s filtration le r6sidu o r g a n i q u e est rejet6 et la phase ac6tone eonserv6e une n u i t - - 2 0 ° C ; le pr6cipit6 qui a p p a r a i t est 61imin6 p a r filtration h - - 2 0 , ° C et le filtrat, concentr6 sous vide partiel, d o n n e u n extrait aqueux appel6 r6sidu ac6tone. Le volume du r6sidu ac6tone est compl6t6 avec de l'eau distilMe p o u r o h t e n i r u n litre au total par kg de tissu trait6 ; retie suspension aqueuse 16g6rement acidifi6e (0,01 M e n acide ae6tique) est extraite trois fois p a r deux volumes d'6ther (oxyde d i 6 t h y l i q u e ) ; les phases 6ther r6unies sont concentr6es sous vide partiel ce qui d o n n e u n r6sidu 6ther. Celui-ci solubilis6 p a r quatre fois son poids (en volume) d'ac6tone est aussit6t r e f r o i d i h --21}°C clans la carboglace ; u n pr6cipit6 apparait, il est s6par6 p a r filtration - - 2 0 ° C sur bfichner, et, a v a n t d'6tre rejet6, il est trait6 deux autres fois p a r l'ac6tone dans les mSmes c o n d i t i o n s ; les filtrats ac6tone r6unis sont concentr6s sous vide partiel ce qui d o n n e un nouveau r6sidu ac6tone. Ce d e r n i e r est solubilis6 sons p e r c o l a t i o n h l'azote par quatre fois son poids fen volume) de m 6 t h a n o l ; l ' i n s o l u h l e est s6par6 p a r filtration sur laine de verre puis trait6 d eux autres fois p a r le m 6 t h a n o l dans les m6mes conditions. Les filtrats r6unis sont refroidis h ---fi5°C dans la carboglace ; u n pr6cipit6 apparait, il est s6par6 p a r filtration sur b i i c h n e r / t - - 6 5 ° C et a v a n t d'etre rejet6 il est trait6 deux autres fois p a r le m6thanol dans les m6mes conditions. Les filtrats r 6 u n i s sont lav6s trois fois p a r le m6me vo!ume d ' h e x a n e et seule la phase m6than01 est conserv6e ; e l l e est 6vapor6e h sec sous vide p a r t i e l jusqu'h o b t e n t i o n d ' u n r6sidu appel6 r6sidu m6thanol.

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 4.

FtL%_CTIONNEMENT DES EXTRAITS TRAITEMENT ALCALIN RAPIDE.

LIPIDIQUES PAR

Les c o n d i t i o n s du t r a i t e m e n t alcalin r a p i d e sont celles de la saponification classique d6crite p a r FAURE [7] mis ~ p a r t le chauffage et le temps de contact. Trois fractions p e u v e n t 6Ire s6par6es : insaponifiable (plus insaponifi6 duns le cas pr6sent), acides gras et hydrosoluble. Voici le d6tail des diff6rentes ~p6ratio.ns r6alis6es : - - l e r6sidu m 6 t h a n o l est solubilis6 par quar a n t e fois son poids (un volume) de potasse h 5 p. cent dans r 6 t h a n o l h 90 °, on ajoute ensuite trois volumes d'eau et le tout est extrait 3 fois p a r quatre volumes d'6ther. Les douze volumes d'6ther sont r 6 u n i s et lav6s u n e fois avec trois volumes puis deux vohtmes d'eau distill6e ; la phase 6ther a i n s i lav6e est 4vapor6e h see sous vide partie] ce qui c o n d u i t au r6sidu i n s a p o n i f i a b l e - insaponifi6. La phase h y d r o a l c o o l i q u e basique est ac.idifi6e jusqu'h pH 1 p a r l'acide e h l o r h y d r i q u e (d -----1,19) dilu6 au tiers dans l'eau distill6e ; les acides gras, alors insolubilis6s sont extraits de la phase h y d r o aleoolique acide trois fois p a r le m6me volume d'~ther ; la phase 6ther est large p a r de l'eau distill6e jusqu'h p H n e n t r e ; il ne reste plus qu'h 6vaporer l'6ther h sec sous vide partiel p o u r o b t e n i r u n r6sidu acide gras. Le r6sidu hydrosoluble c o r r e s p o n d au r6sidu d ' 6 v a p o r a t i o n h sec sous vide p a r t i e l de la phase restante (eaux de lavage comprises).

