Histochemische Untersuchungen über die Enzymaktivität in vegetativen und floralen Sproßscheiteln

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Biochem. Physiol. Pflanzen (BPP), Bd. 167, S. 317-325 (1975)

Histochemische Untersuchungen iiber die Enzymaktivitat in vegetativen und floralen SproBscheiteln 2. Saure Phosphatase ANNE ROSE KLOPFER

Sektion Chemie - Biologie der Padagogischen Hochschule Potsdam, Lehrstuhl fUr Botanik

Histochemical Studies of the Enzyme Activity in Vegetative and Reproductive Shoot Apical Meristems 2. Acid Phosphatase Key Term Index: enzymes, acid phosphatase, histochemical proof, shoot apex; Pharbitis nil, Xanthium pennsylvanicum.

Summary The occurrence of acid phosphatase in vegetative and floral shoot apices of the short-day plants Xanthium pellllsylvanicum and Pharbitis nil was studied by means of the lead sulfide procedure. The highest amount of the enzyme activity was found in the areas of growth and differentiation. Both the extremely apical zones and the older tissues showed little acid phosphatase activity. The pattern of enzyme localization for Xanthium was as following: In the vegetative shoot apices high levels of activity were observed in the central zones, the pith meristems and the procambium. During the transitional stages from the vegetative phase to the floral phase the highest amount of activity was demonstrated in the subterminal zones. For the inflorescence primordium the highest activity was noted in the periphery of the meristem and particularly on the bases and on the flanks of the flower buds. As shown for Pharbitis, the enzyme activity was intense in the subterminal zones of the vegetative meristems as well as in the transitional stages prior to the floral phase. In the flower buds the highest concentration of acid phosphatase was loealized at the bases of the developing parts of the flower.

Zusammenfassung 1. Mit Hilfe der Bleisulfidmethode wurde die Verteilung von saurer Phosphatase in vegetativen und floralen SproBscheiteln der Kurztagspflanzen Xanthium pennsylvanicum und Pharbitis nil untersucht.

2. Gewebebezirke, in denen Wachstums- und Differenzierungsvorgange ablaufen, zeigten allgemein die hochste Enzymaktivitat. Extrem apikale Zonen und altere Gewebe waren enzymarm. 3. Fiir Xanthium-Scheitel ergaben sich folgende Verteilungsmuster: 1m vegetativen Stadium waren Zentralkomplex, Markmeristem und Prokambium reich an Enzym. 1m Ubergangsstadium zur floralen Phase waren die subterminalen Bereiche am starksten gefarbt. Infloreszenzprimordien besaBen an der Peripherie, besonders an den Basen und Flanken der Bliitenprimordien, ihre hochste Aktivitat. 4. Bei vegetativen und Ubergangsscheiteln von Pharbitis wiesen subterminale Scheitelbereiche eine hohe Phosphataseaktivitat auf. Bliitenprimordien waren am starksten an der Basis der jungen Bliitenglieder gefarbt.

