Les anticorps humains antisouris (HAMAs). Réalité et moyens de détection

Immunoanal Biol Sp6c (1992) 32, 53-59 © Elsevier, Paris

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Techniques au quotidien

Les anticorps humains antisouris (HAMAs). Rdalitd et moyens de ddtection N Devilli~re Behring Diagnostic, 260, avenue Napoleon-Bonaparte, 92500 RueiI-Malmaison, France (Re£u le 2 decernbre 1991; accepte le 27 janvier 1992)

R~sum~ m Les anticorps interf~rant dans les immunodosages sont soit sp6cifiques de I'analyte & doser (autoanticorps), soit specifiques du reactif utilise (anticorps monoclonal souris ~ anticorps humain antisouris). IIs conduisent & des valeurs faussement #levees ou faussement abaiss~es. Tres souvent, on trouve des valeurs ~lev~es en analyte dans des s6rums de patients soumis & des immunoscintigraphies ou & des immunotherapies, du fait de la pr6senqe d'HAMAs anti-isotypiques qui r~agissent avec I'anticorps li~ sur la phase solide et I'anticorps traceur. Une methode est decrite ici pour eliminer cette interference. En revanche, des valeurs faussement abaiss~es, causees par des HAMAs anti-idiotypiques, sont tres rarement observ6es et peuvent seulement etre ~limin6es par un pre-traitement tel que I'immuno-absorption ou la precipitation par PEG et ensuite la d~termination de I'analyte Iors du dosage. Avec le d~veloppement de I'immunoscintigraphie et de I'immunotherapie, la probabilit6 d'interferences avec les HAMAs augmentera sensiblement.

anticorps humains antisouris / anticorps monoclonaux / immunoscintigraphie / anticorps hdt~rophiles

Summary - - Human anti-mouse antibody HAMAs. Interference in immunoassays and detection methods. Interfering antibodies in immunoassay systems are either analyte-specific (autoantibodies) or reagent specific (eg human anti-mouse antibodies, HAMAs). They lead to falsely elevated or falsely decreased values. Very often in sera of patients undergoing immunoscintigraphy or -therapy, elevated analyte values are found which are caused by antiisotypic HAMAs which crosslink the solid phase antibody and the tracer antibody. In contrast, falsely decreased values, caused by antiidiotypic HAMAs are observed very rarely and can only be eliminated by pre-treatment, eg immunoadsorption or PEG-precipitation, and subsequent determination of the analyte in the assay. With the expension of immunoscintigraphy and therapy, the probability of HAMA-interference will steadily increase. A method is described to eliminate this interference. Human anti-mouse antibodies ! monoclonal antibodies / immunoscintigraphy / heterophilic antibodies

Introduction En 1975, Kohler et Milstein ont produit pour la premiere fois des anticorps monoclonaux & partir d'hybridomes (lymphocytes B de souris fusionn~s avec des cellules de myelome) [6]. Depuis, I'utilisation des anticorps monoclonaux a pris un essor consid6rable, aussi bien dans le domaine in vivo (immunoscintigraphie, immunoth~rapie, greffes) que dans le domaine in vitro (immunoanalyses).

Influence des H A M A s Iors d'injections d'anticorps m o n o c l o n a u x murins (mab) L'application in vivo d'anticorps monoclonaux murins (mab) & des fins diagnostiques ou therapeutiques peut entrafner une r6ponse immunologique dirig6e contre les immunoglobulines de souris (human anti-mouse antibodies: HAMAs). Les mab peuvent etre utilises comme agents th~rapeutiques seuls, ou lies & des radionucleides, des toxines ou des m6dicaments.

