Isolierung und Identifizierung von Vibrionaceae

Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt, Orig. A 248, 148-161 (1980) Deutsche Gesellschaft fur Hygiene und Mikrobiologie Kommission fur Verfahrensrichtlinien (Leiter: Dr. F.Burkhardt, Erlangen)

Isolierung und Identifizierung von Vibrionaceae 1 Mit 1 Abbildung . Eingegangen am 12. August 1980

Definition derVibrionaceae Vibrionaceae sind gramnegative, starre, gerade oder gekriimmte, meist bewegliche Stabchen mit polarer Begeifselung. Sie sind katalase- und oxidasepositiv, wachsen fakultativ anaerob und bauen Kohlenhydrate fermentativ abo Fiir ihre Ziichtung geniigen einfache Nahrboden. Von humanmedizinischem Interesse sind die Genera Vibrio, Aeromonas und Plesiomonas. In Tab. 1 sind die fur den Menschen wichtigen Arten zusammengestellt. TabeIIe 1. Vibrionaceae-Species von humanmedizinischer Bedeutung"

Vibrio cholerae Vibrio eltor Vibrio albensis (NAG- oder NC-Vibrionen b) Vibrio parahaemolyticus Vibrio alginolyticus" "group F" - Vibrio Laktose-positiver Vibrio C Aeromonas hydrophila Plesiomonas shigelloides C

C

a b C

Die AufsteIIung wurde aus praktischen Grunden in Abweichung von Bergey's Manual (8th Ed. 1974) vorgenommen; NAG = nicht agglutinabeI, non agglutinable, NC = nicht Cholera, non cholera; halophile Vibrionen.

1 ZusammengesteIIt von der Arbeitsgruppe 2.8 Obmann: Prof. Dr. H. E. Muller, Braunschweig Mitglieder: Prof. Dr. ]. Bockemiihl, Hamburg Dr. F. Burkhardt, Erlangen Prof. Dr. A. von Graeuenitz, Zurich

Isolierung und Identifizierung von Vibrionaceae

149

Die wichtigsten Eigenschaften und Reaktionen zur Abgrenzung der Vibrionaceae von den Spirillaceae, Pseudomonadaceae und Enterobacteriaceae gibt Tab. 2 wieder. Tabelle 2. Abgrenzungder Vibrionaceae von anderen Familien Familie

Begeifelung

OF-Test

Vibrionaceae Spirillaceae Pseudomonadaceae Enterobacteriaceae

polar polar polar peritrich

F (O)/_ b 0/F

Oxidase

+"

+

+"

V. metschnikovii: Negativ; b Schwache, oxidierende Kohlenhydrat-Verwertung bei einigen Arten; einige Arten, z, B. Ps. maltopbilia: Negativ.

a

C

Gattung Vibrio Keime der Gattung Vibrio sind polar monotriche, selten lophotriche, kurze (1,5-3,0 pm), gerade oder gekriimmte Stabchen. Sie kommen bevorzugt im Wasser vor, bilden aus Kohlenhydraten kein Gas und sind Urease-negativ, Das Wachstum erfolgt im Temperaturbereich von 18-38 DC bei pH 6,0-9,0. Die optimale NaClKonzentration liegt bei 1,0-3,0 % . Abhangig vom Nahrboden (s. Tab. 3) besteht Empfindlichkeit gegen das Vibriostatikum 0/129 (= 2,4-Diamino-6,7-Diisopropylpteridin).

V. cbolerae und V. eltor V. cholerae und V. eltor sind die Erreger der Cholera asiatica. Sie sind endemisch in zahlreichen tropischen und subtropischen Landern; nach Mitteleuropa werden sie nur sporadisch eingeschleppt. Das typische Krankheitsbild ist durch exzessiven Fliissigkeits - und Elektrolytverlust gekennzeichnet und fiihrt unbehande!t in kurzer Z eit zum Tod. Vie! haufiger sind allerdings leichte oder symptomlose Infektionen. Die Krankheitserscheinungen werden durch ein thermolabiles Enterotoxin hervorgerufen.

Vibrioalbenis (NAG-Vibrionen) NAG- Vibrionen sind ubiquirar verbreitet. Sie kommen in Kiistengewassern und auch in Oberflachenwasser des Binnenlandes vor. Einige Stamme bilden ein Enterotoxin, das dem der Cholera-Vibrionen verwandt ist. Bei anderen Stammen wird ein invasives Verhalten beobachtet; gelegentlich werden solche Stamme aus extraintestinalem Material (Blut, Liquor) isoliert.

