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Le génotypage de résistance du VIH
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sequence. Chaque ddNTP possedant un signal specifique, celui-ci permet de I’identifier lors de son passage devant le faisceau du laser situe en
la sequence
avec
une grande
precision
(chro-
mat ogramme). @nome viral.est de ou R-T). te actuellement emde onzymatique de 6tiser un brin d’ADN ration de zyme deyaticus, enzyme a
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Un sequenceur automatique peut 21chaque migration ou ct Run a’,determiner dans les meilieures conditions, I’enchainement de 1 000 nucleotides. Chacun des deux brins d’ADN est sequence dans une reaction independante. L’analyse de ces sequences est la demiere etspe et fait intervenir des logiciels informatiques. Les sequences sens et anti-sens sont align&es et comparees par le technicien. Les ambigu\Ws sont levees par anayse directe des profils d’electrophorese. La sequence corrigee est ensuite comparee a une sequence de reference (sequence consensus) afin de met&e en evidence les m&&ions ponc-
1983, la grande variabilite de ce virus a ete mise en evidence par I’analyse des sequences nucleotidiques de nombreux isolats de patients europeens, americains ou africains. des sotxhes d’origine gkogrsphiiue 8oign&, des souches provenant de malades diirents d’un m& me pays, ainsi que des sow&es isolees chez le m&me patient. Un isolat du VIH chez un seul individu est done constitue par un melange de souohes virates : on pane de quasi-espece.
Revue Fray&e
des Laboratoires,
janvier 2004, N” 359
de s~quence
Reagt~OllS
B
s u r ]esbfins s ~ s ct antisens et migration
PCR .AI~Nvk~al
~
ADNc Revise Transcription
Potations de muta6ons contuses • . . rams absentes ml ~
Chromatogrammc Ct traduction C
A
G
A
A AAA
A
[]
A
G
N
AGCACATGAT
~,quen~e de i'ES~eace
ADCAG~TGAT
~q,;ez~c* sen~
A ~ G C A G A T G A T
~
P d osltlon c l~utatlon ¢onnue ct pre~nte
quence ~nt ise=6
~
Figure 3 /Les 4tapes de la technique.
Une quasi-esp~ce est constitute, chez un patient, par I'ensemble des g~nomes apparent,s au meme agent infectieux.
Les sous-populations peuvent se modifier au cours du temps, sous I'influencede divers facteurs, comme les traJtementsanlivirauxou les modificatbns de I'immunite de I'h6te. U&olution des quasi-especes resulte de la selection des differents genomes, avec eliminationdes particulesd e f a v o ~ et emergence de populations plus adaptees. Uexistence de ces quasi-especes rend le traitement de I'infection & VlH difficile, car la population virale ne reagit pas de fagon homog~ne aux antiviraux administres. Toutefois, les connaissances sur le genome et le cycle de replication du virus permettent une appreche therapeutique rationnelle. En effet, toute etape du cycle de la r& plication virale peut 6tre une cible de traitement antiviral (figure 4). Les medicaments anti-VlH disponibles actuellement appartiennent & trois categories : les analogues nud~osidiques
(IN), les analogues non nudeosidiques (INN), les inhibiteurs de proteases (IP), Les inhibiteurs de fusion sent actuellement utilis~s en association th~rapeutique, dans le cadre d'essais cliniques de phase III, Une autorisation de raise sur le march~ (AMM) pourrait intervenir courant 2003.
En general, la mise en route d'un traitement depend du nombre des CD4 et de la mesure de la charge virale darts le plasma. Uobjectif theorique du traitement est d'obtenir une charge virale indetectable (< & 50 copies/mL). Uefficacit~ du traitement est jugee & trois mois
Revue Fran~aise des Laboratoires, janvier 2004, N° 359
baisse de la charge virale > & 0,5 log. & long terme, le traitement est juge inefficace si on observe une elevation de la charge virale initialement reduite, une diminution des CD4 et une evolution clinique. En raison de la mise sur le marche de ces nombreuses molecules et du nombre croissant des mutations de resistance decrites, la realisation de genotypes par sequen£~ageautomatique est aujourd'hui incontournable pour le suivi de Finfection & VlH. Cependant, cette technique ne permet pas la mise en evidence des mutations de toutes les souches infectant le patient, mais uniquement celles de la souche majoritaire (au mieux celles d'une double population). Du fait des differentes classes d'antiretroviraux actuellement disponibles, les tests genotypiques realises en routine concernent les genes viraux de la reverse transcriptase et de la protease. Pour chaque patient seront donc realisees quatre reactions :les sequences sens et anti-sens pour chaque gene.
