Genotipos del virus de la hepatitis B en portadores crónicos en la isla de Gran Canaria. Características clinicoepidemiológicas

ORIGINALES

Genotipos del virus de la hepatitis B en portadores crónicos en la isla de Gran Canaria. Características clinicoepidemiológicas María José Pena-Lópeza, Pino Suárez-Bordóna, Diana García-Bardecia, José Luis Rodríguez-San Románb, María Carmen Pérez-Gonzáleza y Bernardo Lafarga-Capuza a

Servicios de Microbiología y bDigestivo. Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín. Las Palmas de Gran Canaria. España.

OBJETIVO. Conocer la distribución de genotipos del virus de la hepatitis B (VHB) de pacientes españoles portadores crónicos y su relación con las características epidemiológicas, la presencia de antígeno e, el nivel sérico del ADN viral (CV) y la alteración de la función hepática. MÉTODOS. Se estudiaron 108 pacientes. El genotipo se realizó en 84 mediante INNO-LiPA HBV GenotypingInnogenetics. RESULTADOS. De los pacientes, 41 fueron mujeres y 67 hombres, con una edad media de 44,1 años. Las fuentes de transmisión fueron: contacto familiar, 26 pacientes (24,1%); transfusiones, 10 (9,3%); promiscuidad sexual, 9 (8,3%); adicción a drogas parenterales, 3 (2,8%); accidente sanitario, 2 (1,8%) y en 58 (53,7%) se desconocía. Cuarenta pacientes (37%) presentaron una hepatitis crónica (HC) y 68 (63%) eran portadores asintomáticos. Sólo en 45 pacientes se conocía el tiempo de evolución de la infección y en 42 fue mayor de 10 años. Cien pacientes (92,6%) presentaron antígeno e-negativo y 90 (83,3%) tuvieron ADN viral detectable. La distribución de genotipos fue: A, 46 (54,8%); D, 20 (23,8%); F, 2 (2,4%); C, 1 (1,2%), coinfección A-G, 7 (8,3%); A-D, 4 (4,8%); D-G, 2 (2,4%); A-C, 1 (1,2%) y A-D-G, 1 (1,2%). No se observaron diferencias significativas entre genotipos. Se observó una tendencia en el genotipo A a presentar HC cuando la CV 10 5 copias/ml (28,9% de los casos) frente al genotipo D (7,7%) (p no significativa). CONCLUSIONES. En nuestra área predomina el genotipo A, D y las coinfecciones con G. Observamos una tendencia del genotipo A a producir una mayor actividad inflamatoria cuando la CV 10 5 copias/ml. Palabras clave: Virus B de la hepatitis. Genotipo. Carga viral.

Hepatitis B virus genotypes in chronic carriers on the island of Gran Canaria. Clinical and epidemiological characteristics OBJECTIVE. To investigate the prevalence of hepatitis B virus (HBV) genotypes in Spanish hepatitis B carriers, and to study the differences in epidemiological characteristics, e antigen (HBeAg) seroconversion, serum DNA viral levels (VL) and liver function alterations. METHODS. This study included 108 patients. Genotyping was carried out in 84 with the INNO-LiPA HBV genotyping assay (Innogenetics). RESULTS. There were 41 women and 67 men, with a mean age of 44.1 years. The source of transmission was family contact in 26 patients (24.1%); transfusions in 10 (9.3%); sexual promiscuity in 9 (8.3%), intravenous drug use in 3 (2.8%), health care accident in 2 (1.8%); and unknown causes in 58 (53.7%). Forty patients had chronic hepatitis and 68 (63%) were healthy carriers. The time of evolution of the infection was known in only in 45 patients, and was over 10 years in 42 of them. One hundred patients (92.6%) were HbeAg-negative and 90 (83.3%) had detectable viral DNA. Genotype A was present in 46 (54.8%), D in 20 (23.8%), F in 2 (2,4%), C in 1 (1.2%), A-G coinfection in 7 (8.3%), A-D in 4 (4.8%), D-G in 2 (2,4%), A-C in 1 (1.2%), and A-D-G in 1 (1.2%). There were no significant differences between genotypes. A trend towards an association was found between VL 10 5 copies/mL and the presence of chronic hepatitis in genotype A (28.9%) as opposed to genotype D (7.7%) (p non significant). CONCLUSIONS. HBV genotypes A and D, and coinfections with G are predominant in our area. Genotype A showed a tendency to produce greater inflammatory activity when VL was 10 5 copies/mL. Key words: Hepatitis B virus. Genotype. Viral load.

