La résistance de la levure aux ions cuivriques

Experimental

278

Cell Research

LA RfiSISTANCE DE LA LEVURE IONS CUIVRIQUES YEAST

37, 278-291

(1965)

AUX

II. SACCHAROM YCES CERE VISIAE, FOAM, INFLUENCE DES IONS CU2+ SUR L’APPARITION DE CELLULES ReSISTANTES A. ANTOINE’

Laboratoire

de Morphologie

Animale Rep

de Z’lJniversite

de Bruxelles,

Belgique

le 13 mars 1964

DANS

le premier article de cette sCrie [l], l’acquisition de la r&stance aux ions cuivriques (dans le milieu de Henneberg B l’extrait de malt) et surtout la perte de cette r&stance au tours de la multiplication en l’absence de cuivre ont CtC 6tudiCes chez Saccharomyces ellipsoideus. Une hypothiise a CtCpropo&e, selon laquelle la rCsistance ht!rCditaire de cet organisme serait de nature cytoplasmique. Chez Saccharomyces cereuisiae, il est 6tabli que la resistance au cuivre est contrblke par un gkne dont 1’alEle rhsistant, dominant, permet B la levure de proliferer vigoureusement dans des milieux complets 1 mM en Cu2+ [3]; ce g&e n’est 1% B aucun des autres g&nes connus de S. cerevisiae [5]. Lorsque des cellules de S. cerevisiae, Yeast Foam, sont cultivhes en prksence de concentrations sublkthales d’ions cuivriques, il apparait rapidement des cellules B rkistance hCrCditaire t&s 6levCe [3]. Les expbriences rapportkes dans le p&sent travail ont t%Cex6cutCes en vue d’ktudier l’influence du Cu2+ sur la modification hCrCditaire de Yeast Foam vers la r6sistance au cuivre; en d’autres termes, on a cherch6 g Ctablir si cette modification, cette mutation, est ou non induite par les ions cuivriques.

MAT6RIEL

ET

MfiTHODES

Le levure utilike au depart est Saccharomyces cerevisiae, Yeast Foam, diplo’ide. Le milieu de Henneberg additionnk d’extrait de malt a toujours BtB employ& il est design6par MH. Composition et prkparation du milieu.-66 g saccharose, 3,3 g bacto peptone (Difco), 3,3 g KH, PO,, 1,3 g Mg SO, * 7H,O, 40 g extrait de malt (Difco), 800 ml eau 1 AgrBgB, Experimental

Chaire Cell

de Zootechnie, Research

37

Institut

Agronomique,

Gembloux,

Belgique.

Rt%istance

de la levure au Cuz+

279

bidistillee; apres dissolution, le milieu est autoclave IO min B 115”, refroidi a 20”, port6 a 1 1 et sterilise 20 min a 120”. Les concentrations finales en ions cuivriques ajoutes sent obtenues en introduisant les quantites appropriees de solutions de CuSO, fraichement sterilisees; elles sont exprimees par MH +X mM CLP+. Dans le cas de milieux solides, a 1,5 o/0 d’agar, le sulfate de cuivre est ajoute au milieu fondu maintenu a 45°C; apres agitation soigneuse, le milieu est reparti a raison de 11 ml par boite de 9 cm. Les boites ainsi preparees sont mises a s&her 48 h a l’etuve B 37“. Les Ctalements sont toujours executes sur des boites sortant de l’etuve ou maintenues dans des containers fermes hermetiquement. Isolement des cellules.-Les cellules sent isoleesau micromanipulateur, dans des gouttelettes pendantes, en chambres a huile de paraffine. Densite’ des populations cellulaires.-Les populations sont determinees par comptage direct a l’hematimetre ou au leucocymbtre de Thoma. Chaque comptage Porte sur au moins 500 cellules; tout bourgeon ayant plus du tiers de la taille adulte est consider6 comme une cellule. Conditions de culture.-La temperature d’incubation est toujours 30”. Les cultures liquides se font en aerobiose, dans des flacons de Roux ou des tubes inclines agites. RI&!3 ULTATS

Apparition de cellules rbistantes dans MH i-O,5 et 1 mM Cu2+.-Un clone de Saccharomyces cerevisiae, Yeast Foam, levure desormais dt%gnCe par YF, est ensemence, a raison de lo6 cellules par ml, dans 50 ml de MH + 05 mM Cuz+ et incube durant 48 h. De cette premiere culture, A, comptant 91 *lo6 cellules par ml, on introduit 0,l ml dans 50 ml de MH +l mM Cu2+ et on incube 24 h. A ce moment, cette culture, B, renferme 52 * lo6 cellules par ml. Aucune cellule de la souche mere YF, parmi 40 isolees dans des gouttelettes de MH +l mM Cu2+, ne prolifere en 24 h; on ne retrouve que la cellule ensemen&e ou seulement quelques cellules filles, toutes mortes. Cent cellules de la culture A isolees dans les m&mes conditions fournissent, en 24 h, 71 colonies dont le diametre moyen est compris entre 180 et 225 p et dont 30 a 40 y0 des individus sont morts. Quand 1,5.108 cellules normales de YF sont ensemencees dans 50 ml de MH +l mM Cu2+, elles ne donnent lieu a aucune proliferation en 24 h d’incubation a 30”; pratiquement, on ne retrouve que les cellules ensemencees, presque toutes mortes. Cent c,ellules de la culture B isolees comme les precedentes donnent naissance B 81 colonies qui se repartissent en deux types bien distincts. Quatorze ont un diametre moyen compris entre 350 et 400 ,u et ne renferment que tres peu de cellules inviables; les 67 autres sont semblables a celles qui sont issues de A. Des cellules de 6 des grosses colonies et de 12 des petites sont isolees dans Experimental