Vibrio parahaemolyticus V. parahaemolyticus kommt besonders in Kiistengewassern vor. Am haufigsten verursacht er Gastroenteritiden, etwa wenn Fische oder andere Meerestiere roh gegessen werden. Wiederholt kam es aber auch zu Gruppenerkrankungen nach Verzehr sekundar kontaminierter Nahrungsmittel. Ausnahmsweise kann V. para-

150

IsoIierung und Identifizierung von Vibrionaceae

haemolyticus auch extraintestinale Infektionen verschiedener Lokalisation hervorrufen.

Anderehalophile Vibrionen V. alginolyticus ist eine in Kiistengewassern vorkommende Art. Der Keim wurde gelegentlich aus Blut oder von Wunden isoliert; als Erreger intestinaler Infektionen spielt er offensichtlich keine Rolle. "Group F" -Vibrionen wurden neuerdings als eigenstandige Einheit erkannt. Sie scheinen weit verbreitet in Meer- und Brackwasser vorzukommen und rufen Gastroenteritis hervor. Laktose-positive Vibrionen sind taxonomisch noch nicht sicher eingeordnet. Sie wurden insbesondere bei Septikamien und Wundinfektionen isoliert. Gewinnung und Transport von Untersuchungsmaterial Bei intestinalen Krankheitsformen bietet die Untersuchung von Stuhl - moglichst im akuten Stadium und vor Anwendung von Antibiotika - die beste Nachweismoglichkeit, AuBerdem kommen Rektalabstriche und ggf, auch Erbrochenes oder Diinndarrninhalt fiir die mikrobiologische Priifung in Betracht. - Bei extraintestinalen Infektionen richtet sich die Wahl des Untersuchungsmaterials nach der Lokalisation der Lasion bzw. nach den klinischen Erscheinungen. Vibrionen sind empfindlich gegen Austrocknung. Wenn Proben nicht sofort nach der Gewinnung untersucht werden konnen, sollten sie in Transportmedium versandt werden. Hierbei ist eine Kiihlung nicht erforderlich. Stehen Transportsubstrate nicht zur Verfiigung, so muB das Untersuchungsmaterial gekiihlt transportiert und auf schnellstem Wege zum Labor gebracht werden. Bei CholeraVerdacht ist die Untersuchungsstelle vorher telefonisch zu verstandigen, damit die erforderlichen Vorbereitungen getroffen werden konnen, AIs Transportmedien nicht geeignet sind Glycerin-haltige gepufferte Salzlosungen.

Cary-Blair-Medium 2 Das halbfeste Medium ist besonders fur Abstriche geeignet; aber auch Stuhl kann - in Tupfern aufgenommen - in diesem Substrat versandt werden. Wegen der vielseitigen Einsatzmoglichkeit etwa auch fur die Konservierung von Salmonellen und Shigellen ist diesem Transportmedium der Vorzug zu geben. Es sollte daher in den Laboratorien stets vorratig gehalten werden.

Alkalisches Peptomoasser (APW]2 Es ist fur festes und fliissiges Material geeignet. Etwa 1 ml bzw. 1 g Probe wird mit 10 ml Medium vermischt. APW ist nur wahrend einer Transportdauer von ca. 6 Std. fur den Nachweis von Vibrionen geeignet.

SalzlOsung nach Venkatraman und Ramakrishnan 2 Diese Losung ist in erster Linie fur Stuhlproben geeignet und bei langerer Transportdauer dem APW vorzuziehen. 2

Siehe Anhang.

Isolierung und Identifizierung von Vibrionaceae

151

Gang der Untersuchung

Mikroskopische Untersuchung Die in der alteren Literatur beschriebene fischzugformige Anordnung der Cholera-Erreger im hitzefixierten, gefarbten Praparat ist nur selten typisch ausgepragt und fiir den Unerfahrenen nicht erkennbar. Daher kann die mikroskopische Untersuchung auf die Priifung des Nativpraparates bei frischen Stuhlproben akut Erkrankter beschrankt werden. Hierbei sind die Vibrionen - vorzugsweise im Dunkelfeld - an ihren iiberaus schnellen, manchmal rotierenden Bewegungen zu erkennen ("Miickenschwarm-Phanomen"). Man vermischt dazu eine kleine Menge des fliissigen Stuhls in 0,5 ml Nahrbouillon. Bei Rektalabstrichen wird der angefeuchtete Tupfer in dieser Bouillonmenge ausgedriickt, Ein Tropfen des Gemisches wird sodann auf einen sauberen Objekttrager gebracht, mit einem Deckglas abgedeckt und mikroskopisch untersucht. Die typische Bewegungsart wird besser sichtbar nach mehrstiindiger Vorbebriitung der Proben bei 35 °-37 °C in alkalischern Peptonwasser, wobei das Material von der Oberflache zu entnehmen ist. Zusatz von 01-Antiserum fiihrt zur Immobilisierung der Cholera-Vibrionen. Dieses Verfahren erfordert stets eine Kontrolle; der Zusatz von physiologischer NeCl-Losung zu parallel angelegten Tropfen des Untersuchungsmaterials darf keinen EinfluG auf die Beweglichkeit haben. Nur bei eindeutiger Immobilisierung der Keime in der mit 01-Antiserum versetzten Probe und persistierender Beweglichkeit in der Kontrolle ist Mitteilung des Verdachts auf Cholera angezeigt. Eine Fehlermoglichkeir liegt in der unspezifischen Immobilisierung durch Konservierungsmittel in Immunseren. Insgesamt erfordert diese Untersuchung eine gewisse Erfahrung.

