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Inhibition de l’adhérence de Staphylococcus epidermidis sur des surfaces en titane par des polymères hydrosolubles bioactifs comportant des fonctions sulfonate, phosphate ou carboxylate
Pathologie Biologie 60 (2012) 84–90
Article original
Inhibition de l’adhe´rence de Staphylococcus epidermidis sur des surfaces en titane par des polyme`res hydrosolubles bioactifs comportant des fonctions sulfonate, phosphate ou carboxylate Inhibition of Staphylococcus epidermidis adhesion on titanium surface with bioactive water-soluble copolymers bearing sulfonate, phosphate or carboxylate functions L. Poussard a,*, C.P. Oue´draogo b, G. Pavon-Djavid c, V. Migonney b a
De´partement de chimie, institut Galile´e, universite´ Paris-13, 99, avenue Jean-Baptiste-Cle´ment, 93430 Villetaneuse, France CSPBAT, FRE 3043, institut Galile´e, universite´ Paris-13, 99, avenue Jean-Baptiste-Cle´ment, 93430 Villetaneuse, France c BPC, Inserm U 698, institut Galile´e, universite´ Paris-13, 99, avenue Jean-Baptiste-Cle´ment, 93430 Villetaneuse, France b
I N F O A R T I C L E
R E´ S U M E´
Historique de l’article : Rec¸u le 14 septembre 2009 Accepte´ le 1 juillet 2010
Les prothe`ses implante´es chez l’homme sont parfois sujettes a` des infections bacte´riennes qui vont jusqu’a` menacer leur pe´rennite´. Diffe´rentes me´thodes sont en cours d’e´tude pour lutter contre ces infections, parmi lesquelles le greffage sur la surface de la prothe`se, de polyme`res bioactifs, se re´ve`le une solution prometteuse. Ce travail pre´sente l’influence de diffe´rents polyme`res bioactifs hydrosolubles sur l’inhibition de l’adhe´rence de Staphylococcus epidermidis a` la surface d’e´chantillons en titane initialement pre´adsorbe´s de diffe´rentes prote´ines. Quelle que soit la prote´ine e´tudie´e, il est montre´ que le polyme`re bioactif comportant des fonctions sulfonate ge´ne`re une inhibition de l’adhe´rence de S. epidermidis. Lors d’une pre´adsorption de plasma, l’inhibition est de l’ordre de 68 % lorsque la concentration en fonction sulfonate est de 2,5 mmol/L. Des surfaces de titane greffe´es par le polyme`re bioactif ont e´galement e´te´ teste´es. On retrouve une activite´ inhibitrice de l’adhe´rence similaire a` celle du cas pre´ce´dent. Ces re´sultats pre´liminaires sont de nature a` susciter un inte´reˆt clinique dans la lutte contre l’infection des dispositifs me´dicaux, car ils mettent en e´vidence un net effet local d’inhibition de l’adhe´rence de S. epidermidis. Des copolyme`res comportant d’autres groupements fonctionnels (phosphate ou carboxylate) ont e´te´ dissous dans une suspension bacte´rienne afin de de´terminer l’influence de la composition sur l’inhibition de l’adhe´rence bacte´rienne. Les taux d’inhibition obtenus pour ces copolyme`res ne sont pas significativement infe´rieurs a` ceux de l’homopolyme`re comportant exclusivement des fonctions sulfonate, tant que la proportion en fonction sulfonate reste supe´rieure a` 50 %. La fonction sulfonate est donc la principale responsable de l’inhibition de l’adhe´rence de S. epidermidis. ß 2010 Elsevier Masson SAS. Tous droits re´serve´s.
Mots cle´s : Adhe´rence Staphylococcus epidermidis Inhibition Titane Polyme`re bioactif Sulfonate Carboxylate Phosphate
A B S T R A C T
Keywords: Adhesion Staphylococcus epidermidis Inhibition Titane Bioactive polymer Sulfonate Carboxylate Phosphate
Implanted prostheses are sometimes subject to bacterial infections, which can threat their benefit rule on a long-term basis. Various methods are studied to fight against these infections. Among them, the grafting of bioactive polymers onto the prosthesis surface shows up as a promising way to the problem of infections. This work presents the influence of various water-soluble bioactive polymers on the inhibition of the Staphylococcus epidermidis adhesion on the titanium samples surfaces initially preadsorbed with various proteins. Whatever the studied protein is, it is shown that the bioactive polymer containing sulfonate functions generates an inhibition of the adhesion of Staphylococcus epidermidis. For a plasma preadsorption, the inhibition rate rises up to 68% when the concentration of sulfonate function is 2.5 mmol/L. Titanium surfaces grafted with the bioactive polymer were also tested. We find an inhibitive activity of the adhesion close to that of the previous case. These preliminary results can point up a clinical interest in the fight against the medical devices infection, because they highlight a
* Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (L. Poussard), [email protected] (G. Pavon-Djavid). 0369-8114/$ – see front matter ß 2010 Elsevier Masson SAS. Tous droits re´serve´s. doi:10.1016/j.patbio.2010.07.004
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clear local effect of S. epidermidis adhesion inhibition. Copolymers containing other functional groups (phosphate or carboxylate) were dissolved in a bacterial suspension to monitor the influence of the composition on the adhesion inhibition. Their inhibition rates are not significantly lower than those of pNaSS homopolymers, as much as the sulfonate function proportion remains higher than 50%. Thus, the sulfonate function is the main responsible for the inhibition of the S. epidermidis adhesion. ß 2010 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.
1. Introduction Les infections associe´es a` l’utilisation des biomate´riaux aboutissent fre´quemment a` l’e´chec des implants me´dicaux. Des e´tudes portant sur des implants explante´s ainsi que des e´tudes in vitro ont montre´ que l’adhe´sion bacte´rienne sur les biomate´riaux e´tait une e´tape importante dans le de´veloppement de l’infection [1]. En effet, les bacte´ries peuvent s’attacher a` la surface des biomate´riaux directement ou par l’interme´diaire des prote´ines d’adhe´rence. Une fois adhe´re´es, leur comportement peut changer. Par exemple, elles peuvent e´voluer vers une virulence accrue et/ou une re´sistance supe´rieure aux me´canismes de de´fense de l’hoˆte ou aux antibiotiques [2]. Plusieurs e´tudes sur l’adhe´rence et la colonisation de Staphyloccocus epidermidis ont e´te´ mene´es in vivo et in vitro sur des mate´riaux polyme`res destine´s a` la fabrication d’implants. Les conclusions ont re´ve´le´ que la propension de cette bacte´rie a` coloniser ces mate´riaux est corre´le´e avec sa pathoge´nicite´ [3–6]. Beaucoup de microorganismes et en particulier S. epidermidis, une fois adhe´re´s, cre´ent des films protecteurs et complexes de mucopolysaccharides, connus sous le nom de biofilms, qui augmentent la stabilite´ des colonies et pour e´chapper a` re´action immune de l’hoˆte [7]. Apre`s formation du biofilm, les bacte´ries peuvent s’en extraire pour devenir des satellites libres qui e´migrent et s’attachent a` d’autres surfaces non colonise´es. La structure du biofilm facilite e´galement la communication de cellule-a`-cellule, promouvant des changements phe´notypiques, l’adaptation contre la re´action immune, cela favorise les processus ge´ne´tiques de transfert de la re´sistance aux antibiotiques [8]. Il est tre`s difficile d’e´liminer des bacte´ries dans une colonie adhe´rente qui a forme´ un biofilm car elle devienne re´fractaire aux antimicrobiens. Parmi les solutions propose´es pour e´viter la formation du biofilm, l’e´laboration de nouvelles surfaces inhibitrices de l’adhe´rence des bacte´ries a fait l’objet de plusieurs recherches. Diffe´rentes approches ont e´te´ de´veloppe´es afin de re´duire l’attachement des bacte´ries aux mate´riaux polyme`res. En particulier, les techniques d’impre´gnation du mate´riau par des antiseptiques et/ou des antibiotiques ou les modifications de surface par greffage chimique ou par incorporation de mole´cules biologiques telles que l’he´parine, permettent d’obtenir une diminution sensible de l’adhe´rence bacte´rienne [9]. Ainsi Franc¸ois et al. montrent l’inhibition de l’adhe´rence de S. epidermidis par l’he´parine et par des polysaccharides sulfate´s en solution sur des surfaces de poly(me´thyle me´thacrylate) pre´alablement adsorbe´es de fibronectine [10]. Nous avons montre´ qu’en fonction de leur composition chimique, certains polyme`res fonctionnels peuvent avoir un effet d’inhibition sur l’adhe´rence et la prolife´ration bacte´rienne tout en favorisant l’adhe´rence cellulaire [11–14]. Notre travail s’inscrit dans ce cadre, et l’objectif de cette e´tude est de de´velopper de nouvelles formulations a` usage biome´dical permettant de re´pondre a` ces deux crite`res suivants : (1) limiter l’adhe´rence bacte´rienne, (2) confe´rer un roˆle bioactif aux biomate´riaux implante´s vis-a`-vis des tissus environnants, et notamment les tissus osseux. C’est ainsi que nous avons e´te´ conduit a` synthe´tiser des polyme`res porteurs de groupements sulfonate, carboxylate et phosphate et a` e´valuer leurs proprie´te´s. Par ailleurs, le roˆle des prote´ines plasmatiques a e´te´ mis en e´vidence par Franc¸ois et al. qui ont de´montre´ l’influence des prote´ines sur les premie`res e´tapes de la colonisation bacte´rienne [15].