Introducción

Correspondencia: Dra. M.J. Pena-López. Servicio de Microbiología. Hospital de Gran Canaria Dr. Negrín. Barranco de la Ballena, s/n. 35020 Las Palmas de Gran Canaria. España. Correo electrónico: [email protected] Manuscrito recibido el 24-8-2004; aceptado el 20-1-2005.

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El virus de la hepatitis B (VHB) se ha clasificado en ocho genotipos principales (A-H) que presentan una distribución geográfica diferente 1,2. En distintos estudios se ha documentado que los genotipos pueden influir en la progresión de la enfermedad hepática 3 y, en algunos casos, se ha sugerido que pueden tener distinta respuesta al tratamiento antiviral 4,5. La mayor parte de los estudios Enferm Infecc Microbiol Clin 2005;23(7):415-8

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publicados se han realizado en áreas de alta endemicidad, en donde predominan los genotipos B y C, mientras que en Europa, zona de baja endemia con predominio de otros genotipos, los estudios son escasos. Así, se ha documentado que los pacientes con infección por el genotipo C presentan una menor seroconversión espontánea del antígeno e 6,7 (HBeAg) y un mayor potencial para causar enfermedad 8 con respecto al B. Además, existen pruebas clínicas de que los pacientes infectados con el genotipo C presentan una mayor evolución a cirrosis 9 y mayores complicaciones en el hepatocarcinoma 10; sin embargo, los infectados con el genotipo B manifiestan una mayor mortalidad por insuficiencia hepática secundaria a exacerbaciones agudas de la infección crónica11. Por otro lado, en zonas en donde predominan otros genotipos, se ha observado, en algunos casos, que el genotipo D se asocia con una mayor gravedad de la enfermedad y desarrollo de hepatocarcinoma que el genotipo A12, un aumento de la recurrencia postrasplante13 y, a veces, una elevación de la mortalidad 14; sin embargo, en otros estudios se ha observado una mayor seroconversión espontánea que en los genotipos A y B 7,15. Debido a la posible influencia del genotipo en la historia natural de la infección crónica por el VHB y a los escasos trabajos publicados que relacionan las características de la enfermedad hepática con el genotipo viral en pacientes europeos, hemos realizado el presente estudio con dos objetivos: a) conocer la distribución de genotipos del virus de la hepatitis B en una serie de pacientes españoles portadores crónicos que residen en la isla de Gran Canaria, y b) analizar la relación del genotipo del VHB con las características epidemiológicas de los pacientes, la detección de HBeAg, el nivel sérico del ADN del VHB (ADN-VHB) y la alteración de la función hepática.

Métodos Pacientes Se incluyeron en el estudio 108 pacientes españoles portadores crónicos del VHB que fueron atendidos en una unidad de hepatología desde julio de 2002 hasta diciembre del año 2003. Se excluyeron los pacientes con tratamiento antiviral en el momento del estudio, los coinfectados con otros virus hepatotropos y los pacientes alcohólicos. Se recogieron los siguientes datos sobre la base del estudio sistemático durante el manejo de los pacientes: epidemiológicos (edad, sexo y grupo de riesgo de transmisión), clínicos (sintomatología de la enfermedad, histología hepática obtenida por biopsia, fecha de diagnóstico, duración de la infección y si había recibido tratamiento previo) y de laboratorio (marcadores serológicos del VHB, valores de alanino-aminotransferasa (ALT) durante el seguimiento de la enfermedad y detección de ADN-VHB). La duración de la infección se estimó por el conocimiento de un episodio de hepatitis aguda en el historial del paciente o la presencia de un incremento en las concentraciones de ALT y con el antígeno de superficie del virus B (HBsAg) positivo en suero. El diagnóstico de hepatitis crónica por el virus B se realizó por la positividad del HBsAg y la elevación persistente de los valores de ALT durante un período superior a 6 meses o la presencia de lesión hepática demostrada histológicamente. El diagnóstico de portador asintomático se basó en la positividad del HBsAg en pacientes sin síntomas clínicos y en la normalidad de las pruebas de función hepática en dos o más determinaciones separadas por un intervalo de más de 6 meses.

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En la última columna de la tabla 1 se recogen las características de los pacientes.