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Einleitung

Die vorliegende Mitteilung setzt den Bericht tiber die enzymhistochemischen Untcrsuchungen an SproJ3scheiteln fort. Nach den Befunden tiber die Zytochromoxydase (KLOPFER 1973) sollen nun Aktivitat und Lokalisatiol1 der sogenannten sauren Phosphatase dargestellt werden. Unter dieser Bezeichnung faBt man eine Gruppe von Enzymen zusammen, die beipH-Werten im sauren Bereich die Hydrolyse verschiedener Phosphomonoester katalysieren. Ais Untersuchungsobjekte dienten wieder die Kurztagspflanzen Xanthium pennsylvanicum W ALLR. und Pharbitis nil CHOIS., die sich durch die Entwicklung ihrer floralen Scheitel unterscheiden. Bei Xanthium entstehen Infloreszenzen, wahrend sich bei Pharbitis Einzelbltiten differenzieren. Material und Methoden Die Pflanzen wurden unter den gleichen Voraussetzungen angezogen, wie sie in der ersten Mitteilung (KLOPFER 1973) beschrieben wurden. Auch die Herstellung von Kryostatschnitten der frisch entnommenen SproBspitzen erfolgte in gleicher Weise. Enzymnach weis. - Zum Nachweis der sauren Phosphatase wurde die von GOMORI entwickelte Bleisulfidmethode angewendet, die verschiedentlich fiir pflanzliche Gewebe modifiziert worden ist. Die eigenen Untersuchungen erfolgten nach den Angaben von FREY (1954): Als Inkubationsliisung diente das klare Filtrat aus einem Gemisch von 0,8 ml 3,2%igem Na-p-Glycerophosphat, 2,0 ml 0,1 M Bleinitrat, 8,0 ml 0,1 M Azetatpuffer pH 5,1, 1,2 ml destilliertem Wasser. Die Kryostatschnitte wurden in destilliertem Wasser gewaschen und anschlieBend 15-20 min bei 37 °C inkubiert. Danach wurden die Schnitte in Wasser gewaschen, mit 2%iger Essigsaure behandelt, wieder gewaschen und 5 min mit verdiinnter gelber Ammoniumsulfidliisung entwickelt. Dadurch erscheinen an den Reaktionsorten braunschwarze Niederschlage von Bleisulfid. Die Schnitte wurden mit Wasser abgespiilt und zur Auswertung und Dokumentation in Glyzerin eingelegt oder in Glyzeringelatine einge bettet. Kontrollversuche. - Zur Kontrolle dienten folgende Versuche: 1. Hitzegetiitete Schnitte wurden normal inkubiert und nachbehandelt. 2. Eine eventuelle Verfarbung der Schnitte durch Ammoniumsulfid wurde untersucht, indem die Schnitte 30 min in diese Liisung eingelegt wurden. 3. Das Inkubationsgemisch wurde ohne Substrat angesetzt, und die Schnitte wurden in diesem Medium normal inkubiert und nachbehandelt. 4. Dem Inkubationsgemisch wurde 0,01 M NatriumfJuorid als Inhibitor zugesetzt. Bei allen Kontrollen blieb die Braunschwarz-Farbung aus.

Ergebnisse

Die Enzymverteilung bei Xanthium Die Bleisulfid-Methode wurde an den Langsschnitten vegetativer und floraler SproBscheitel angewendet. 46 vegetative Scheitel im Alter von 9-42 Tagen und 28 induzicrte SproBscheitel verschiedener Entwicklungsstadien wurden untersucht. Die Angaben

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Abb. 1. Schnitt durch vegetative Scheitel von Xanthium pennsylvanicum. a) Hohe Enzymaktivitiit in Zentralkomplex, Markmeristem, Prokambium und iilterem Blattprimordium. 21 d alt. b) Hohe Enzymaktivitiit im gesamten Hauptscheitel sowie im Achselscheitel und im Prokambium. 30d alt. Vergr. 100x.

zur Lokalisation der sauren Phosphahse beziehen sich jeweils auf die aktivsten Gewebebezirke, die durch Bleisulfid-Bildung dunkelbraun bis schwarz erscheinen. Die ubrigen Zellen waren gelblich bis ockerfarben. Bei allen vegetativen SproBscheiteln fallt der Phosphatasenachweis im Bereich der Markmutterzellen und des Markmeristems kraftig schwarzbraun aus. Genauso intensiv ist das Prokambium gefarbt (Abb. 1). Das Dermatogen und die auBersten Rindenschichten hatten etwas schwachere Bleisulfid-Niederschlage (Abb. 1 b). Typisch scheint auch das Verhalten des Initialkomplexes zu sein, der von den auBersten 2 -3 Zellschichten gebildet wird. Bei der Mehrzahl der Schnitte ist dieser Komplex nicht oder nur schwach gefarbt (Abb. 1a), nur bei 5 der beobachteten SproBscheitel stimmttl die Farbung des Initialkomplexes und des darunterliegenden Gewebes uberein (Abb. 1 b).