Des homopolyme`res et copolyme`res solubles comportant des groupements sulfonate, carboxylate ou phosphate ont e´te´ synthe´tise´s puis purifie´s et caracte´rise´s. La capacite´ de ces nouveaux polyme`res a` inhiber l’adhe´rence de S. epidermidis a e´te´ e´value´e sur des surfaces en titane pre´adsobe´es de prote´ines dans l’objectif de se rapprocher de l’environnement physiologique du mate´riau une fois implante´. 2. Mate´riels et me´thodes 2.1. Le support en titane Le titane utilise´ (purete´ : 99,7 %, Alfa Aesar GmbH & Co.KG) se pre´sente sous forme d’une plaque de 200 mm 200 mm et d’e´paisseur 0,5 mm obtenue par laminage. Des e´chantillons sont de´coupe´s dans cette plaque, sous forme de pastilles carre´es de 1 cm2 de surface. Avant toute utilisation, ces pastilles de titane sont soumises a` un de´capage a` l’ace´tone afin d’e´liminer toute impurete´. On proce`de ensuite a` un nettoyage sous agitation magne´tique avec diffe´rentes solutions. Le protocole ope´re´ est le suivant : trois fois trois heures dans une solution de NaCl a` 1,5 M, trois fois trois heures dans une solution de NaCl a` 0,15 M, trois fois trois heures dans de l’eau distille´e, et enfin trois fois trois heures dans du sulfure de plomb (II) (PbS) sans Ca2+–Mg2+. Les pastilles sont ensuite ste´rilise´es sous UV pendant 15 minutes par face et conserve´es dans du PbS sans Ca2+–Mg2+ ste´rile a` 4 8C. 2.2. Les polyme`res 2.2.1. Purification des re´actifs Le styre`ne sulfonate de sodium NaSS (ACROS ORGANICS), de masse molaire M = 206 g/mol est purifie´ par recristallisation dans un me´lange eau/e´thanol 10/ 90 en volume. Apre`s filtration et se´chage sous vide, on obtient un solide sous forme de paillettes blanches. L’acide me´thacrylique MA (Aldrich) (M = 86 g/mol) est purifie´ par distillation a` 30 8C. Le me´thacryloyloxye´thyl phosphate (MOEP) (Aldrich) (M = 210 g/mol) est dissous dans du te´trahydrofurane a` une concentration de 1 mol/L et purifie´ par passage sur re´sine afin d’e´liminer les inhibiteurs de polyme´risation. Le monome`re MOEP n’e´tant pas soluble dans l’eau sous sa forme acide, il est neutralise´ par un exce`s d’hydroxyde de sodium en solution aqueuse puis pre´cipite´ dans l’ace´tone. La poudre blanche obtenue, de MOEP de sodium (M = 254 g/mol) est se´che´e dans une e´tuve sous vide. Tous ces monome`res sont finalement conserve´s a` basse tempe´rature (4 8C) avant utilisation. L’amorceur de polyme´risation radicalaire, le 2,2’ azobis[2-(2-imidazolin-2yl)propane] dihydrochloride AIPH (WACO), est utilise´ sans purification pre´alable. 2.2.2. Synthe`se du polyme`re pNaSS et des copolyme`res p(MA/NaSS) et p(MOEP/NaSS) Le polyme`re pNaSS, et les copolyme`res (PMA/NaSS) et p(MOEP/NaSS) sont obtenus par polyme´risation radicalaire des monome`res introduits en proportion variable a` une concentration totale de 0,7 mol/L dans l’eau bidistille´e en pre´sence d’AIPH selon la me´thode de´crite dans la litte´rature par Berlot et al. [12]. Apre`s 16 heures de re´action a` 50 8C sous atmosphe`re d’argon, le milieu re´actionnel est pre´cipite´ dans l’e´thanol. Les polyme`res sont re´cupe´re´s sont forme de poudre blanche et se´che´s dans une e´tuve sous vide. L’utilisation de ces polyme`res pour une expe´rimentation biologique requiert une purification pre´alable effectue´e par dialyse avec des membranes a` un seuil de coupure 1000 g/mol (Spectropor MWCO 1000), qui permettent d’e´liminer les impurete´s (monome`re re´siduel et oligome`res). Pour chaque composition de polyme`re, une solution a` 10 mg/mL est pre´pare´e avec du PBS sans Ca2+–Mg2+. Cette solution est dialyse´e contre le PBS pendant 9 heures en changeant re´gulie`rement le PBS de dialyse, d’amener le pH de la solution a` un pH physiologique de 7,40. La solution purifie´e est finalement passe´e sur microfiltre (2 mm) pour e´liminer tout re´sidu. Les compositions retenues sont les suivantes :
homopolyme`re pNaSS ; copolyme`re p(MA/NaSS) de composition molaire : 100/0, 50/50 et 20/80 ; copolyme`re p(MOEP/NaSS) de composition molaire : 100/0, 70/30, 50/50 et 30/70 (Fig. 1).
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Fig. 1. Structure chimique des polyme`res. a : pNaSS, b : p(MA/NaSS), c : p(MOEP/NaSS)
2.2.3. De´termination de la concentration en groupements sulfonate en solution et de la composition des copolyme`res Afin de de´terminer avec pre´cision les pertes occasionne´es par la dialyse, la concentration molaire en groupements sulfonate des polyme`res mis en solution dans le PBS est analyse´e quantitativement par spectrophotome´trie UV (Spectrome`tre Lambda 25, Perkin Elmer) a` partir de l’absorbance a` 261 nm de la fonction styre`ne sulfonate en utilisant la loi de Beer-Lambert (e´quation 1). A ¼ e:l:C
(1)
avec :
e : coefficient d’extinction molaire (L/mol/cm) ; l : trajet optique de la cellule (cm) ; C : concentration molaire (mol/L) (Fig. 2). La mesure de l’absorbance de la fonction styre`ne sulfonate des copolyme`res permet donc d’en de´duire leur composition molaire par rapport aux concentrations initiales en monome`res introduits. La concentration finale des solutions est ajuste´e a` une valeur de 5 105 mol/L de motifs par dilution dans du PBS. Ces solutions sont ensuite dilue´es afin d’obtenir les concentrations ne´cessaires aux diffe´rents protocoles ope´ratoires. A` titre d’exemple, 50 mL d’une composition sont ajoute´s a` 950 mL de suspension bacte´rienne pour obtenir une concentration finale de 2,5 106 mol/L de motifs dans la suspension bacte´rienne (soit une concentration massique de 0,515 mg/mL). 2.2.4. Greffage de pNaSS sur le titane Une modification de la surface des e´chantillons de titane est effectue´e par la me´thode grafting from (greffage a` partir de la surface). Des radicaux peroxyde sont cre´e´s a` la surface du titane par un me´lange acide sulfurique / eau oxyge´ne´e selon des travaux de´crits pre´ce´demment [16,17]. On ajoute ensuite du monome`re NaSS dont la polyme´risation s’effectue a` partir des radicaux pre´sents a` la surface de l’e´chantillon. Les pastilles modifie´es sont ensuite rince´es avec de l’eau distille´e pour e´liminer le monome`re re´siduel et se´che´es a` l’e´tuve.
2.3. Le mate´riel biologique 2.3.1. Les bacte´ries La souche employe´e est la souche S. epidermidis RP 62 (ATCC 35984), maintenue en culture sur ge´lose Mueller Hinton (AES Laboratoire). Un repiquage est effectue´ toutes les trois semaines. Des cultures sont pre´pare´es en bouillon de culture frais (Mueller Hinton MH : AES Laboratoire) et incube´es en suspension a` 37 8C pendant une nuit. La suspension bacte´rienne est centrifuge´e puis remise en suspension dans un milieu frais. Ainsi, 160 mL de cette suspension sont pre´leve´s et ajoute´s a` 1 mL de bouillon MH puis incube´s a` 37 8C pendant trois heures. La suspension bacte´rienne obtenue est centrifuge´e, et les bacte´ries reprises dans du tampon phosphate (PBS, Invitrogen) avec Ca2+ et Mg2+ a` la concentration de 5 106 UFC/mL. 2.3.2. Adhe´rence bacte´rienne sur le titane Les e´chantillons de titane pre´alablement nettoye´s sont place´s dans des puits d’une plaque de 24 puits et pre´adsorbe´s de prote´ines. 1 mL d’une solution d’albumine bovine BSA (Sigma) dans du PBS (0,4 g/L) est ajoute´. Les disques de titane sont incube´s 30 minutes a` 37 8C sous agitation. Apre`s trois lavages au PBS, 1 mL d’une des solutions prote´iques suivantes : fibrinoge`ne (Fg) bio-transfusion, 300 mg/mL de PBS ; fibronectine (Fn) euromedex, 20 mg/mL de PBS, ou plasma humain CT hoˆpital Avicenne, est ajoute´. Apre`s une heure d’agitation a` 37 8C, l’exce`s de prote´ines est e´limine´ par des lavages au PBS. Apre`s l’adsorption de prote´ines, 1 mL de suspension bacte´rienne (106 UFC/mL) est ajoute´ dans chaque puits en pre´sence ou non de polyme`res bioactifs. Les suspensions e´tudie´es sans polyme`re servent de re´fe´rence pour chaque condition prote´ique. L’adhe´rence bacte´rienne est re´alise´e pendant une heure a` 37 8C sous agitation. Chaque expe´rience est effectue´e en triplicata. Le nombre des bacte´ries adhe´re´es sur la surface est e´value´ par microscopie (Microscope Axiolab, Zeiss). Les bacte´ries sont fixe´es avec une solution de formalde´hyde (4 % en PBS) pendant 30 minutes a` 4 8C puis marque´es a` l’iodure de propidium (Sigma) pendant cinq minutes. Les pastilles de titane sont place´es entre lame et lamelle et observe´es a` un grossissement X 100. Quinze photographies sont prises pour chaque condition expe´rimentale afin de calculer le nombre moyen des bacte´ries adhe´re´es par centime`tre carre´ de titane.
3. Re´sultats 3.1. Adhe´rence de Staphylococcus epidermidis sur le titane en pre´sence de pNaSS
Fig. 2. Coefficients d’extinction molaire a` 261 nm des copolyme`res p(MOEP/NaSS) en fonction de leur composition.
Des proprie´te´s inhibitrices de l’adhe´rence bacte´rienne ont e´te´ rapporte´es pour des surfaces recouvertes de pNaSS [12,13]. L’adhe´rence des S. epidermidis sur les pastilles de titane pre´adsorbe´es de prote´ines a e´te´ e´tudie´e en absence et en pre´sence de pNaSS solubles introduits en meˆme temps que les inoculum de suspensions bacte´riennes. Diffe´rentes concentrations en fonction sulfonate ont e´te´ e´tudie´es : 0,75 ; 1,5 et 2,5 mmol/L. En l’absence de polyme`re bioactif, l’adhe´rence de S. epidermidis est la plus e´leve´e lors d’une pre´adsorption de fibrinoge`ne. La pre´sence de polyme`re pNaSS dans le milieu conduit a` une inhibition de l’adhe´rence. En effet, quelle que soit la prote´ine pre´adsorbe´e, une diminution du nombre de bacte´ries adhe´re´es est constate´e lorsque la concentration en pNaSS augmente (Fig. 3). Cependant, cette courbe de dose–re´ponse se stabilise en un plateau d’inhibition lorsque la concentration en motif styre`ne sulfonate exce`de 1,5 mmol/L.