Cell Research 37

A. Antoine

280

le milieu sans cuivre et y sont multipliees durant 144 generations ou doublements de population. A ce moment, 20 cellules de chacun des clones sont isolees dans des gouttelettes de MH +l mM Cu2+ et incubees 24 h. Les 120 cellules issues des grosses colonies donnent naissance a 119 colonies volumineuses de m&me type que celles dont elles proviennent. Les 240 cellules derivant des petites colonies fournissent 235 colonies semblables aux petites colonies observees precedemment dans le milieu toxique. 11 existe done deux types de cellules a resistance permanente, dans la culture B. Le premier, le plus resistant, est appele YFR, il prolifiire dans MH $1 m&f Cu2+ comme dans le milieu sans cuivre. Toutes les cellules de YFR etalees sur MH + 1,6 mM Cu2+ et MH +2,5 mM Cu2+ donnent naissance, apres 48 h d’incubation, B de grosses colonies rondes, de diametre superieur B 1,5 et 1,2 mm. Le second type presente une resistance permanente, mais inferieure h celle de YFR. Le maintien de la resistance, apres 144 generations dans le milieu sans cuivre, indique qu’elle est, comme celle de YFR, de nature genetique, aussi ce second type est-il design& par MR, (moyennement resistant de nature probablement genetique). ‘routes les cellules de clones MR, sont capables de proliferer sur MH + 1,6 mM Cu2+ en donnant, en 48 h, des colonies de diametre inferieur a 0,6 mm et quelques rares colonies plus grosses dont le bord est irregulier. De tels clones MR, sont isoles des populations semblables a celle de la culture B d&rite, maintenues plus de 120 generations dans le milieu sans cuivre. Lorsque des cellules de la souche parentale YF sont CtalCes sur MH + 1,6 mM Cu2+ et MH +2,5 mM Cu”+, on n’observe, dans les memes conditions, qu’une seule petite colonie de diametre inferieur a 0,5 mm pour 750 et 520.000 cellules CtalCes, respectivement. Les trois formes YF, YFR et MRG peuvent etre determinees par la culture sur MH + 1,G mM Cu2+. Dans le milieu normal, elles se comportent de facon identique; il n’y a pas d’avantage selectif de l’une par rapport aux autres, decelable apres culture en aerobiose du melange des trois types. L’experience d&rite, oti la resistance est testee en gouttelettes, a &C reproduite en Ctalant, toutes les 6 heures sur MH + 1,6 mM Cu2+, des echantillons des cultures A et B, ce qui permet de traiter un nombre beaucoup plus important de cellules. Les resultats obtenus sont comparables a ceux qui viennent d’etre rapport&; ils indiquent que les cellules YFR a resistance stable la plus elevee naissent dans le milieu toxique a partir de MRG. Etude de la descendance de cellules MRG isole’es.--Pour tenter de demontrer la modification de cellules MR, en YFR et d’apprkcier l’influence des ions cuivriques sur ce phenomene, des cellules MRG sont isolees dans des goutteExperimental

Cell Research

37

Rbistance

de la levure au Cu2+

281

lettes de MH, B partir d’une culture de YF durant 24 heures dans MH + 1 mM Cu2+, prCcCdCe d’une culture de 48 h dans MH +0,5 mM Cu2+. Vingt clones qui en derivent sont cultives dans le m&me milieu saris cuivre. Les clones sont CtalCs en stries d’environ 150 cellules sur MH + 1,6 mM Cu2+, apres 15 generations dans MH. Les dix premiers sont &ales sur MH et MH + 1,6 mM Cu2+, en double exemplaire, apres 120 generations dans le milieu normal. Les resultats, apres 48 h d’incubation, sont rassembles dans le Tableau I. TABLEAU (A) clones

Types de colonies dans des stries d’environ MR, isoles et cultives durant 15 generations

Les stries Clones

1 2 5 6 9 12

I.

des clones

GCR

GCBI

CI

-

(B) Types 120 generations

PC

1 1

3 8

-

Clones

+++ +++ +++ +++ +++ +++

2 2 2 4

de colonies dans les etalements dans le milieu saris cuivre.

