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Les hauts polymères dans les solutions d'albumine humaine
Revue Fran~aise de Transfusion et Immuno-h6matologie Tome XXV - - N° 5 -- 1982
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Les hauts polym res dans les solutions d'albumine humaine Leur evaluation quantitative par dlectrophorOse en gradient de polyacrylamide par P. LAMBIN, D. ROCHU, N. H E R A N C E et J.M. F I N E Laboratoire d'Immunochimie des Prot6ines, Centre National de Transfusion Sanguine, PARIS.
F
INLAYSON et al. [4, 5] ont m o n t r 6 que les solutions d'albumine /~ usage th6rapeutique contenaient, outre le m o n o m ~ r e d'albumine de poids mo16culaire 66 000, un certain p o u r c e n t a g e de polym6res (dimbres, trimbres, t6tram6res et hauts polymbres). Ces polymbres p r e n n e n t naissance d u r a n t les processus de fractionn e m e n t [4, 5]. C o m m e l'ont Inontr6 FRIEDLI et KISTLER [8], les solutions d ' a l b u m i n e concentr6es (20 % ou 25 %) contiennent une plus forte p r o p o r t i o n de polym6res que les solutions dilu6es. La p r o p o r t i o n des polym~res est 6galement augmentde par la pasteurisation h 60 ° C et par le stockage prolong6 des solutions d'albumine [8, 12]. Le chauffage r6p6t6 de solutions d ' a l b u m i n e /t 56° C p e n d a n t plusieurs j o u r s [13] entraine une a u g m e n t a t i o n i m p o r t a n t e du
Manuscrit re~u le 4-5-1982.
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p o u r c e n t a g e des polym6res p o u v a n t conduire h une gdlification de la solution. L'existence d ' u n r a p p o r t 6troit entre la stabilit6 d ' u n e solution d ' a l b u m i n e et sa faible teneur en polym6res semble bien 6tablie. Pour cette raison, l'6valuation quantitative des f o r m e s polym6ris6es de l'albumine est u n p a r a m 6 t r e i m p o r t a n t /~ connaitre. De n o m b r e u s e s techniques ont 6 t d proposdes p o u r cette 6valuation. La technique actuellement la plus utilis6e est la c h r o m a t o g r a p h i e sur gel de Sephadex G 150 ou G 200 [2-5, 8, 9]. De plus, l ' u l t r a c e n t r i f u g a t i o n analytique [4, 6], l'61ectrophor6se en gel de polyacrylamide ~ c o n c e n t r a t i o n constante [6, 8, 13, 15], l'dlectrophor~se en gel d'acrylamide-agarose [12] ou l'dlectrophor6se en gel d ' a m i d o n combin6e ~ l'immuno-pr6cipitation [14], et r6cemm e n t la c h r o m a t o g r a p h i e h h a u t e p e r f o r m a n c e [1] ont 6td 6galement utilis6es. Dans ce travail, nous avons fait appel ~ l'61ectrophor6se en gradient de p o l y a c r y l a m i d e de 3 h 20 % p o u r analyser les diff6rentes fractions obtenues p a r c h r o m a t o g r a p h i e d'exclusion de solutions d ' a l b u m i n e humaine, puis p o u r 6valuer les p r o p o r t i o n s de m o n o m 6 r e s et de polym6res en prdsence ou en l'absence d ' u n agent d i s s o c i a n t : le dodecyl sulfate de s o d i u m (SDS). Enfin nous avons c o m p a r 6 les rdsultats obtenus p a r dlectrophor~se et par chromatographie.
M A T E R I E L ET M E T H O D E S Mat6riel Les solutions d ' a l b u m i n e g 20 % et h 4 % p r o v i e n n e n t du Centre National de Transfusion Sanguine. Leur t e n e u r en impuretds a 6t6 mesurde par 61ectrophor6se quantitative sur acdtate de cellulose selon les modalit6s techniques pr6conisdes p a r le groupe d'experts de la P h a r m a c o p d e europ6enne. Les solutions utilisdes dans ce travail contenaient moins de 3 % de prot6ines autres que l'albumine. Les prot6ines c o n t a m i n a n t e s ont une mobilit6 ~10U ~2 et sont de faible taille mol6culaJre c o m m e le m o n t r e leur 6tude i m m u n o c h i m i que (absence d'%M, d'haptoglobine, d'IgM, d'IgG, d'IgA et de C3).
Analyse c h r o m a t o g r a p h i q u e des s o l u t i o n s d'albumine Les c h r o m a t o g r a p h i e s ont 6t6 rdalis6es soit sur Sephadex G 200 (Pharmacia), soit sur Ultrogel AcA 34 (LKB) avec des colonnes de 100 × 2,5 cm, le d6bit d'dlution 6tant de 20 m l / h e u r e et la quantit6 ddpos6e de 100 mg sous un v o l u m e de 2,5 ml. La d6tection des pics
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SOLUTIONS D'ALBU.,~IINE H U M A I N E
a 6t6 effectude h 280 n m p a r un 6valu6e en densitds optiques. La p a r planim6trie. Parallblement, les ont 6t6 pool6s, leur v o l u m e m e s u r 6 6valu6e p a r la m d t h o d e de LowRY
a p p a r e i l UVICORD S (LKB) et surface des pics a 6t6 mesur6e 61uats c o r r e s p o n d a n t /~ ces pics et leur c o n c e n t r a t i o n en prot6ine et co11. [11].