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3.2. Adhe´rence bacte´rienne sur le titane non modifie´ et le titane greffe´ par du pNaSS Le but de cette e´tude est d’e´valuer l’influence de l’activite´ inhibitrice du pNaSS en pre´sence de prote´ines plasmatiques, selon qu’il soit en solution physiologique au contact d’un implant, ou greffe´ par liaison covalente a` la surface de cet implant (Fig. 4). L’adhe´rence de S. epidermidis est e´value´e sur des pastilles de titane : (1) non modifie´es ; (2) non modifie´es en pre´sence de pNaSS dissous dans le milieu d’adhe´rence a` une concentration de 2,5 106 mol/L de fonctions sulfonate (concentration correspondant au plateau d’inhibition) ; (3) greffe´es par du pNaSS. Les re´sultats pre´sente´s en Fig. 5 montrent que sur le titane fonctionnalise´, l’adhe´rence est bien moindre que sur le titane non modifie´. En revanche, l’activite´ inhibitrice du pNaSS est similaire que le polyme`re soit en solution ou greffe´ a` la surface du mate´riau (Fig. 5). Fig. 3. Adhe´rence de S. epidermidis sur le titane pre´adsorbe´ de diffe´rentes prote´ines a` diffe´rentes concentrations de pNaSS contenu dans la suspension bacte´rienne. & : plasma, : fibrinoge`ne, D : fibronectine.
Tableau 1 De´termination de la concentration en pNaSS permettant l’inhibition de 50 % de l’adhe´rence bacte´rienne selon la prote´ine pre´adsorbe´e. Prote´ines pre´adsorbe´es
CI50 de pNaSS (mmol/L de fonctions sulfonate)
Plasma
Fibrinoge`ne
Fibronectine
0,62
0,71
1,7
L’inhibition de l’adhe´rence de S. epidermidis sur la surface du titane en pre´sence de pNaSS est calcule´e en effectuant le rapport des bacte´ries adhe´rentes pour chaque concentration de polyme`re sur les bacte´ries adhe´rentes en absence de polyme`re. La de´termination de la concentration du polyme`re ne´cessaire pour inhiber 50 % des bacte´ries, CI50, est pre´sente´e dans le Tableau 1. Les re´sultats montrent que la CI50 du pNaSS en pre´sence de la fibronectine est trois fois plus importante que celles calcule´es lorsque le titane est pre´adsorbe´ de fibrinoge`ne ou de plasma. L’effet inhibiteur du pNaSS est tre`s inte´ressant, en particulier dans le cas de l’adhe´rence due au fibrinoge`ne, car la litte´rature a rapporte´ la pre´sence de nombreux re´cepteurs du fibrinoge`ne sur la membrane externe de plusieurs souches de S. epidermidis [1,18]. Dans la suite de l’e´tude, nous nous sommes inte´resse´s au plasma, qui est un ensemble prote´ique davantage repre´sentatif des conditions in vivo lors de l’implantation d’une prothe`se.
3.3. Adhe´rence de Staphylococcus epidermidis sur le titane en pre´sence des copolyme`res p(Ma/NaSS) et p(MOEP/NaSS) Bien que les fonctions sulfonate soient reconnues efficaces pour limiter l’adhe´sion bacte´rienne, elles ne sont pas suffisantes pour jouer plusieurs roˆles bioactifs. La pre´sence d’autres groupements fonctionnels dans la composition du polyme`re est ne´cessaire pour diversifier les proprie´te´s biologiques et les applications biome´dicales telle que, par exemple, l’application en orthope´die. A` ce titre, des copolyme`res p(MA/NaSS) et p(MOEP/NaSS) ont e´te´ teste´s car les fonctions carboxylate ou phosphate sont susceptibles d’avoir des interactions avec les tissus vivants, conduisant a` ame´liorer l’oste´ointe´gration d’implants orthope´diques. L’impact de la formulation des copolyme`res sur l’inhibition de l’adhe´rence bacte´rienne a e´te´ e´tudie´. La Fig. 5 pre´sente le pourcentage d’inhibition de l’adhe´rence de S. epidermidis en fonction des compositions des copolyme`res p(MA/NaSS) et p(MOEP/NaSS) explicite´s respectivement par les rapports R et R’ de´finis en e´quation 2. R¼
½CO ½PO2 0 2 3 et R ¼ 2 þ ½SO3 ½PO3 þ ½SO 3
½CO 2
(2)
L’adhe´sion sur des pastilles de titane pre´adsorbe´es de plasma a e´te´ re´alise´e en pre´sence de diffe´rentes formulations de copolyme`res a` une concentration molaire en motifs de 2,5 106 mol/L et compare´e a` celle obtenue lors de la pre´sence de l’homopolyme`re pNaSS servant de re´fe´rence (pourcentage d’inhibition de l’adhe´rence bacte´rienne : 68 3 %). Les re´sultats montrent une meˆme tendance ge´ne´rale qui est une faible diminution de l’inhibition de l’adhe´rence lorsque la teneur en fonctions phosphate ou carboxylate
Fig. 4. Illustration de l’adhe´rence de S. epidermidis selon la relation entre le polyme`re bioactif pNaSS et l’e´chantillon en titane. (i) : absence de pNaSS, (ii) : pNaSS en solution, (iii) : pNaSS greffe´.
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Fig. 5. Nombre moyen de bacte´ries adhe´rentes ( de´viation standard, n = 15), en pre´sence de plasma, sur le support en titane selon la nature de la liaison avec le pNaSS. E´tude statistique par test Anova, * : p < 0,01.
Fig. 6. Inhibition de l’adhe´rence de S. epidermidis sur le titane pre´adsorbe´ de plasma a` une concentration de 2,5 10-6 mol/L de motifs de diffe´rentes compositions de copolyme`res. D : p(MA/NaSS), * : p(MOEP/NaSS).
augmente. Ce re´sultat incombe a` la diminution de la teneur en fonction sulfonate et corrobore les re´sultats pre´ce´dents avec une diminution de l’inhibition lorsque la concentration en fonction sulfonate est moindre, tant que l’on n’atteint pas le plateau d’inhibition. Quelle que soit la composition des copolyme`res e´tudie´s, on peut conside´rer que l’inhibition de l’adhe´rence bacte´rienne n’est pas significativement plus basse que celle du pNaSS, tant que la proportion molaire en fonction sulfonate reste supe´rieure a` 50 % (R ou R’ infe´rieur a` 0,5). Ainsi, les compositions de copolyme`res pre´sentant une proportion minimale de 50 % de fonctions sulfonate pre´sentent un inte´reˆt the´rapeutique certain, car ils sont susceptibles d’exercer a` la fois une activite´ antibacte´rienne similaire a` celle du pNaSS, et de promouvoir une autre activite´ biologique graˆce aux autres groupements fonctionnels qu’ils posse`dent (Fig. 6).
4. Discussion L’infection sur mate´riau implante´ repre´sente actuellement un proble`me de sante´ publique. Diffe´rentes approches ont e´te´ de´veloppe´es afin de re´duire l’attachement des bacte´ries aux
mate´riaux, premie`re e´tape de la colonisation de l’implant. L’inhibition de l’adhe´rence bacte´rienne par des techniques traditionnelles d’impre´gnation de mate´riaux a e´te´ largement reporte´e dans la litte´rature [19,20]. L’approche effectue´e lors de ce travail est diffe´rente et consiste a` introduire une chaıˆne macromole´culaire comportant des groupements fonctionnels bioactifs, tels les fonctions sulfonate. En effet, ces fonctions ont montre´ leur efficacite´ dans l’inhibition de l’adhe´rence bacte´rienne [11,14]. L’objectif de ce travail a e´te´ d’e´tudier l’activite´ de polyme`res, comportant en sus des groupements sulfonates (SO3), des fonctions carboxylate (COO) et/ou phosphate (PO42), vis-a`-vis de l’inhibition de l’adhe´rence de S. epidermidis sur le titane en pre´sence de prote´ines plasmatiques. Le titane constitue un mate´riau de choix utilise´ dans la confection de nombreux dispositifs me´dicaux, comme les implants biomate´riaux me´talliques orthope´diques et dentaires. Le choix de pre´-absorber nos pastilles de titane par des prote´ines plasmatiques permet de se rapprocher de la situation in vivo. Il est admis que ces prote´ines participent a` l’interaction cellules/biomate´riaux, comme l’ont de´montre´ Jarvis et Bryers concernant la fibronectine [21]. En effet, tre`s rapidement apre`s l’implantation, les prote´ines pre´sentes dans le plasma et les liquides inflammatoires s’adsorbent a` la surface de l’implant. Les groupes chimiques pre´sents a` la surface de l’implant interagissent avec les prote´ines du milieu environnant et ces interactions peuvent s’ave´rer irre´versibles et conduire a` une perte de l’activite´ biologique des prote´ines adsorbe´es. Parmi ces prote´ines, le fibrinoge`ne est pre´sent dans le plasma a` une concentration de 3 mg/mL et son adsorption a e´te´ largement documente´e [22]. Les re´cepteurs du fibrinoge`ne, appele´s clumping factor (Clf) A et B jouent un roˆle central dans la colonisation de l’implant par S. epidermidis pouvant ge´ne´rer des infections pre´judiciables au patient [2,18,23]. Un traitement de la surface de l’implant par du pNaSS serait alors pertinent pour limiter le risque d’adhe´rence, dans l’hypothe`se ou` son interaction rapide avec les prote´ines limiterait la disponibilite´ des sites de reconnaissance par les adhe´sines des bacte´ries. Le test d’adhe´rence en incubant du pNaSS en solution en meˆme temps que les bacte´ries sur les pastilles de titane a pre´sente´ des re´sultats tre`s inte´ressants. En effet, quelle que soit la nature des prote´ines pre´adsorbe´es, une baisse du nombre de bacte´ries adhe´re´es est observe´e lorsque la concentration en polyme`re, introduit simultane´ment aux bacte´ries, augmente. Ainsi, le pNaSS est tre`s actif vis-a`-vis de S. epidermidis en pre´sence de plasma : sa concentration inhibitrice (CI50) est de l’ordre de 0,62 mmol/L de motifs (soit une concentration massique de 0,130 mg/mL, significativement moindre que celles des autres prote´ines teste´es, notamment la fibronectine. L’activite´ inhibitrice de l’adhe´rence bacte´rienne de ces copolyme`res anioniques peut eˆtre compare´e a` celle de polyme`res comportant des fonctions ammonium quaternaire, couramment utilise´s pour leur activite´ biocide. Le mode d’action de ces mate´riaux cationiques est cependant diffe´rent, car l’activite´ biocide est due a` l’adsorption des fonctions ammonium quaternaire sur la surface anionique de la bacte´rie. Les groupements ammonium migrent ensuite a` l’inte´rieur des membranes cytoplasmiques et provoque sa lyse, ce qui engendre la mort de la bacte´rie [24]. La longueur de chaıˆne des groupements alkyle porte´s par l’ammonium quaternaire exerce un roˆle important sur l’activite´ biocide. Comme l’ont rapporte´ Eren et al. concernant l’activite´ antibacte´rienne de polynorborne`nes hydrosolubles comportant des ammoniums quaternaires avec des chaıˆnes alkyles de diffe´rente longueur, l’inhibition de la prolife´ration bacte´rienne est la plus importante lorsque les chaıˆnes alkyles posse`dent plus de six carbones [25]. Les auteurs ont alors releve´ une inhibition de 90 % de la prolife´ration bacte´rienne pour des concentrations en