15 16 17 18 20

sur

MH+

Colonies Clones

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Colonies sur MH temoins

451 283 315 346 292 137 198 250 247 253

sur MH + 1,6 mM saris cuivre.

3, 4, 7, 8, 10, 11, 13, 14 et 19 sent formees

1 -

150 cellules, dans le milieu

uniquement

de 20

de PC.

GCR

GCBI

CI

PC

-

-

3 2 1 1 1

+++ -t + + +++ + + -t -1- + +

1 1 2

1,6

Cuz+,

-

mM

Cu2+ des clones

sur MH

+ 1,6 mM

1 a 10, apres

Cu2+

GCR

474 268 315 342 292 144 210 261 256 260

GCBI

CI

PC

7

-

6 1 2

-

4 11 5 8 2 3 6 2 8 6

463 257 304 328 289 139 204 258 227 254

-

6

1 21 -

Les stries et les Ctalements sent incubes 48 h. GCR, grosses colonies rondes > 1,5 mm; GCBI, grosses colonies a bord irrbgulier; CI, colonies intermediaires; PC, petites colonies <0,6 mm produites normalement par les MR, sur MH + 1,6 mM Cu2+. Experimental

Cell Research

37

A. Antoine

282

Les colonies observees sur le milieu toxique sont de differents types design& par des abreviations. GCR, grosses colonies rondes, de diametre superieur a 1,s mm, dont tous les individus sont YFR. Les GCR ont une cellule YFR a leur origine. GCBI, grosses colonies, de diamirtre superieur a 1,s mm, a bord irregulier, festonne. CI, colonies intermediaires de diamittre compris entre 0,6 et 1,s mm, h bord presque toujours irregulier. PC, petites colonies de diametre inferieur a 0,6 mm. Chacun des dix clones de la partie B du tableau provient bien d’une cellule MR,, puisque, aprits 120 generations dans le milieu saris cuivre, toutes les cellules restent capables de proliferer sur MH +1,6 mM Cu2+ en donnant surtout des petites colonies, en moyenne plus de 96 Oh. Dans certaines stries et dans 6 des 10 Ctalements on peut observer des grosses colonies rondes (GCR) dont les cellules meres sont des YFR qui existaient dans les populations CtalCes. Apres 15 et 120 generations dans MH, les frequences des cellules YFR sont comparables dans les clones MR,; comme il n’y a pas d’avantage selectif des MR, sur les YFR dans le milieu normal, il semble bien que c’est au debut du sejour dans le milieu saris cuivre que les cellules YFR se forment a partir des MR,. Ce serait done au tours des premieres generations qui suivent leur depart du milieu toxique, MH + 1 mM Cu2+, que des MRG seraient modilikes en YFR. La confirmation partielle de cette idee peut &tre fournie aisement. Des cellules MR, des clones 2-5 et 9 du Tableau I sont isolees a nouveau dans TARI,EAU II. Types de colonies formees apres 48 h d’incubation d’etalements, sur MH+l,B mA4 Cu*+, de cultures de 25 generations dans MH provenant de cellules MR, isolees des clones 2-5 et 9 du tableau I. Ces clones ont CtC maintenus durant 120 generations dans le milieu saris cuivre depuis l’isolement initial de cellules MR,, d’une culture de YF en presence d’ions cuivriques. Nouveaux clones

