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Intérêt de l’immunoblot dans l’évaluation du statut sérologique vis-à-vis de l’hépatite C
Pathologie Biologie 52 (2004) 517–521 http://france.elsevier.com/direct/PATBIO/
Intérêt de l’immunoblot dans l’évaluation du statut sérologique vis-à-vis de l’hépatite C Immunoblot in the serological diagnosis of hepatitis C virus infection P. Zachary*, M. Ullmann, S. Djeddi, M.J. Wendling, E. Schvoerer, F. Stoll-Keller, J.-P. Gut Institut de virologie, faculté de médecine, 3, rue Koeberlé, 67000 strasbourg , France Reçu le 28 juin 2004 ; accepté le 13 juillet 2004 Disponible sur internet le 18 septembre 2004
Résumé Dans le cadre de l’évaluation de trois trousses EIA de dépistage des anticorps anti-VHC, nous avons étudié les caractéristiques de trois immunoblots, le Deciscan HCV Plus, le Riba HCV 3.0 SIA et l’Inno-Lia, vis-à-vis de 44 sérums discordants en EIA. Nous les avons considérés comme test de confirmation. Un échantillon était étiqueté comme faux-positif en EIA si au moins deux immunoblots étaient négatifs et éventuellement un troisième indéterminé avec, dans tous les cas, une recherche de l’ARN du VHC par PCR négative. Avec au moins deux immunoblots positifs, un échantillon aurait été considéré comme un vrai positif. Ainsi, 34 sérums étaient étiquetés comme faux-positifs et dix échantillons ont été exclus car il n’a pas été possible de trancher entre vrais et faux positifs. Aucun des 44 sérums discordants n’a été confirmé positif par immunoblot et par PCR. L’usage de l’immunoblot, dans le cas d’une discordance des tests de dépistage, a permis de conclure à un faux positif dans 52 % des cas avec trois immunoblots négatifs et, dans 77 % des cas, avec deux immunoblots négatifs et un immunoblot indéterminé. Les échantillons faussement positifs par l’EIA Monolisa ont donné plus souvent un résultat indéterminé avec le test Deciscan par rapport aux autres immunoblots; il en était de même pour le couple Vitros–Riba. Cela est probablement lié à l’utilisation d’antigènes communs pour les tests provenant d’un même fabricant. L’Inno-Lia est le test ayant présenté le plus de résultats négatifs ce qui en fait le coffret le plus spécifique. © 2004 Elsevier SAS. Tous droits réservés. Abstract The objective of the study was to assess three immunoblot assays, the Deciscan HCV Plus, the Riba and the Inno-Lia, on 44 discordant samples with three EIA kits. These immunoblots were considered as confirmation reagents. A result was considered as a false positive by anti-HCV antibody assay if the three immunoblots were negative or if two immunoblots were negative with the third being indeterminate and a negative virogical genomic diagnosis observed on all the samples. The result was positive if at least two immunoblots out of three were positive. Thus, 34 samples were considered as false positive and ten samples were excluded because it was impossible to conclude between true or false positive result. The 44 discordant results were never confirmed as positive by the use immunoblot or PCR. The three immunoblots were negative for half of the samples and two immunoblots and one indeterminate were observed for 77% of the samples. The false positive results by the Monolisa assay were more often found indeterminate with the Deciscan assay than with the other immunoblots. That was also checked for Vitros/Riba pair. One of the explanations could be the use of common antigens for the reagents from the same manufacturer. The Inno-Lia test is the most specific immunoblot according to the results obtained in our study. © 2004 Elsevier SAS. Tous droits réservés. Mots clés : Immunoblot ; Spécificité ; VHC ; Elisa ; Diagnostic sérologique Keywords: Immunoblot; Specificity; HCV; EIA; Serologic diagnosis
* Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (P. Zachary). 0369-8114/$ - see front matter © 2004 Elsevier SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.patbio.2004.07.024
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P. Zachary et al. / Pathologie Biologie 52 (2004) 517–521
1. Introduction L’infection par le virus de l’hépatite C représente un problème de santé publique dans le monde en raison de la prévalence importante de la maladie, du traitement lourd et pas systématiquement efficace en fonction du type viral, des lésions hépatiques et extrahépatiques à long terme ainsi que de la méconnaissance de certains modes de transmission [1,2]. Il est donc essentiel de connaître le plus précisément possible les individus contaminés afin de mieux les traiter et de prévenir la dissémination du virus. Par conséquent, dans le cadre du diagnostic biologique de l’hépatite C, la recherche des anticorps spécifiques antihépatite C, signe d’une contamination par le VHC, apparaît d’une grande importance. Il nous a paru utile d’évaluer les tests de dépistage des anticorps anti-VHC présents sur le marché français en terme de sensibilité sur des panels de séroconversion et de spécificité sur 2020 échantillons provenant de patients hospitalisés, à la différence de la plupart des études faites sur des sérums de donneurs de sang [3]. Dans l’étude de spécificité, nous avons fait le choix d’effectuer trois immunoblots et de les considérer comme test de confirmation afin de trancher quant aux résultats discordants obtenus par un ou plusieurs tests EIA. La place de l’immunoblot étant remise en question [4] ou, au contraire, considérée comme essentielle parmi les tests sérologiques à la disposition des biologistes dans l’aide au diagnostic dans le cadre de l’infection par le VHC [5], il était intéressant d’étudier cet outil et de comparer des tests présents sur le marché français. Nous présentons dans ce travail les résultats obtenus avec trois immunoblots sur 44 échantillons considérés comme discordants par les tests de dépistage parmi 2020 échantillons analysés.