Isolierung Zur Isolierung von Vibrionen ist die Verwendung flussiger Anreicherungsmedien und fester Nahrboden erforderlich. Die Bebriitung erfolgt bei 35 °-37 °C in normaIer Atmosphare,

FlUssige Medien Zur Anreicherung von Vibrionen werden die unten genannten Medien empfohlen. Sie werden mit ca. 1 ml (g) Untersuchungsmaterial auf 10 ml Medium beimpft; Tupfer werden darin ausgewalkt. Nach einer fiir die einzelnen Fliissigmedien unterschiedlichen Bebriitungsdauer wird von der Oberflache der Kultur eine Ose Material auf Festnahrboden bzw. ca. 0,2 ml in eine Sekundaranreicherung gebracht. Dabei diirfen die Anreicherungsbriihen nicht aufgeschiittelt werden. Bei der Untersuchung von Proben mit vermutlich geringem Erregergehalt, z. B. von symptomlosen Ausscheidern oder Rekonvaleszenten, werden zwei aufeinanderfolgende Anreicherungen empfohlen. Hierbei konnen, dem Laborbetrieb angepafst, Anreicherungsmedien unterschiedlicher Selektvitat und somit auch unterschiedlich langer Bebriitungsdauer kombiniert werden. 11 Zbl. Bakt. Hyg., I. Abr. Orig. A 248

152

IsoIierung und Identifizierung von Vibrionaceae

Alkalisches Peptonwasser (APW) 2 Die Bebriitungsdauer betragt ca. 4-6 Std. APW mit 1 fJ/ o NaCI eignet sich zur Anreicherung sowohl von Cholera- und NAG- als auch von halophilen Vibrionen.

Galle-Pepton-Bouillon (GPB) 2 Die Bebriitungsdauer betragt ca. 8-12 Std. Die Bouillon ist ahnlich gut geeignet wieAPW.

Glukose-Salz-Teepol-Bouillon (GSTB) 2 Die Bebriitungsdauer betragt ca. 12-18 Std. Die Bouillon eignet sich zur Anreicherung halophiler Vibrionen in Lebensmitteln und Wasserproben.

Feste Niihrboden Vibrionen zeigen gute Entwicklung auf einfachen, nicht-selektiven Nahrboden wie Fleischwasser- oder Blut-Agar. Halophile Vibrionen benotigen zu optimalem Wachstum in der Regel einen NaCI-Gehalt von 2-30/0. Zusatzlich sind zur Diagnose Selektivnahrboden erforderlich. Stets sollte dabei ein selektiver mit einem nicht oder weniger selektiven Nahrboden kombiniert werden. Das Untersuchungsmaterial wird auf die Fesmahrboden direkt ausgestrichen. Daneben werden aus den Anreicherungsbriihen Subkulturen angelegt. Die Bebriitung erfolgt bei 35 °_37 "C,

TCBS-Agar (Thiosulfate CitrateBileSaltsSucrose Agar)2 TCBS-Agar ist der empfehlenswerteste Selektivnahrboden zur Isolierung aller Vibrionen. Er sollte deshalb in jedem bakteriologischen Labor vorratig sein. Das Medium wird kraftig beimpft und nach Bebnitung iiber Nacht abgelesen, Cholera-, Saccharose-positive NAG- und "group F"-Vibrionen bilden £lache, zentral manchmal eingedellte, gelbe Kolonien von etwa 2 mm Durchmesser. Saccharose-negative NAG-, Laktose-positive halophile Vibrionen und V. parahaemolyticus wachsen in blaulich-griinen Kolonien von ca. 3 mm Durchmesser. V. alginolyticus wachst gelb und ist schleimig erhaben. V. parahaemolyticus laRt sich nur schwer vom Nahrboden abheben. Dagegen bilden andere halophile Vibrionen meist weiche Kolonien, von denen sich das Material leicht abnehmen laRt. Dasselbe gilt fiir Enterobacteriaceae, die teilgehemmt sind und in Form kleinerer Kolonien wachsen. Zu beachten ist, dag die Oxidasereaktion vom Koloniematerial dieses Nahrbodens nicht durchgefiihrt werden kann.