Analyse 61ectrophor6tique des solutions d'albumine Les gels de p o l y a c r y l a m i d e utilis6s p o u r ce travail sont des gradients d o n t la c o n c e n t r a t i o n varie d ' u n e mani~re lin~aire de 3 h 20 %. Ces gels, d ' u n e d i m e n s i o n de 80 × 70 × 3 ram, ont 6t6 coul6s selon une m 6 t h o d e p r 6 c 6 d e m m e n t d6crite [10]. Chaque gel p e r m e t l'6tude simultan6e de 5 6chantillons. Les 61ectrophor~ses ont 6t6 r6alis6es dans une cuve G r a d i p o r e Multi 4. EN UABSENCE DS SDS, l'61ectrophor6se est r6alis6e en t a m p o n Tris-borate-EDTA p H 8,2 (Tris 10,75 g/l, acide b o r i q u e 5,04 g/l, EDTAN a 2 : 0 , 9 3 g/l). 250 t~g de chaque 6chantillon d ' a l b u m i n e dilu~s dans du glyc6rol (concentration finale 10 %) sont d6pos6s et soumis h une 61ectrophor~se de 8 h e u r e s sous 80 volts. La coloration des prot6ines est effectu6e p a r : a m i d o s c h w a r z 10B 1 g, acide ac6tique 70 ml, eau distill6e 930 ml p e n d a n t 18 h e u r e s suivie de d6coloration 61ectrophor6tique p e n d a n t 1 h e u r e (d6colorateur GD4 P h a r m a c i a ) clans de l'eau ac6tique h 5 p o u r 100, puis la d~coloration est achev6e sous simple agitation p e n d a n t 12 heures. EN PRI~SENCE de SDS, l'61ectrophor~se est r6alis6e en t a m p o n phosp h a t e 0,01 M p H 7,2 c o n t e n a n t 0 , 1 % de SDS, Les solutions d ' a l b u m i n e sont dilu6es dans du SDS /t 1 % et 350 ~g de prot6ines m61ang6s /~ du glyc6rol (concentration finale 10 %) sont soumis ~t l'61ectrophorose (80 volts - 8 heures). La coloration est r6alis6e p a r la solution s u i v a n t e : A m i d o s c h w a r z : 2g, m 6 t h a n o l : 250 ml, acide a c 6 t i q u e : 150 ml, eau distill6e : 600 ml p e n d a n t 18 heures. Aprbs 18 heures de coloration, ces gels sont d6color6s 61ectrophor6tiquement darts de l'eau ac6tique /t 7 %. L'6valuation d e n s i t o m d t r i q u e est r6alisde sur un d e n s i t o m 6 t r e Corning (modOle 750) h 600 n m avec une fente de 2 m m de large. L'analyse des diff6rentes fractions sdpar6es p a r c h r o m a t o g r a p h i e a 6t6 r6alis6e soit p a r 61ectrophor6se en l'absence de SDS (voir plus haut) soit en pr6sence de SDS. Dans ce cas, 20 ~xg de prot6ines trait6es p a r le SDS h 1 % et dilu6es dans du glycerol (concentration finale 10 %) sont soumis h l'61ectrophor6se. La coloration a 6t6 r6alis6e c o m m e p r 6 c 6 d e m m e n t m a i s en r e m p l a ~ a n t l'Amidoschwarz p a r le bleu de C o o m a s s i e dans la solution colorante.
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RESULTATS I.-
S6paration 61ectrophor6tique et chromatographique du monom~re et des diff6rents polym~res de l'albumine
L'dlectrophor~se en gradient de polyacrylamide (3 /~ 20 %) p e r m e t de s 6 p a r e r les d i f f 6 r e n t e s f o r m e s d ' a s s o c i a t i o n des m o l d c u l e s d ' a l b u m i n e en f o n c t i o n de l e u r taille mo16culaire. Le m o n o m 6 r e , qui const i t u e la f r a c t i o n m a j o r i t a i r e , a la m o b i l i t 6 61ectrophor6tique la p l u s 61evde alors que les p o l y m 6 r e s o n t u n e m o b i l i t 6 d ' a u t a n t p l u s f a i b l e que l e u r t a i l l e m o l 6 c u l a i r e est plus 61ev6e. P a r c e t t e t e c h n i q u e , il est p o s s i b l e d ' i n d i v i d u a l i s e r n e t t e m e n t d i m b r e s , t r i m 6 r e s et t6tram b r e s (Fig. 1). En l ' a b s e n c e de SDS, la p r d s e n c e d ' a g r 6 g a t s p 6 n 6 t r a n t d i f f i c i l e m e n t d a n s le gel est not6e dans c e r t a i n e s p r 6 p a r a t i o n s . P a r contre, u n t r a i t e m e n t p r 6 a l a b l e de la s o l u t i o n d ' a l b u m i n e p a r le SDS d i s s o c i e c o m p l b t e m e n t les a g r 6 g a t s et p e r m e t ainsi la p 6 n 6 t r a t i o n darts le gel de la t o t a l i t 6 des p r o t 6 i n e s d6pos6es.
Fic. 1 . - Electrophor~se en gel de polyacrylamide (gradient lin6aire de 3 h 20 %) de diff6rents lots d'albumine en l'absence de SDS. Coloration des prot6ines par l'Amidoschwarz. T: albumine t6moin riche en polym6res. i, 2, 3 : 3 lots diff6rents d'albumine h 20 %.
La chromatographie sur Ultrogel AcA 34 ou S e p h a d e x G 200 ne p e r m e t p a s d ' i n d i v i d u a l i s e r aussi d i s t i n c t e m e n t les d i f f 6 r e n t e s f o r m e s d ' a s s o c i a t i o n de l ' a l b u m i n e , c e p e n d a n t 3 pics p e u v e n t 6tre distingu6s.