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polyme`res de l’ordre de 10 mg/mL. Dans le cas de notre e´tude, une inhibition de 50 % de l’adhe´rence est obtenue pour une concentration 20 fois infe´rieure. Ainsi, bien que les parame`tres e´tudie´s ne soient pas les meˆmes, cette comparaison souligne une activite´ antibacte´rienne des copolyme`res que nous avons synthe´tise´s a` tre`s faible concentration. En outre, on e´vite le manque de se´lectivite´ souligne´ par Eren dans le cas des ammoniums quaternaires a` longue chaıˆne alkyle qui s’ave`rent e´galement eˆtre cytotoxiques [25]. Les copolyme`res, p(MA/NaSS) et p(MOEP/NaSS), ont e´te´ teste´s selon le meˆme protocole expe´rimental que celui applique´ au pNaSS en solution quant a` leur activite´ sur l’adhe´rence de S. epidermidis en pre´sence de plasma. Les fonctions phosphate ont de´ja` e´te´ e´tudie´es par Jung [26] qui a modifie´ du chitosane en lui greffant du MOEP. Il s’est ave´re´ que ces mate´riaux pre´sentaient une activite´ antimicrobienne supe´rieure a` 95 %, significativement augmente´e par rapport a` celle du chitosane de´ace´tyle´. Ceci justifie la pertinence des fonctions phosphate pour une e´ventuelle application antibacte´rienne. Les copolyme`res comportant en partie des fonctions carboxylate ou phosphate induisent une inhibition similaire mais le´ge`rement infe´rieure a` celle calcule´e pour le pNaSS seul. Il suffit cependant de conserver un minium de 50 % de fonctions sulfonate dans la composition des copolyme`res pour conserver une inhibition du meˆme ordre de grandeur que la re´fe´rence pNaSS. L’inte´reˆt du couplage des groupements sulfonate avec les groupements carboxylate et/ou phosphate est d’avoir acce`s a` d’autres proprie´te´s bioactives comme l’oste´ointe´gration, et donc de cumuler plusieurs proprie´te´s au sein d’un meˆme mate´riau. L’objectif final en termes d’application biome´dicale est de fonctionnaliser la surface d’un implant par des polyme`res bioactifs. Le greffage du polyme`re pNaSS sur le titane par la me´thode de Mayingi et al. permet de ge´ne´rer une surface provoquant une inhibition de l’adhe´rence de S. epidermidis sensiblement ame´liore´e par rapport a` celle obtenue lors de l’ajout du polyme`re en solution [17]. L’explication propose´e rele`ve du fait que les conformations prote´iques sont modifie´es par la pre´sence des groupements fonctionnels jouant un roˆle sur les sites de reconnaissance des prote´ines. Dans le cas du greffage, le polyme`re pre´sentant des groupements ioniques est lie´ par une liaison covalente a` la surface du titane, ce qui permet un bon controˆle de l’adsorption des prote´ines, alors que dans l’autre cas, le polyme`re en solution n’est pas stabilise´ sur le titane. Comme la re´ponse biologique de´pend de la conformation des prote´ines pre´adsorbe´es, toute modification chimique sciemment choisie de la surface peut ge´ne´rer une activite´ anti-adhe´sive et/ou antiprolife´rative vis-a`-vis des bacte´ries. 5. Conclusion L’objectif de cette e´tude e´tait d’e´tablir et d’e´valuer l’activite´ inhibitrice de diffe´rents polyme`res bioactifs vis-a`-vis de l’adhe´rence de S. epidermidis sur une surface en titane mode´lisant un implant. Les expe´riences in vitro ont principalement e´te´ mene´es avec le pNaSS, polyme`re de re´fe´rence de l’e´tude, les fonctions sulfonate e´tant reconnues pour leur activite´ anti-bacte´rienne. De ce travail, il ressort que les fonctions ioniques bioactives sont susceptibles de re´agir avec les prote´ines en bloquant certains de leurs sites avec lesquels S. epidermidis interagit normalement. L’interaction bacte´ries – biomate´riaux via les prote´ines peut ainsi eˆtre limite´e, comme il est montre´ avec succe`s avec toutes les prote´ines e´tudie´es, et particulie`rement le fibrinoge`ne, prote´ine reconnue pour posse´der de nombreux re´cepteurs de fixation de S. epidermidis. Des tests mene´s avec le plasma sanguin, repre´sentatif de l’ensemble prote´ique in vivo, ont mis en e´vidence l’activite´ inhibitrice du pNaSS que celui-ci soit dissous dans la suspension
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bacte´rienne ou greffe´ a` la surface de l’implant. Des e´tudes restent cependant a` re´aliser afin d’e´valuer l’activite´ inhibitrice des polyme`res sur d’autres souches bacte´riennes notamment celles productrices de slime implique´es dans les infections sur corps e´tranger. La possibilite´ de fonctionnaliser la surface d’un implant par un polyme`re bioactif ouvre une nouvelle voie prometteuse pour un traitement local susceptible de limiter les infections nosocomiales. Enfin, des e´tudes ont e´te´ effectue´es avec des copolyme`res p(MOEP/NaSS) et p(MA/NaSS) comprenant respectivement des fonctions phosphate ou carboxylate en sus des fonctions sulfonate. Il a e´te´ montre´ que l’activite´ inhibitrice de l’adhe´rence bacte´rienne est proche de celle du pNaSS, tant que la proportion molaire de fonctions sulfonate de ces copolyme`res reste supe´rieure a` 50 %. On peut ainsi envisager le greffage de nouveaux copolyme`res pouvant exercer plusieurs activite´s bioactives simultane´es, telle une ame´lioration de l’oste´o-inte´gration de l’implant ge´ne´re´e par les fonctions phosphate en outre de l’activite´ inhibitrice de l’adhe´rence bacte´rienne provoque´e par les fonctions sulfonate. De´claration d’inte´reˆts Les auteurs de´clarent ne pas avoir de conflits d’inte´reˆts en relation avec cet article. Re´fe´rences [1] Vaudaux P, Yasuda H, Velazco MI, Huggler E, Ratti I, Waldvogel FA, et al. Role of host and bacterial factors in modulating staphylococcal adhesion to implanted polymer surfaces. J Biomater Appl 1990;5:134–53. [2] Arciola CR, Donati ME, Montanaro L. Adhesion to a polymeric biomaterial affects the antibiotic resistance of Staphylococcus epidermidis. New Microbiol 2001;24:63–8. [3] Chang CC, Merritt K. Infection at the site of implanted materials with and without preadhered bacteria. J Orthop Res 1994;12:526–31. [4] Darouiche RO, Landon GC, Patti JM, Nguyen LL, Fernau RC, McDevitt D, et al. Role of Staphylococcus aureus surface adhesins in orthopaedic device infections: are results model-dependent? J Med Microbiol 1997;46:75–9. [5] Gagnon RF, Richards GK, Subang R. Experimental Staphylococcus epidermidis implant infection in the mouse. Kinetics of rifampin and vancomycin action. Asaio J 1992;38:M596–599. [6] Vaudaux P, Suzuki R, Waldvogel FA, Morgenthaler JJ, Nydegger UE. Foreign body infection: role of fibronectin as a ligand for the adherence of Staphylococcus aureus. J Infect Dis 1984;150:546–53. [7] Finch RG, Pritchard DI, Bycroft BW, Williams P, Stewart GS. Quorum sensing: a novel target for anti-infective therapy. J Antimicrob Chemother 1998;42: 569–71. [8] Khardori N, Yassien M. Biofilms in device-related infections. J Ind Microbiol 1995;15:141–7. [9] Darouiche RO. Prevention of vascular catheter-related infections. Neth J Med 1999;55:92–9. [10] Francois P, Letourneur D, Lew DP, Jozefonwicz J, Vaudaux P. Inhibition by heparin and derivatized dextrans of Staphylococcus epidermidis adhesion to in vitro fibronectin-coated or explanted polymer surfaces. J Biomater Sci Polym Ed 1999;10:1207–21. [11] Bauer T, Pavon-Djavid G, He´lary G, Lortat-Jacob A, Migonney V. 289 inhibition de l’adhe´rence bacte´rienne sur le ciment. Rev Chir Orthop Reparatr Appar Mot 2007;93:156–1156. [12] Berlot S, Aissaoui Z, Pavon-Djavid G, Belleney J, Jozefowicz M, Helary G, et al. Biomimetic poly(methyl methacrylate)-based terpolymers: modulation of bacterial adhesion effect. Biomacromolecules 2002;3:63–8. [13] Berlot-Moirez S, Pavon-Djavid G, Mondargent B, Jozefowicz M, Migonney V. Modulation of Staphylococcus aureus adhesion by biofunctional copolymers derived from polystyrene. ITBM 2002;23:102–8. [14] Anagnostou F, Debet A, Pavon-Djavid G, Goudaby Z, Helary G, Migonney V. Osteoblast functions on functionalized pmma-based polymers exhibiting Staphylococcus aureus adhesion inhibition. Biomaterials 2006;27:3912–9. [15] Francois P, Vaudaux P, Foster TJ, Lew DP. Host-bacteria interactions in foreign body infections. Infect Control Hosp Epidemiol 1996;17:514–20. [16] Antoci Jr V, Adams CS, Parvizi J, Davidson HM, Composto RJ, Freeman TA, et al. The inhibition of Staphylococcus epidermidis biofilm formation by vancomycinmodified titanium alloy and implications for the treatment of periprosthetic infection. Biomaterials 2008;29:4684–90. [17] Mayingi J, Helary G, Noirclere F, Bacroix B, Migonney V. Grafting of bioactive polymers onto titanium surfaces and human osteoblasts response. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc 2007;5119–22.