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N Devilli~rre

Ces HAMAs peuvent ~tre produits chez certains patients en quantites suffisantes pour modifier la biodistribution des doses de I'anticorps inject6 par la suite, et perturber I'interpr~tation des images. Chez d'autres patients, la r~p~tition des examens est possible avant que ces HAMAs deviennent un facteur limitant et, bien qu'il y ait quelques perturbations de la biodistribution de I'anticorps marque, les I~sions peuvent ~tre n~anmoins diagnostiqu~es avec precision [11]. Les reponses peuvent varier d'un individu & un autre; de m~me que certains anticorps sont plus immunogenes que d'autres. Par ailleurs, on ne peut affirmer que le m~me anticorps, marque avec diff6rents radionucleides, pr~sente la m~me immunog~nicit~. Le Docteur Steinstrasser [16] considere que la baisse du taux d'HAMAs, obtenue en comparant I'lgG et les fragments (fab), est beaucoup plus faible que les diff6rences observ~es entre diverses sp~cificit~s d'anticorps. L'information sur I'immunog~nicite des fragments Fab est peu fournie car de nombreux patients ~tudi~s avec ces molecules dans le cadre des rejets de greffes, ~taient soumis & une th~rapeutique immunosuppressive, et la plupart des tests HAMAs sont incapables de detecter les anticorps diriges contre les fragments monovalents. Des alternatives ont et6 propos~es pour reduire ces HAMAs apres immunoth~rapie, car ceux-ci emp~chent la rep6tition des traitements. La cyclosporine A (CsA), molecule & effet immunosuppressif, a ~t~ proposee pour pallier & ce phenom~ne [7]. Muto et al [10] ont montr~ que la probabilit6 de former des HAMAs est r~duite chez les patients qui ont subi recemment une chimiotherapie. En revanche, la production de HAMAs est accrue Iorsque la d o s e inject~e d'anticorps augmente ou Iors de multiples injections [12]. La voie d'entr~e de I'anticorps a son importance. Ainsi, des ~tudes r~alisees chez le rat apr~s injection d'anticorps monoclonal de souris ont montre que les AMA (anti-mouse antibodies) sont produits Iorsque I'on utilise la voie intradermique ou la voie sous-cutan6e, alors que ce n'est pas le cas Iors d'injections intraveineuses ou intraperiton6ales [11]. L'injection r~p~t~e de mab, qui induit la production de HAMAs, entraine une inefficacite therapeutique et dans certains cas aboutit & des complications anaphylactiques si la th~rapeutique est poursuivie [3]. Cette reponse HAMAs peut ~tre anti-isotypique, anti-idiotypique ou mixte. Une r~ponse importante anti-idiotypique est susceptible d'em-

p~cher le ciblage de la tumeur en bloquant le site de liaison de I'antig~ne & ranticorps [4]. La d~termination d'une r~ponse d'HAMAs antiidiotypique est tr~s importante avant de r6p~ter une immunoscintigraphie, car elle evite d'obtenir des resultats faussement n6gatifs causes par les anticorps bloquants anti-idiotypiques. II est surprenant de noter que des HAMAs preexistent (d~finis comme non iatrog~nes) chez des sujets n'ayant jamais re(;u d'anticorps murins [8].

Influence des H A M A s sur les immunodosages

Les HAMAs perturbent ~galement les immunodosages qui utilisent des anticorps monoclonaux murins [1]. Effet des diff6rentes interferences dues aux anticorps dans diff6rents systemes

Le type d'interference est fonction de la configuration du dosage (comp~titif par rapport sandwich, une ~tape par rapport & deux 6tapes), des anticorps utilis~s (specificitY, isotype, utilisation comme r6actif de capture ou reactif marqu6) de I'analyte et de la sousclasse ou de I'isotype du mab injectS, entraTnant une reaction immunitaire d u p a t i e n t [5]. Les anticorps interf~rant dans les immunodosages sont, soit sp~cifiques de I'analyte & doser (autoanticorps), soit specifiques du r~actif utilise (anticorps monoclonal souris ~ anticorps humain antisouris). IIs conduisent & des valeurs faussement elevees ou faussement abaiss6es. G6n6rafites sur les interf6rences Les s~parations qui dependent des r~actions de precipitation non specifiques, comme par exemple la precipitation des IgG par des alcools tels que le poly6thyl~neglycol (PEG) possedent par nature le plus grand degr~ de robustesse face aux differents facteurs d'interf~rence immunologique. Cependant, les pr6cipitations non sp~cifiques conduisent le plus souvent & des affirmations diagnostiques ou analytiques incertaines & la suite de la forte d~viation de la liaison non sp6cifique (NSB variable d'un serum & un autre et entre le s~rum et les standards de la courbe d'6talonnage) avec une mauvaise r~partition de la fraction libre du traceur. Les techniques de s~paration par double anticorps qui se distinguent par des NSB bas et homogenes d'un echantillon & rautre, sont