2. Matériel et méthodes 2.1. Sérums L’étude de la spécificité des trois trousses sérologiques a été évaluée prospectivement sur 2020 échantillons consécutifs frais non
sélectionnés de sérums envoyés entre les mois de juillet et octobre 2002 à notre laboratoire de virologie des hôpitaux universitaires de Strasbourg pour la recherche des anticorps de l’hépatite C. Ces échantillons provenaient des divers services de l’hôpital ou bien nous étaient adressés par des laboratoires d’analyses médicales de ville. La sensibilité des trois tests a été déterminée sur des sérums congelés provenant de huit panels de séroconversion commerciaux. 2.2. Réactifs Nous avons testé les performances de trois trousses EIA : Monolisa anti-HCV Pus version 2 (Bio-Rad, Marnes La Coquette, France), Axsym HCV 3.0 (laboratoires Abbott, Rungis, France) et Vitros anti-HCV (Orthoclinical-Diagnostics, Issy-Les-Moulineaux, France). Quand un ou plusieurs tests de dépistage étaient positifs, afin d’attribuer un statut sérologique à tous les échantillons de notre étude prospective nous avons réalisé trois immunoblots : Deciscan HCV Plus (Bio-Rad, Marnes La Coquette, France), Chiron Riba HCV 3.0 SIA (Orthoclinical-Diagnostics, Issy-Les-Moulineaux, France) et Inno-Lia HCV Ab III Update ( InGen, Rungis, France) et, parfois, un diagnostic génomique viral (DGV) par RT-PCR (COBAS Amplicor, Roche Diagnostics, Meylan, France) avec une limite de détection de 50 UI/ml. Les caractéristiques ainsi que les critères d’interprétation de ces trois immunoblots sont détaillés respectivement dans les Tableaux 1,2. 2.3. Mode opératoire Les tests étaient utilisés conformément aux instructions des fabricants. Tous les échantillons considérés comme douteux en EIA après repassage étaient considérés comme positifs ce qui correspond à notre attitude de routine où un résultat douteux est considéré comme « non négatif ». Pour un échantillon donné, les trois tests EIA étaient effectués le jour même. En fonction des résultats obtenus par les tests de dépistage, l’algorithme décisionnel suivant était appliqué (Fig. 1). Quand les trois tests étaient négatifs, l’échantillon était considéré comme négatif pour la recherche des anticorps anti-HCV. Un sérum initialement positif dans un, deux ou les trois tests de dépistage (première intention) était refait en double sur les trois tests (seconde intention).
Tableau 1 Caractéristiques des trois immunoblots Distributeurs INGEN
Trousses INNO-LIA HCV Ab IV update
BIORAD
DECISCAN HCV PLUS
ORTHOCLINICALDIAGNOSTICS
CHIRON RIBA HCV 3,0 SIA
Couverture épitopique Ag issus des régions: C (C1,C2); hypervariable E2 (RHV); hélicase NS3 (protéine recombinante hautement purifiée su sous-type 1b); NS4, NS4B et NS5A * Protéines recombinantes produites par E.coli à partir de clones sélectionnés dans la région non structurale NS3 et NS4 et protéines de fusion GST (les gènes codant pour NS3 et NS4 ont été fusionnés au gène de la glutathion S Transférase) * Peptides sélectionnés pour leur haute immunogénicité dans la région structurale C1 et C2 et dans la région non structurale NS4 * 2 Antigènes recombinants c33c et NS5+ 2 peptides de synthèse c100p et 5-1-1-p dans la région non structurale du virus * 1 peptide de synthèse c22p codé par la région de core * SOD provient de la fusion de NS5 et c33c avec le gène de la superoxyde dismutase
Remarques 10 µl / sérum ou plasma Durée du test: 1 nuit d’incubation et 1H20 Technique en 2 temps Lecture et Interprétation simple (POS-IND-NEG) 10 µl/sérum ou plasma Durée du test: 3 Heures Technique plus rapide Lecture simple Interprétation plus complexe (POS-POS probable-IND-NEG)
20 µl / sérum ou plasma Durée du test: 5 Heures Technique en 2 temps Lecture et Interprétation simple (POS-IND-NEG)
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Tableau 2 Critères d’interprétation des trois immunoblots
Chiron Riba 3.0 (Ortho)
Deciscan HCV plus (Biorad)