Niihr- oder Fleischwasser-Agar Zur Isolierung von Cholera- und NAG-Vibrionen eignet sich gewohnlicher Nahr- oder Fleischwasser-Agar mit neutralem pH. Voraussetzung ist lediglich, dag der Nahrboden klar ist, Man streicht fraktioniert aus, bebriitet bei 35-37 °C iiber Nacht und liest unter dem Stereomikroskop bei 10facher VergroRerung mit Schrag2

Siehe Anhang.

Isolierung und Identifizierung von Vibrionaceae

153

lichtbeleuchtung nach Henry abo Hierzu wird von einer Lichtquelle mit weitgehend parallelem Strahlengang das Licht auf einenPlanspiegel reflektiert und unter einem Winkel von ungefahr 45 ° durch den Nahrboden hindurchgeleitet (s, Abb. 1).

Abb. 1. Technikder Schraglichtbeleuchtung nach Henry. Cholera- und NAG-Vibrionen bilden relativ flache, homogen graue, nicht leuchtende Kolonien, die sich deutlich von den mehr erhabenen bis halbkugeligen, brillant irisierenden Kolonien der gramnegativen Begleitflora abheben. Die OxidaseReaktion kann in Zweifelsfallen eine zusatzliche Hilfe sein.

Andere Niihrboden Bromthymolblau-Teepol-Agar, Taurocholat-Gelatine-Agar, Tellurit-T aurocholat-Gelatine-Agar (Monsur) und Cholera-Agar nach Felsenfeld und Watanabe haben sich zwar in Endemiegebieten bewahrt, sind aber fiir den Unerfahrenen schwierig zu handhaben. Auf ihre Beschreibung wird deshalb hier verzichtet. Identijizierung

Verdachtige Kolonien werden auf polytrope Medien abgeimpfl:. Zu empfehlen ist Kligler-Agar, wahrend Triple Sugar Iron (TSI) Agar wegen seines SaccharoseGehaltes zur Vorauswahl bei Verdacht auf V. cholerae nicht geeignet ist. Bei Cholera-Verdacht muf durch Probeagglutination mit polyvalentem AntiCholera-Serum eine friihzeitige Verdachtsdiagnose gestellt werden. Im positiven Fall und bei Ausschluli einer Spontanagglutination erfolgt sofort die Meldung an Einsender und Gesundheitsbehorden. Vibrionen zeigen auf Kligler-Rohrchen nach 18stiindiger KuItur ein Reakrionsbild wie Shigellen: Schragflache rot, Hochschicht gelb, kein Gas, kein H 2S. Die weitere Identifizierung von Cholera- Vibrionen erfolgt biochemisch und zur Abgrenzung von NAG-Vibrionen serologisch. Die Identifizierung von V. parabaemolyticus und seine Abgrenzung gegen andere halophile Vibrionen geschieht mit Hilfe biochemischer Teste. Hier hat die serologische Bestimmung nur epidemiologische Bedeutung. Als Oberflachenkulturen sind Vibrionen empfindlich gegeniiber langerer Kiihllagerung bei 4 -c.

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Vibrio eltor

F

F

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= Positiv in 100 %-90 ' I.

Positiv in 10- 90 'I. Posir iv in 0- 10 % nieht un rersuchr

Aeromo nas bydr ophila

Plesiomonas shigelloides

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Isolierung und Identifizierung von Vibrionaceae

155

Biochemische Verfahren Die fur Vibrionen charakteristischen und fur ihre Abgrenzung von Aeromonas und Plesiomonas zweckmaliigen Reaktionen ergeben sich aus Tab. 3. Die nicht-halophilen Vibrionen (V. cholerae, V. eltor und NAG-Vibrionen) konnen zur epidemiologischen Charakterisierung auf Grund ihres Verhaltens gegeniiber Saccharose, Arabinose und Mannose nach Heiberg in 8 Gruppen eingeteilt werden. Die Cholera-Erreger gehoren dabei der Heiberg-Gruppe I an (Tab. 4). Tabelle 4. Biochemische Differenzierung von Vibrionen nach Heiberg und Smith u. Goodner