Les anticorps humains antisouris (namas)

perturbees par les anticorps heterophiles diriges contre le premier anticorps. Ces anticorps heterophiles empechent la fixation des anticorps de separation (deuxieme anticorps) sur le complexe antigene-anticorps. II en resulte une surestimation de la teneur en antigene dans I'echantillon du patient Iors des dosages par competition [14]. Des interferences au cours de la premiere reaction anticorps-antigene sont souvent observees en presence d'auto-anticorps vis-&-vis des analytes. Dans les dosages RIA par competition, les resultats peuvent etre fausses par exc~s ou par defaut selon I'agent de separation: avec les techniques de separation double-anticorps, ces auto-anticorps conduisent & un resultat faussement eleve alors que pour les techniques avec precipitation par le PEG, on obtient des valeurs faussement abaissees. Une pre-precipitation par le PEG de 1'6chantillon permet d'eviter ce type d'interferences. Avec des dosages immunoradiometriques (IRMA), des interferences ont ete egalement notees, se manifestant par une augmentation artificielle du NSB du serum du patient. La raison supposee fut la presence d'anticorps vis&-vis des reactifs de la trousse [17]. La figure 1 montre une representation habituelle des anticorps avec la molecule interferente. Cela a pour consequence un mauvais classement des patients (de normal & pathoIogique (fig 2). Comme il s'agit d'anticorps specifiques d'espece (porteurs de marqueurs antigeniques specifiques) ils ne peuvent se lier & n'importe quelle IgG (comme pour les facteurs rhumatofdes).

Interferences dues aux HAMAs Avec I'apparition des anticorps monoclonaux, un deplacement significatif des systemes analytiques utilises a eu lieu (methodologies avec analyte marque vers anticorps marque). Des interferences dues aux HAMAs dans un grand nombre de dosages ont ete observees, notamment darts les serums de patients soumis & une immunoscintigraphie ou & une immunotherapie. Deux cas differents peuvent se presenter: - I'immunogene responsable de la reponse & I'anticorps humain est lie & la specificite de I'essai; par exemple I'administration d'anticorps anti-ACE (in vivo) interfere avec la mesure dans le tube & essai (in vitro) de I'ACE; dans ce cas, la valeur mesuree chez le patient peut etre faussement elevee (causee par les HAMAs anti-isotypiques) ou faussement abaissee (causee par les HAMAs anti-idiotypiques);

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o~

"

3

#',~l

Fig 1. Representation schematique d'une substance interferant sur un systeme IRMA. Un anticorps fixe & une phase soiide (1) est lie par une liaison non specifique & une substance interferente (3) li6e & I'epitope (5) d'un anticorps marque (2).

5

•A

5

1

S~al

2 5

4

Concentrationde I'analyte normal • Ii ; pathologique

Fig 2. Influence sur les resultats (normal - pathologique) des substances interferentes.

administre n'a pas de lien avec la specificite du dosage, par exemple la determination de la TSH apr~s I'administration d'anticorps anti-ACE; dans ce cas, les HAMAs anti-isotypiques peuvent interferer dans le dosage et des valeurs faussement elevees sont le plus souvent observees.

-I'immunogene

Modeles analytiques De nombreuses procedures ont et6 proposees pour contrer les effets des anticorps heterophiles, par exemple: la precipitation au polyethylene glycol [13], le chauffage & 70°C [3, 13] le blocage avec des IgG de souris ou des fragments d'lgG de souris [2], le blocage avec des IgG antihumaines liees & la proteine A [9]. II faut noter que les interferences observees avec les dosages dependent des kits utilises. Pour notre part, nous avons opte, dans le cas des dosages au cours desquels les anticorps monoclonaux de souris sont utilises, pour I'addition de serum de souris et de rat (IgG non specifique) pour eviter I'interference avec les HAMAs. Cependant, malgre cette mesure preventive, des serums presentent encore des valeurs faussement elevees en raison du fort titre en IgG antisouris qu'ils contiennent.