Métodos La detección de marcadores de VHB en suero se realizó por técnicas inmunoenzimáticas y de inmunoquimioluminiscencia convencionales (Abbott). La detección del ADN-VHB se realizó por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa (HBV-Cobas Amplicor Monitor®-Roche Diagnostics System). La detección de genotipos de las cepas de VHB se determinó por un ensayo de sondas en línea (INNO-LiPA HBV Genotyping®, Innogenetics Inc., Ghent, Bélgica), previa extracción del ADN mediante el equipo Light Diagnostic ViralXpress® (Chemicon International) y amplificación por PCR anidada de una secuencia del gen pol (dominios B y C) mediante el sistema INNO-LiPA HBV DR/Genotyping Amplification kit® (Innogenetics Inc.)16. Para la interpretación de los resultados se siguieron las instrucciones del fabricante. Todas las muestras que presentaron reactividad por más de un genotipo fueron remitidas a un segundo laboratorio para su confirmación. En todos los casos se confirmaron los resultados. En tres (20%) de las muestras en que se detectó la infección por más de un genotipo, se realizó la secuenciación de los dominios B y C del gen pol, para confirmar que se trataba de verdaderas infecciones mixtas. Para la secuenciación, la extracción del ADN se realizó utilizando el equipo High Pure Template Preparation kit® (Roche Diagnostics), la amplificación mediante el sistema INNOLiPA HBV DR/Genotyping Amplification kit® (Innogenetics Inc) y para la reacción de secuenciación se utilizaron cebadores que hibridan en las posiciones con sentido nt 414-422 y sin sentido nt 822-803 utilizando el equipo BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems). Para el análisis estadístico de los resultados se utilizó el estadístico de la ji cuadrado ␹ 2 para establecer la asociación entre variables cualitativas y el test de la t de Student para las variables cuantitativas. Se aceptó la significación estadística para p < 0,05.

Resultados De los 108 pacientes incluidos en el estudio, 41 (38,0%) fueron mujeres y 67 (62,0%) hombres, con una edad media de 44,1 ± 11,6 años (límites: 15-75). Los principales grupos de riesgo de transmisión fueron convivencia con un paciente infectado por el VHB en 26 pacientes (24,1%), antecedentes de transfusiones en 10 casos (9,3%), múltiples parejas sexuales al año en 9 pacientes (8,3%), la adicción a drogas por vía parenteral en 3 casos (2,8%), accidente sanitario por pinchazo en 2 pacientes (1,8%) y en los 58 (53,7%) pacientes restantes se desconocía cualquier factor de riesgo. De los 108 portadores crónicos del VHB, 40 (37%) presentaban una hepatitis crónica (HC) y 68 (63%) eran portadores asintomáticos. De los 40 pacientes con HC, en 23 se realizó estudio histológico por biopsia hepática, hallándose una HC activa en 17 de ellos, cirrosis en tres, hepatocarcinoma en uno y una HC persistente en dos. En ninguno de los 68 portadores asintomáticos se realizó estudio histológico hepático. En 63 pacientes (58,3%) se desconocía el tiempo de evolución de la infección y de los 45 restantes, en tres (6,7%) el tiempo de evolución era inferior a 10 años y en 42 (93,3%) mayor de 10 años. Cien pacientes (92,6%) fueron HBeAg negativo, con anticuerpo e positivo. Todos los portadores sanos mostraron seroconversión del HBeAg, 55 (80,9%) con DNA-VHB positivo, teniendo cuatro de ellos (7,3%) una CV > 10 5 copias/ml. De los 40 pacientes con hepatitis crónica, 32 presentaron HBeAg negativo (80%), 35 mantenían el ADN-VHB positivo (88,5%), 15 de ellos (42,9%) con una CV > 10 5 copias/ml. 32

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TABLA 1. Características de los pacientes con infección por VHB en los distintos genotipos Genotipos n.º (%)

Datos epidemiológicos Edad media ± DE (años) Sexo Hombre Mujer Mecanismo de transmisión Familiar ADVP Promiscuidad sexual Personal sanitario Transfusiones Desconocido Datos virológicos HBeAg Positivo Negativo CV (copias/ml) < 200 > 200 y ⱕ 10 5 > 10 5 Datos clínicos Portador asintomático HCA Duración de la infección Desconocido < 10 años > 10 años Total

A

D

A-G

Otros

No genotipo

Total

45,4 ± 10,3

43,5 ± 14,5

35,4 ± 5,3

41,6 ± 11,8

45,6 ± 12,2

44,1 ± 11,6

33 (71,7) 13 (28,3)

14 (70,0) 6 (30,0)

5 (71,4) 2 (28,6)

3 (27,3) 8 (72,7)

12 (50,0) 12 (50,0)

67 (62,0) 41 (38,0)

10 (21,7) 1 (2,2) 3 (6,5) 2 (4,3) 5 (10,9) 25 (54,3)

8 (40,0) 1 (5,0) 1 (5,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 10 (50,0)

1 (14,3) 1 (14,3) 3 (42,9) 0 (0,0) 1 (14,3) 1 (14,3)

4 (36,4) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 7 (63,6)