Négatif aucune bande une ou plusieurs bande(s) autre(s) que c33c ou c22-3 < 1+ a c22-3 ou c33c < 1+ répétable 1 mois plus tard aucune bande
Critères d’interprétation des 3 immunoblots Indéterminé 1 bande > 1+ tout autre profil ne correspondant pas aux critères précédemment définis notamment si la bande SOD est >1+ en présence d’une ou plusieurs bandes antigéniques b 1 bande visualisée 2 bandes du gène de la capside (C1,C2)
Inno-Lia HCV Ab III Update (Immogenetics)
aucune bande
1 bande d’intensité ≥ 1+
1 bande d’intensité +/– exceptée la NS3
NS3 d’intensité > +/–
Positif 2 bandes antigéniques (ou plus) dont 1 au moins en c22-3 ou c33c ≥ 1+
2 bandes de 2 gènes différents d’intensité = 0,5 (Positif probable) au moins 2 bandes de 2 gènes différents d’intensité > 0,5 + (Positif) au moins 2 bandes d’intensité ≥ +/–
a
Si seule la bande SOD est positive, l’échantillon est considéré négatif. Si la bande SOD présente une réactivité supérieure ou égale à 1+ en présence d’une ou plusieurs bandes antigéniques réactives, l’échantillon est considéré comme indéterminé. b
Quand on observait une discordance entre les tests pour un échantillon, on effectuait les trois immunoblots ainsi qu’une recherche génomique par PCR. Dans le cas d’une PCR positive, cas non rencontré, l’échantillon aurait été considéré comme positif indépendamment des résultats des immunoblots. L’échantillon était considéré comme sérologiquement négatif quand les trois immunoblots étaient négatifs ou si l’un d’entre eux était indéterminé. Dans la
situation où au moins deux immunoblots auraient été positifs, cas qui ne s’est pas produit, l’échantillon aurait été considéré comme sérologiquement positif. Dans tous les autres cas, l’échantillon a été considéré comme sérologiquement indéterminé. Quand les trois tests étaient positifs, un, deux ou trois immunoblots étaient effectués ainsi que la recherche d’ARN du VHC (Fig. 1). Selon l’arbre décisionnel adopté, en cas de recherche
Fig. 1. Algorithme décisionnel. 1 Le nombre correspondant d’échantillons est donné entre parenthèses. 2 DVG : Diagnostic génomique viral. 3 Exclu si au moins un immunoblot est indéterminé. Dans le cas où les trois immunoblots sont négatifs ainsi que le DVG, l’échantillon est considéré comme faux positif. Cette dernière possibilité ne s’est pas produite.
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génomique positive et/ou d’au moins un immunoblot positif, l’échantillon était considéré comme sérologiquement positif.
3. Résultats 3.1. Spécificité des trois trousses de dépistage Parmi les 2020 échantillons testés avec les trois trousses de dépistage, 1900, 76 et 44 sérums étaient respectivement trouvés négatifs, positifs et discordants. Sur les 44 échantillons discordants, 23, 11 et 9 sérums présentaient respectivement trois immunoblots négatifs; deux immunoblots négatifs avec un troisième indéterminé et deux immunoblots indéterminés. Un sérum présentait un immunoblot négatif, un immunoblot indéterminé et un immunoblot positif. La recherche de l’ARN du VHC par RT-PCR était indétectable pour ces 44 échantillons. Dans dix cas, le statut sérologique n’ayant pas pu être clairement défini, nous avons décidé de les exclure du calcul de la spécificité. En suivant l’arbre décisionnel fixé, nous avons donc considéré 34 échantillons discordants parmi les 44 comme de « vrais-négatifs sérologiques ». 3.2. Analyse des immunoblots sur les 34 échantillons discordants Parmi les 34 échantillons considérés comme sérologiquement négatif, 17, 13 et sept sérums étaient respectivement positifs en EIA Axsym, Vitros et Monolisa. Trois Deciscan et trois Riba étaient indéterminés sur les 17 sérums positifs en Axsym. Un Deciscan et trois Riba étaient indéterminés sur les 13 sérums positifs en Vitros et deux Deciscan étaient indéterminés sur les sept positifs en Monolisa. L’Inno-Lia était négatif sur les 34 échantillons discordants considérés comme négatifs.
