La microdissection de chromosomes par laser

‘utilisation d’un fin faisceau laser comme outil de dissection permet une selection tres precise de fragments de chromosomes a partir du genome total. Lorsqu’un fragment selection& est bien identifie, il peut Qre utilise comme (( sonde )) pour rep&w ou confirmer I’existence de la sequence d’ADN complementaire sur une plaque metaphasique a etudier. Sit s’agit d’un fragment inconnu, correspondant par exemple a une translocation detect&z Ions d’un caryotype, son utilisation pourra conduire a I’identification du chromosome dont provient ce fragment. En effet, mis en presence dune plaque metaphasique normale servant de reference, le fragment s’appatiera avec le chromosome homologue non transloque. Cette localisation du fragment inconnu sur un chromosome identifie permettra de caracteriser la translocation et de faciliter I’etablissement de certains diagnostics. L’obtention d'un fragment patticulier se d&oule en deux etapes. Dans un premier temps, le fragment est physiquement isole a pat-tir du genome total. Les methodes de selection sont particulierement difficiles a mettre en ceuvre dans la mesure oh I’ADN a isoler ne constitue qu’une tres faible proportion de I’ensemble. Ainsi, un fragment correspondant a une bande G ne represente qu’environ 0,5 % du genome total. En revanche, la seconde phase qui consistea amplifier I’ADN selectionne est facilitee par I’utilisation de la polymerase chain reaction (PCR). L’amelioration sensible de la methodologie doit done avant tout porter sur la premiere &ape, c’est-a-dire la selection physique du fragment de chromosome desire. Une methode bien etablie consiste a p&lever, par grattage a I’aide d’une micropipette, un petit fragment sur une plaque metaphasique etalee. Cependant celle-ci presente par rapport a la microdissection laser un certain nombre de limites : endommagement possible de la par-tie prelevee, definition approximative des extremites du fragment, limitation de la taille de celui-ci a environ 700 paires de bases. La microdissection laser ouvre, quant a elle, de nouvelles

L

Analyse

(banding.

possibilites. Notamment la selection rapide de genes B pattir du fragment preleve et ainsi I’etablissement dune cartographic transcriptionnelle du gknome. La microselection tres simple dans son principe (voir figure) consiste a deplacer, sur les chromosomes &ales en plaque metaphasique, un faisceau laser Bmis par une source argon (h = 488 nm). Celui-ci, Bmis a forte puissance, bnjle les chromosomes sur son passage. Lorsqu’il se trouve sur une region contenant le fragment a selectionner, le faisceau est devil par un miroir et epargne ainsi le fragment d’interet. Ce fragment sera ensuite decolle de la lame pour etre transfer6 dans un tube a PCR afin d’etre amplifie. Le faisceau laser est suffisamment fin pour permettre par exemple de brrjler une chromatide en laissant son homologue intacte. II est deplace au moyen dune souris et son effet est visualise sur un Qcran video. Une fois recupere, le materiel selectionne est soumis a une &ape d’amplification par PCR dans des conditions tres rigoureuses (notamment vis-a-vis des contaminations), imposees par la tres faible quantite d’ADN. Ensuite I’hybridation sur une plaque metaphasique de reference et la revelation par fluorescence permettent la localisation du fragment inconnu. Cette methodologie, deja utilisee pour des chromosomes vegetaux et humains, est appreciee pour sa reproductibilite et sa rapidite. La qualite de I’ADN obtenu par amplification est dans une phase d’optimisation. Les perspectives laissent B penser que des fragments de 1,5 kb devraient dtre obtenus saris difficult& n Philippe MbiZEAU et Mustapha BENSAASA hstitut

Pasteur,

hserm-Pasteur,

PrbParative,

Unit6

de biochimie

Roux,

Paris

cedex

75782

Cytom&ie cellulaire,

analytique

et

28, rue du Docteur-

15.

Remerciements Nous remercions Mmes H Kiefer et V Cacheux. MM B Baron et G Tachdjian (Institut Pasteur) pour I’aide qu’ils nous ont apporttk

FISH)

Brulage au laser

Transfeti

Analyse

(banding,

FISH)

6 Avldine

fluoresc&w

Fig - Principe de la selection de fragment chromosomique et application. 1. Le caryotype revele une translocati d’origine inconnue (dessinee en rouge), qu’il s’agit d’identifier. 2. Le laser, en balayant point par point I’ensembll de la preparation, brOle tous les chromosomes de la plaque, a I’exception du fragment a identifier qu’il contourr 3-4. Ce fragment est r&up&e puis transfer& pour amplification par PCR. A ce stade, la biotine est incorporee a ‘ADN. 5. Cet ensemble ADN-biotine, souvent appelee (( sonde b), est incube avec des chromosomes (c normaux de reference, identifies (banding R ou G, prealablement denatures). La sonde inconnue va s’hybrider avec a sequence complementaire, trouvee sur I’un des chromosmes. 6. L’hybridation est rev&e par addition d’avidine-fluroresceine, en raison de la forte affinite entre I’avidine et la biotine. 7. La sonde est ainsi localisee s .m des chromosomes de la plaque, g&e a sa fluorescence. LETECHNOSCOPEDEBlOFUTLlRl65

*Mars1997

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