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Abb. 2. Schnitt durch florale Scheitel von Xanthium pennsylvanicum. a) Infloreszenzscheitel, 49d alt, 5d nach der Induktion. Hiichste Phosphataseaktivitat im subterminalen Scheitelbereich, im Prokambium und in den alteren Blattprimordien. b) Infloreszenzprimordium, 5ld alt, lOd nach der Induktion. Starke Farbung der mannlichen Bliitenprimordien, des Prokambiums und der weiblichen Infloreszenzen. Vergr. SOx.

1m Bereich des Flankenkomplexes und der Blattprimordien variieren die Ergebnisse stark. Auf Abb. 1 a ist das jiingste Blattprimordium kaum gefarbt, auf Abb. 1 b dagegen erscheint es schwarz. Altere Primordien konnen vollig oder wenigstens in ihren Flankenbereichen gefarbt sein. Ebenso uneinheitlich verhalten sich die Achselscheitel. Folgende Moglichkeiten wurden beobachtet: Die Achselscheitel sind kaum gefarbt; sie sind vollig gefarbt (Abb. 1 b); oder die Farbung beschrankt sich auf einen Bereich unterhalb einer hellen peripheren Zone, die aus 2 Zellschichten besteht. Abb. 2a zeigt den Langsschnitt eines Scheitels zu Beginn seiner floralen Entwicklung. Die Zonierung des vegetativen Scheitels verschwindet, und es kommt zu einer

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Abb. 3. Schnitt durch die SprofJspitze von Pharbitis nil (100 X vergrofJert). a) Vegetativer Scheitel. 5d alt. Starke Enzymaktivitat im Rinden- und Markmeristem. b) Floraler Scheitel. 17 d alt, 9 d nach der Induktion. Starke Schwarzung im Mark, den auBeren Zellschichten der jungen Brakteen und im Bliitenstiel.

starken Aufwolbung. Die ersten Brakteen und Blutenprimordien werden ausgegliedert. Bei diesen Ubergangsstadien war immer der subterminale Bereich stark gefarbt, wahrend die terminale Zone keine oder nur eine schwache Reaktion zeigte. Diese Gipfelzone umfaBte 6 -10 Zellschichten. Auch junge Brakteen und Blutenprimordien blieben hell. Nur die auBerste Zellschicht bildete manchmal eine Ausnahme und wies deutliche Ablagerungen von Bleisulfid auf. Das Prokambium und die auBeren Rindenschichten zeigten regelmaBig eine intensive Reaktion. Die Achselscheitel verhielten sich nicht einheitlich. In Abb. 2 a ist der Achselscheitel ungefarbt. In anderen beobachteten Schnitten war die Enzymaktivitat im Achselscheitel und in der subterminalen Zone des floral en Hauptscheitels gleich.

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Abb. 4. Pharbilis nil, Bliilenprimordium. 17 d alt, 12 d nach der Induktion. 100 X • - Starke Enzymaktivitiit in der gesamten Achse bis hinauf zu den Basen der Bliitenglieder.

An voll ausgebildeten Infloreszenzprimordien (Abb. 2b) weisen die jungen Brakteen und die mannlichen Bliitcnprimordien eine hohe Phosphataseaktivitat auf. Eine Ausnahme bilden nur die obersten Schichten, wie das an den alteren Primordien im Basalteil des Kopfchens zu erkennen ist. Das zentrale Mark der mannlichen Infloreszenz bleibt hell, wahrend die Prokambiumstrange tief schwarz erscheinen. Die weiblichen Infloreszenzprimordien wiesen eine hohe Enzymaktivitat auf. Die Enzymverteilung bei Pharbitis Der Nachweis der sauren Phosphatase wurde an den Schnitten von 35 vegetativen und 15 floralen Scheiteln ausgefiihrt. Die vegetativen Spro13scheitel waren zwischen 8 und 35 Tagen alt. Dabei ergab sich unabhangig yom Alter ein ctwa gleichartiges Far-

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Abb. 5. Vergleich der Aktivitiit der s(!uren Phosphaiase in vegetativen, induzierten und floralen Sprof.lscheiteln. Oben: Xanthium pennsylvanicum,

unten: Pharbitis nil.