Colonies Colonies sur MH temoins

GCR

21 22

413 419

419 412

5, 5,

439 429

432 441

-

91 9,

387 393

380 395

-

Experimental

Cell Research

37

sur MH+

1,6 mM

&-I31

Cu2+ CI

PC

24 27

395 385

2 3

16 20

414 418

a 2

17 15

361 378

-

Rbistance

de la levure au Cu2+

283

MH, apres un sejour de 120 generations dans ce m&me milieu depuis l’isolement initial. Deux nouveaux clones freres issus de chacun des anciens sont cultives dans MH durant 25 generations; des Cchantillons sont alors Ctales sur MH et MH +1,6 mM Cu2+, en double exemplaire. A ce moment, il s’est produit 145 generations depuis que les cellules meres des clones 2-5 et 9 ont 6th sorties du milieu toxique. Le Tableau II donne les resultats de ces etalements. On ne retrouve plus de colonies GCR dans les etalements, il ne s’est plus forme de cellules YFR decelables dans les echantillons eta%, depuis le second isolement dans le milieu saris cuivre. La difference entre les Tableaux I et II n’est pas signilicative en ce qui concerne les clones 2 et 5, mais elle l’est hautement pour le clone 9 dont 8,2 % des cellules etaient des YFR, alors que les clones 9, et 9, ne renferment plus d’YFR parmi 775 cellules etalees. 11 semble done bien que la formation de cellules YFR est limitee aux premieres generations qui suivent l’isolement initial, c’est-a-dire la sortie du milieu toxique. Des suspensions de cellules de colonies GCBI etalees sur MH +1,6 mM Cu2+ donnent naissance a des colonies GCR, GCBI, CI et PC; les GCBI sont constituees de cellules MRo et YFR, elles ne proviennent pas d’une cellule YFR dont toute la descendance serait YFR. Formation de cellules YFR ir partir du clone MR, 2,.-Les cellules YFR a resistance hereditaire la plus forte semblent naitre des MRG, avec une frequence ClevCe, lorsque ces dernieres sont chargees de cuivre. Dans le milieu normal, les MR, paraissent beaucoup plus stables et ne pas muter ou ne muter qu’a un taux nettement inferieur a celui que l’on observe dans le milieu toxique. Le clone MR, 2, et le clone 2 dont il provient n’ont jamais montre de disposition particuliere a produire des cellules YFR, depuis le premier isolement dans le milieu saris cuivre. Le premier a Cte choisi, pour cette raison, comme materiel d’investigation de l’influence des ions cuivriques sur le taux de mutation des MR, en YFR. Des cellules MRc 2, sont CtalCes sur MH, MH +1,6 mM Cu2+ et MH + 2,5 mM Cu2+, apres avoir sejourne dans le milieu sans cuivre durant 155 et 35 generations depuis l’isolement des clones 2 et 2,. Apres 48 h d’incubation, les Ctalements sur les milieux toxiques ne montrent aucune grosse colonie ronde (GCR), il n’existe done pas d’individu YFR parmi 9,3 * 105 cellules du clone MRG2, maintenu dans le milieu normal. Toutes les cellules prolifiirent sur MH +1,6 mM Cu2+; plus de 97 % donnent des petites colonies (PC), les autres produisent des colonies intermediaires (CI). Sur MH temoin, on observe 19 - 651810

Experimental

Cell

Research

37

A. Antoine

284

quelques petites colonies, 0,8 %, de diamittre inferieur a 0,6 mm, a c&C de colonies de grande taille. Le lendemain, d’un des Ctalements sur MH +1,6 mM Cu2+ incubC ainsi 72 h, quatre petites colonies et deux colonies intermediaires sont prelevees et mises en suspension dans de l’eau sterile; elles comptent respectivement 3.105 et 8,5 * 105 cellules et les diametres sont 0,7 et 1 mm. Les suspensions des 6 colonies sont etalces en quantites @ales sur MH et MH + 1,6 mM Cu2+. Les resultats des observations apres 48 h d’incubation sont donnes par le Tableau III. 11 existe des cellules YFR dans les quatre petites colonies de 72 h sur MH + 1,6 mM Cu2+; ces YFR sont B l’origine des grosses colonies rondes, GCR, de la seconde partie du Tableau III. Partant des donnees fournies par cette experience, il est possible d’estimer le taux de mutation des MR, 2, en YFR sur le milieu toxique, en appliquant une methode arithmetique mise au point pour des conditions semblables [4]. Sur MH +1,6 mM Cu2+, l’avantage selectif des YFR sur les AIR, 2, est important; en 72 h, les premieres produisent des colonies de 2,5 a 3 mm de diametre comprenant 3 * 107 individus alors que les MRG 2, donnent des colonies d’environ 0,7 mm de diametre et de 3.105 cellules. Calcule sur cette base l’avantage sclectif est 1,36. Deux facteurs intervenant en sens inverse sont negliges dans ce calcul; il est certain que la surpopulation limite plus fortement la multiplication cellulaire dans les colonies YFR que dans les MR,; par contre, les colonies MRG renferment de nombreuses cellules qui donnent naissance a des petites colonies sur le milieu sans cuivre, de telles TABLEAU

Types de colonies observees sur MH et MH de cellules de 4 petites colonies (PC) et de 2 d’un Ctalement sur MH + 1,6 mM Cu2+ de avec le cuivre Origine

Colonies

PC,

482:

PC, PC, PC, Cl1 Cl,

Experimental

111.

+ 1,6 mM Cu2+, apres colonies intermediaires cellules du clone MR, depuis 155 generations.

sur MH

48 h d’incubation d’etalements (CI), toutes de 72 h, provenant 2, n’ayant plus Cte en contact

Colonies

sur MH

462:

4 GCR+

506: 453: 526:

94 > 1,5 mm + 341~ 0,6 mm + 47 intermediaires 228>1,5+230<0,6+48 I 343 > 1,5 + 90 < 0,6 + 20 I 112>1,5+331<0,6+73 I

495: 482: 481:

6 GCR + 135 CI + 354 PC 4 GCR + 9 GCBI + 225 CI + 244 PC 6 GCR+2 GCBI+78 CI+365 PC

438: 426:

394>1,5+6<0,6+15 I 366 > 1,5 + 41~ 0,6 + 19 I

451: 463:

51 GCR+16 GCBI+343 CI+41 PC 38 GCR + 14 GCBI + 360 CI + 51 PC

Cell Research

37

61 CI+

+ 1,6 mdd Cu2+

397 PC

Rbistance

de la levure

285

au Cu2+

cellules se developpent moins rite sur le milieu toxique que les MR, normales. 11 est impossible de preciser la compensation qui s’opere entre les deux facteurs en cause, mais on peut considerer que l’avantage selectif des YFR sur les MR, est voisin de 1,4. Dans le calcul du taux de mutation en YFR, on ne devra tenir comme susceptibles de muter que les cellules MRG 2, ayant fourni des grosses colonies et une partie, arbitrairement la moitie, de celles qui ont produit des colonies intermediaires sur MH; ces cellules sont les seules capables de donner naissance B des YFR de type respiratoire normal. Sur le milieu toxique, MH + 1,6 mM Cu2+, le taux de mutation des MRG 2, en YFR Ctabli pour un avantage selectif de 1,4 en faveur de YFR est 0,86. 10-3. Dans le Tableau III, les Ctalements sur MH sont tres heterogenes. Les petites colonies formees, apres 72 h d’incubation sur MH + 1,6 mM Cu2+ de cellules MR, 2,, renferment de nombreux individus donnant des petites colonies rondes, de diametre inferieur a 0,6 mm, sur MH; elles contiennent Cgalement des cellules qui produisent des colonies de taille intermediaire sur le m$me milieu non toxique. Ces colonies intermediaires sont le plus souvent festonnees, certaines presentent une surface plissee. Dans les 4 PC @tudiCes, les frequences des cellules donnant des colonies petites et intermediaires, sur MH, sont respectivement 50,4 et 9,5 %. Tests de variation et (( replica-plating ),.-La technique d’etude de la variation, de Luria et Delbruck [7] et celle des (( replica-plating )) de Lederberg [4] ont ete mises au point en vue de determiner l’origine spontanee ou induite des mutants resistants a des toxiques ou des antibiotiques. L’application de ces methodes dans le cas de S. cerevisiae, YF n’a fourni que des resultats dont on ne peut tirer de conclusion. Le seul renseignement precis obtenu est qu’il n’existe pas de cellule capable de donner une grosse colonie ronde (GCR) sur les milieux toxiques, parmi 1010cellules YF obtenues en milieu saris cuivre. Dans le milieu normal, YF ne mute pas ou ne mute qu’a un taux tres faible en YFR. L’experience precedente a montre que les YFR apparaissent a partir des MR, avec une frequence de l’ordre de 1O-3 sur MH + 1,6 mM Cu2+, alors qu’on n’en observe pas parmi 9,3 * 105 cellules MR, maintenues en milieu saris cuivre. On peut se demander si la modification des cellules YF en MR, presente le m&me caractere d’induction probable par les ions cuivriques. L’etude de colonies obtenues lors de l’etalement de cellules de la souche mere YF sur MH +1,6 mM Cu2+ est un moyen d’aborder le probleme. Experimental

Cell Research

37

A. Antoine

286

Parmi 22. lo3 cellules YF &al&es sur MH + 1,6 mM Cu2+, 16 donnent naissance a des petites colonies (PC) de 25 a 30 * 103 individus, apres 48 h d’incubation. Cinq de ces colonies sont isolees et mises en suspension dans 3 ml de MH. Les suspensions sont incubees jusqu’au moment oti les populations sont 10s cellules, ce qui correspond a 12 generations dans le milieu normal. Des Cchantillons de ces populations sont alors etales sur MH et MH +1,6 mM Cu2+. Le lendemain, 5 autres petites colonies, de 72 h cette fois, sont traitees de la m&me faqon, elles comprennent de 1 a 1,5.105 cellules et le sejour dans le milieu sans cuivre est de 10 generations. Les etalements sont examines apres 48 h d’incubation, les resultats figurent au Tableau IV. Apres 12 generations dans le milieu sans cuivre, la plupart des cellules issues des 5 petites colonies de 48 h d’un Ctalement de YF sur MH +1,6 mM Cu2+ ont perdu le pouvoir de proliferer sur le milieu toxique. Les cellules meres de ces colonies n’etaient certainement pas des MR, dont toute la descendance serait restee resistante. 11 semble done exister dans les populations YF, n’ayant jamais &C en contact avec les ions cuivriques, des individus de structure genetique YF qui sont dans un etat physiologique tel qu’ils peuvent se multiplier lentement sur les milieux t&s toxiques. Les cellules lllles s’y accoutument au cuivre, mais cette accoutumance n’est pas permanente, elle se perd en t&s grande partie au tours de 12 generations dans le milieu normal. De tels individus YF B resistance moyenne presumee physioTABLEAU

IV.