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Article original
Inhibition de l’adhe´rence de Staphylococcus epidermidis sur des surfaces en titane par des polyme`res hydrosolubles bioactifs comportant des fonctions sulfonate, phosphate ou carboxylate Inhibition of Staphylococcus epidermidis adhesion on titanium surface with bioactive water-soluble copolymers bearing sulfonate, phosphate or carboxylate functions L. Poussard a,*, C.P. Oue´draogo b, G. Pavon-Djavid c, V. Migonney b a
De´partement de chimie, institut Galile´e, universite´ Paris-13, 99, avenue Jean-Baptiste-Cle´ment, 93430 Villetaneuse, France CSPBAT, FRE 3043, institut Galile´e, universite´ Paris-13, 99, avenue Jean-Baptiste-Cle´ment, 93430 Villetaneuse, France c BPC, Inserm U 698, institut Galile´e, universite´ Paris-13, 99, avenue Jean-Baptiste-Cle´ment, 93430 Villetaneuse, France b
I N F O A R T I C L E
R E´ S U M E´
Historique de l’article : Rec¸u le 14 septembre 2009 Accepte´ le 1 juillet 2010
Les prothe`ses implante´es chez l’homme sont parfois sujettes a` des infections bacte´riennes qui vont jusqu’a` menacer leur pe´rennite´. Diffe´rentes me´thodes sont en cours d’e´tude pour lutter contre ces infections, parmi lesquelles le greffage sur la surface de la prothe`se, de polyme`res bioactifs, se re´ve`le une solution prometteuse. Ce travail pre´sente l’influence de diffe´rents polyme`res bioactifs hydrosolubles sur l’inhibition de l’adhe´rence de Staphylococcus epidermidis a` la surface d’e´chantillons en titane initialement pre´adsorbe´s de diffe´rentes prote´ines. Quelle que soit la prote´ine e´tudie´e, il est montre´ que le polyme`re bioactif comportant des fonctions sulfonate ge´ne`re une inhibition de l’adhe´rence de S. epidermidis. Lors d’une pre´adsorption de plasma, l’inhibition est de l’ordre de 68 % lorsque la concentration en fonction sulfonate est de 2,5 mmol/L. Des surfaces de titane greffe´es par le polyme`re bioactif ont e´galement e´te´ teste´es. On retrouve une activite´ inhibitrice de l’adhe´rence similaire a` celle du cas pre´ce´dent. Ces re´sultats pre´liminaires sont de nature a` susciter un inte´reˆt clinique dans la lutte contre l’infection des dispositifs me´dicaux, car ils mettent en e´vidence un net effet local d’inhibition de l’adhe´rence de S. epidermidis. Des copolyme`res comportant d’autres groupements fonctionnels (phosphate ou carboxylate) ont e´te´ dissous dans une suspension bacte´rienne afin de de´terminer l’influence de la composition sur l’inhibition de l’adhe´rence bacte´rienne. Les taux d’inhibition obtenus pour ces copolyme`res ne sont pas significativement infe´rieurs a` ceux de l’homopolyme`re comportant exclusivement des fonctions sulfonate, tant que la proportion en fonction sulfonate reste supe´rieure a` 50 %. La fonction sulfonate est donc la principale responsable de l’inhibition de l’adhe´rence de S. epidermidis. ß 2010 Elsevier Masson SAS. Tous droits re´serve´s.
Mots cle´s : Adhe´rence Staphylococcus epidermidis Inhibition Titane Polyme`re bioactif Sulfonate Carboxylate Phosphate
A B S T R A C T
Keywords: Adhesion Staphylococcus epidermidis Inhibition Titane Bioactive polymer Sulfonate Carboxylate Phosphate
Implanted prostheses are sometimes subject to bacterial infections, which can threat their benefit rule on a long-term basis. Various methods are studied to fight against these infections. Among them, the grafting of bioactive polymers onto the prosthesis surface shows up as a promising way to the problem of infections. This work presents the influence of various water-soluble bioactive polymers on the inhibition of the Staphylococcus epidermidis adhesion on the titanium samples surfaces initially preadsorbed with various proteins. Whatever the studied protein is, it is shown that the bioactive polymer containing sulfonate functions generates an inhibition of the adhesion of Staphylococcus epidermidis. For a plasma preadsorption, the inhibition rate rises up to 68% when the concentration of sulfonate function is 2.5 mmol/L. Titanium surfaces grafted with the bioactive polymer were also tested. We find an inhibitive activity of the adhesion close to that of the previous case. These preliminary results can point up a clinical interest in the fight against the medical devices infection, because they highlight a
* Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (L. Poussard), [email protected] (G. Pavon-Djavid). 0369-8114/$ – see front matter ß 2010 Elsevier Masson SAS. Tous droits re´serve´s. doi:10.1016/j.patbio.2010.07.004
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clear local effect of S. epidermidis adhesion inhibition. Copolymers containing other functional groups (phosphate or carboxylate) were dissolved in a bacterial suspension to monitor the influence of the composition on the adhesion inhibition. Their inhibition rates are not significantly lower than those of pNaSS homopolymers, as much as the sulfonate function proportion remains higher than 50%. Thus, the sulfonate function is the main responsible for the inhibition of the S. epidermidis adhesion. ß 2010 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.
1. Introduction Les infections associe´es a` l’utilisation des biomate´riaux aboutissent fre´quemment a` l’e´chec des implants me´dicaux. Des e´tudes portant sur des implants explante´s ainsi que des e´tudes in vitro ont montre´ que l’adhe´sion bacte´rienne sur les biomate´riaux e´tait une e´tape importante dans le de´veloppement de l’infection [1]. En effet, les bacte´ries peuvent s’attacher a` la surface des biomate´riaux directement ou par l’interme´diaire des prote´ines d’adhe´rence. Une fois adhe´re´es, leur comportement peut changer. Par exemple, elles peuvent e´voluer vers une virulence accrue et/ou une re´sistance supe´rieure aux me´canismes de de´fense de l’hoˆte ou aux antibiotiques [2]. Plusieurs e´tudes sur l’adhe´rence et la colonisation de Staphyloccocus epidermidis ont e´te´ mene´es in vivo et in vitro sur des mate´riaux polyme`res destine´s a` la fabrication d’implants. Les conclusions ont re´ve´le´ que la propension de cette bacte´rie a` coloniser ces mate´riaux est corre´le´e avec sa pathoge´nicite´ [3–6]. Beaucoup de microorganismes et en particulier S. epidermidis, une fois adhe´re´s, cre´ent des films protecteurs et complexes de mucopolysaccharides, connus sous le nom de biofilms, qui augmentent la stabilite´ des colonies et pour e´chapper a` re´action immune de l’hoˆte [7]. Apre`s formation du biofilm, les bacte´ries peuvent s’en extraire pour devenir des satellites libres qui e´migrent et s’attachent a` d’autres surfaces non colonise´es. La structure du biofilm facilite e´galement la communication de cellule-a`-cellule, promouvant des changements phe´notypiques, l’adaptation contre la re´action immune, cela favorise les processus ge´ne´tiques de transfert de la re´sistance aux antibiotiques [8]. Il est tre`s difficile d’e´liminer des bacte´ries dans une colonie adhe´rente qui a forme´ un biofilm car elle devienne re´fractaire aux antimicrobiens. Parmi les solutions propose´es pour e´viter la formation du biofilm, l’e´laboration de nouvelles surfaces inhibitrices de l’adhe´rence des bacte´ries a fait l’objet de plusieurs recherches. Diffe´rentes approches ont e´te´ de´veloppe´es afin de re´duire l’attachement des bacte´ries aux mate´riaux polyme`res. En particulier, les techniques d’impre´gnation du mate´riau par des antiseptiques et/ou des antibiotiques ou les modifications de surface par greffage chimique ou par incorporation de mole´cules biologiques telles que l’he´parine, permettent d’obtenir une diminution sensible de l’adhe´rence bacte´rienne [9]. Ainsi Franc¸ois et al. montrent l’inhibition de l’adhe´rence de S. epidermidis par l’he´parine et par des polysaccharides sulfate´s en solution sur des surfaces de poly(me´thyle me´thacrylate) pre´alablement adsorbe´es de fibronectine [10]. Nous avons montre´ qu’en fonction de leur composition chimique, certains polyme`res fonctionnels peuvent avoir un effet d’inhibition sur l’adhe´rence et la prolife´ration bacte´rienne tout en favorisant l’adhe´rence cellulaire [11–14]. Notre travail s’inscrit dans ce cadre, et l’objectif de cette e´tude est de de´velopper de nouvelles formulations a` usage biome´dical permettant de re´pondre a` ces deux crite`res suivants : (1) limiter l’adhe´rence bacte´rienne, (2) confe´rer un roˆle bioactif aux biomate´riaux implante´s vis-a`-vis des tissus environnants, et notamment les tissus osseux. C’est ainsi que nous avons e´te´ conduit a` synthe´tiser des polyme`res porteurs de groupements sulfonate, carboxylate et phosphate et a` e´valuer leurs proprie´te´s. Par ailleurs, le roˆle des prote´ines plasmatiques a e´te´ mis en e´vidence par Franc¸ois et al. qui ont de´montre´ l’influence des prote´ines sur les premie`res e´tapes de la colonisation bacte´rienne [15].