Zonen hoher Enzymaktivitiit punktiert.

bungsmuster: Rindenmeristem, Markmeristem und junges Mark sind stark gefarbt (Abb.3a). Das Prokambium wies eine schwachere Reaktion auf. Auch der terminale Scheitelabschnitt zeigte eine geringe Enzymaktivitat. Andere Bereiche reagierten uneinheitlich, so die Achselscheitel, die entweder gar nicht gefarbt waren oder die gleiche Schwarzung aufwiesen wie die aktivsten Zonen des Hauptscheitels. Die Blattprimordien konnen ebenfalls unverandert bleiben, oder sie weisen in ihren Flanken eine Schwarzung auf. Ftir flomle altere Scheitel war typisch, daB die bereits angelegten Bltitenglieder und das Restmeristem nicht oder schwacher gefarbt sind als der subterminale Abschnitt (Abb. 3 b). Die helle terminale Zone ist dabei von wechselnder Ausdehnung. Sowohl bei den floralen Scheiteln als auch bei den voll ausgebildeten Bltitenprimordien (Abb. 4) bleiben die Flanken der Knospen heller als das zentmle Markmeristem. Bei den Bltitenprimordien ist eine intensive Reaktion auf die Basen der Bltitenglieder und auf das junge Mark beschrankt. Die Anlagen der Bltitenglieder bleiben in jedem FaIle schwacher gefarbt und zeigen nur geringe Bleisulfidfallungen. Das ist z. B. an den jungen Stamina auf Abb. 4 gut zu beobachten. Besonders auffallig ist an diesem Schnitt das Verhalten der sich differenzierenden Karpellprimordien. Ihre sich intensiv teilenden Zellen weisen tiberhaupt keine Enzymaktivitat auf. Die Rindenschicht ist mit Ausnahmc der auBersten Zellschicht kaum gefiirbt. Erst im Bereich des zuktinftigen Bltitenstiels erfolgt eine intensive Schwarzung tiber die gesamte Schnittflache. Vergleich der Enzymverteilung Ftir den Vergleich der Enzymlokalisation wurden die wesentlichen Ergebnisse in Abb. 5 zusammengefaBt. Die charakteristische Verteilung der sauren Phosphatase

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ist in schematische Langsschnittbilder der vegetativen, Ubergangs- und floralen SproJ3scheitel von Xanthium und Pharbitis eingetragen. Subterminale Scheitelbereiche erwiesen sich tibereiIlstimmend bei vegetativen und Dbergangsscheiteln beider Objekte als Orte mit hoher Enzymaktivitat. Auch in den Flanken alterer Blattprimordien war stets eine positive Enzymreaktion zu beobachten, wahrend die apikalen Scheitelabschnitte wenig oder keine saure Phosphatase enthielten. Besonders ausgepragt war dieser Enzymmangel bei den Ubergangsscheiteln und im vegetativen Meristem von Pharbitis. Bei der Differenzierung der Bltiten von Xanthium und Pharbitis ist saure Phosphatase in basalen Bereichen des Primordiums nachweisbar. 1m Gegensatz dazu sind die Anlagen der einzelnen Bltitenglieder weitgehend enzymfrei, ein Befund, der besonders an den Langsschnitten von Pharbitis auffiel.