4. Discussion L’usage de l’immunoblot dans le sérodiagnostic de l’infection par le virus de l’hépatite C s’est fait très rapidement après la mise au point de la première génération de tests de dépistage. Mais l’intérêt de ce test, qui n’est pas considéré comme un test de confirmation mais comme un test de validation sérologique, reste controversé en raison d’une spécificité et d’une sensibilité perfectibles. Dans le cadre d’une étude d’évaluation de la spécificité de trois trousses sérologiques de dépistage du virus de l’hépatite C, il nous a paru également intéressant d’étudier les caractéristiques des principaux immunoblots présents sur le marché français sur une population de sérums discordants dans les tests de dépistage. L’emploi de l’immunoblot, dans le cas d’une discordance des tests de dépistage, a permis de trancher dans 52 % des cas avec trois immunoblots négatifs et, dans 77 % des cas, quand
on a considéré un résultat sérologique négatif avec un immunoblot indéterminé et deux immunoblots négatifs. Si l’on avait uniquement utilisé le test Riba, qui est celui utilisé en routine au laboratoire, le pourcentage aurait été de 77 % de résultats sérologiques considérés comme négatifs. Ces résultats apparaissent satisfaisants comparés à ceux retrouvés par Cecille et al. [6]. En effet, le Riba avait permis d’interpréter le statut sérologique vis-à-vis du VHC dans 35 % des cas dans leur série où l’on observait une discordance entre différents tests de dépistage. Il semble exister une corrélation positive entre réactif de dépistage et immunoblot provenant d’un même fabricant. En effet, le test Riba est plus souvent indéterminé que les deux autres immunoblots quand le test Vitros est positif et il en est de même pour le test Deciscan, quand le test Monolisa est positif. Ces fausses réactivités communes entre tests de dépistage et immunoblot pourraient être dues à la composition antigénique identique des deux types de trousses. Néanmoins, cette hypothèse est difficilement vérifiable car les fabricants concernés n’ont pas souhaité nous donner la composition exacte des différents peptides de synthèse et protéines recombinantes entrant dans la composition de leurs trousses. Il nous semble donc préférable d’utiliser des trousses provenant de fabricants différents pour réaliser les tests de dépistage et de validation afin d’éviter au maximum de conclure à tort à la séropositivité d’un échantillon. Dans cette étude, le coffret Inno-Lia HCV Ab III Update était l’immunoblot le plus spécifique. Aucun des 34 échantillons discordants considérés comme sérologiquement négatifs ne présentait une réactivité avec ce réactif. Néanmoins, il existe un biais important car l’Inno-Lia n’a pas été confronté au test de dépistage EIA Inno-Test provenant du même fabricant. En effet il pourrait exister, comme dans le cas des réactifs BioRad et Ortho, des fausses positivités communes aux deux réactifs. À l’inverse, la trousse Deciscan paraît être la moins spécifique des trois immunoblots. Cela est d’autant plus surprenant que ce test est dépourvu de protéine NS5 qui est généralement incriminée dans des réactions non spécifiques. À l’heure actuelle, l’usage de l’immunoblot dans le sérodiagnostic de l’infection par le virus de l’hépatite C n’est pas codifié. La preuve en est que ce test n’est pas considéré comme un test de confirmation sérologique mais au mieux comme un test de « validation », voire un simple test sérologique au même titre que les tests de dépistage de type Elisa. De plus, ce test n’est pas inscrit à la nomenclature des actes de biologie médicale. Certes ce test n’est pas d’une spécificité excellente puisque la plupart des fabricants mentionnent dans leur notice d’utilisation des valeurs de l’ordre de 95,9 à 97,16 % ce qui est en deçà des spécificités retrouvées pour les tests Elisa mais il se révèle plus informatif en raison de son caractère qualitatif et semi-quantitatif propre aux immunoblots. En effet, en fonction du profil en terme de nombre de bandes réactives et de l’intensité de ces dernières, il est possible de présumer du stade de l’infection. Selon les tests, dans le cas
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d’une séroconversion, les premiers anticorps apparaissant sont les immunoglobulines dirigées contre NS3 ou une protéine de capside, le profil s’enrichissant par la suite par des anticorps dirigés contre d’autres protéines constitutives du virus. De même, en cas de guérison supposée, on assiste généralement à une diminution d’intensité, ou même à une disparition de certaines bandes dans le sens inverse de leur vitesse d’apparition [7]. En comparant le profil anticorps obtenu par l’immunoblot Riba d’une population de patients présentant une hépatite C chronique active à une population de patients présumés guéris, les anticorps anti-NS5 étaient présents chez 73 % des patients atteints d’une hépatite C chronique réplicative contre aucun des patients non virémiques de façon durable [8]. Dans notre expérience de routine, le test Inno-Lia s’est déjà révélé plus sensible que certains tests de dépistage lors de séroconversion [9]. À notre connaissance, il n’existe pas d’études comparant les performances des immunoblots que nous avons évalués. On trouve néanmoins des travaux évaluant différentes générations d’immunoblots. Ainsi, Damen et al. ont montré que la troisième génération du test Riba était plus performante que la deuxième en terme de sensibilité et de spécificité du fait du remplacement de protéines recombinantes par des peptides de synthèse [10]. En conclusion, l’étude de la spécificité de trois trousses de dépistage anti-VHC nous a permis également d’appréhender les performances en terme de spécificité de trois immunoblots. Ces derniers sont globalement performants puisqu’ils nous ont apporté une aide dans deux tiers des cas. Néanmoins, leur place dans le diagnostic sérologique de routine de l’hépatite C n’est pas clairement défini en raison d’une spécificité imparfaite, d’une sensibilité peu documentée et d’un coût important par rapport aux tests de dépistage. Remerciements Les auteurs remercient les sociétés BioRad, OrthoclinicalDiagnostic et Ingen pour la fourniture des trousses sérologi-
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ques utilisées dans cette étude ainsi que les hôpitaux universitaires de Strasbourg pour leur soutien.