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N Devilli6rre

Ces echantillons, test~s de nouveau apr6s ajout d'une plus grande quantit~ de serum de souris ou de rat, conduisent en gendral & une diminution de la valeur initiale. Les grandes quantites de serum de souris ou de rat exigees dans ce cas, ne peuvent 6tre systematiquement incorporees dans I'essai sans inconvenient, puisqu'ils influencent les resultats. Ces inconvenients peuvent 6tre evites (fig 3) par I'addition d'une prot~ine [6], qui est tres semblable immunologiquement & I'lgG utilisee dans le dosage, b I'exception du fragment fab liant I'antigene [7]. Ainsi, la proteine ne peut s e l i e r b I'analyte et n'interagit pas avec celui-ci, m6me si elle est ajoutee en exces. Une condition supplementaire est son absence de liaison immunologique & tous les autres composants du s~rum. La non-r~alisation de ces conditions pourrait amener & la formation d'un reseau dans I'bchantillon, en diminuant I'effet souhaite, qui vise b supprimer cette interference. De plus, des influences sur la cinetique et sur I'~quilibre de la r~action avec I'analyte ne pourraient pas 6tre exclues. Ainsi, le nombre d'interf~rences possibles est r~duit au minimum. L'utilisation de ces substances a ~te protegee par un brevet Behring (n ° EP 0 296 544). Les bchantillons de patients presentant des titres ~lev6s de HAMAs ~tant relativement rares, ils ne peuvent 6tre utilis6s afin d'etudier et d'optimiser les systemes d'immunodosages. Dans le but de d~terminer les effets de diff~rentes ,substances pouvant supprimer I'influence des HAMAs, des mod61es analytiques ont ~te con~us avec des anticorps anti-lgG de souris provenant de lapin et de ch6vre. La figure 4 montre clairement I'augmentation du signal, proportionnelle b la quantite d'anticorps antisouris, et la suppression de cet effet par I'addition d'lgG de rat et de souris.

7 2

5

7

,_ V J / . 7

4"

/ /

5 Fig 3. Representation du modele utilis6 dans la trousse RIAgnost TSH pour pallier aux interferences.

% de liaison 100

o

,

,tY

/ ./* ~

.......$/

1 lraccur + s~ram de rat 2 traceur + IgG do rat 3 traceur + lgG de souris non sp6cifique 4 trac©ur + s~mm de ral + IgG do rat 5 traczur

0.1

0.01

I

I

I

0.1

1

10

.-I 100

/~g d'anticorps anti-souris de ch~vro/ml

F i g 4 . Valeurs faussement elev6es causees par des anticorps de chevre antisouris. Effet de diff~rentes substances suppressives.

R~sultats analytiques Exactitude Puisqu'il n'y a pas de methodes de reference independantes pour d~terminer I'exactitude des basses valeurs en analytes tels que I'ACE ou la TSH, les procbdures de dosage doivent 6tre modifi~es afin de conduire & des valeurs non perturbees par ces interf6rences. Cela peut 6tre r6alis~ par une precipitation des IgG du s~rum de patient avec du PEG, suivie de la procedure de dosage normal (fig 5). La validit~ d'une telle approche a bt~ prouv~e par des essais de r~cup~ration.

Application de milieux suppresseurs dans les dosages immunoradiometriques de TSH et ACE La m6thode quantitative de determination des HAMAs peut 6tre realisee avec la trousse Enzygnost HAMAs micro (Behring). hTSH Irma. Plusieurs s~rums de patients ont ete etudi~s avec un dosage utilisant les composants de la trousse RIAgnost hTSH auxquels on a ajout~ du s~rum de rat, des IgG non specifiques de souris (monoclonal). Les valeurs faussement elev~es (le traceur de re-

Les anticorps humains antisouris (hamas)

f~rence s a n s le milieu s u p p r e s s e u r ) sont dim i n u e e s en fonction de la nature et de la quantit~ du milieu s u p p r e s s e u r (fig 6). A C E Irma. La concentration d'ACE de divers ~chantillons positifs en HAMAs a ~t~ determinee par un dosage ,,deux ~tapes- (mono- et polyclonal), par un dosage RIAgnost ACE oQ I'anticorps monoclonal de souris est li~ & la phase solide, et le deuxieme anticorps est I'anticorps polyclonal de lapin marqu~ et par un ,,dosage une ~ t a p e , avec deux anticorps monoclonaux. Comme r6ference, sont prises les valeurs d'ACE obtenues & partir d'~chantillons apr6s precipitation au PEG. Les valeurs mesurees avec une methodologie deux ~tapes sont pres-

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que les memes que les valeurs ,,exactes,, obtenues apr~s precipitation au PEG. Ceci est previsible dans la mesure o~J les HAMAs anti-isotypiques ne sont pas capables de r~agir avec les deux anticorps qui derivent de differentes especes. De meme, une interference causee par les HAMAs anti-idiotypiques est improbable parce que les anticorps de la phase solide different dans leur specificit6 des anticorps utilis6s pour la scintigraphie ou la th6rapeutique.