Lors de l ' e x t r a c t i o n et du f r a c t i o n n e m e n t des extraits lipidiques, toutes les phases ont 6t6 6vapor6es sous p r e s s i o n r6duite avec u n Rotavapor Bfichi h une t e m p 6 r a t u r e ne d6passant jamais 4 5 ° C ; u n e b o n n e d 6 s h y d r a t a t i o n des r6sidus est obtenue p a r e n t r a i n e m e n t r6p6t6s avec d e l'6thanol ; certains de ces r6sidus doivent 6tre chauff6s h 45°C p o u r p o u v o i r 6tre solubilis6s dans l'lmile d'olive lors de l ' i n j e c t i o n . CHROMATOGRAPttIE EN COUCHE MINCE. (C.C.i~'[.).

Les p r o d u i t s ciguatoxiques ne p e u v e n t (,tre r6v616s sp6eifiquement que p a r leur action chez l ' a n i m a l aussi ne peut-on les 6tudier q u ' e n C.C.M. pr6parative. Celle-ci a lieu sur des plaques (20 × 2:0, era) de Silicagel G 60 F 254 de 2 m m d'6paisseur (Merck). Une quantit6 de p r o d u i t ciguatoxique c o r r e s p o n d a n t h 200 D.L.M. soit de quoi tuer 10 souris de 20 g est d6pos6e sur u n e ou plusieurs plaqu,es dans la limite des 40 mg retenus comme charge m a x i m a l e d ' u n e plaque. P o u r le d 6 v e l o p p e m e n t on utilise u n e c u r e s t a n d a r d (Shandon) dont les parois sont recouvertes de p a p i e r c h r o m a t o g r a p h i q u e 6pats : e l l e est satur6e

Etude

biochimique

des toxines

au pr6alable deux heures p a r le solvant benz6nebutanol (75:2.5). La m i g r a t i o n dans le solvant a lieu sur 10 cm h 25°C ce qui c o r r e s p o n d "/ une h e u r e de d~LveIoppement. Aprbs a v o i r effectu6 un contr61e de l'aspect du c h r o m a t o g r a m m e aux U.V. on le f r a c t i o n n e en un c e r t a i n n o m b r e de bandes parall61es n ' e x c 6 d a n t pas un c e n t i m 6 t r e de largeur. Chaque b a n d e est r6cup6r6e par gratlage. Elle est 61u6e deux fois p a r 50 ml de m61ange m6t h a n o l - c h l o r o f o r m e (8.0:20) et une lois p a r 50 ml de m6thanol sur v e r r e fritt6 de porosit6 3. Aprbs

481

marines.

RESULTATS. L ' e n s e m b l e des donn6es q u a n t i t a t i v e s r e c u e i l l i e s est consign6 darts le tableau I e t illustr6 p a r la figure 1. TEST CHAT. Les r6actions c l i n i q u e s h l ' i n g e s t i o n p a r le chat d ' u n e quantit6 de c h a i r 6quivalente ~ 10 p. cent de son poids vif, out d6jh 6t6 d6crites [9]. Les s y m p t 6 m e s n e u r o l o g i q u e s observ6s p e r m e t t e n t de d i s t i n g u e r des poissons comestibles (absence de

TABLEAU I.

Caract~risation

des

r~sidus obtenus par leur poids, leur D.L.M. et leur toxicit~ Comvaraison a v e c la c i g u a t o x i c i t d [~line i n i t i a l e .

chez

la s o u r i s .

R6sidu m6thanol Iractionn6 en R6sidu methanol Toxicit6 de la chair chez le chat

Poisson et tissu exlrait (t000 g}

ll6sidu insaponifiable insaponifi6 (')

R:sidu acides gras !')

'7, ~

C. strialus . . . . . . . . P. leopardus . . . . . . .

Fortement v~n6ncux

6

]10yennemenl v6n~neux

12,1

S.

gibbus . . . . . . . . .

P.

leopardus . . . . . .

8,3

m

L . bohar . . . . . . . . . .