SOLUTIONS D'ALBUM1NE HUMA1NE
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Les protdines prdsentes dans ces pics ont dtd concentrdes puis analysdes p a r dlectrophor6se en gradient de polyacrylamide. C o m m e le m o n t r e la Iigure 2, le p r e m i e r pic (volume exclu) contient des agrdgats p6ndtrant difficilement dans le gel et des polymbres de poids moldculaire dlevd (pentam6res, tdtram6res). Le deuxi6me pic c o r r e s p o n d essentiellement aux formes dim6riques et trimdriques, et le troisi6me pic contient le m o n o m ~ r e et une p a t t i e du dim6re. Lorsque le pic c h r o m a t o g r a p h i q u e exclu (ou pic I) est traitd p a r le SDS puis analysd par dlectrophor~se en gradient de polyacrylamide, on constate c o m m e p r d c d d e m m e n t que les agrdgats sont dissocids par le SDS et que la totalitd des protdines ddposdes pdn~trent dans le gel. Comme le m o n t r e la figure 3, ces agrdgats sont constituds presque exclusive3
A
m~res I +
FIG. 2 . - A: profil d'dlution de l'analyse chromatographique (Ultrogel AcA 34) de 100 mg d'un lot d'album.ine ~t 20 %. B: Analyse par dlectrophor6se en gel de polyacrylamide (gradient lindaire de 3 ~ 20 %) du lot d'alburnine non fractionn6 (T) et des diffdrentes fractions obtenues par chromatographie (pics I, 2 et 3). Coloration des protdines par l'Amidoschwarz. m e n t par des formes h a u t e m e n t polym~risdes. En prdsence de SDS, ces hauts polym~res (t~tram~res, pentam~res, etc.) p o u r r o n t donc faire l'objet d'une m e s u r e densitomdtrique en r u e de leur estimation
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LAMBIN P. et coll.
q u a n t i t a t i v e . Des m e s u r e s d ' a b s o r b a n c e effectu6es h 280 n m s u r les pics I c o n c e n t r 6 s a v a n t et apr6s t r a i t e m e n t p a r le SDS m o n t r e n t que cet a g e n t d i s s o c i a n t e n t r a i n e u n e d i m i n u t i o n de 20 h 40 % de la densit6 o p t i q u e de la s o l u t i o n d u e h la s o l u b i l i s a t i o n des agr6gats p a r le SDS. I1 s e m b l e d o n c que l ' 6 v a l u a t i o n q u a n t i t a t i v e du p i c I p a r a b s o r p t i o n h 280 n m en l ' a b s e n c e de SDS e n t r a i n e u n e surestim a t i o n de la q u a n t i t 6 des p o l y m ~ r e s d u e ~ la p r 6 s e n c e des agr6gats.
F~6. 3 . - Electrophor6se en gel de polyacrylamide (gradient lin6aire de 3 ~t 20 %) en prdsence de SDS (coloration par le bleu de Coomassie). T: solution d'albumine t6moin. 1, 2 et 3: pics I chromatographiques de 3 pr6parations diff6rentes d'albumine h 20 %.
II. - - Evaluation quantitative des hauts p o l y m ~ r e s d'albumine par 61ectrophor~se C o m m e nous l ' a v o n s vu plus haut, c e t t e m e s u r e n ' e s t p o s s i b l e q u ' a p r ~ s t r a i t e m e n t de l ' a l b u m i n e p a r le SDS. Des 6 t u d e s pr61imin a i r e s o n t m o n t r 6 que le b l e u de C o o m a s s i e utilis6 h a b i t u e l l e m e n t p o u r la c o l o r a t i o n des p r o t 6 i n e s en SDS n ' a v a i t p a s u n e f i x a t i o n p r o p o r t i o n n e l l e h la q u a n t i t 6 de p r o t 6 i n e s d6pos6e. L ' A m i d o s c h w a r z p e r m e t p a r c o n t r e d ' o b t e n i r d ' e x c e l l e n t s r d s u l t a t s q u a n t i t a t i f s . Dans un p r e m i e r t e m p s , n o u s avons d 6 t e r m i n 6 la q u a n t i t 6 o p t i m a l e de p r o t 6 i n e h d ~ p o s e r p o u r c h a q u e 61ectrophor~se. C o m m e on p e u t le v o i r s u r la f i g u r e 4, le p o u r c e n t a g e de h a u t s p o l y m ~ r e s p a r r a p p o r t au m o n o m ~ r e et aux o l i g o m ~ r e s c r o i t j u s q u ' h u n e l i m i t e de 350 l~g d ' a l b u m i n e p a r d6p6t p u i s r e s t e stable. C'est c e t t e q u a n t i t 6 q u e n o u s avons utilis6e p o u r les r 6 s u l t a t s donn6s darts le t a b l e a u I. Les v a l e u r s indiqu~es s o n t ]a m o y e n n e de 5 e x p 6 r i e n c e s diff6rentes. La r e p r o -
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SOLUTIONS D'ALBUM1NE H U M A I N E
d u c t i b i l i t 6 des rnesures est de -+ 20 %. Un e x e m p l e de trac6 densit o m 6 t r i q u e est donn6 d a n s la figure 5. TABLEAU I
Pourcentage de hauts p o l y m & e s et d'agr~gats dans 10 solutions d'albumine injectable.
LOT
CHROMATOGRAPHIE SUP.
ELECTROPHORESE EN GRADIENT DE POLYACRYLAMIDE ET S D S
Densitom6trie 1 2 3 4 5 6 7
Dosage des prot6ines
Absorbance 280 nm
4,6 4,7 4,5 0,8 2,3 4,4 4,8 1,3 2,8 1,3
5,8 7,5 7,9 0,9 6,7 6 6,8 2,9 4,5 3,4
4,2 5,6 4,8 0,9 1,9 4
5,9 1,1 3,2 1,7
8
9 10
AcA 34
Hauts potym~res ( % )
tot 7
tot 6
.
150
200
250
300
tot 5
350
400
~g
d'Atbumine
d6pos6s
FIG. 4. - - Pourcentage de hauts polym~res observ6s par 6lectrophor6se en gradient de polyacrylamide et SDS dans 3 lots d'albumine en fonction de la quantit6 d6pos6e (coloration: Amidoschwarz).