Etalements sur MH et MH + 1,6 mM Cu2+ de populations issues, en milieu colonies de 48 et 72 h d’un Btalement de YF sur MH + 1,6 mM CuZf. (A) Colonies de 48 h: sejour generations dans MH.

de 12 generations

Sur MH

Experimental

dans

MH;

(B)

Colonies

SW MH

normal,

de petites

de 72 h: sejour

+ 1,6 m&f

Cu2+

A 1 2 3 4 5

541> 518 > 571~ 472 > 328 >

1,5 mm 1,5 + 1~ 0,6 1,5 + 2 < 0,6 1,5 1,5

19 PC 2 c1+100 55 PC 3 CI+75 2 CI+17

B 1 2 3 4 5

325 82 468 576 87

1,5 mm 0,7 1,5 + 2 < 0,7 1,5 + 2 < 0,7 0,7

254: 4 GCR+7 CI-k243 PC 87 PC 301: 2 GCR + 9 Cl + 290 PC 433: 19 GCBI+S5 CI+319 PC 83 PC

Cell

Research

> < > > <

37

PC PC PC

de 10

R&stance

287

de la levure au Cu2+

logique sont design& par MR,; l’origine physiologique de leur resistance parait &tre contirmee par les deux petites experiences suivantes : Une cellule YF est isolee dans une gouttelette de MH et incubee jusqu’a formation de 400 cellules. Des series de 20 cellules sont alors isolees dans des gouttelettes de MH et MH +0,5-0,6-0,7-0,8-0,9 et 1 mM Cu2+. Apres 24 h on observe respectivement 20-20-17-14-S-2 et 0 colonies d’incubation, dont la taille decroit en fonction de la concentration en ions cuivriques. Dans le milieu normal, les 400 premiers descendants d’une cellule YF sont surement identiques a la cellule mere en ce qui concerne le genome; les differences observees de capacite a proliferer dans les milieux toxiques ne peuvent done relever que de variations d’etats physiologiques. De m&me, des cellules d’un clone YF Ctalees sur des milieux solides MH + 1,2-1,4-1,6-1,s et 2,5 mM Cu2+ donnent naissance seulement a des colonies de diametre inferieur a 0,5 mm en 48 h d’incubation; les frequences respectives des colonies formees sont pour mille cellules etalees : 190-l 1-1,30,22 et 0,002. Trois des colonies de 72 h de la partie B du Tableau IV ont egalement une cellule MR, a leur origine, ce sont les no 1, 3 et 4. Ici, une proportion importante de cellules gardent la faculte de proliferer sur MH + 1,6 mM Cu2+, apres 10 generations dans le milieu sans cuivre; ce fait et la presence de colonies GCR et GCBI sur le milieu toxique indiquent l’existence de nombreuses cellules MRG a resistance hereditaire, dans les trois colonies envisagees; deux d’entre elles renfermant m&me environ 1 % d’individus YFR, les no 1 et 3. La nature des cellules meres des colonies 2 et 5 est indeterminee, ce ne sont en tous cas pas des MR,, puisque sur MH toutes les colonies sont de petite taille. Le type MR, n’etant pas avantage par rapport B YF dans le milieu normal, il apparait que les MRG se sont formees a un taux ClevC, au depens des MR,, sur le milieu toxique, dans les colonies Ctudiees. Ce taux peut &tre estime a partir des don&es du Tableau IV (A). 11 parait raisonnable de presumer qu’apres 12 generations dans le milieu sans cuivre, la moitie des cellules restees capables de donner des petites colonies (PC) sur le milieu toxique sont des MRo, ainsi que toutes celles qui donnent des colonies intermediaires [2]. D’autre part, sur MH +1,6 mM Cu2+, l’avantage selectif des MR, sur les MR, est faible, les colonies de 48 h des deux types presentent des diametres tres voisins; les colonies issues de cellules MR, comptent 30. lo3 cellules, si l’avantage des MRG Ctait 1,2, leurs colonies renfermeraient 240 *lo3 et se distingueraient nettement, il est done inferieur a 1,2. Le taux de mutation des cellules MR, (YF) en MRG calcule d’apres les Experimental

Cell

Research

37

288

A. Antoine

don&es proposees et un avantage de 1,2 en faveur des MR, est 4,l .10-3; des cellules YF mutent done, sur le milieu toxique, avec une frequence tres ClevCe. Aucune des 10 colonies Ctudiees, prises au hasard parmi les 16 existant dans l’etalement initial de 22 * lo3 cellules YF sur MH + 1,6 mM Cu2+, n’a une cellule MRG a son origine; la probabilite est done grande qu’il n’existe pas de cellule MR, parmi les 22. lo3 cellules YF de l’echantillon CtalP. Dans le milieu saris cuivre, les cellules YF ne paraissent pas muter en MR, A un taux superieur a 4,5.10-s.