16,1

P . leopardus . . . . . .

Peu v ~ n ~ n e u x

60

Comestible

80 48,6

C. strialus . . . . . . . .

20,4

C.

hippurus . . . . . . .

T~moin

S.

gibbus . . . . . . . . .

Fortement v ~ n ~ n e u x

95

Mo~'euuemcntv6n6neux

67,4

P . leopardus . . . . . . .

Peu v6n6neux

64,4

C. slriatus . . . . . . . .

Comestible

64

C. slrialus . . . . . . . .

.i

(*) Le poids et la toxicit6 de ces deux r6sidus sontexprim(~s en p. cent de ceux du r6sidu m6thanol correspondant.

6 v a p o r a t i o n h sec sous pression r6duite, la totalit6 de e h a q u e r6sidu est r e p r i s e p a r un m i l l i l i t r e de T w e e n 60 (Wako C o m p a n y ) . On injecte cehfi-ci nne seule souris et on observe la s y m p t o m a t o l o g i e induite. La pr6sence de c h o l i n e dans la f r a c t i o n h y d r o soluble est 6tudi6e, p a r c o m p a r a i s o n avec un t6moin, sur des p l a q u e s a n a l y t i q u e s de celhflose m i c r o c r i s t a l l i n e (Camag) en utilisanl les t e c h n i ques d6crites p a r Yasumoto et E n d o [8]. B I O C H I M I E , 1976, 58, n ° 4.

signes), peu v6n6neux ( i n c o o r d i n a t i o n m o t r i c e 16g6re), m o y e n n e m e n t v6n6neux (ataxie l o c o m o t r i c e i m p o r t a n t e ) , f o r t e m e n t v6n6neux (mort de l'animaD. ETUDE DU POIDS ET DE LA TOXICITE DES DIVERS RESIDUS OBTENUS. Rdsidu

m~thanol.

Deux groupes i n d 6 p e n d a n t s des esp6ces 6tudi6es p e u v e n t 6tre distingu6s : celui des ex~raits

482

J. P. V e r n o u x

m u s c u l a i r e s h r e n d e m e n t p o n d 6 r a l faible (de l ' o r d r e de I h 5 p o u r mille) et celui des extraits v i s c 6 r a u x h r e n d e m e n t plus 61ev6 (de l ' o r d r e de 9 14 p o u r mille). Les D.L.M. 61ev6es en g6n6ral t6moignent du caract~re trbs i m p u r du r6sidu m6thanol. Mais alors que la toxicit6 des extraits m u s c u l a i r e s i n d i q u e une c o r r e s p o n d a n c e assez b o n n e avec la c i g u a t o x i c i t 6 f61ine initiale, celle des extraits v i s c 6 r a u x ne m o n t r e aucune relation. Les s y m p t 6 m e s obs.erv6s chez la souris sont variables, soit v o i s i n s de ceux d6crits plus loin p o u r le r6sidu i n s a p o n i f i a b l e - insaponifi6 (extraits musculaires v6n6neux chez le chat) soit de ceux d6crits p o u r le r6sidu acides gras (extraits musculaires comestibles et extraits de viscbres). Cette absence d'homog6u.6it6 dans la r6ponse c l i n i q u e m o n t r e q u ' a u stade r6sidu-m6thanol, la v a l e u r des tests p h a m a c o l o g i q u e s peut 6tre fauss6e p a r la pr6sence d ' i m p u r e t 6 s toxiques.

To×icit6

souris(u.s.)

el R. B a g n i s .