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LAMBIN
P. et coll.
/ ? 82.9
10.9
1.9
4.2
FIG. 5 . - Exemple de diagramme d'enregistrement densitom6trique d'une pr6paration d'albumine g 20 % analys6e par 61ectrophor6se en gradient de polyacrylamide aprbs traitement par le SDS (coloration par l'Amidoschwarz). 1 : monom6re (82,9 %), 2 : dim6re (10,9 %), 3 : trim6re (1,9 %). 4: hauts polymbres (4,2 %).
I I I . - - C o m p a r a i s o n d e s r 6 s u l t a t s o b t e n u s par les m 6 t h o d e s 61ectrop h o r 6 t i q u e s et c h r o m a t o g r a p h i q u e s Ces r 6 s u l t a t s s o n t r a p p o r t d s d a n s le t a b l e a u I. Dans le cas de la c h r o m a t o g r a p h i e , nous i n d i q u o n s les v a l e u r s o b s e r v 6 e s en mesur a n t d ' u n e p a r t la s u r f a c e des pics d6tect6s h 280 n m et d ' a u t r e p a r t la q u a n t i t 6 de p r o t d i n e s p r 6 s e n t e d a n s ces pics 6valu6e p a r la m d t h o d e de LOWRY et coll. [11]. On c o n s t a t e que la p r o p o r t i o n de h a u t s p o l y m 6 r e s e s t i m d e p a r la m 6 t h o d e de LOWRY et coll. est v o i s i n e de celle o b t e n u e p a r 61ectrophor6se a l o r s que des p o u r c e n t a g e s plus 61ev6s (environ 40 %) s o n t o b t e n u s p a r la p l a n i m 6 t r i e des pics chromatographiques. DISCUSSION La p h a r m a c o p 6 e e u r o p 6 e n n e r e c o m m a n d e l ' a n a l y s e des s o l u t i o n s d ' a l b u m i n e p a r c h r o m a t o g r a p h i e s u r gel de p e r m d a t i o n et l ' e s t i m a t i o n q u a n t i t a t i v e des p r o t d i n e s p r 6 s e n t e s d a n s le pic exclu de la c h r o r n a t o g r a p h i e . L ' a n a l y s e des d i f f 6 r e n t s pics c h r o m a t o g r a p h i q u e s p a r 61ectrophorbse en g r a d i e n t de p o l y a c r y l a m i d e nous a p e r m i s
SOLUTIONS D'ALBUMINE HUMAINE
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de m o n t r e r que le pic 1 c o r r e s p o n d non /~ l'ensemble des formes polymdrisdes mais seulement aux hauts polymbres (t6tram6res, pentam6res, etc.) et fi des agr6gats. Les autres pics chromatographiques sont h4tdrog6nes g l'61ectrophorhse, puisque le pic 2 contient du trim6re et du dim~re et le pic 3 du m o n o m 6 r e et du dim6re. L'dlectrophorhse en gradient de polyacrylamide, sans t r a i t e m e n t prdalable de la solution d ' a l b u m i n e p a r un agent dissociant, p e r m e t de s 6 p a r e r p a r f a i t e m e n t le monom6re, le dim~re, le trim6re, mais se r4v61e inutilisable p o u r la quantification des hauts polym6res et des agrdgats c o r r e s p o n d a n t au pic I de la chromatographie. Par contre, cette m~me technique, utilisde aprhs traiteinent de la solution d ' a l b u m i n e p a r le SDS et dans les conditions d'expdrience que nous prdconisons (ddp6t de 350 Ixg de produit, coloration fi l'Amidoschwarz), p e r m e t d'6valuer q u a n t i t a t i v e m e n t les hauts polymhres pr6sents dans les solutions ainsi que ceux rdsultant de la dissociation des agr6gats. Les pourcentages ainsi observ6s sont voisins de ceux obtenus par la c h r o m a t o g r a p h i e ~t condition d'estimer la quantit6 de hauts polym6res par une mdthode chimique c o m m e le r e c o m m a n d e la Pharmacop6e, et non p a r la m e s u r e de l ' a b s o r b a n c e ~t 280 nm. BERTOLINI [1] a r d c e m m e n t m o n t r 6 clairement l'existence de tels 6carts entre ces deux types de mesure. Nous avons pu 6galement v6rifier sur des lots d ' a l b u m i n e p r o v e n a n t d'autres Centres de Transfusion fran~ais, que les r6sultats de l'estimation des prot6ines r6alisde par la m 6 t h o d e de Lowry, ceux effectu4s par dosage de l'azote (selon Kjeldahl) et ceux rdalis6s par 61ectrophor6se dtaient similaires. Par contre la m e s u r e de l ' a b s o r b a n c e dans I'UV entraine dans la plupart des cas une s u r e s t i m a t i o n i m p o r t a n t e (environ 40 %) de la proportion des protdines pr6sentes dans le volume exclu de la chromatographie. En ce qui concerne la pr6cision des mesures, il est ~t n o t e r que l'6valuation quantitative des hauts polym6res, fraction qui repr6sente entre 1 et 10 % de la totalit6 de la solution d ' a l b u m i n e demeure quelle que soit la m d t h o d e employ6e ( c h r o m a t o g r a p h i e ou 61ectrophorhse en gradient de polyacrylamide) entachde d'un coefficient de variation de ± 20 % de la valeur ddtermin6e. I1 faut dgalement r e m a r q u e r que si le SDS se rdvhle capable de solubiliser les agr6gats d'albumine, il ne peut dissocier les polym6res qui rdsultent d'une interaction p r o b a b l e m e n t covalente entre les moldcules d'albumine. Cette interaction est sans doute lide /~ l'existence de g r o u p e m e n t s SH fibres qui p e r m e t t e n t l'association des moldcules d'albumine entre elles p o u r f o r m e r des polym~res selon un processus encore mal expliqu6 [7].