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Intérêt de l’immunoblot dans l’évaluation du statut sérologique vis-à-vis de l’hépatite C Immunoblot in the serological diagnosis of hepatitis C virus infection P. Zachary*, M. Ullmann, S. Djeddi, M.J. Wendling, E. Schvoerer, F. Stoll-Keller, J.-P. Gut Institut de virologie, faculté de médecine, 3, rue Koeberlé, 67000 strasbourg , France Reçu le 28 juin 2004 ; accepté le 13 juillet 2004 Disponible sur internet le 18 septembre 2004
Résumé Dans le cadre de l’évaluation de trois trousses EIA de dépistage des anticorps anti-VHC, nous avons étudié les caractéristiques de trois immunoblots, le Deciscan HCV Plus, le Riba HCV 3.0 SIA et l’Inno-Lia, vis-à-vis de 44 sérums discordants en EIA. Nous les avons considérés comme test de confirmation. Un échantillon était étiqueté comme faux-positif en EIA si au moins deux immunoblots étaient négatifs et éventuellement un troisième indéterminé avec, dans tous les cas, une recherche de l’ARN du VHC par PCR négative. Avec au moins deux immunoblots positifs, un échantillon aurait été considéré comme un vrai positif. Ainsi, 34 sérums étaient étiquetés comme faux-positifs et dix échantillons ont été exclus car il n’a pas été possible de trancher entre vrais et faux positifs. Aucun des 44 sérums discordants n’a été confirmé positif par immunoblot et par PCR. L’usage de l’immunoblot, dans le cas d’une discordance des tests de dépistage, a permis de conclure à un faux positif dans 52 % des cas avec trois immunoblots négatifs et, dans 77 % des cas, avec deux immunoblots négatifs et un immunoblot indéterminé. Les échantillons faussement positifs par l’EIA Monolisa ont donné plus souvent un résultat indéterminé avec le test Deciscan par rapport aux autres immunoblots; il en était de même pour le couple Vitros–Riba. Cela est probablement lié à l’utilisation d’antigènes communs pour les tests provenant d’un même fabricant. L’Inno-Lia est le test ayant présenté le plus de résultats négatifs ce qui en fait le coffret le plus spécifique. © 2004 Elsevier SAS. Tous droits réservés. Abstract The objective of the study was to assess three immunoblot assays, the Deciscan HCV Plus, the Riba and the Inno-Lia, on 44 discordant samples with three EIA kits. These immunoblots were considered as confirmation reagents. A result was considered as a false positive by anti-HCV antibody assay if the three immunoblots were negative or if two immunoblots were negative with the third being indeterminate and a negative virogical genomic diagnosis observed on all the samples. The result was positive if at least two immunoblots out of three were positive. Thus, 34 samples were considered as false positive and ten samples were excluded because it was impossible to conclude between true or false positive result. The 44 discordant results were never confirmed as positive by the use immunoblot or PCR. The three immunoblots were negative for half of the samples and two immunoblots and one indeterminate were observed for 77% of the samples. The false positive results by the Monolisa assay were more often found indeterminate with the Deciscan assay than with the other immunoblots. That was also checked for Vitros/Riba pair. One of the explanations could be the use of common antigens for the reagents from the same manufacturer. The Inno-Lia test is the most specific immunoblot according to the results obtained in our study. © 2004 Elsevier SAS. Tous droits réservés. Mots clés : Immunoblot ; Spécificité ; VHC ; Elisa ; Diagnostic sérologique Keywords: Immunoblot; Specificity; HCV; EIA; Serologic diagnosis
* Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (P. Zachary). 0369-8114/$ - see front matter © 2004 Elsevier SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.patbio.2004.07.024
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P. Zachary et al. / Pathologie Biologie 52 (2004) 517–521
1. Introduction L’infection par le virus de l’hépatite C représente un problème de santé publique dans le monde en raison de la prévalence importante de la maladie, du traitement lourd et pas systématiquement efficace en fonction du type viral, des lésions hépatiques et extrahépatiques à long terme ainsi que de la méconnaissance de certains modes de transmission [1,2]. Il est donc essentiel de connaître le plus précisément possible les individus contaminés afin de mieux les traiter et de prévenir la dissémination du virus. Par conséquent, dans le cadre du diagnostic biologique de l’hépatite C, la recherche des anticorps spécifiques antihépatite C, signe d’une contamination par le VHC, apparaît d’une grande importance. Il nous a paru utile d’évaluer les tests de dépistage des anticorps anti-VHC présents sur le marché français en terme de sensibilité sur des panels de séroconversion et de spécificité sur 2020 échantillons provenant de patients hospitalisés, à la différence de la plupart des études faites sur des sérums de donneurs de sang [3]. Dans l’étude de spécificité, nous avons fait le choix d’effectuer trois immunoblots et de les considérer comme test de confirmation afin de trancher quant aux résultats discordants obtenus par un ou plusieurs tests EIA. La place de l’immunoblot étant remise en question [4] ou, au contraire, considérée comme essentielle parmi les tests sérologiques à la disposition des biologistes dans l’aide au diagnostic dans le cadre de l’infection par le VHC [5], il était intéressant d’étudier cet outil et de comparer des tests présents sur le marché français. Nous présentons dans ce travail les résultats obtenus avec trois immunoblots sur 44 échantillons considérés comme discordants par les tests de dépistage parmi 2020 échantillons analysés.