Gruppe Fermentation von: Saccharose Arabinose Mannose

+

II

III

IV

+

+ + +

+ +

+

V

VI

+

VII

VIII

+ +

+

Serologische Verfahren V. cholerae und V. eltor lassen sich von den iibrigen Vibrionen durch die Agglutination mit polyvalentem Anti-Cholera-Serum (O'l-Serum) unterscheiden. Hierzu wird Material von verdachtigen Kolonien bzw. Reinkulturen auf einem Objekttrager in einem Tropfen Serum bzw. physiologischer NeCl-Losung (negative Kontrolle) gleichmasig verrieben. Nach wiederholtem Hin- und Herwiegen tritt im positiven Fall spatestens innerhalb einer Minute eine makroskopisch sichtbare Agglutination ein. TCBS ist kein giinstiger Nahrboden zur serologischen Priifung. Altere Kulturen (> 18 Std.) ergeben haufig eine schlechte Objektglasagglutination. In allen unklaren Fallen sollte grundsatzlich eine Subkultur auf Nahr- oder Kligler-Agar angelegt werden, von der nach 4- bis 6stiindiger Bebriitung eine erneute Agglutination durchgefiihrt werden kann. Bei positivem Ausfall (und negativer Kontrollreaktion in physiologischer Na.Cl-Losung) wird das Ergebnis mitgeteilt. Mittels absorbierter Seren ist die Unterscheidung der Serovare Ogawa (O-Faktoren AB), Inaba (O-Faktoren AC), Hikojima (O-Faktoren ABC) und Rough moglich (s. Tab. 5). Tabelle 5. Serovarevon V. cholerae und V. eltor Serovar 01

Ogawa

+ + + +

+

(polyvalent)

Ogawa Inaba Hikojima Rough

+

Agglutination im Serum Inaba Rough

+ +

+

Physiol. NaCl-Kontr.

156

Isolierung und Identifizierung von Vibrionaceae

Die serologische Bestimmung von V. parahaemolyticus erfolgt mit 0- und KSereno Man kennt 12 0-, ein H- und 58 K-Antigene. Zusdtzliche diagnostische Verfahren Unterscheidung von V. cholerae und V. eltor

Hierzu konnen die in Tab. 6 zusammengestellten Reaktionen herangezogen werden. Wegen gelegentlich abweichender Reaktionen einzelner Stamme sollte sich die Diagnostik nie auf einen einzelnen Test stiitzen.

Tabelle 6. Unterscheidung von V. cholerae und V. eltor Test

V. cholerae

+

Voges-Proskauer-Reaktion

(3 Tage bei 22°C)

Hamagglutination von Schaf- oder Hiihner-Ery.

Polymyxin B (50 E/Bliittchen) "Klassischer" Cholera-Phage IV (in Routinetestverdiinnung)

V. eltor

sensibel sensibel

+

resistent resistent

Hdmagglutinationstest: Frisches defibriniertes Hiihner- oder Schafblut wird dreimal in phosphatgepufferter NeCl-Losung gewaschen, scharf zentrifugiert und auf eine 2,5 Ofoige Suspension verdiinnt (das Sediment wird als 100 Ofo genommen). Auf einem Objekttrager wird sodann in einem Tropfen der Erytrozytensuspension Material einer frischen Kultur von Nahragar zu einer milchigen Suspension eingerieben und wie bei der Objektglasagglutination durch Kippen des Objekttragers vermischt. Im positiven Faile tritt innerhalb einer Minute eine feinkornige Agglutination auf. Eltor-Vibrionen reagieren positiv, V. cholerae negativ. Polymyxin-B-Test: Aus einer Kultur in Nahrbouillon (ohne Glukose-Zusatz) werden einige Tropfen mit sterilem Tupfer oder Spatel auf einer Nahragarplatte ausgespatelt, Nach Lufl:trocknen wird ein Testblattchen mit 50 Einheiten Polymyxin B (Difco, Nr. 6191-90-7) aufgelegt und die Kultur tiber Nacht bebriitet. Eltor-Vibrionen wachsen ungehemmt, V. cbolerae- Vibrionen zeigen einen kleinen Hemmhof. Lysis-Test mit dem .klassisdien" Cholera-Phagen IV: Dieser Test wird nur groBeren Laboratorien empfohlen, die Erfahrung mit der Handhabung von Bakteriophagen besitzen. Unterscheidung von V. parahaemolyticus, V. alginolyticus und anderen halophilen Vibrionen

1m allgemeinen lassen sich V. parahaemolyticus und V. alginolyticus von dem fischpathogenen V. anguillarum und anderen, nicht naher charakterisierten marinen Vibrionen durch ihr Wachstum bei 42°C im Wasserbad unterscheiden. Gleichfalls fiir die Differenzierung brauchbar ist die Fahigkeir der meisten Stamme von V. alginolyticus, auf Nahragar bei 35°C zu schwarmen.