3 (12,5) 0 (0,0) 2 (8,3) 0 (0,0) 4 (16,7) 15 (62,5)

26 (24,1) 3 (2,8) 9 (8,3) 2 (1,9) 10 (9,3) 58 (53,7)

2 (4,3) 44 (95,7)

3 (15,0) 17 (85,0)

3 (42,9) 4 (57,1)

0 (0,0) 11 (100,0)

0 (0,0) 24 (100,0)

8 (7,4) 100 (92,6)

0 (0,0) 38 (82,6) 8 (17,4)

0 (0,0) 13 (65,0) 7 (35,0)

0 (0,0) 3 (42,9) 4 (57,1)

0 (0,0) 11 (100,0) 0 (0,0)

18 (75,0) 6 (25,0) 0 (0,0)

18 (16,7) 71 (65,7) 19 (17,6)

29 (63,0) 17 (37,0)

13 (65,0) 7 (35,0)

2 (28,6) 5 (71,4)

7 (63,6) 4 (36,4)

17 (70,8) 7 (29,2)

68 (63,0) 40 (37,0)

26 (56,5) 1 (2,2) 19 (41,3)

6 (30,3) 1 (5,0) 13 (65,0)

5 (71,4) 0 (0,0) 2 (28,6)

7 (63,6) 1 (9,1) 3 (27,3)

19 (79,2) 0 (0,0) 5 (20,8)

63 (58,3) 3 (2,8) 42 (38,9)

46 (

20 (

7(

11 (

24 (

108 (

VHB: virus de la hepatitis B; DE: desviación estándar; ADVP: adictos a drogas por vía parenteral; HBeAg: antígeno e de la hepatitis B; CV: carga viral.

Sólo el 37,5% de todos los pacientes con HC tenían un nivel de carga superior a 10 5 copias/ml. El estudio de genotipos se realizó en 84 pacientes. En 24 casos no fue posible realizar la genotipificación, debido a que en 18 no se detectó ADN-VHB en suero y en seis no se obtuvo muestra suficiente. La prevalencia de genotipos obtenido fue la siguiente: genotipo A en 46 pacientes (54,8%), D en 20 (23,8%), F en 2 (2,4%), C en 1 (1,2%), coinfección A-G en 7 (8,3%), A-D en 4 (4,8%), D-G en 2 (2,4%), A-C en 1 (1,2%) y A-D-G en 1 (1,2%). El porcentaje global de coinfecciones por más de un genotipo fue del 17,9%. Las tres muestras secuenciadas (2 A-G y 1 D-G) confirmaron la presencia de genotipos G puros en los primeros 2 casos y D puro en el tercer caso, por lo que las secuencias que hibridan con el genotipo A en los primeros 2 casos y con el genotipo G en el tercero deben ser poblaciones minoritarias no detectadas por secuenciación. En la tabla 1 se muestran las características de los pacientes con infección por el VHB en los diferentes genotipos. Sólo se observaron variaciones en las características virológicas respecto al genotipo. Así, el 95,7% de los pacientes con genotipo A presentó HBeAg negativo, frente al 85% del genotipo D, no siendo esta variación estadísticamente significativa. Referente a la CV, tampoco se encontró diferencia significativa entre el genotipo A (82,6% de los pacientes con CV ⱕ 10 5) y el D (65% con CV ⱕ 10 5). En la tabla 2 se observan las características clínicas de la infección respecto al genotipo y la CV. En los pacientes con genotipo A, el 28,9% de los pacientes con CV ⱕ 10 5 presentaban una enfermedad hepática activa frente al 7,7% en el genotipo D (p no significativa). Los 3 pacientes con cirrosis correspondían al genotipo A del VHB. 33

TABLA 2. Características virales (genotipo y carga viral) en los portadores sanos y en las hepatitis crónicas por VHB

Genotipo A CV ≤ 10 5 CV > 10 5 Genotipo D CV ≤ 10 5 CV > 10 5 Genotipo A-G CV ≤ 10 5 CV > 10 5 Otros genotipos CV ≤ 10 5 CV > 10 5 No genotipable CV ≤ 200 No muestra

Portador asintomático (%)

Hepatitis crónica (%)

29 (63,1) 27 (71,1) 2 (25,0) 13 (65,0) 12 (92,3) 1 (14,3) 2 (28,6) 1 (33,3) 1 (25,0) 7 (63,6) 7 (63,0) 0 (0,0) 17 (70,8) 13 (72,2) 4 (66,7)

17 (36,9) 11 (28,9) 6 (75,0) 7 (35,0) 1 (7,7) 6 (85,7) 5 (71,4) 2 (66,7) 3 (75,0) 4 (36,4) 4 (36,4) 0 (0,0) 7 (29,2) 5 (27,8) 2 (33,3)

46 38 8 20 13 7 7 3 4 11 11 0 24 18 6

68

40

108

Total

Total

CV: carga viral en copias/ml.