2. Matériel et méthodes 2.1. Sérums L’étude de la spécificité des trois trousses sérologiques a été évaluée prospectivement sur 2020 échantillons consécutifs frais non
sélectionnés de sérums envoyés entre les mois de juillet et octobre 2002 à notre laboratoire de virologie des hôpitaux universitaires de Strasbourg pour la recherche des anticorps de l’hépatite C. Ces échantillons provenaient des divers services de l’hôpital ou bien nous étaient adressés par des laboratoires d’analyses médicales de ville. La sensibilité des trois tests a été déterminée sur des sérums congelés provenant de huit panels de séroconversion commerciaux. 2.2. Réactifs Nous avons testé les performances de trois trousses EIA : Monolisa anti-HCV Pus version 2 (Bio-Rad, Marnes La Coquette, France), Axsym HCV 3.0 (laboratoires Abbott, Rungis, France) et Vitros anti-HCV (Orthoclinical-Diagnostics, Issy-Les-Moulineaux, France). Quand un ou plusieurs tests de dépistage étaient positifs, afin d’attribuer un statut sérologique à tous les échantillons de notre étude prospective nous avons réalisé trois immunoblots : Deciscan HCV Plus (Bio-Rad, Marnes La Coquette, France), Chiron Riba HCV 3.0 SIA (Orthoclinical-Diagnostics, Issy-Les-Moulineaux, France) et Inno-Lia HCV Ab III Update ( InGen, Rungis, France) et, parfois, un diagnostic génomique viral (DGV) par RT-PCR (COBAS Amplicor, Roche Diagnostics, Meylan, France) avec une limite de détection de 50 UI/ml. Les caractéristiques ainsi que les critères d’interprétation de ces trois immunoblots sont détaillés respectivement dans les Tableaux 1,2. 2.3. Mode opératoire Les tests étaient utilisés conformément aux instructions des fabricants. Tous les échantillons considérés comme douteux en EIA après repassage étaient considérés comme positifs ce qui correspond à notre attitude de routine où un résultat douteux est considéré comme « non négatif ». Pour un échantillon donné, les trois tests EIA étaient effectués le jour même. En fonction des résultats obtenus par les tests de dépistage, l’algorithme décisionnel suivant était appliqué (Fig. 1). Quand les trois tests étaient négatifs, l’échantillon était considéré comme négatif pour la recherche des anticorps anti-HCV. Un sérum initialement positif dans un, deux ou les trois tests de dépistage (première intention) était refait en double sur les trois tests (seconde intention).
Tableau 1 Caractéristiques des trois immunoblots Distributeurs INGEN
Trousses INNO-LIA HCV Ab IV update
BIORAD
DECISCAN HCV PLUS
ORTHOCLINICALDIAGNOSTICS
CHIRON RIBA HCV 3,0 SIA
Couverture épitopique Ag issus des régions: C (C1,C2); hypervariable E2 (RHV); hélicase NS3 (protéine recombinante hautement purifiée su sous-type 1b); NS4, NS4B et NS5A * Protéines recombinantes produites par E.coli à partir de clones sélectionnés dans la région non structurale NS3 et NS4 et protéines de fusion GST (les gènes codant pour NS3 et NS4 ont été fusionnés au gène de la glutathion S Transférase) * Peptides sélectionnés pour leur haute immunogénicité dans la région structurale C1 et C2 et dans la région non structurale NS4 * 2 Antigènes recombinants c33c et NS5+ 2 peptides de synthèse c100p et 5-1-1-p dans la région non structurale du virus * 1 peptide de synthèse c22p codé par la région de core * SOD provient de la fusion de NS5 et c33c avec le gène de la superoxyde dismutase
Remarques 10 µl / sérum ou plasma Durée du test: 1 nuit d’incubation et 1H20 Technique en 2 temps Lecture et Interprétation simple (POS-IND-NEG) 10 µl/sérum ou plasma Durée du test: 3 Heures Technique plus rapide Lecture simple Interprétation plus complexe (POS-POS probable-IND-NEG)
20 µl / sérum ou plasma Durée du test: 5 Heures Technique en 2 temps Lecture et Interprétation simple (POS-IND-NEG)
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Tableau 2 Critères d’interprétation des trois immunoblots
Chiron Riba 3.0 (Ortho)
Deciscan HCV plus (Biorad)
Négatif aucune bande une ou plusieurs bande(s) autre(s) que c33c ou c22-3 < 1+ a c22-3 ou c33c < 1+ répétable 1 mois plus tard aucune bande
Critères d’interprétation des 3 immunoblots Indéterminé 1 bande > 1+ tout autre profil ne correspondant pas aux critères précédemment définis notamment si la bande SOD est >1+ en présence d’une ou plusieurs bandes antigéniques b 1 bande visualisée 2 bandes du gène de la capside (C1,C2)
Inno-Lia HCV Ab III Update (Immogenetics)
aucune bande
1 bande d’intensité ≥ 1+
1 bande d’intensité +/– exceptée la NS3
NS3 d’intensité > +/–
Positif 2 bandes antigéniques (ou plus) dont 1 au moins en c22-3 ou c33c ≥ 1+
2 bandes de 2 gènes différents d’intensité = 0,5 (Positif probable) au moins 2 bandes de 2 gènes différents d’intensité > 0,5 + (Positif) au moins 2 bandes d’intensité ≥ +/–
a
Si seule la bande SOD est positive, l’échantillon est considéré négatif. Si la bande SOD présente une réactivité supérieure ou égale à 1+ en présence d’une ou plusieurs bandes antigéniques réactives, l’échantillon est considéré comme indéterminé. b