Isolierung und Identifizierung von Vibrionaceae

157

Kanagauia-Phdnomen: Das Kanagawa-Hamolysin ist mit der Enteropathogenitat von V. parahaemolyticus-Stammen gut korre1iert. Der Test ist Speziallaboratorien vorbehalten.

Isolierung von Vibrionen ausWasser und Lebensmittel Da im Zusammenhang mit einem Ausbruch einer Vibrioneninfektion meist Wasser und Lebensmittel in die Umgebungsuntersuchungen einbezogen werden, solI die Untersuchung auch derartigen Materials behande1t werden.

Wasserproben APW mit 1 % NaCI ist zur Isolierung aller Vibrionen geeignet. In einer dicht schliefsenden Literflasche werden 100 mll0fach konzentriertes APW vorgelegt und mit dem zu untersuchenden Wasser auf 1 1 aufgefiillt, Der pH wird mit 0,1 N NaOH auf 8,6 bis 9,2 eingestellt. Nach 6 bis 8 Std. Bebriitung bei 35-37 °C wird, ohne die Flasche zu schiitte1n, von der Oberflache auf TCBS-Agar abgeimpfl: und eine zweite Anreicherung durch Uberimpfen von 1 bis 2 ml der ersten Anreicherung in die 10fache Menge einfach konzentrierten APW angelegt, Nach 6 bis 8 Std. Bebriitung bei 35-37 °C erfolgt von hier die zweite Subkultur auf TCBS-Agar. Klares Wasser kann auch membranfiltriert werden. Die Filterscheibe wird in 50 ml APW gebracht und weiterbearbeitet wie oben angegeben. Als spezifisches Nahrmedium zur Untersuchung auf V. parahaemolyticus wird Glukose-Salz-Teepol-Bouillon (GSTB) 2 empfohlen. GSTB wird als einfach oder doppelt konzentrierte Bouillon (mit der gleichen Menge Wasserprobe aufzuftillen) angewandt. Die Bebriitung erfolgt bei 35-37°C iiber Nacht mit Subkultur auf TCBS-Agar.

Lebensmittel Lebensmitte1proben werden zur quantitativen Untersuchung in physiologischer NaCl-Losung bei Verdacht auf Cholera- und NAG-Vibrionen bzw. in 3 Ofoiger NaCI-Losung bei Verdacht auf halophile Vibrionen homogenisiert und in entsprechenden Verdiinnungsstufen auf TCBS-Agar ausgespatelt. Zur qualitativen Untersuchung erfolgt die Anreicherung der homogenisierten Probe in der 10fachen Menge einfach konzentrierter APWs mit nachfolgender Zweitanreicherung. Zur Untersuchung auf V. parahaemolyticus kann statt APW auch einfach konzentrierte GSTB verwendet werden.

Referenz-Laboratorien Robert Koch-Institut des BGA, Nordufer 20, D-I000 Berlin: Nationales Referenz-Zentrum fiir Cholera-Vibrionen Hygienisches Institut, Gorch-Fock-Wa11 15-17, D-2000 Hamburg 36: Identifizierung von Cholera-Vibrionen und V. parahaemolyticus, Lysovar-Bestimmung von V. eltor. Aeromonas - Plesiomonas Humanpathogene Keime der Gattung Aeromonas sind im allgemeinen polar monotrich begeifelt. Plesiomonas bewegt sich mit Hil£e einer polar lophotrichen

Begeifselung. 2

SieheAnhang.

158

Isolierung und Identifizierung von Vibrionaceae

Beide Arten sind Katalase- und Oxidase-positiv, sporenlos, wachsen fakultativ anaerob und fermentieren Kohlenhydrate (Aeromonas teilweise mit Gasbildung, Plesiomonas ohne Gasbildung). Wahrend Aeromonas eine Reihe Exoenzyme bildet (DNAse, Gelatinase, Kaseinase, Lipase), fehlen diese Enzyme bei Plesiomonas. Das Wachstum erfolgt in einem Temperaturbereich von 10-40 °C; die optimale Wachstumstemperatur liegt bei 30 °C; auch bei 37 °C ist das Wachstum noch gut.