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LAMBIN
P. et coll.
EN CONCLUSION, l'61ectrophor6se en g r a d i e n t de p o l y a c r y l a m i d e SDS, utilis6e selon certaines modalitds pr6cis6es dans ce travail, p e r m e t l'6valuation q u a n t i t a t i v e du p o u r c e n t a g e des h a u t s p o l y m 6 r e s et agr6gats des p r 6 p a r a t i o n s c o m m e r c i a l e s d ' a l b u m i n e d ' u n e m a n i 6 r e simple et rapide. RESUME
Les p r 6 p a r a t i o n s d ' a l b u m i n e purifi6e c o n t i e n n e n t ~t c6t6 du monom 6 r e de poids mol6culaire 66 000, u n p o u r c e n t a g e variable de polym b r e s qui a p p a r a i s s e n t d u r a n t le f r a c t i o n n e m e n t , le c h a u f f a g e et la c o n s e r v a t i o n des solutions. Un faible p o u r c e n t a g e de h a u t s polym~res est le reflet d ' u n e b o n n e stabilit6 de la solution. La m 6 t h o d e d'6valuation de la p r o p o r t i o n des p o l y m ~ r e s a c t u e l l e m e n t pr6conis6e consiste en u n e c h r o m a t o g r a p h i e d'exclusion. Dans ce travail, nous avons utilis6 le h a u t p o u v o i r de rdsolution de l'61ectrophor~se en gradient de p o l y a c r y l a m i d e p o u r s 6 p a r e r les m o n o m 6 r e s et les diff6rents p o l y m b r e s des solutions d ' a l b u m i n e et p o u r c o n n a i t r e la c o m p o s i t i o n des diff6rents pics c h r o m a t o g r a p h i q u e s . Nous avons p u m o n t r e r que le pic exclu (ou pic 1) contient les h a u t s p o l y m b r e s de l ' a l b u m i n e et des agr6gats, alors que le pic 2 c o r r e s p o n d aux f o r m e s dim6riques et t r i m 6 r i q u e s et que le pic 3 contient e s s e n t i e l l e m e n t le m o n o m 6 r e . Les agr6gats du pic 1 p e u v e n t 6tre dissocids p a r le SDS. L'utilisation de l'61ectrophor6se en gradient de p o l y a c r y l a m i d e selon les conditions pr6cisdes dans ce travail, en p a r t i c u l i e r aprbs t r a i t e m e n t de l'6chantillon p a r le SDS p e r m e t u n e 6valuation q u a n t i t a t i v e des h a u t s p o l y m b r e s et des agr6gats dans les solutions d ' a l b u m i n e et ceci avec u n e reproductibilit6 trbs satisfaisante. Ces r6sultats sont voisins de ceux o b t e n u s p a r c h r o m a t o g r a phie suivie de la m e s u r e c h i m i q u e de la quantit6 de prot6ine pr6sente dans les 61uats m a i s inf6rieurs h ceux r 6 s u l t a n t de la m e s u r e planim 6 t r i q u e des t r a c f s c h r o m a t o g r a p h i q u e s o b t e n u s p a r une lecture h 280 nm. SUMMARY I s o l a t e d a l b u m i n a l m o s t always contains p o l y m e r i z e d f o r m s w h i c h a p p e a r during p r e p a r a t i o n a n d storage of the protein. The p r o p o r tion of p o l y m e r i z e d f o r m s reflects the degree of stability of the solution. The q u a n t i t a t i v e e s t i m a t i o n of the p o l y m e r s is usually p e r f o r m e d b y gel c h r o m a t o g r a p h y . I n this w o r k , the high r e s o l u t i o n p o w e r of p o l y a c r y l a m i d e gradient gel e l e c t r o p h o r e s i s (Gradient PAGE) was u s e d to s e p a r a t e the p o l y m e r s p r e s e n t in the p r e p a r a tions of h u m a n s e r u m albumin.
SOLUTIONS D'ALBUMINE HUMAINE
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The analysis of the different peaks obtained by gel chromatog r a p h y allows to conclude that peak 1 contains aggregates and high polymers, peak 2 t r i m e r and d i m e r and peak 3 the m o n o m e r of albumin. The aggregates of the peak 1 can be dissociated by SDS and correspond, in gradient PAGE, to the high polymers. By using gradient PAGE in the presence of SDS u n d e r the conditions described in this paper, it is possible to estimate the p r o p o r t i o n of high p o l y m e r s and aggregates present in albumin preparations. These results are similar to those obtained by c h r o m a t o g r a p h y followed by a protein assay b u t noticeably inferior to those resulting f r o m m e a s u r e m e n t s p e r f o r m e d by a b s o r b a n c e at 280 nm. LAMBIN, Centre National de Transfusion Sanguine, 6, rue Alexandre-Cabanel, 75015 PARIS. P.
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Les hauts polym res dans les solutions d'albumine humaine Leur evaluation quantitative par dlectrophorOse en gradient de polyacrylamide par P. LAMBIN, D. ROCHU, N. H E R A N C E et J.M. F I N E Laboratoire d'Immunochimie des Prot6ines, Centre National de Transfusion Sanguine, PARIS.