DISCUSSION

ET

CONCLUSIONS

Lorsque des cellules de Saccharomyces cerevisiae, Yeast Foam, (YF) sont cultivees 48 h dans du milieu de Henneberg au malt (MH) +0,5 mM Cu2+, puis 24 h dans MH + 1 mM Cu2+, la seconde culture comprend deux types de cellules dont la resistance au cuivre est permanente. La forme la plus resistante, appelee YFR, predomine tres rapidement dans les milieux les plus toxiques, elle prolifere dans MH + 1 mM Cu2+ aussi bien que dans MH. La resistance de YFR est hereditaire, elle n’est pas influencee par un sejour de 144 generations dans le milieu saris cuivre. Le type YFR est comparable a celui qui a Cte decrit par Brenes-Pomales et rrl. [3], oti la resistance est due a la presence d’un gene dominant. Une forme B resistance stable, mais moins &levee que celle de YFR, existe en tres grand nombre dans la seconde culture d’ N adaptation )), avant que de la capacite de des cellules YFR puissent y ttre decelees. La persistance ce second type de proliferer lentement dans les milieux t&s toxiques indique que sa resistance est de nature genetique, comme celle de YFR; il est design& par MR,, moyennement resistant de nature genetique. Les cellules YFR semblent se former a partir des MR,, dans le milieu toxique. Des cellules MRG isolees d’une culture d’adaptation et cultivees dans le milieu normal fournissent des clones qui renferment des cellules YFR. Les frequences des cellules YFR dans les clones issus de cellules MR, ne se modifient pas au tours de la culture de ceux-ci, dans le milieu saris cuivre, durant 105 generations; les frequences determinees apres 15 et 120 generations dans MH sont semblables. Les deux types cellulaires se multiplient a la m&me vitesse dans MH, il en resulte que les YFR se forment seulement dans MH au tours des premieres generations qui suivent l’isolement des immediatement apres que ces dernieres sortent cellules MRe, c’est-a-dire du milieu toxique. Dans les limites des echantillons testes, les clones MR, Experimental

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isoles a nouveau apres 120 generations dans MH et cultives dans ce m&ne milieu ne produisent plus de cellules YFR. Les YFR naissent done a partir des MR, dans le milieu toxique ou au tours des premieres generations dans MH, quand la teneur en cuivre du contenu cellulaire est encore suflisante. Le cuivre tree done, dans les cellules MRG, un Ctat d’instabilite favorable a leur modification en YFR. La presence de nombreuses cellules YFR parmi les 3 * lo4 premiers descendants d’individus MR, isoles et cultives durant 15 generations dans le milieu normal est remarquable; elle permet d’exclure l’idee selon laquelle les YFR proviendraient de mutations spontanees ou de processus sexuels L’apparation des YFR est le resultat suivis de phenomiines de selection. d’une alteration hereditaire induite par le cuivre intracellulaire. L’etude du clone MR, 2, a montre qu’il n’existe pas d’YFR parmi 9,3. 105 cellules MR, obtenues dans le milieu saris cuivre; ce clone provient de l’isolement dans MH de cellules du clone MRG 2 maintenu lui-m&me durant 120 generations en l’absence d’ions cuivriques. Par contre, les colonies de 72 h sur MH +1,6 mM Cu2+ issues de cellules MR, 2, renferment des cellules YFR en grand nombre. Sur le milieu toxique, le taux de mutation des MR, 2, en YFR est tres Cleve, il est de l’ordre de 1 . 10e3, soit au moins mille fois plus ClevC que dans le milieu saris cuivre. Les colonies de 72 heures sur MH + 1,6 mM Cu2+ sont tres hedrogenes; elles comprennent, outre des MR, et des YFR, divers types de cellules qui donnent des petites colonies sur le milieu non toxique, ainsi que des colonies de taille intermediaire d’aspect variable. Les ions cuivriques apparaissent &tre un agent mutagene : ils induisent la mutation de RIR, vers la forme YFR plus resistante et la formation de deticients respiratoires [6, 81; ils semblent en outre provoquer une serie de mutations qui interessent la taille et la forme des colonies sur le milieu normal. Les tests de variation et les ((replica-plating )) ne permettent pas d’etablir une influence des ions cuivriques sur la modification de cellules parentales YF en des formes de resistance stable plus ClevCe. 11s ont cependant montri! qu’il n’existe pas d’individu YFR parmi pres de 1010 cellules YF obtenues dans le milieu saris cuivre; dans le milieu normal, le type parental ne mute pas en YFR ou ne mute qu’a un taux t&s faible. Lorsque des cellules de la souche mere YF recoltees dans le milieu normal sont CtalCes sur MH +1,6 mM Cu2+, elles fournissent en moyenne, en 48 h, 13 petites colonies pour lo4 cellules etalees. Les colonies ainsi obtenues sur le milieu toxique n’ont pas une cellule MR, A leur origine, puisque la descendance de la plupart des cellules qui les composent a perdu le pouvoir de Experimental