Aeromonas bydrophila Innerhalb der Gattung Aeromonas kommt der Species A. hydrophila humanpathogene Bedeutung zu, Zwar differenzieren einige Autoren weiter und unterscheiden noch A. punctata bzw. A. sobria, doch besteht hierfiir derzeit keine Notwendigkeit. Die Keime sind weit verbreitet. Sie kommen bei verschiedenen Tierarten normalerweise vor. FlurKaltbliiter wie Reptilien, Frosche und Fische konnen sie pathogen sein. Haufig findet man sie in Oberflachen- und Abwasser, gelegentlich im Boden und in Lebensmitteln. Beim Menschen ist A. bydropbila selten. Sie kann akute Diarrhoe von kurzer Dauer verursachen. Wundinfektionen und Septikamien, die letzteren meist im Zusammenhang mit Lebererkrankungen oder Malignomen, wurden beschrieben .

Plesiomonas shigelloides Diese Keime werden im Wasser und bei einigen Warmbluterarten gefunden. Sie sind in Mitteleuropa selten. Beim Menschen sind nur wenige extraintestinale Infektionen bekanntgeworden; die meisten Stamme wurden von Diarrhoe-Patienten besonders in tropischen und subtropischen Gebieten isoliert. Ihre Kenntnis ist wichtig wegen der erforderlichen Abgrenzung vom Genus Vibrio.

Gewinnung und Transport von Untersuchungsmaterial Die Art des Untersuchungsmaterials richter sich nach der vorliegenden Erkrankung. Eine gezielte Fahndung nach diesen Keimen diirfte die Ausnahme sein. In der Regel werden sie erst bei unterschiedlichen Krankheitsprozessen nach Isolierung aus entsprechendem Material identifiziert, Fiir den Transport von Abstrichen und Stuhl werden folgende Medien empfohlen,

Stuart-Medium 2 Dieses halbfeste Medium laBt sich universell einsetzen, wenngleich es fur Vibrionen auf Grund seines mehr im Neutralen liegenden pH nicht so optimal ist wie Cary -Blair-Medium.

Cary-Blair-Medium 2 (Siehe oben, S. 150).

2

Siehe Anhang.

Isolierung und Identifizierung von Vibrionaceae

159

Gang der Untersuchung

Mikroskopische Untersuchung Die Untersuchung intestinalen Materials ist unergiebig. Extraintestinales Material lagt gramnegative, gerade, selten auch Ieicht gekriimmte Stabchen erkennen.

Isolierung Die Keime lassen sich mittels einfacher fliissiger und fester Nahrmedien kultivieren. Als Bebriitungstemperatur empfiehlt sich wie bei Vibrionen 35-37 0c. Auf festen Nahrboden bilden sich Kolonien, die denen von Enterobacteriaceae ahneln. Viele Aeromonas-Stamme zeigen Hamolyse. Die positive Oxidase-Reaktion liefert einen wesentlichen Hinweis. Die Keime wachsen auf einfachem Nahrund Blutagar sowie auf Endo- und MacConkey-Agar. Hier entwickeln sich je nach Vergarungsvermogen fiir Laktose farblose oder rote Kolonien.

ldentifizierung Die biochemische Identifizierung erfolgt an Hand der Angaben in Tab. 2 und 3. Ein Teil der P. shigelloides-Stiimme liigt sich mit Antiserum gegen die Glattform von Shigella sonnei agglutinieren.

Anhang

Cary-Blair-Medium Natriumthioglykolat Na 2HP0 4 NaCl Agar Aqua dest.

ad

1,5 g 1,1 g 5,0 g 5,0 g 991 ml

Vorsichtig erhitzen bis der Agar gelost ist, Nach Abkiihlen auf 50°C 9 ml einer frisch zubereiteten l0f0igen CaCl 2-Losung zugeben und auf pH 8,4 einstellen. Sterile Schraubverschlufsflaschen von ca. 10 ml Inhalt werden zu 4/5 des Volumens gefiillt und 15 Min. bei 100°C im stromenden Dampf erhitzt. Zuvor sollten die Flaschen in 0,067 M Sorensen-Puffer, pH 8,1 gewaschen worden sein.

Alkalisches Peptonu/asser (APW) Pepton NaCl Aqua dest.

ad

10,0 g 10,0 g 1000 ml

pH 8,5-9,2, in Rohrchen zu 10 ml abfiillen, Sterilisation 15 Min. bei 120°C.

Salzlosung nachVenkatramanund Ramakrishnan(modifiziert) Vollmeersalz Pepton Aqua dest.

ad

20,0 g 5,0 g 1000 ml

pH 8,6-8,8 einstellen, 10-15 ml in Scliraubverschlufsflaschen abfiillen, 10 Min. bei 120°C autoklavieren.