F
INLAYSON et al. [4, 5] ont m o n t r 6 que les solutions d'albumine /~ usage th6rapeutique contenaient, outre le m o n o m ~ r e d'albumine de poids mo16culaire 66 000, un certain p o u r c e n t a g e de polym6res (dimbres, trimbres, t6tram6res et hauts polymbres). Ces polymbres p r e n n e n t naissance d u r a n t les processus de fractionn e m e n t [4, 5]. C o m m e l'ont Inontr6 FRIEDLI et KISTLER [8], les solutions d ' a l b u m i n e concentr6es (20 % ou 25 %) contiennent une plus forte p r o p o r t i o n de polym6res que les solutions dilu6es. La p r o p o r t i o n des polym~res est 6galement augmentde par la pasteurisation h 60 ° C et par le stockage prolong6 des solutions d'albumine [8, 12]. Le chauffage r6p6t6 de solutions d ' a l b u m i n e /t 56° C p e n d a n t plusieurs j o u r s [13] entraine une a u g m e n t a t i o n i m p o r t a n t e du
Manuscrit re~u le 4-5-1982.
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LAMB1N
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p o u r c e n t a g e des polym6res p o u v a n t conduire h une gdlification de la solution. L'existence d ' u n r a p p o r t 6troit entre la stabilit6 d ' u n e solution d ' a l b u m i n e et sa faible teneur en polym6res semble bien 6tablie. Pour cette raison, l'6valuation quantitative des f o r m e s polym6ris6es de l'albumine est u n p a r a m 6 t r e i m p o r t a n t /~ connaitre. De n o m b r e u s e s techniques ont 6 t d proposdes p o u r cette 6valuation. La technique actuellement la plus utilis6e est la c h r o m a t o g r a p h i e sur gel de Sephadex G 150 ou G 200 [2-5, 8, 9]. De plus, l ' u l t r a c e n t r i f u g a t i o n analytique [4, 6], l'61ectrophor6se en gel de polyacrylamide ~ c o n c e n t r a t i o n constante [6, 8, 13, 15], l'dlectrophor~se en gel d'acrylamide-agarose [12] ou l'dlectrophor6se en gel d ' a m i d o n combin6e ~ l'immuno-pr6cipitation [14], et r6cemm e n t la c h r o m a t o g r a p h i e h h a u t e p e r f o r m a n c e [1] ont 6td 6galement utilis6es. Dans ce travail, nous avons fait appel ~ l'61ectrophor6se en gradient de p o l y a c r y l a m i d e de 3 h 20 % p o u r analyser les diff6rentes fractions obtenues p a r c h r o m a t o g r a p h i e d'exclusion de solutions d ' a l b u m i n e humaine, puis p o u r 6valuer les p r o p o r t i o n s de m o n o m 6 r e s et de polym6res en prdsence ou en l'absence d ' u n agent d i s s o c i a n t : le dodecyl sulfate de s o d i u m (SDS). Enfin nous avons c o m p a r 6 les rdsultats obtenus p a r dlectrophor~se et par chromatographie.
M A T E R I E L ET M E T H O D E S Mat6riel Les solutions d ' a l b u m i n e g 20 % et h 4 % p r o v i e n n e n t du Centre National de Transfusion Sanguine. Leur t e n e u r en impuretds a 6t6 mesurde par 61ectrophor6se quantitative sur acdtate de cellulose selon les modalit6s techniques pr6conisdes p a r le groupe d'experts de la P h a r m a c o p d e europ6enne. Les solutions utilisdes dans ce travail contenaient moins de 3 % de prot6ines autres que l'albumine. Les prot6ines c o n t a m i n a n t e s ont une mobilit6 ~10U ~2 et sont de faible taille mol6culaJre c o m m e le m o n t r e leur 6tude i m m u n o c h i m i que (absence d'%M, d'haptoglobine, d'IgM, d'IgG, d'IgA et de C3).
Analyse c h r o m a t o g r a p h i q u e des s o l u t i o n s d'albumine Les c h r o m a t o g r a p h i e s ont 6t6 rdalis6es soit sur Sephadex G 200 (Pharmacia), soit sur Ultrogel AcA 34 (LKB) avec des colonnes de 100 × 2,5 cm, le d6bit d'dlution 6tant de 20 m l / h e u r e et la quantit6 ddpos6e de 100 mg sous un v o l u m e de 2,5 ml. La d6tection des pics
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SOLUTIONS D'ALBU.,~IINE H U M A I N E
a 6t6 effectude h 280 n m p a r un 6valu6e en densitds optiques. La p a r planim6trie. Parallblement, les ont 6t6 pool6s, leur v o l u m e m e s u r 6 6valu6e p a r la m d t h o d e de LowRY
a p p a r e i l UVICORD S (LKB) et surface des pics a 6t6 mesur6e 61uats c o r r e s p o n d a n t /~ ces pics et leur c o n c e n t r a t i o n en prot6ine et co11. [11].