ni6re i m p o r t a n t e et l'on r e t r o u v e p o u r ceux-ci p r e s q u e la totalit6 de la toxicit6 du r6sidu m6thanol h o m o l o g u e . I1 y a cette fois-ci une tr6s b o n n e corr61ation entre la ciguatoxicit6 f~line et la toxicit6-souris des r~sidus i n s a p o n i f i a b l e s - i n s a p o n i fibs quel que soit l ' 6 c h a n t i l l o n tissulaire initial. Toutefois p o u r un n i v e a u de ciguatoxicit6 donn6 chez le chat, ]es extraits v i s c 6 r a u x sont en g6n6ral plus toxiques que les extraits de muscle. Le tableau c l i n i q u e chez la souris et le j e u n e chat est homog6ne, p o u r t o u s ] e s extraits h l ' e x c e p t i o n du p o i s s o n t6moin, C. h i p p u r u s et analogue h celui i n d u i t p a r la c i g u a t o x i n e purifi6e de S. g i b b u s utilis6e c o m m e contr61e [101 (*). II y a d o n c c o n c e n t r a t i o n des p r o d u i t s ciguatoxiques dans ]e r6sidu insaponifiable - insaponifi6 p o u r les poissons (h l ' e x c e p t i o n de C. h i p p u r u s ) . Le r e n d e m e n t est satisfaisant h p a r t i r de filets m u s c u l a i r e s v6n6neux, peu ou non c o n t a m i n d s p a r des i m p u r e t 4 s to xiques. Remarque :

Ces r6sultats ne sont valables que p o u r les r6sidus insaponifiable-insaponifi6s extraits h l'6ther. Ceux extraits h l ' h e x a n e ne sont jamais ciguatox i q u e s (la c i g u a t o x i c i t 6 peut c e p e n d a n t ~tre retrouv6e e n t i 6 r e m e n t p a r e x t r a c t i o n ult6rieure l'6ther). R ~ s i d u a c i d e s gras.

/

~'/

..

z

oz. o

Toxicit~ chat

pv

mv

fv

FIG. 1. - - Relations entre les toxieitds souris respectives des r~sidus, mdthanol (O 0), insaponifiableinsaponifi6 (O-- : - - O ) , aeides gras (A-- --A) en dehelle semi logarithmique pour les muscles (m) d'une part, les vise~res digestifs (V) d'autre part ct la ciguatoxicit6 museulaire initiale (dehelle arbitraire) ~valude au test chat (C, comestible; pV, mV et fV, peu moyennement et fortement vdndneux).

R~sidu insaponifiable - insaponi[i&

Le p o i d s r6cup6r6 est g6n6ralement p e u 61ev6 (10 h 3,6 p. cent du p o i d s du r~sidu m 6 t h a n o l c o r r e s p o n d a n t ) quels que soient le tissu et l'esp6ce 6tudi6s. Dans le cas des extraits de c h a i r v6n6neuse chez ]e c h a t la D.L.M. d i m i n u e d ' u n e maBIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 4.

Les v a r i a t i o n s i m p o r t a n t e s dans le r e n d e m e n t p o n d 6 r a l p a r r a p p o r t au r6sidu m 6 t h a n o l corresp o n d a n t (17 ~ 78 p. cent), i n d 6 p e n d a n t e s de l'esp~ce et des tissus, sont peut 6tre dues ~ une diff6rence de c o m p o s i t i o n en acides gras volatils. La m~me variabilit~ se r e t r o u v a n t darts la toxicitY, n ' i n d i q u e a u c u n e r e l a t i o n avec la ciguatoxicit6 f61ine ; d ' a i l l e u r s p o u r les extraits visc6raux, la c o u r b e acides gras r a p p e l l e f o r t e m e n t celle des r6sidus m 6 t h a u o l p o u r ]aquelle la m~me r e m a r q u e avait ~t~ faite. Les effets p h y s i o l o g i q u e s sur la souris c o m m e sur le j e u n e chat sont aussi polym o r p h e s . Aux doses l~tales, ils se t r a d u i s e n t e s s e n t i e l l e m e n t p a r des p a r a l y s i e s m u s c u I a i r e s i r r 6 v e r s i b l e s n ' e n t r a n t pas dans le c a d r e c l i n i q u e ciguatoxique. Les i m p u r e t 6 s t o x i q u e s se r e t r o u v e n t d o n c concentr6es dans le r6sidu acides gras. I cur pr6sence (*) Aux doses 16tales, on note dans l'ordre ehronologique : - - chez la souris : hypodynamie, diarrh6e, 6reetion et eyanose du p6nis chez le mtde, dyspn6e, incoordination motriee, hypers~cr~tion laerymale, mort dans un tableau d'insuffisance reslalratoire dans les 24 heures. - - chez le chaton : vomissement, diarrh6e, dyspnde, taehycardie, tr6mulations linguales, hypers6erdtion salivaire, ataxle loeomotrice, d6shydratation et mort en 48 h 72 heures.