Diskussion

Bei der sauren Phosphatase handelt es sich urn ein haufiges und aIlgemein verbreitetes Enzym des Stoffwechsels. Das zeigt sich auch in den eigenen histochemischen Befunden, da aIle ZeIlen der getesteten Schnitte wenigstens eine gelb- bis heBbraune Tonung erfuhren. Auch FREY (1954) £and das Enzym universeB verbreitet. Neben Zentren mit hoher Aktivitat kam es in geringem MaJ3e in samtlichen ZeIlen der von ihm untersuchten Samen und vegetativen Organe vor. Zu dem gleichen Ergebnis kam YIN (1945), als er Lamium-SproJ3spitzen untersuchte. Er fand aIle meristematischen ZeBen des Vegetationskegels stark gefarbt. In geringer Entfernung yom Scheitel wurde die Farbung von Mark lind innerer Rinde schwacher, wahrend die auJ3ere Rinde und das Prokambium keine Abschwachung aufwiesen. Auch andere Autoren beschaitigten sich mit der Verteilung von saurer Phosphatase in SproJ3meristemen. Zum Beispiel wurde das Enzym von VANDEN BORN (1963) und von FOSKET und MIKSCHE (1966) an Coniferen-Scheiteln sowie von MIA und PATHAK (1968) am SproJ3scheitel von Rauwolfia nachgewiesen. VANDEN BORN fand dabei, daJ3 das Enzym hauptsachlich an Gewebe gebunden ist, in denen Teilungs- und Differenzierungsprozesse stattfinden, wahrend in reifen Geweben nur eine geringe Aktivitat vorhanden ist. Die Reaktionsintensitat verringerte sich also mit zunehmendem Abstand von der Scheitelspitze. Dieses Verhalten kann flir Xanthium und Pharbitis im wesentlichen bestatigt werden. FOSKET und MIKSCHE fan den an alteren Pinus-Scheiteln ein entsprechendes Muster, nur an sehr jungen Samlingsscheiteln variierte es mit der Herausbildung der zytologischen Zonierung. MIA und PATHAK wiesen saure Phosphatase bevorzugt in sich differenzierenden Markund RindenzeBen des Rauwolfia-Scheitels nacho Auch in den Wurzelmeristemen geht eine hohe Phosphataseaktivitat mit beginnender Differenzierung konform. Das zeigten AVERS und Mitarb. (1959,1961,1964) an WurzelzeBen, die sich zu Wurzelhaaren entwickeln.

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Die eigenen Befunde stimmen im wesentlichen mit der zitierten Literatur iiberein. An den SproBscheiteln von Xanthium und Pharbitis ist das Enzym verstarkt dort lokalisiert, wo Wachstums- und erste Differenzierungsprozesse stattfinden. Das wird durch eine kriiftige Bleisulfidablagerung sichtbar. Die tiefer gelegenen SproBteile, also altere Gewebepartien, waren enzymarm. Das kam in einer gelblichen bis hellbraunen Farbung zum Ausdruck und ist an der Differenzierung des Markparenchyms gut zu verfolgen. Auch extrem apikale Bereiche, wie Initialkomplex oder junge Primordien, ergaben meistcns keinen nennenswerten Phosphatasenachweis. Literatur AVERS, CH. J., Histochemical localization of enzyme activities in root meristem cells. Amer. J. Bot. 48,137-143 (1961). - and GRIMM, R. B., Comparative enzyme differentiation in grass roots. J. Acid phosphatase. Amer. J. Bot. 46, 190-193 (1959). CZERNIK, C. A., and AVERS, CH. J., Phosphatase activity and cellular differentiation in Phleum root meristem. Amer. J. Bot. 51, 424-431 (1964). FOSKET, D. E., and MIKSCHE, J. P., A histochemical study of the seedling shoot apical meristem of Pinus lambertiana. Amer. J. Bot. 53, 694-702 (1966). FREY, G., Aktivitat und Lokalisation von saurer Phosphatase in den vegetativen Teilen einiger Angiospermen und in einigen Samen. Ber. Schweiz. bot. Ges. 64, 390-452 (1954). KLOPFER, A., Histochemische Untersuchungen uber die Enzymaktivitat in vegetativen und floralen SproBscheiteln. 1. Zytochromoxydase. Biochem. Physiol. Pflanzen (BPP) 164, 383-396 (1973). MIA, A. J., and PATHAK, S. M., A histochemical study of the shoot apical meristem of Rauwolfia with reference to differentiation of sclereids. Can. J. Bot. 46, 115-120 (1968). VANDEN BORN, W. H., Histochemical studies of enzyme distribution in shoot tips of white spruce (Picea glauca). Can. J. Bot. 41, 1509-1527 (1963). YIN, H. C., A histochemical study of the distribution of phosphatase in plant tissues. New Phytol. Engl. 44, 191-195 (1945). Eingegangen 23. Dezember 1974. Anschrift der Verfasserin: Dr. ANNEROSE KLOPFER, DDR -

15 Potsdam, Heinrich-Rau-Allee 7.