Analyse 61ectrophor6tique des solutions d'albumine Les gels de p o l y a c r y l a m i d e utilis6s p o u r ce travail sont des gradients d o n t la c o n c e n t r a t i o n varie d ' u n e mani~re lin~aire de 3 h 20 %. Ces gels, d ' u n e d i m e n s i o n de 80 × 70 × 3 ram, ont 6t6 coul6s selon une m 6 t h o d e p r 6 c 6 d e m m e n t d6crite [10]. Chaque gel p e r m e t l'6tude simultan6e de 5 6chantillons. Les 61ectrophor~ses ont 6t6 r6alis6es dans une cuve G r a d i p o r e Multi 4. EN UABSENCE DS SDS, l'61ectrophor6se est r6alis6e en t a m p o n Tris-borate-EDTA p H 8,2 (Tris 10,75 g/l, acide b o r i q u e 5,04 g/l, EDTAN a 2 : 0 , 9 3 g/l). 250 t~g de chaque 6chantillon d ' a l b u m i n e dilu~s dans du glyc6rol (concentration finale 10 %) sont d6pos6s et soumis h une 61ectrophor~se de 8 h e u r e s sous 80 volts. La coloration des prot6ines est effectu6e p a r : a m i d o s c h w a r z 10B 1 g, acide ac6tique 70 ml, eau distill6e 930 ml p e n d a n t 18 h e u r e s suivie de d6coloration 61ectrophor6tique p e n d a n t 1 h e u r e (d6colorateur GD4 P h a r m a c i a ) clans de l'eau ac6tique h 5 p o u r 100, puis la d~coloration est achev6e sous simple agitation p e n d a n t 12 heures. EN PRI~SENCE de SDS, l'61ectrophor~se est r6alis6e en t a m p o n phosp h a t e 0,01 M p H 7,2 c o n t e n a n t 0 , 1 % de SDS, Les solutions d ' a l b u m i n e sont dilu6es dans du SDS /t 1 % et 350 ~g de prot6ines m61ang6s /~ du glyc6rol (concentration finale 10 %) sont soumis ~t l'61ectrophorose (80 volts - 8 heures). La coloration est r6alis6e p a r la solution s u i v a n t e : A m i d o s c h w a r z : 2g, m 6 t h a n o l : 250 ml, acide a c 6 t i q u e : 150 ml, eau distill6e : 600 ml p e n d a n t 18 heures. Aprbs 18 heures de coloration, ces gels sont d6color6s 61ectrophor6tiquement darts de l'eau ac6tique /t 7 %. L'6valuation d e n s i t o m d t r i q u e est r6alisde sur un d e n s i t o m 6 t r e Corning (modOle 750) h 600 n m avec une fente de 2 m m de large. L'analyse des diff6rentes fractions sdpar6es p a r c h r o m a t o g r a p h i e a 6t6 r6alis6e soit p a r 61ectrophor6se en l'absence de SDS (voir plus haut) soit en pr6sence de SDS. Dans ce cas, 20 ~xg de prot6ines trait6es p a r le SDS h 1 % et dilu6es dans du glycerol (concentration finale 10 %) sont soumis h l'61ectrophor6se. La coloration a 6t6 r6alis6e c o m m e p r 6 c 6 d e m m e n t m a i s en r e m p l a ~ a n t l'Amidoschwarz p a r le bleu de C o o m a s s i e dans la solution colorante.
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RESULTATS I.-
S6paration 61ectrophor6tique et chromatographique du monom~re et des diff6rents polym~res de l'albumine
L'dlectrophor~se en gradient de polyacrylamide (3 /~ 20 %) p e r m e t de s 6 p a r e r les d i f f 6 r e n t e s f o r m e s d ' a s s o c i a t i o n des m o l d c u l e s d ' a l b u m i n e en f o n c t i o n de l e u r taille mo16culaire. Le m o n o m 6 r e , qui const i t u e la f r a c t i o n m a j o r i t a i r e , a la m o b i l i t 6 61ectrophor6tique la p l u s 61evde alors que les p o l y m 6 r e s o n t u n e m o b i l i t 6 d ' a u t a n t p l u s f a i b l e que l e u r t a i l l e m o l 6 c u l a i r e est plus 61ev6e. P a r c e t t e t e c h n i q u e , il est p o s s i b l e d ' i n d i v i d u a l i s e r n e t t e m e n t d i m b r e s , t r i m 6 r e s et t6tram b r e s (Fig. 1). En l ' a b s e n c e de SDS, la p r d s e n c e d ' a g r 6 g a t s p 6 n 6 t r a n t d i f f i c i l e m e n t d a n s le gel est not6e dans c e r t a i n e s p r 6 p a r a t i o n s . P a r contre, u n t r a i t e m e n t p r 6 a l a b l e de la s o l u t i o n d ' a l b u m i n e p a r le SDS d i s s o c i e c o m p l b t e m e n t les a g r 6 g a t s et p e r m e t ainsi la p 6 n 6 t r a t i o n darts le gel de la t o t a l i t 6 des p r o t 6 i n e s d6pos6es.
Fic. 1 . - Electrophor~se en gel de polyacrylamide (gradient lin6aire de 3 h 20 %) de diff6rents lots d'albumine en l'absence de SDS. Coloration des prot6ines par l'Amidoschwarz. T: albumine t6moin riche en polym6res. i, 2, 3 : 3 lots diff6rents d'albumine h 20 %.
La chromatographie sur Ultrogel AcA 34 ou S e p h a d e x G 200 ne p e r m e t p a s d ' i n d i v i d u a l i s e r aussi d i s t i n c t e m e n t les d i f f 6 r e n t e s f o r m e s d ' a s s o c i a t i o n de l ' a l b u m i n e , c e p e n d a n t 3 pics p e u v e n t 6tre distingu6s.
SOLUTIONS D'ALBUM1NE HUMA1NE
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Les protdines prdsentes dans ces pics ont dtd concentrdes puis analysdes p a r dlectrophor6se en gradient de polyacrylamide. C o m m e le m o n t r e la Iigure 2, le p r e m i e r pic (volume exclu) contient des agrdgats p6ndtrant difficilement dans le gel et des polymbres de poids moldculaire dlevd (pentam6res, tdtram6res). Le deuxi6me pic c o r r e s p o n d essentiellement aux formes dim6riques et trimdriques, et le troisi6me pic contient le m o n o m ~ r e et une p a t t i e du dim6re. Lorsque le pic c h r o m a t o g r a p h i q u e exclu (ou pic I) est traitd p a r le SDS puis analysd par dlectrophor~se en gradient de polyacrylamide, on constate c o m m e p r d c d d e m m e n t que les agrdgats sont dissocids par le SDS et que la totalitd des protdines ddposdes pdn~trent dans le gel. Comme le m o n t r e la figure 3, ces agrdgats sont constituds presque exclusive3
A
m~res I +
FIG. 2 . - A: profil d'dlution de l'analyse chromatographique (Ultrogel AcA 34) de 100 mg d'un lot d'album.ine ~t 20 %. B: Analyse par dlectrophor6se en gel de polyacrylamide (gradient lindaire de 3 ~ 20 %) du lot d'alburnine non fractionn6 (T) et des diffdrentes fractions obtenues par chromatographie (pics I, 2 et 3). Coloration des protdines par l'Amidoschwarz. m e n t par des formes h a u t e m e n t polym~risdes. En prdsence de SDS, ces hauts polym~res (t~tram~res, pentam~res, etc.) p o u r r o n t donc faire l'objet d'une m e s u r e densitomdtrique en r u e de leur estimation
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LAMBIN P. et coll.