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E t u d e b i o c h i m i q u e des toxines m a r i n e s . n'est n u l l e m e n t i m p u t a b l e au t r a i t e m e n t a l c a l i n puisqu'elle a d6jh 6t6 not6e p r 6 c 6 d e m m e n t p o u r les r6sidus m6thanol d ' 6 c h a n t i l l o n s h forte t e n e u r en acides gras (muscles comestibles et visc~res). Mieux, lors &e la p r 6 p a r a t i o n du r6sidu m6lhanol, les pr6cipit6s obtenus h basse t e m p 6 r a t u r e dans l'ac6tone et le m6thanol i n d u i s e n t aussi les m6mes sympt6mes (*).

R~sidu hydrosoluble. L ' a p p r 6 c i a t i o n du poids et de la loxicit6 de ce r6sidu est g6n6e p a r u n e forte t e n e u r en c h l o r u r e de potassium r6sultant de la r6action acide-base. Pour s u r m o n t e r cet i n c o n v 6 n i e n t le r6sidu h y d r o soluble a 6t6 6puts6 successivement p a r l'6ther et par l'6thanol et l'on obtient les deux ¢ sous-r6sidus >> corresponffants. Chez la souris Ie ~> entra~ne les s y m p t 6 m e s d6crits p o u r le r6sidu acide gras mats b e a u c o u p moths marqu6s. Le ,.~sous-r6sidu 6thanol>> i n d u i t chez la souris u n s y n d r o m e hypersecr6toire, u n 6tat convulsif, puts soil la mort en dix minutes, soit u n e r 6 c u p 6 r a t i o n rapide. La symptomatologie est due h la choline, dont la pr6sence a effectivement pu 6tre confirm6e p a r c h r o m a t o g r a p h i e a n a l y t i q u e en couehe mince. La choline n ' 6 t a n t pus retrouv6e en milieu neutre, son a p p a r i t i o n dolt donc r6sulter de l ' h y d r o l y s e de certains lipides, possible dans les c o n d i t i o n s alcalines douces utilis6es [71. Le r6sidu h y d r o s o l u b l e c o n t i e n t d o n c entre autres de la choline et des acides gras n o n extraits. ETUDE

P A n C H R O M A T O G R A P H I E EN COUCHE MINCE

(C.C.M.). La m i g r a t i o n des substances ciguato.xiques en C.C.M. p r 6 p a r a t i v e sur plaque de Silicagel G d'6paisseur 2 m m a 6t6 6tudi6e seulement p o u r les 6 c h a n t i l l o n s m u s c u l a i r e s au stade r6sidu m6t h a n o l et r~sidu insaponifiable-insaponifi6. Le syst6me b e n z ~ n e - b u t a n o l (75:25) r6.v~le alors u n e b a n d e ciguatoxique c o m m u n e /~ m i g r a t i o n lente (Rf 0,30 ~ 0,40.) c e r t a i n e m e n t analogue /~ la ciguatoxine d6j~ isol6e [3] c o m m u n e elle aussi ~ plusieurs poissons [2]. I1 p e r m e t 6galement de mettre en 6vidence deux autres b a n d e s i n d u i s a n t aussi des effets ciguatoxiques. L ' u n e tr~s nette, /~ migration r a p i d e (Rf 0,57 ~ 0,67) n'est retrouv6e que dans l'extrait de muscle de S. gibbus. L'autre (Rf 0,10 ~ 0,20) n'est pr6sente que duns les extraits m u s c u l a i r e s de P. leopardus, C. striatus et L.

bohar. (*) Un traitement alcalin rapide peut done ~tre effleaee avant le stade r~sidu m~thanol, ainsi un r6sidu-~ther pr~par~ h partir de 500 grammes de chair de S. gibbus, lav~ h l'hexane a donn~ 50 mg de r~sidu insaponifiable-insaponifi~ de D.L.M. ---- 0,007 mg/g.

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Ces r6sultats sont valables aussi bien p o u r le r6sidu m 6 t h a n o l que p o u r le r6sidu insaponifiableinsaponifi6 c o n f i r m a n t que la structure globale des p r o d u i t s ciguatoxiques est peu ou pas affect6e p a r un t r a i t e m e n t alcalin rapide.