La realisation et I'interpretation des tests genotypiques restent assez difficUeset necessitent une bonne expertisedes techniciens et des biologistes avec une mise & jour continuelle des connaissances. Les tests peuvent 6tre effectues soit & I'aide des techniques ,, maison ,,, soit par des trousses commerciales. Actuellement, le groupe ANRS AC11 a standardise une technique de sequen(~age <, maison ,,, et deux firmes, Visible Genetics et PE Applied Biosystems commercialisent des trousses. Le technicien realise ici & la fois les etapes de biologie moleculaire (extraction, reverse transcription, amplification,reaction de sequence), mais egalement les etapes d'analyse informatique (alignement et correction des sequences sens et anti-sens, comparaison avec la sequence de reference). Un algorithme informatique remis reguli&ement & jour permet ensuite de deduire des sensibilites et/ou des resistances probables aux differents anti-retroviraux. Le rapport du Pr Delfraissy a defini en 1999 les indications pour les tests genotypiques de resistance (tableau I).
Nathalie Delphin Laboratoire de virologie, Hepital Tenon, Paris.
POUR Ell SAVOIRPLUS...
~3 sant~4ouv.fr [3 visgen.com Q sidaneLass&fr
~3 perkinelmer.fr www.anrs.fr
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1983, la grande variabilite de ce virus a ete mise en evidence par I’analyse des sequences nucleotidiques de nombreux isolats de patients europeens, americains ou africains. des sotxhes d’origine gkogrsphiiue 8oign&, des souches provenant de malades diirents d’un m& me pays, ainsi que des sow&es isolees chez le m&me patient. Un isolat du VIH chez un seul individu est done constitue par un melange de souohes virates : on pane de quasi-espece.
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Une quasi-esp~ce est constitute, chez un patient, par I'ensemble des g~nomes apparent,s au meme agent infectieux.
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(IN), les analogues non nudeosidiques (INN), les inhibiteurs de proteases (IP), Les inhibiteurs de fusion sent actuellement utilis~s en association th~rapeutique, dans le cadre d'essais cliniques de phase III, Une autorisation de raise sur le march~ (AMM) pourrait intervenir courant 2003.
En general, la mise en route d'un traitement depend du nombre des CD4 et de la mesure de la charge virale darts le plasma. Uobjectif theorique du traitement est d'obtenir une charge virale indetectable (< & 50 copies/mL). Uefficacit~ du traitement est jugee & trois mois
Revue Fran~aise des Laboratoires, janvier 2004, N° 359
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La realisation et I'interpretation des tests genotypiques restent assez difficUeset necessitent une bonne expertisedes techniciens et des biologistes avec une mise & jour continuelle des connaissances. Les tests peuvent 6tre effectues soit & I'aide des techniques ,, maison ,,, soit par des trousses commerciales. Actuellement, le groupe ANRS AC11 a standardise une technique de sequen(~age <, maison ,,, et deux firmes, Visible Genetics et PE Applied Biosystems commercialisent des trousses. Le technicien realise ici & la fois les etapes de biologie moleculaire (extraction, reverse transcription, amplification,reaction de sequence), mais egalement les etapes d'analyse informatique (alignement et correction des sequences sens et anti-sens, comparaison avec la sequence de reference). Un algorithme informatique remis reguli&ement & jour permet ensuite de deduire des sensibilites et/ou des resistances probables aux differents anti-retroviraux. Le rapport du Pr Delfraissy a defini en 1999 les indications pour les tests genotypiques de resistance (tableau I).
Nathalie Delphin Laboratoire de virologie, Hepital Tenon, Paris.
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