Des homopolyme`res et copolyme`res solubles comportant des groupements sulfonate, carboxylate ou phosphate ont e´te´ synthe´tise´s puis purifie´s et caracte´rise´s. La capacite´ de ces nouveaux polyme`res a` inhiber l’adhe´rence de S. epidermidis a e´te´ e´value´e sur des surfaces en titane pre´adsobe´es de prote´ines dans l’objectif de se rapprocher de l’environnement physiologique du mate´riau une fois implante´. 2. Mate´riels et me´thodes 2.1. Le support en titane Le titane utilise´ (purete´ : 99,7 %, Alfa Aesar GmbH & Co.KG) se pre´sente sous forme d’une plaque de 200 mm 200 mm et d’e´paisseur 0,5 mm obtenue par laminage. Des e´chantillons sont de´coupe´s dans cette plaque, sous forme de pastilles carre´es de 1 cm2 de surface. Avant toute utilisation, ces pastilles de titane sont soumises a` un de´capage a` l’ace´tone afin d’e´liminer toute impurete´. On proce`de ensuite a` un nettoyage sous agitation magne´tique avec diffe´rentes solutions. Le protocole ope´re´ est le suivant : trois fois trois heures dans une solution de NaCl a` 1,5 M, trois fois trois heures dans une solution de NaCl a` 0,15 M, trois fois trois heures dans de l’eau distille´e, et enfin trois fois trois heures dans du sulfure de plomb (II) (PbS) sans Ca2+–Mg2+. Les pastilles sont ensuite ste´rilise´es sous UV pendant 15 minutes par face et conserve´es dans du PbS sans Ca2+–Mg2+ ste´rile a` 4 8C. 2.2. Les polyme`res 2.2.1. Purification des re´actifs Le styre`ne sulfonate de sodium NaSS (ACROS ORGANICS), de masse molaire M = 206 g/mol est purifie´ par recristallisation dans un me´lange eau/e´thanol 10/ 90 en volume. Apre`s filtration et se´chage sous vide, on obtient un solide sous forme de paillettes blanches. L’acide me´thacrylique MA (Aldrich) (M = 86 g/mol) est purifie´ par distillation a` 30 8C. Le me´thacryloyloxye´thyl phosphate (MOEP) (Aldrich) (M = 210 g/mol) est dissous dans du te´trahydrofurane a` une concentration de 1 mol/L et purifie´ par passage sur re´sine afin d’e´liminer les inhibiteurs de polyme´risation. Le monome`re MOEP n’e´tant pas soluble dans l’eau sous sa forme acide, il est neutralise´ par un exce`s d’hydroxyde de sodium en solution aqueuse puis pre´cipite´ dans l’ace´tone. La poudre blanche obtenue, de MOEP de sodium (M = 254 g/mol) est se´che´e dans une e´tuve sous vide. Tous ces monome`res sont finalement conserve´s a` basse tempe´rature (4 8C) avant utilisation. L’amorceur de polyme´risation radicalaire, le 2,2’ azobis[2-(2-imidazolin-2yl)propane] dihydrochloride AIPH (WACO), est utilise´ sans purification pre´alable. 2.2.2. Synthe`se du polyme`re pNaSS et des copolyme`res p(MA/NaSS) et p(MOEP/NaSS) Le polyme`re pNaSS, et les copolyme`res (PMA/NaSS) et p(MOEP/NaSS) sont obtenus par polyme´risation radicalaire des monome`res introduits en proportion variable a` une concentration totale de 0,7 mol/L dans l’eau bidistille´e en pre´sence d’AIPH selon la me´thode de´crite dans la litte´rature par Berlot et al. [12]. Apre`s 16 heures de re´action a` 50 8C sous atmosphe`re d’argon, le milieu re´actionnel est pre´cipite´ dans l’e´thanol. Les polyme`res sont re´cupe´re´s sont forme de poudre blanche et se´che´s dans une e´tuve sous vide. L’utilisation de ces polyme`res pour une expe´rimentation biologique requiert une purification pre´alable effectue´e par dialyse avec des membranes a` un seuil de coupure 1000 g/mol (Spectropor MWCO 1000), qui permettent d’e´liminer les impurete´s (monome`re re´siduel et oligome`res). Pour chaque composition de polyme`re, une solution a` 10 mg/mL est pre´pare´e avec du PBS sans Ca2+–Mg2+. Cette solution est dialyse´e contre le PBS pendant 9 heures en changeant re´gulie`rement le PBS de dialyse, d’amener le pH de la solution a` un pH physiologique de 7,40. La solution purifie´e est finalement passe´e sur microfiltre (2 mm) pour e´liminer tout re´sidu. Les compositions retenues sont les suivantes :
homopolyme`re pNaSS ; copolyme`re p(MA/NaSS) de composition molaire : 100/0, 50/50 et 20/80 ; copolyme`re p(MOEP/NaSS) de composition molaire : 100/0, 70/30, 50/50 et 30/70 (Fig. 1).
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Fig. 1. Structure chimique des polyme`res. a : pNaSS, b : p(MA/NaSS), c : p(MOEP/NaSS)
2.2.3. De´termination de la concentration en groupements sulfonate en solution et de la composition des copolyme`res Afin de de´terminer avec pre´cision les pertes occasionne´es par la dialyse, la concentration molaire en groupements sulfonate des polyme`res mis en solution dans le PBS est analyse´e quantitativement par spectrophotome´trie UV (Spectrome`tre Lambda 25, Perkin Elmer) a` partir de l’absorbance a` 261 nm de la fonction styre`ne sulfonate en utilisant la loi de Beer-Lambert (e´quation 1). A ¼ e:l:C
(1)
avec :
e : coefficient d’extinction molaire (L/mol/cm) ; l : trajet optique de la cellule (cm) ; C : concentration molaire (mol/L) (Fig. 2). La mesure de l’absorbance de la fonction styre`ne sulfonate des copolyme`res permet donc d’en de´duire leur composition molaire par rapport aux concentrations initiales en monome`res introduits. La concentration finale des solutions est ajuste´e a` une valeur de 5 105 mol/L de motifs par dilution dans du PBS. Ces solutions sont ensuite dilue´es afin d’obtenir les concentrations ne´cessaires aux diffe´rents protocoles ope´ratoires. A` titre d’exemple, 50 mL d’une composition sont ajoute´s a` 950 mL de suspension bacte´rienne pour obtenir une concentration finale de 2,5 106 mol/L de motifs dans la suspension bacte´rienne (soit une concentration massique de 0,515 mg/mL). 2.2.4. Greffage de pNaSS sur le titane Une modification de la surface des e´chantillons de titane est effectue´e par la me´thode grafting from (greffage a` partir de la surface). Des radicaux peroxyde sont cre´e´s a` la surface du titane par un me´lange acide sulfurique / eau oxyge´ne´e selon des travaux de´crits pre´ce´demment [16,17]. On ajoute ensuite du monome`re NaSS dont la polyme´risation s’effectue a` partir des radicaux pre´sents a` la surface de l’e´chantillon. Les pastilles modifie´es sont ensuite rince´es avec de l’eau distille´e pour e´liminer le monome`re re´siduel et se´che´es a` l’e´tuve.
2.3. Le mate´riel biologique 2.3.1. Les bacte´ries La souche employe´e est la souche S. epidermidis RP 62 (ATCC 35984), maintenue en culture sur ge´lose Mueller Hinton (AES Laboratoire). Un repiquage est effectue´ toutes les trois semaines. Des cultures sont pre´pare´es en bouillon de culture frais (Mueller Hinton MH : AES Laboratoire) et incube´es en suspension a` 37 8C pendant une nuit. La suspension bacte´rienne est centrifuge´e puis remise en suspension dans un milieu frais. Ainsi, 160 mL de cette suspension sont pre´leve´s et ajoute´s a` 1 mL de bouillon MH puis incube´s a` 37 8C pendant trois heures. La suspension bacte´rienne obtenue est centrifuge´e, et les bacte´ries reprises dans du tampon phosphate (PBS, Invitrogen) avec Ca2+ et Mg2+ a` la concentration de 5 106 UFC/mL. 2.3.2. Adhe´rence bacte´rienne sur le titane Les e´chantillons de titane pre´alablement nettoye´s sont place´s dans des puits d’une plaque de 24 puits et pre´adsorbe´s de prote´ines. 1 mL d’une solution d’albumine bovine BSA (Sigma) dans du PBS (0,4 g/L) est ajoute´. Les disques de titane sont incube´s 30 minutes a` 37 8C sous agitation. Apre`s trois lavages au PBS, 1 mL d’une des solutions prote´iques suivantes : fibrinoge`ne (Fg) bio-transfusion, 300 mg/mL de PBS ; fibronectine (Fn) euromedex, 20 mg/mL de PBS, ou plasma humain CT hoˆpital Avicenne, est ajoute´. Apre`s une heure d’agitation a` 37 8C, l’exce`s de prote´ines est e´limine´ par des lavages au PBS. Apre`s l’adsorption de prote´ines, 1 mL de suspension bacte´rienne (106 UFC/mL) est ajoute´ dans chaque puits en pre´sence ou non de polyme`res bioactifs. Les suspensions e´tudie´es sans polyme`re servent de re´fe´rence pour chaque condition prote´ique. L’adhe´rence bacte´rienne est re´alise´e pendant une heure a` 37 8C sous agitation. Chaque expe´rience est effectue´e en triplicata. Le nombre des bacte´ries adhe´re´es sur la surface est e´value´ par microscopie (Microscope Axiolab, Zeiss). Les bacte´ries sont fixe´es avec une solution de formalde´hyde (4 % en PBS) pendant 30 minutes a` 4 8C puis marque´es a` l’iodure de propidium (Sigma) pendant cinq minutes. Les pastilles de titane sont place´es entre lame et lamelle et observe´es a` un grossissement X 100. Quinze photographies sont prises pour chaque condition expe´rimentale afin de calculer le nombre moyen des bacte´ries adhe´re´es par centime`tre carre´ de titane.
3. Re´sultats 3.1. Adhe´rence de Staphylococcus epidermidis sur le titane en pre´sence de pNaSS
Fig. 2. Coefficients d’extinction molaire a` 261 nm des copolyme`res p(MOEP/NaSS) en fonction de leur composition.
Des proprie´te´s inhibitrices de l’adhe´rence bacte´rienne ont e´te´ rapporte´es pour des surfaces recouvertes de pNaSS [12,13]. L’adhe´rence des S. epidermidis sur les pastilles de titane pre´adsorbe´es de prote´ines a e´te´ e´tudie´e en absence et en pre´sence de pNaSS solubles introduits en meˆme temps que les inoculum de suspensions bacte´riennes. Diffe´rentes concentrations en fonction sulfonate ont e´te´ e´tudie´es : 0,75 ; 1,5 et 2,5 mmol/L. En l’absence de polyme`re bioactif, l’adhe´rence de S. epidermidis est la plus e´leve´e lors d’une pre´adsorption de fibrinoge`ne. La pre´sence de polyme`re pNaSS dans le milieu conduit a` une inhibition de l’adhe´rence. En effet, quelle que soit la prote´ine pre´adsorbe´e, une diminution du nombre de bacte´ries adhe´re´es est constate´e lorsque la concentration en pNaSS augmente (Fig. 3). Cependant, cette courbe de dose–re´ponse se stabilise en un plateau d’inhibition lorsque la concentration en motif styre`ne sulfonate exce`de 1,5 mmol/L.