Quand on observait une discordance entre les tests pour un échantillon, on effectuait les trois immunoblots ainsi qu’une recherche génomique par PCR. Dans le cas d’une PCR positive, cas non rencontré, l’échantillon aurait été considéré comme positif indépendamment des résultats des immunoblots. L’échantillon était considéré comme sérologiquement négatif quand les trois immunoblots étaient négatifs ou si l’un d’entre eux était indéterminé. Dans la
situation où au moins deux immunoblots auraient été positifs, cas qui ne s’est pas produit, l’échantillon aurait été considéré comme sérologiquement positif. Dans tous les autres cas, l’échantillon a été considéré comme sérologiquement indéterminé. Quand les trois tests étaient positifs, un, deux ou trois immunoblots étaient effectués ainsi que la recherche d’ARN du VHC (Fig. 1). Selon l’arbre décisionnel adopté, en cas de recherche
Fig. 1. Algorithme décisionnel. 1 Le nombre correspondant d’échantillons est donné entre parenthèses. 2 DVG : Diagnostic génomique viral. 3 Exclu si au moins un immunoblot est indéterminé. Dans le cas où les trois immunoblots sont négatifs ainsi que le DVG, l’échantillon est considéré comme faux positif. Cette dernière possibilité ne s’est pas produite.
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génomique positive et/ou d’au moins un immunoblot positif, l’échantillon était considéré comme sérologiquement positif.
3. Résultats 3.1. Spécificité des trois trousses de dépistage Parmi les 2020 échantillons testés avec les trois trousses de dépistage, 1900, 76 et 44 sérums étaient respectivement trouvés négatifs, positifs et discordants. Sur les 44 échantillons discordants, 23, 11 et 9 sérums présentaient respectivement trois immunoblots négatifs; deux immunoblots négatifs avec un troisième indéterminé et deux immunoblots indéterminés. Un sérum présentait un immunoblot négatif, un immunoblot indéterminé et un immunoblot positif. La recherche de l’ARN du VHC par RT-PCR était indétectable pour ces 44 échantillons. Dans dix cas, le statut sérologique n’ayant pas pu être clairement défini, nous avons décidé de les exclure du calcul de la spécificité. En suivant l’arbre décisionnel fixé, nous avons donc considéré 34 échantillons discordants parmi les 44 comme de « vrais-négatifs sérologiques ». 3.2. Analyse des immunoblots sur les 34 échantillons discordants Parmi les 34 échantillons considérés comme sérologiquement négatif, 17, 13 et sept sérums étaient respectivement positifs en EIA Axsym, Vitros et Monolisa. Trois Deciscan et trois Riba étaient indéterminés sur les 17 sérums positifs en Axsym. Un Deciscan et trois Riba étaient indéterminés sur les 13 sérums positifs en Vitros et deux Deciscan étaient indéterminés sur les sept positifs en Monolisa. L’Inno-Lia était négatif sur les 34 échantillons discordants considérés comme négatifs.
4. Discussion L’usage de l’immunoblot dans le sérodiagnostic de l’infection par le virus de l’hépatite C s’est fait très rapidement après la mise au point de la première génération de tests de dépistage. Mais l’intérêt de ce test, qui n’est pas considéré comme un test de confirmation mais comme un test de validation sérologique, reste controversé en raison d’une spécificité et d’une sensibilité perfectibles. Dans le cadre d’une étude d’évaluation de la spécificité de trois trousses sérologiques de dépistage du virus de l’hépatite C, il nous a paru également intéressant d’étudier les caractéristiques des principaux immunoblots présents sur le marché français sur une population de sérums discordants dans les tests de dépistage. L’emploi de l’immunoblot, dans le cas d’une discordance des tests de dépistage, a permis de trancher dans 52 % des cas avec trois immunoblots négatifs et, dans 77 % des cas, quand
on a considéré un résultat sérologique négatif avec un immunoblot indéterminé et deux immunoblots négatifs. Si l’on avait uniquement utilisé le test Riba, qui est celui utilisé en routine au laboratoire, le pourcentage aurait été de 77 % de résultats sérologiques considérés comme négatifs. Ces résultats apparaissent satisfaisants comparés à ceux retrouvés par Cecille et al. [6]. En effet, le Riba avait permis d’interpréter le statut sérologique vis-à-vis du VHC dans 35 % des cas dans leur série où l’on observait une discordance entre différents tests de dépistage. Il semble exister une corrélation positive entre réactif de dépistage et immunoblot provenant d’un même fabricant. En effet, le test Riba est plus souvent indéterminé que les deux autres immunoblots quand le test Vitros est positif et il en est de même pour le test Deciscan, quand le test Monolisa est positif. Ces fausses réactivités communes entre tests de dépistage et immunoblot pourraient être dues à la composition antigénique identique des deux types de trousses. Néanmoins, cette hypothèse est difficilement vérifiable car les fabricants concernés n’ont pas souhaité nous donner la composition exacte des différents peptides de synthèse et protéines recombinantes entrant dans la composition de leurs trousses. Il nous semble donc préférable d’utiliser des trousses provenant de fabricants différents pour réaliser les tests de dépistage