'~/,';,°~;°d~'.1°°°° ',; I

Ii

200 I11 serum de patient (standard, contr61e) +

10

200 I~1 24% PEG 6000 1

$ 1 ) Homogen6iser

3,5

2) Centrifuger 15 min > 1 500 g

7,5

3,3

7,9

18,1

]J Faclcur ItAMA - EnzygnostllAMA Effet des dift~rentes substances suppressives

$ E] gans=ubstanc¢=upprc==ive Im + IgG de tit + ~rum de rat [] + lgG de sosrls non sp~ciflqut:

Mesure de surnageant

+l'ensembl©de==ubslan¢¢= supptesslv©a

Fig 6. Effet de differentes substances suppressives sur des serums positifs en HAMAs avec un dosage hTSH Irma.

Fig 5. Precipitation par le PEG.

T a b l e a u

•

I. Determination de I'ACE dans des serums HAMAs positifs.

Acm

inject# mab

HAMA Facteur

Dosage avec la trousse RIAgnost ACE Dosage deux #tapes

Dosage une 6tape

Apr~s pr#- Proc#dure Apres pr#- Proc#dure cipitation classique cipitation classique PEG PEG

431/26

OC-125

250/183 494/32

16,1 4,9 4,3 7,9 7,8 7,5 11 12,6 12,4 11,1 11,3 12,1 4,9 33

0,6 1,3 1,3 75 1,0 1,0 1,0 1,0 0,2 0,6 0,2 0 2,8 0,6

1,9 3,0 1,1 73 2,1 1,0 2,4 2,8 1,5 1,7 1,1 2,3 4,6 1,7

3,0 4,4 0 76 3,0 0,9 1,9 3,6 1,9 0,3 0,3 2,6 6,9 3,0

73 12,8 11 ca 200 36 82 26 54 180 41 169 ca 1 000 65 > 200

+ 0,5% s#rum de rat

43,7 7,1 -

16 33,1 13,2 17,1 58 15 73,5 > 200 12 155

+ 5 #g 1 000 tlg d'lgG de d'lgG de souris souris non sp#ci- non sp#cifique/ml fique/ml

8,1 3,2 -

6,7 8,3 5,0 7,1 8,9 3,6 21,8 > 200 9,5 16

1,9 3,6 3,6 74 3,2 2,4 1,9 2,8 1,5 1,7 1,5 2,0 5,2 3,4

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N Devilli~rre

ACEng/ml

Refdrences

300"

200 ~

~

Fact.... HAMA

100"

o ,1

--n 1

10

11 16

o N

12

•

~100

j 1000

/zgtrac~urd'immunoglobulinede sourisnonsp~cifique Fig 7. Suppression des valeurs faussement ~levees en ACE par des IgG de souris non specifiques.

Dans un dosage une ~tape ne contenant pas de substances suppressives, des concentrations faussement ~lev6es en ACE peuvent ~tre obtenues du fait d'une reaction avec les HAMAs anti-isotypiques. Lorsqu'on rajoute des quantit~s croissantes de substance suppressive (les IgG monoclonales non sp~cifiques murines, la concentration d'ACE -mesuree avoisine la valeur , p r 6 c i s e , obtenue apres precipitation par le PEG (tableau I, fig 7). Des ~chantillons avec des valeurs d'ACE faussement abaiss~es n'ont pas 6t~ observ~es. En c o n c l u s i o n , & partir de ces d o n n ~ e s il est important pour le biologiste d'identifier les s ~ r u m s de patients ayant subi des injections d'anticorps m o n o c l o n a u x de souris, afin de p o u v o i r a n a l y s e r les ~ v e n t u e l l e s discord a n c e s avec la clinique. Par ailleurs, I'apparition de d o s a g e s HAMAs c o m m e r c i a u x pourra permettre d ' e x p l o r e r plus precis~ment ce p h ~ n o m e n e .

Remerciements

L'auteur remercie le Docteur Schnorr, directeur de la recherche au laboratoire de radiochimie HoechstFrancfort, pour lui avoir transmis les donnees analytiques et bibliographiques. Merci egalement & Mademoiselle Chenesseau, pour avoir r~alise la dactylographie de ce document.

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