160

Isolierung und Identifizierung von Vibrionaceae

Galle-Pepton-Bouillon (GPB) Pepton NaCI Narriumtaurocholar Na2COs Aqua dest.

ad

10,0 g 10,0 g 5,0 g 1,0 g 1000 ml

pH 8,4-9,2 einstellen, in Mengen von 10-25 ml abfiillen, 15 Min. bei 120 DC autoklavieren. Die Bouillon ist nur 3-5 Tage haltbar. Das Medium ist als Fertigprodukt erhaltlich, z. B. Merck Art.-Nr. 10264, "Cholera-Anreicherungsbouillon".

Glukose-Salz-Teepol-Bouillon (GSTB)

Pepton Fleischextrakt NaCI Glukose Methylviolett Teepol " Aqua dest.

ad

Konzentration einfach doppelt 10,0 g 20,0 g 3,0 g 6,0 g 30,0 g 60,0 g 5,0 g 10,0 g 0,002 g 0,004 g 4,0 ml 8,0 ml 1000 ml 1000 ml

Auf pH 7,4 einstellen, 15 Min. bei 120 °C autoklavieren. * Teepol ist ein in Deutschland nicht kaufliches Detergens der Shell AG. Ein brauchbares, aber verdiinntes Produkt ist Teepol 610, Art-Nr. 35796 der Serva Feinbiochemica GmbH, Postfach 105260, 6900 Heidelberg, oder Teepol-Losung (angereichert) Best.-Nr. MM 369 der Oxid Deutschland GmbH, Postfach 1127, 4230 WeseI.

TCBS-Agar(Thiosulfate CitrateBileSaltsSucroseAgar) Komplexer Nahrboden, der in dehydrierter Form von verschiedenen Herstellern angeboten wird, z. B. BBL Nr. 11686, Difco 06050-01-2, Merck 10263, Oxoid CM 333, Pasteur 69456. Die angebotenen Nahrboden haben je nach Hersteller unterschiedliche Selektivitat.

Stuart-Medium Das komplexe Medium wird von verschiedenen Herstellern teils als StuartMedium, teils als modifiziertes Transport-Kohle-Medium angeboten, z. B. BBL Nr, 11740-11742, Difco 0621 bzw. 0744, Merck 5417, Oxoid CM 111/112 u. v. a.

Cholera-Serum (Ol-Antiserum) Polyvalente und monovalente diagnostische Antiseren gegen V. cholerae und V. eltor konnen bezogen werden von 1. Robert Koch-Institut des BGA, Nordufer 20, D-1000 Berlin. 2.Institut Pasteur Production, Nr. 57141, in der Bundesrepublik erhaltlich tiber Fa. Fresenius, Postfach 1480, 6380 Bad Homburg. 3. Difco Nr. 2430-47-1,2431-47-0 und 2432-47-9.

Isolierung und Identifizierung von Vibrionaceae

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Literatur 1. Bockemiibl, ].: Einfache Laboratoriumsdiagnostik der E1 Tor Cholera. Arzt!' Lab. 20 (1974) 32-41 2. Bodiemiihl, ].: Epidemiology and control, isolation and identification of pathogenic vibrios. IV Congreso Peruano de Microbiologia y Parasitologia, Lima (1977) 3. Feeley, [, C. and A Balows: Vibrio. In: Manual of Clinical Microbiology, 2nd Ed., pp. 238-245. American Society for Microbiology, Washington (1974) 4. Lee.]. V., T. 1. Donovan, and A 1. Furniss: Characterization, taxonomy, and emended description of Vibriometschnikovii. Int. J. system. Bact. 28 (1978) 99-111 5. Popoff, M. and M. Veron: A taxonomic study of the Aeromonas hydrophila-Aeromonas punctata group. J. gen. Microbio!' 94 (1976) 11-22 6. Schlessinger, D.: Vibrio parahaemolyticus: Occurrence, identification and clinical significance. In: Microbiology 1974. American Society for Microbiology, Washington (1975) 7. Schubert, R. H. W.: Genus II Aeromonas. Genus III Plesiomonas. In: 8th Edition, Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, pp. 345-349. Williams & Wilkins Co., Baltimore (1974) 8. Sheuian, ]. M. and M. Veron: Genus I Vibrio. In: 8th Edition, Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, pp. 340-345. Williams & Wilkins Co., Baltimore (1974). 9. Von Graeuenitz, A: Aeromonas and Plesiomonas. In: Manual of Clinical Microbiology, 3rd Ed. American Society for Microbiology, Washington (1980) Professor Dr. Dr. Hans E. Muller, Staat!' Medizinaluntersuchungsamt, Hallestr. 1, 0-3300 Braunschweig