DISCUSSION ET CONCLUSION. Duns la limite des e x p 6 r i m e n t a t i o n s d6crites, cette 6rude i n d i q u e qu'h u n static r e l a t i v e m e n t pr6coce lors de l ' e x t r a c t i o n de p r o d u i t s ciguatoxiques il y a c o n t a m i n a t i o n des r6sidus p a r des impuret~s toxiques associ6es aux acides gras. Un t r a i t e m e n t alcalin r a p i d e par le biais de quetques r6actions chimiques (lib6ration partielle d'acides gras et de choline, f o r m a t i o n de savons) p e r m e t leur 61imination. Les mol6cules ciguatoxiques se r e t r o u v e n t concentr6es dans u n e phase off leur action p h a r m a c o l o g i q u e est toujours pr6pond~rante. On peut ainsi 6valuer d ' u n e m a n i ~ r e plus pr6cise el r e l a t i v e m e n t rapide, la ciguatoxicit6 de tissus de poissons de r6cif. La m6thode propos6e est alors tr~s conseill~e p o u r tester les visc~res et d6celer une ciguatoxicit6 potentielle masqu6e / t c e stade pr6coce de l'extraction. Au cours de cette ~tude nous avons aussi confirm6 plusieurs donn~es ant6rieures relatives h la ciguatoxine h savoir : --ses propri6t6s p h y s i c o c h i m i q u e s lors de l ' e x t r a e t i o n telles que r6sistance h la c h a l e u r /~ l'6tat brut, solubilit6 h l'ac~tone, l'6ther et le m6thanol, insolubilit6 h l ' h e x a n e [3, 11, 12]. --- son action p h a r m a c o l o g i q u e sur le chat et la souris [3, 4, 9], sa pr6sence en quantit6 r6duite duns la chair de poissons de r6cifs, comestible p o u r le chat [13], -

-

- - son existence chez P. leopardus. C. striatus, S. gibbus et L. bohar [14] mats pus ehez C. hippurus. Gr~tce ~ l ' u t i l i s a t i o n en c h r o m a t o g r a p h i e en couche m i n c e p r 6 p a r a t i v e d ' u n systbme de d6vel o p p e m e n t neutre benz~ne-butanol, pr6conis6 p o u r les alcaloides [15], d'autres mol6cules ciguatoxiques ont 6t6 relrouv6es chez les quatre poissons 6tudi6s. Jusque lh, cette variabilit6 n ' a v a i t 6t6 rapport6e que pour S. gibbus [10] et C. striatus [4].

Reraereiements. Nous tenons h exprimer notre gratitude h nos collaborateurs du laboratoire de Biochimie, de l'Animalerie et h nos pSeheurs : M'le Hugon, M~es Chungue et Thevenin, MM. Drollet, Pliehart, Bennett, Nanai et Jaequet.

J. P. Vernoux et R. Bagnis.

484 R~SUME.

Lors de l'extraction de produits ciguatoxiques h p a r t i r de tissus de divers poissons de r6cif, l'application d'un t r a i t e m e n t alcalin rapide h des r6sidus obtenus h u n stade pr6eoce est efficace pour sSparer la f r a c t i o n eiguatoxique des impuret6s toxiques oui f a u s s e n t souvent la valeur des tests pharmacologiques. Un dosage biologique plus pr6cis est alors possible. Un tel t r a i t e m e n t n'affecte ni t'activit6 physiologique chez le chat e t l a souris, ni ]e e o m p o r t e m e n t ehrom:atographique en eouche mince pr6parative dans nn syst6me benz6n,e-butanol (75:25) des mol6eules eiguatoxiques. BIBLIOGRAPHIE. 1. Bagnis, R. (1969) Mise au p o i n t sur les intoxications par poissons v4n6neux de type ciguatera, Presse Mddicale, 77 (2), 59-60. 2. Hashimoto, Y. (1974) Proceedings of the Congress on drugs of the sea (Porto-Rico) in press. 3. Scheuer, P. J., T~kahashi, W., Tsutsumi, J. & Yoshida, T. (19'67) Science, ~55, 1267-1268.

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 4.

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