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3.2. Adhe´rence bacte´rienne sur le titane non modifie´ et le titane greffe´ par du pNaSS Le but de cette e´tude est d’e´valuer l’influence de l’activite´ inhibitrice du pNaSS en pre´sence de prote´ines plasmatiques, selon qu’il soit en solution physiologique au contact d’un implant, ou greffe´ par liaison covalente a` la surface de cet implant (Fig. 4). L’adhe´rence de S. epidermidis est e´value´e sur des pastilles de titane : (1) non modifie´es ; (2) non modifie´es en pre´sence de pNaSS dissous dans le milieu d’adhe´rence a` une concentration de 2,5 106 mol/L de fonctions sulfonate (concentration correspondant au plateau d’inhibition) ; (3) greffe´es par du pNaSS. Les re´sultats pre´sente´s en Fig. 5 montrent que sur le titane fonctionnalise´, l’adhe´rence est bien moindre que sur le titane non modifie´. En revanche, l’activite´ inhibitrice du pNaSS est similaire que le polyme`re soit en solution ou greffe´ a` la surface du mate´riau (Fig. 5). Fig. 3. Adhe´rence de S. epidermidis sur le titane pre´adsorbe´ de diffe´rentes prote´ines a` diffe´rentes concentrations de pNaSS contenu dans la suspension bacte´rienne. & : plasma, : fibrinoge`ne, D : fibronectine.
Tableau 1 De´termination de la concentration en pNaSS permettant l’inhibition de 50 % de l’adhe´rence bacte´rienne selon la prote´ine pre´adsorbe´e. Prote´ines pre´adsorbe´es
CI50 de pNaSS (mmol/L de fonctions sulfonate)
Plasma
Fibrinoge`ne
Fibronectine
0,62
0,71
1,7
L’inhibition de l’adhe´rence de S. epidermidis sur la surface du titane en pre´sence de pNaSS est calcule´e en effectuant le rapport des bacte´ries adhe´rentes pour chaque concentration de polyme`re sur les bacte´ries adhe´rentes en absence de polyme`re. La de´termination de la concentration du polyme`re ne´cessaire pour inhiber 50 % des bacte´ries, CI50, est pre´sente´e dans le Tableau 1. Les re´sultats montrent que la CI50 du pNaSS en pre´sence de la fibronectine est trois fois plus importante que celles calcule´es lorsque le titane est pre´adsorbe´ de fibrinoge`ne ou de plasma. L’effet inhibiteur du pNaSS est tre`s inte´ressant, en particulier dans le cas de l’adhe´rence due au fibrinoge`ne, car la litte´rature a rapporte´ la pre´sence de nombreux re´cepteurs du fibrinoge`ne sur la membrane externe de plusieurs souches de S. epidermidis [1,18]. Dans la suite de l’e´tude, nous nous sommes inte´resse´s au plasma, qui est un ensemble prote´ique davantage repre´sentatif des conditions in vivo lors de l’implantation d’une prothe`se.
3.3. Adhe´rence de Staphylococcus epidermidis sur le titane en pre´sence des copolyme`res p(Ma/NaSS) et p(MOEP/NaSS) Bien que les fonctions sulfonate soient reconnues efficaces pour limiter l’adhe´sion bacte´rienne, elles ne sont pas suffisantes pour jouer plusieurs roˆles bioactifs. La pre´sence d’autres groupements fonctionnels dans la composition du polyme`re est ne´cessaire pour diversifier les proprie´te´s biologiques et les applications biome´dicales telle que, par exemple, l’application en orthope´die. A` ce titre, des copolyme`res p(MA/NaSS) et p(MOEP/NaSS) ont e´te´ teste´s car les fonctions carboxylate ou phosphate sont susceptibles d’avoir des interactions avec les tissus vivants, conduisant a` ame´liorer l’oste´ointe´gration d’implants orthope´diques. L’impact de la formulation des copolyme`res sur l’inhibition de l’adhe´rence bacte´rienne a e´te´ e´tudie´. La Fig. 5 pre´sente le pourcentage d’inhibition de l’adhe´rence de S. epidermidis en fonction des compositions des copolyme`res p(MA/NaSS) et p(MOEP/NaSS) explicite´s respectivement par les rapports R et R’ de´finis en e´quation 2. R¼
½CO ½PO2 0 2 3 et R ¼ 2 þ ½SO3 ½PO3 þ ½SO 3
½CO 2
(2)
L’adhe´sion sur des pastilles de titane pre´adsorbe´es de plasma a e´te´ re´alise´e en pre´sence de diffe´rentes formulations de copolyme`res a` une concentration molaire en motifs de 2,5 106 mol/L et compare´e a` celle obtenue lors de la pre´sence de l’homopolyme`re pNaSS servant de re´fe´rence (pourcentage d’inhibition de l’adhe´rence bacte´rienne : 68 3 %). Les re´sultats montrent une meˆme tendance ge´ne´rale qui est une faible diminution de l’inhibition de l’adhe´rence lorsque la teneur en fonctions phosphate ou carboxylate
Fig. 4. Illustration de l’adhe´rence de S. epidermidis selon la relation entre le polyme`re bioactif pNaSS et l’e´chantillon en titane. (i) : absence de pNaSS, (ii) : pNaSS en solution, (iii) : pNaSS greffe´.
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Fig. 5. Nombre moyen de bacte´ries adhe´rentes ( de´viation standard, n = 15), en pre´sence de plasma, sur le support en titane selon la nature de la liaison avec le pNaSS. E´tude statistique par test Anova, * : p < 0,01.
Fig. 6. Inhibition de l’adhe´rence de S. epidermidis sur le titane pre´adsorbe´ de plasma a` une concentration de 2,5 10-6 mol/L de motifs de diffe´rentes compositions de copolyme`res. D : p(MA/NaSS), * : p(MOEP/NaSS).
augmente. Ce re´sultat incombe a` la diminution de la teneur en fonction sulfonate et corrobore les re´sultats pre´ce´dents avec une diminution de l’inhibition lorsque la concentration en fonction sulfonate est moindre, tant que l’on n’atteint pas le plateau d’inhibition. Quelle que soit la composition des copolyme`res e´tudie´s, on peut conside´rer que l’inhibition de l’adhe´rence bacte´rienne n’est pas significativement plus basse que celle du pNaSS, tant que la proportion molaire en fonction sulfonate reste supe´rieure a` 50 % (R ou R’ infe´rieur a` 0,5). Ainsi, les compositions de copolyme`res pre´sentant une proportion minimale de 50 % de fonctions sulfonate pre´sentent un inte´reˆt the´rapeutique certain, car ils sont susceptibles d’exercer a` la fois une activite´ antibacte´rienne similaire a` celle du pNaSS, et de promouvoir une autre activite´ biologique graˆce aux autres groupements fonctionnels qu’ils posse`dent (Fig. 6).
4. Discussion L’infection sur mate´riau implante´ repre´sente actuellement un proble`me de sante´ publique. Diffe´rentes approches ont e´te´ de´veloppe´es afin de re´duire l’attachement des bacte´ries aux
mate´riaux, premie`re e´tape de la colonisation de l’implant. L’inhibition de l’adhe´rence bacte´rienne par des techniques traditionnelles d’impre´gnation de mate´riaux a e´te´ largement reporte´e dans la litte´rature [19,20]. L’approche effectue´e lors de ce travail est diffe´rente et consiste a` introduire une chaıˆne macromole´culaire comportant des groupements fonctionnels bioactifs, tels les fonctions sulfonate. En effet, ces fonctions ont montre´ leur efficacite´ dans l’inhibition de l’adhe´rence bacte´rienne [11,14]. L’objectif de ce travail a e´te´ d’e´tudier l’activite´ de polyme`res, comportant en sus des groupements sulfonates (SO3), des fonctions carboxylate (COO) et/ou phosphate (PO42), vis-a`-vis de l’inhibition de l’adhe´rence de S. epidermidis sur le titane en pre´sence de prote´ines plasmatiques. Le titane constitue un mate´riau de choix utilise´ dans la confection de nombreux dispositifs me´dicaux, comme les implants biomate´riaux me´talliques orthope´diques et dentaires. Le choix de pre´-absorber nos pastilles de titane par des prote´ines plasmatiques permet de se rapprocher de la situation in vivo. Il est admis que ces prote´ines participent a` l’interaction cellules/biomate´riaux, comme l’ont de´montre´ Jarvis et Bryers concernant la fibronectine [21]. En effet, tre`s rapidement apre`s l’implantation, les prote´ines pre´sentes dans le plasma et les liquides inflammatoires s’adsorbent a` la surface de l’implant. Les groupes chimiques pre´sents a` la surface de l’implant interagissent avec les prote´ines du milieu environnant et ces interactions peuvent s’ave´rer irre´versibles et conduire a` une perte de l’activite´ biologique des prote´ines adsorbe´es. Parmi ces prote´ines, le fibrinoge`ne est pre´sent dans le plasma a` une concentration de 3 mg/mL et son adsorption a e´te´ largement documente´e [22]. Les re´cepteurs du fibrinoge`ne, appele´s clumping factor (Clf) A et B jouent un roˆle central dans la colonisation de l’implant par S. epidermidis pouvant ge´ne´rer des infections pre´judiciables au patient [2,18,23]. Un traitement de la surface de l’implant par du pNaSS serait alors pertinent pour limiter le risque d’adhe´rence, dans l’hypothe`se ou` son interaction rapide avec les prote´ines limiterait la disponibilite´ des sites de reconnaissance par les adhe´sines des bacte´ries. Le test d’adhe´rence en incubant du pNaSS en solution en meˆme temps que les bacte´ries sur les pastilles de titane a pre´sente´ des re´sultats tre`s inte´ressants. En effet, quelle que soit la nature des prote´ines pre´adsorbe´es, une baisse du nombre de bacte´ries adhe´re´es est observe´e lorsque la concentration en polyme`re, introduit simultane´ment aux bacte´ries, augmente. Ainsi, le pNaSS est tre`s actif vis-a`-vis de S. epidermidis en pre´sence de plasma : sa concentration inhibitrice (CI50) est de l’ordre de 0,62 mmol/L de motifs (soit une concentration massique de 0,130 mg/mL, significativement moindre que celles des autres prote´ines teste´es, notamment la fibronectine. L’activite´ inhibitrice de l’adhe´rence bacte´rienne de ces copolyme`res anioniques peut eˆtre compare´e a` celle de polyme`res comportant des fonctions ammonium quaternaire, couramment utilise´s pour leur activite´ biocide. Le mode d’action de ces mate´riaux cationiques est cependant diffe´rent, car l’activite´ biocide est due a` l’adsorption des fonctions ammonium quaternaire sur la surface anionique de la bacte´rie. Les groupements ammonium migrent ensuite a` l’inte´rieur des membranes cytoplasmiques et provoque sa lyse, ce qui engendre la mort de la bacte´rie [24]. La longueur de chaıˆne des groupements alkyle porte´s par l’ammonium quaternaire exerce un roˆle important sur l’activite´ biocide. Comme l’ont rapporte´ Eren et al. concernant l’activite´ antibacte´rienne de polynorborne`nes hydrosolubles comportant des ammoniums quaternaires avec des chaıˆnes alkyles de diffe´rente longueur, l’inhibition de la prolife´ration bacte´rienne est la plus importante lorsque les chaıˆnes alkyles posse`dent plus de six carbones [25]. Les auteurs ont alors releve´ une inhibition de 90 % de la prolife´ration bacte´rienne pour des concentrations en