Discusión La evolución de la infección por el VHB varía dependiendo de las características del virus y del paciente, aunque se desconoce la importancia de los genotipos del VHB en el curso clínico de la enfermedad. Existen resultados discordantes en los estudios realizados, aunque hay pruebas de diferente evolución en los pacientes infectados con los genotipos B y C, según algunos trabajos publicados. España es un país con una baja tasa de infección crónica por VHB, con una prevalencia que oscila entre el 0,5-1%. Enferm Infecc Microbiol Clin 2005;23(7):415-8

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En nuestra población los genotipos más frecuentes fueron el A y el D, como en otras áreas españolas17,18, aunque en zonas peninsulares el genotipo D es más prevalente y como en otros países europeos19, 20. Se han detectado un alto porcentaje de infecciones mixtas por más de un genotipo, principalmente con el genotipo G, el cual siempre lo encontramos en coinfección, lo que concuerda con lo que previamente se había descrito 21, ya que en más del 95% de los casos se encontró coinfectando con otros genotipos. No se han hallado diferencias entre las características epidemiológicas de los pacientes infectados (edad, sexo, mecanismo de transmisión de la infección y momento de la infección) y los distintos genotipos del VHB, aunque hay que destacar el alto porcentaje de pacientes en los que se desconocía la vía de transmisión de la infección y el momento exacto del contagio, por lo que estos datos limitan los resultados. Tampoco se pueden sacar conclusiones sobre las características de los pacientes con infecciones mixtas por distintos genotipos, principalmente con el genotipo G, aunque nuestros resultados muestran que estos pacientes presentan en un mayor porcentaje hepatitis crónica activa, antígeno e positivo y CV superior a 10 5 copias/ml. Al contrario que otros estudios 7,15 observamos un mayor número de pacientes portadores de antígeno e en el genotipo D que en el A. No obstante, se debe de tener en cuenta que, al igual que en otras publicaciones, en la mayoría de los pacientes con VHB se desconoce el momento de la infección y, por lo tanto, la duración de esta. Este hecho es importante en el conocimiento de la historia natural de la infección crónica de la hepatitis B, y en el momento que se produce la seroconversión del antígeno e, ya que esta podría estar más relacionada con los factores tiempo de evolución e inicio de la infección que con el genotipo. Este dato hay que tenerlo en cuenta con la limitación de que el número de pacientes con antígeno e positivo es muy bajo. Asimismo, también encontramos que el genotipo D presenta una tendencia a tener concentraciones de ADN-VHB en suero más elevadas, ya que el 35% de los pacientes con este genotipo muestran viremias por encima de 10 5 copias/ ml frente al 17% de los pacientes con el genotipo A. Este parámetro, que no se ha valorado en la mayor parte de los estudios publicados, creemos que habría que tenerlo en cuenta, ya que puede ser un indicador de que la infección del VHB por el genotipo D tenga una peor evolución que el genotipo A, como se observa en un reciente trabajo publicado 22. Aunque en este estudio no se aprecian diferencias en la alteración de la función hepática entre los distintos genotipos, cuando analizamos a los pacientes con CV < 10 5 copias/ml encontramos un mayor porcentaje de alteración de la función hepática en los pacientes con el genotipo A que con el D, lo que podría significar que el genotipo A puede desencadenar una mayor actividad inflamatoria hepática. En suma, al igual que la mayor parte de los estudios publicados, los resultados deben de valorarse con las limitaciones que se han descrito, ya que el momento del contagio y el tiempo de evolución de la infección se desconoce en la mayoría de los casos. Por ello, creemos de interés que se realicen nuevos estudios con mayor número de pacientes en los que se analicen el genotipo del VHB, el nivel de CV y el tiempo de duración de la enfermedad para comprender mejor la influencia del genotipo en la evolución de la infección por el VHB.

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Como conclusión, podemos afirmar que, en nuestra área, existe una gran variedad de genotipos, en el que predomina el A, seguido del D y las coinfecciones, principalmente con el genotipo G. No encontramos diferencias significativas entre los genotipos en el estado antígeno-anticuerpo e, los niveles de CV en suero, ni en el grado de actividad inflamatoria hepática, y sí una tendencia del genotipo A a producir una mayor actividad inflamatoria hepática cuando la CV era inferior a 10 5 copias/ml, lo que podría estar relacionado con la expresión de una respuesta inmunológica eficaz en el paciente.

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