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proliferer sur MH + 1,6 mM Cu2+, apres un sejour de 12 generations dans le milieu sans cuivre. Les cellules meres de ces petites colonies sont vraisemblablement des YF dont I’etat physiologique est tel qu’elles peuvent se multiplier lentement sur le milieu toxique; ce sont des MR,, moyennement resistantes physiologiques, dont la structure genetique est celle de la souche mere YF. Des differences physiologiques influencent en effet, dans une large mesure, la capacite de cellules YF de survivre et se multiplier lentement en presence d’ions cuivriques; c’est ainsi que parmi les premiers descendants d’une cellule YF isolee dans le milieu sans cuivre, on peut observer de nombreux degres de resistance, bien que toutes les cellules possedent le mCme potentiel g&Gtique. Les petites colonies formees apres 48 h d’incubation d’etalement d’YF sur MH +1,6 mM Cu2+ comprennent des cellules MR,; la proportion des MR, parmi l’ensemble des cellules d’une colonie est t&s nettement accrue par la prolongation de l’incubation durant 24 h. A ce moment, deux colonies sur les trois qui sont issues de cellules MR, sont formees de 105 cellules environ et renferment des individus YFR. Sur le milieu toxique, le taux estime de la mutation des cellules MR, (YF) en MR, est 4,l .10-3; dans les limites des determinations effect&es, il est au moins 100 fois superieur a celui de la mCme mutation qui pourrait se produire dans le milieu normal. 11 est tres probable, en effet, qu’il n’existe pas de cellule MR, parmi 22. lo3 cellules YF recoltees en milieu normal. Le type YFR dont la resistance au Cu2+ est la plus ClevCe et hereditaire parait se former par un processus en deux &apes. Quand des cellules YF sont cultivees dans des concentrations suffisantes de Cu2+, les ions cuivriques semblent d’abord favoriser leur modification en MR,; ils creent ensuite un Ctat d’instabilite dans les cellules MRG et induisent leur mutation en YFR. Le type MRG presente une resistance moyenne, mais permanente comme celle de YFR, il apparait &tre un stade intermediaire obligatoire entre la forme parentale sensible, YF, et la forme la plus resistante YFR.

I1 existe deux types de cellules a resistance permanente dans les cultures d’adaptation de S. cerevisiae, Yeast Foam, a 1 mM de Cu2+ dans le milieu de Henneberg au malt. Le type dont la resistance est la plus Clevee, YFR, correspond a celui qui a et6 decrit par Brenes-Pomales et al., ou la resistance est due a un gene dominant, le second, MRc, presente une resistance moins forte, mais de nature genetique probable, comme celle de YFR. Les cellules sensibles, YF, ne mutent pas en YFR dans Ie milieu non toxiExperimental

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que; les YFR se forment avec une frequence elevee a partir des MR,, quand Les MRG cultivees en la concentration intracellulaire en Cu2+ est suftisante. l’absence de Cu2+ ne produisent plus de YFR. Le cuivre interne tree dans les cellules MR, un &at d’instabilite favorable a leur mutation en YFR. Les ions cuivriques paraissent egalement induirent la mutation de YF en MR,, ainsi qu’une serie de mutations qui interessent la taille et la forme des colonies sur le milieu normal. Lorsque des cellules sensibles YF sont cultivees dans des concentrations sublethales de Cu2+, le cuivre semble d’abord favoriser la formation de cellules MR,. 11 tree alors un Ctat d’instabilite de ces cellules et induit leur mutation en YFR. Le stade MR, apparait comme un intermediaire obligatoire dans la voie qui aboutit au type YFR, le plus resistant. SUMMARY

Two types of cells with permanent resistance to copper may be found in cultures of S. cerevisiae, Yeast Foam, which have been adapted by growth in 1 mM of Cu2+ in Henneberg’s medium with malt. The type with the higher resistance, YFR, corresponds to that which has been described by BrenesPomales et al., where a dominant gene is responsible for the resistance. The second type, MRc, has a lower resistance; this resistance, as well, appears to be genetically controlled. The sensitive cells, YF, do not mutate to YFR in the non-toxic medium. The YFR type appears with a high frequency from the MRG, when the intracellular concentration of Cu2+ is sufficient. MRG cells cultivated in the absence of Cu2+ no longer produce YFR. The internal copper creates in the MR, cells an unstable state favourable to their mutation to YFR. The cupric ions seem also to induce the mutation from YF to MR, and, moreover, a group of mutations involving the size and shape of the colonies on the normal medium. When sensitive cells (YF) are cultivated in sublethal concentrations of Cu2+, copper seems first to favour the formation of MR, cells: it then creates an unstable state in these cells and induces their mutation to YFR. The MRG type appears as an obligatory intermediate leading to the most resistant cells, YFR. BIBLIOGRAPHIE 1. ANTOINE, A., Ezppt[ Cell Res. 36, 73 (1964). 2. ANTOINE, A., Etude biochimique et gknktique de la r&stance au Cu2+ chezla Editions Duculot, Gembloux, Belgique, 1962. 3. BRENES-POMALES, A., LINDEGREN,~. C. et LINDEGREN,G., Nature 176,841 4. LEDERBERG, J. et LEDERBERG, E. M., J. Bact. 63, 399 (1952). 5. LINDEGREN, C. C., LINDEGREN, G., SHULT, E. et YUH-SIN-HWANG, LVature 6. LINDEGREN, C. C.,NAGAI, S. et NAGAI, H., ibid. 182,446 (1958). 7. LURIA, S. E. et DELBR~~CK, M., Genetics 28, 491 (1943). 8. YANAGISHIMA, N., J. Znsf. Polyfech. Osaka 11, 25 (1960). Experimenfal

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