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polyme`res de l’ordre de 10 mg/mL. Dans le cas de notre e´tude, une inhibition de 50 % de l’adhe´rence est obtenue pour une concentration 20 fois infe´rieure. Ainsi, bien que les parame`tres e´tudie´s ne soient pas les meˆmes, cette comparaison souligne une activite´ antibacte´rienne des copolyme`res que nous avons synthe´tise´s a` tre`s faible concentration. En outre, on e´vite le manque de se´lectivite´ souligne´ par Eren dans le cas des ammoniums quaternaires a` longue chaıˆne alkyle qui s’ave`rent e´galement eˆtre cytotoxiques [25]. Les copolyme`res, p(MA/NaSS) et p(MOEP/NaSS), ont e´te´ teste´s selon le meˆme protocole expe´rimental que celui applique´ au pNaSS en solution quant a` leur activite´ sur l’adhe´rence de S. epidermidis en pre´sence de plasma. Les fonctions phosphate ont de´ja` e´te´ e´tudie´es par Jung [26] qui a modifie´ du chitosane en lui greffant du MOEP. Il s’est ave´re´ que ces mate´riaux pre´sentaient une activite´ antimicrobienne supe´rieure a` 95 %, significativement augmente´e par rapport a` celle du chitosane de´ace´tyle´. Ceci justifie la pertinence des fonctions phosphate pour une e´ventuelle application antibacte´rienne. Les copolyme`res comportant en partie des fonctions carboxylate ou phosphate induisent une inhibition similaire mais le´ge`rement infe´rieure a` celle calcule´e pour le pNaSS seul. Il suffit cependant de conserver un minium de 50 % de fonctions sulfonate dans la composition des copolyme`res pour conserver une inhibition du meˆme ordre de grandeur que la re´fe´rence pNaSS. L’inte´reˆt du couplage des groupements sulfonate avec les groupements carboxylate et/ou phosphate est d’avoir acce`s a` d’autres proprie´te´s bioactives comme l’oste´ointe´gration, et donc de cumuler plusieurs proprie´te´s au sein d’un meˆme mate´riau. L’objectif final en termes d’application biome´dicale est de fonctionnaliser la surface d’un implant par des polyme`res bioactifs. Le greffage du polyme`re pNaSS sur le titane par la me´thode de Mayingi et al. permet de ge´ne´rer une surface provoquant une inhibition de l’adhe´rence de S. epidermidis sensiblement ame´liore´e par rapport a` celle obtenue lors de l’ajout du polyme`re en solution [17]. L’explication propose´e rele`ve du fait que les conformations prote´iques sont modifie´es par la pre´sence des groupements fonctionnels jouant un roˆle sur les sites de reconnaissance des prote´ines. Dans le cas du greffage, le polyme`re pre´sentant des groupements ioniques est lie´ par une liaison covalente a` la surface du titane, ce qui permet un bon controˆle de l’adsorption des prote´ines, alors que dans l’autre cas, le polyme`re en solution n’est pas stabilise´ sur le titane. Comme la re´ponse biologique de´pend de la conformation des prote´ines pre´adsorbe´es, toute modification chimique sciemment choisie de la surface peut ge´ne´rer une activite´ anti-adhe´sive et/ou antiprolife´rative vis-a`-vis des bacte´ries. 5. Conclusion L’objectif de cette e´tude e´tait d’e´tablir et d’e´valuer l’activite´ inhibitrice de diffe´rents polyme`res bioactifs vis-a`-vis de l’adhe´rence de S. epidermidis sur une surface en titane mode´lisant un implant. Les expe´riences in vitro ont principalement e´te´ mene´es avec le pNaSS, polyme`re de re´fe´rence de l’e´tude, les fonctions sulfonate e´tant reconnues pour leur activite´ anti-bacte´rienne. De ce travail, il ressort que les fonctions ioniques bioactives sont susceptibles de re´agir avec les prote´ines en bloquant certains de leurs sites avec lesquels S. epidermidis interagit normalement. L’interaction bacte´ries – biomate´riaux via les prote´ines peut ainsi eˆtre limite´e, comme il est montre´ avec succe`s avec toutes les prote´ines e´tudie´es, et particulie`rement le fibrinoge`ne, prote´ine reconnue pour posse´der de nombreux re´cepteurs de fixation de S. epidermidis. Des tests mene´s avec le plasma sanguin, repre´sentatif de l’ensemble prote´ique in vivo, ont mis en e´vidence l’activite´ inhibitrice du pNaSS que celui-ci soit dissous dans la suspension
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bacte´rienne ou greffe´ a` la surface de l’implant. Des e´tudes restent cependant a` re´aliser afin d’e´valuer l’activite´ inhibitrice des polyme`res sur d’autres souches bacte´riennes notamment celles productrices de slime implique´es dans les infections sur corps e´tranger. La possibilite´ de fonctionnaliser la surface d’un implant par un polyme`re bioactif ouvre une nouvelle voie prometteuse pour un traitement local susceptible de limiter les infections nosocomiales. Enfin, des e´tudes ont e´te´ effectue´es avec des copolyme`res p(MOEP/NaSS) et p(MA/NaSS) comprenant respectivement des fonctions phosphate ou carboxylate en sus des fonctions sulfonate. Il a e´te´ montre´ que l’activite´ inhibitrice de l’adhe´rence bacte´rienne est proche de celle du pNaSS, tant que la proportion molaire de fonctions sulfonate de ces copolyme`res reste supe´rieure a` 50 %. On peut ainsi envisager le greffage de nouveaux copolyme`res pouvant exercer plusieurs activite´s bioactives simultane´es, telle une ame´lioration de l’oste´o-inte´gration de l’implant ge´ne´re´e par les fonctions phosphate en outre de l’activite´ inhibitrice de l’adhe´rence bacte´rienne provoque´e par les fonctions sulfonate. De´claration d’inte´reˆts Les auteurs de´clarent ne pas avoir de conflits d’inte´reˆts en relation avec cet article. Re´fe´rences [1] Vaudaux P, Yasuda H, Velazco MI, Huggler E, Ratti I, Waldvogel FA, et al. Role of host and bacterial factors in modulating staphylococcal adhesion to implanted polymer surfaces. J Biomater Appl 1990;5:134–53. [2] Arciola CR, Donati ME, Montanaro L. Adhesion to a polymeric biomaterial affects the antibiotic resistance of Staphylococcus epidermidis. New Microbiol 2001;24:63–8. [3] Chang CC, Merritt K. Infection at the site of implanted materials with and without preadhered bacteria. J Orthop Res 1994;12:526–31. [4] Darouiche RO, Landon GC, Patti JM, Nguyen LL, Fernau RC, McDevitt D, et al. Role of Staphylococcus aureus surface adhesins in orthopaedic device infections: are results model-dependent? J Med Microbiol 1997;46:75–9. [5] Gagnon RF, Richards GK, Subang R. Experimental Staphylococcus epidermidis implant infection in the mouse. Kinetics of rifampin and vancomycin action. Asaio J 1992;38:M596–599. [6] Vaudaux P, Suzuki R, Waldvogel FA, Morgenthaler JJ, Nydegger UE. Foreign body infection: role of fibronectin as a ligand for the adherence of Staphylococcus aureus. J Infect Dis 1984;150:546–53. [7] Finch RG, Pritchard DI, Bycroft BW, Williams P, Stewart GS. Quorum sensing: a novel target for anti-infective therapy. J Antimicrob Chemother 1998;42: 569–71. [8] Khardori N, Yassien M. Biofilms in device-related infections. J Ind Microbiol 1995;15:141–7. [9] Darouiche RO. Prevention of vascular catheter-related infections. Neth J Med 1999;55:92–9. [10] Francois P, Letourneur D, Lew DP, Jozefonwicz J, Vaudaux P. Inhibition by heparin and derivatized dextrans of Staphylococcus epidermidis adhesion to in vitro fibronectin-coated or explanted polymer surfaces. J Biomater Sci Polym Ed 1999;10:1207–21. [11] Bauer T, Pavon-Djavid G, He´lary G, Lortat-Jacob A, Migonney V. 289 inhibition de l’adhe´rence bacte´rienne sur le ciment. Rev Chir Orthop Reparatr Appar Mot 2007;93:156–1156. [12] Berlot S, Aissaoui Z, Pavon-Djavid G, Belleney J, Jozefowicz M, Helary G, et al. Biomimetic poly(methyl methacrylate)-based terpolymers: modulation of bacterial adhesion effect. Biomacromolecules 2002;3:63–8. [13] Berlot-Moirez S, Pavon-Djavid G, Mondargent B, Jozefowicz M, Migonney V. Modulation of Staphylococcus aureus adhesion by biofunctional copolymers derived from polystyrene. ITBM 2002;23:102–8. [14] Anagnostou F, Debet A, Pavon-Djavid G, Goudaby Z, Helary G, Migonney V. Osteoblast functions on functionalized pmma-based polymers exhibiting Staphylococcus aureus adhesion inhibition. Biomaterials 2006;27:3912–9. [15] Francois P, Vaudaux P, Foster TJ, Lew DP. Host-bacteria interactions in foreign body infections. Infect Control Hosp Epidemiol 1996;17:514–20. [16] Antoci Jr V, Adams CS, Parvizi J, Davidson HM, Composto RJ, Freeman TA, et al. The inhibition of Staphylococcus epidermidis biofilm formation by vancomycinmodified titanium alloy and implications for the treatment of periprosthetic infection. Biomaterials 2008;29:4684–90. [17] Mayingi J, Helary G, Noirclere F, Bacroix B, Migonney V. Grafting of bioactive polymers onto titanium surfaces and human osteoblasts response. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc 2007;5119–22.
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