et de validation afin d’éviter au maximum de conclure à tort à la séropositivité d’un échantillon. Dans cette étude, le coffret Inno-Lia HCV Ab III Update était l’immunoblot le plus spécifique. Aucun des 34 échantillons discordants considérés comme sérologiquement négatifs ne présentait une réactivité avec ce réactif. Néanmoins, il existe un biais important car l’Inno-Lia n’a pas été confronté au test de dépistage EIA Inno-Test provenant du même fabricant. En effet il pourrait exister, comme dans le cas des réactifs BioRad et Ortho, des fausses positivités communes aux deux réactifs. À l’inverse, la trousse Deciscan paraît être la moins spécifique des trois immunoblots. Cela est d’autant plus surprenant que ce test est dépourvu de protéine NS5 qui est généralement incriminée dans des réactions non spécifiques. À l’heure actuelle, l’usage de l’immunoblot dans le sérodiagnostic de l’infection par le virus de l’hépatite C n’est pas codifié. La preuve en est que ce test n’est pas considéré comme un test de confirmation sérologique mais au mieux comme un test de « validation », voire un simple test sérologique au même titre que les tests de dépistage de type Elisa. De plus, ce test n’est pas inscrit à la nomenclature des actes de biologie médicale. Certes ce test n’est pas d’une spécificité excellente puisque la plupart des fabricants mentionnent dans leur notice d’utilisation des valeurs de l’ordre de 95,9 à 97,16 % ce qui est en deçà des spécificités retrouvées pour les tests Elisa mais il se révèle plus informatif en raison de son caractère qualitatif et semi-quantitatif propre aux immunoblots. En effet, en fonction du profil en terme de nombre de bandes réactives et de l’intensité de ces dernières, il est possible de présumer du stade de l’infection. Selon les tests, dans le cas
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d’une séroconversion, les premiers anticorps apparaissant sont les immunoglobulines dirigées contre NS3 ou une protéine de capside, le profil s’enrichissant par la suite par des anticorps dirigés contre d’autres protéines constitutives du virus. De même, en cas de guérison supposée, on assiste généralement à une diminution d’intensité, ou même à une disparition de certaines bandes dans le sens inverse de leur vitesse d’apparition [7]. En comparant le profil anticorps obtenu par l’immunoblot Riba d’une population de patients présentant une hépatite C chronique active à une population de patients présumés guéris, les anticorps anti-NS5 étaient présents chez 73 % des patients atteints d’une hépatite C chronique réplicative contre aucun des patients non virémiques de façon durable [8]. Dans notre expérience de routine, le test Inno-Lia s’est déjà révélé plus sensible que certains tests de dépistage lors de séroconversion [9]. À notre connaissance, il n’existe pas d’études comparant les performances des immunoblots que nous avons évalués. On trouve néanmoins des travaux évaluant différentes générations d’immunoblots. Ainsi, Damen et al. ont montré que la troisième génération du test Riba était plus performante que la deuxième en terme de sensibilité et de spécificité du fait du remplacement de protéines recombinantes par des peptides de synthèse [10]. En conclusion, l’étude de la spécificité de trois trousses de dépistage anti-VHC nous a permis également d’appréhender les performances en terme de spécificité de trois immunoblots. Ces derniers sont globalement performants puisqu’ils nous ont apporté une aide dans deux tiers des cas. Néanmoins, leur place dans le diagnostic sérologique de routine de l’hépatite C n’est pas clairement défini en raison d’une spécificité imparfaite, d’une sensibilité peu documentée et d’un coût important par rapport aux tests de dépistage. Remerciements Les auteurs remercient les sociétés BioRad, OrthoclinicalDiagnostic et Ingen pour la fourniture des trousses sérologi-
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ques utilisées dans cette étude ainsi que les hôpitaux universitaires de Strasbourg pour leur soutien.
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Cecille A, Wendling MJ, Panabiere O, Gut JP. Étude rétrospective de l’intérêt du test RIBA-3 pour 68 cas de sérologies discordantes vis-àvis du virus de l’hépatite C obtenues avec des tests Elisa de 3e génération. Reste t’il un intérêt au RIBA-3? Pathol Biol 1999;47:508– 11.
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Knoch I. Hépatite C présumée guérie : caractéristiques biologiques (thèse). Strasbourg: Faculté de médecine-université Louis Pasteur; 1998. p. 1–46.
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Zachary P, Wendling MJ, Djeddi S, Schvoerer E, Ullmann M, StollKeller F, et al. VIes Journée Francophones de virologie, Paris, Cinétique d’apparition des marqueurs virologiques d’une primo-infection par le virus de l’hépatite C chez une toxicomane (publication affichée) Avril 2004.
[10] Damen M, Zaaijer HL, Cuypers HTM, Vrielink H, Van der Poel CL, Reesink HW, et al. Reliability of the third-generation recombinant immunoblot assay for hepatitis C virus.