q u a n t i t a t i v e . Des m e s u r e s d ' a b s o r b a n c e effectu6es h 280 n m s u r les pics I c o n c e n t r 6 s a v a n t et apr6s t r a i t e m e n t p a r le SDS m o n t r e n t que cet a g e n t d i s s o c i a n t e n t r a i n e u n e d i m i n u t i o n de 20 h 40 % de la densit6 o p t i q u e de la s o l u t i o n d u e h la s o l u b i l i s a t i o n des agr6gats p a r le SDS. I1 s e m b l e d o n c que l ' 6 v a l u a t i o n q u a n t i t a t i v e du p i c I p a r a b s o r p t i o n h 280 n m en l ' a b s e n c e de SDS e n t r a i n e u n e surestim a t i o n de la q u a n t i t 6 des p o l y m ~ r e s d u e ~ la p r 6 s e n c e des agr6gats.
F~6. 3 . - Electrophor6se en gel de polyacrylamide (gradient lin6aire de 3 ~t 20 %) en prdsence de SDS (coloration par le bleu de Coomassie). T: solution d'albumine t6moin. 1, 2 et 3: pics I chromatographiques de 3 pr6parations diff6rentes d'albumine h 20 %.
II. - - Evaluation quantitative des hauts p o l y m ~ r e s d'albumine par 61ectrophor~se C o m m e nous l ' a v o n s vu plus haut, c e t t e m e s u r e n ' e s t p o s s i b l e q u ' a p r ~ s t r a i t e m e n t de l ' a l b u m i n e p a r le SDS. Des 6 t u d e s pr61imin a i r e s o n t m o n t r 6 que le b l e u de C o o m a s s i e utilis6 h a b i t u e l l e m e n t p o u r la c o l o r a t i o n des p r o t 6 i n e s en SDS n ' a v a i t p a s u n e f i x a t i o n p r o p o r t i o n n e l l e h la q u a n t i t 6 de p r o t 6 i n e s d6pos6e. L ' A m i d o s c h w a r z p e r m e t p a r c o n t r e d ' o b t e n i r d ' e x c e l l e n t s r d s u l t a t s q u a n t i t a t i f s . Dans un p r e m i e r t e m p s , n o u s avons d 6 t e r m i n 6 la q u a n t i t 6 o p t i m a l e de p r o t 6 i n e h d ~ p o s e r p o u r c h a q u e 61ectrophor~se. C o m m e on p e u t le v o i r s u r la f i g u r e 4, le p o u r c e n t a g e de h a u t s p o l y m ~ r e s p a r r a p p o r t au m o n o m ~ r e et aux o l i g o m ~ r e s c r o i t j u s q u ' h u n e l i m i t e de 350 l~g d ' a l b u m i n e p a r d6p6t p u i s r e s t e stable. C'est c e t t e q u a n t i t 6 q u e n o u s avons utilis6e p o u r les r 6 s u l t a t s donn6s darts le t a b l e a u I. Les v a l e u r s indiqu~es s o n t ]a m o y e n n e de 5 e x p 6 r i e n c e s diff6rentes. La r e p r o -
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SOLUTIONS D'ALBUM1NE H U M A I N E
d u c t i b i l i t 6 des rnesures est de -+ 20 %. Un e x e m p l e de trac6 densit o m 6 t r i q u e est donn6 d a n s la figure 5. TABLEAU I
Pourcentage de hauts p o l y m & e s et d'agr~gats dans 10 solutions d'albumine injectable.
LOT
CHROMATOGRAPHIE SUP.
ELECTROPHORESE EN GRADIENT DE POLYACRYLAMIDE ET S D S
Densitom6trie 1 2 3 4 5 6 7
Dosage des prot6ines
Absorbance 280 nm
4,6 4,7 4,5 0,8 2,3 4,4 4,8 1,3 2,8 1,3
5,8 7,5 7,9 0,9 6,7 6 6,8 2,9 4,5 3,4
4,2 5,6 4,8 0,9 1,9 4
5,9 1,1 3,2 1,7
8
9 10
AcA 34
Hauts potym~res ( % )
tot 7
tot 6
.
150
200
250
300
tot 5
350
400
~g
d'Atbumine
d6pos6s
FIG. 4. - - Pourcentage de hauts polym~res observ6s par 6lectrophor6se en gradient de polyacrylamide et SDS dans 3 lots d'albumine en fonction de la quantit6 d6pos6e (coloration: Amidoschwarz).
494
LAMBIN
P. et coll.
/ ? 82.9
10.9
1.9
4.2
FIG. 5 . - Exemple de diagramme d'enregistrement densitom6trique d'une pr6paration d'albumine g 20 % analys6e par 61ectrophor6se en gradient de polyacrylamide aprbs traitement par le SDS (coloration par l'Amidoschwarz). 1 : monom6re (82,9 %), 2 : dim6re (10,9 %), 3 : trim6re (1,9 %). 4: hauts polymbres (4,2 %).
I I I . - - C o m p a r a i s o n d e s r 6 s u l t a t s o b t e n u s par les m 6 t h o d e s 61ectrop h o r 6 t i q u e s et c h r o m a t o g r a p h i q u e s Ces r 6 s u l t a t s s o n t r a p p o r t d s d a n s le t a b l e a u I. Dans le cas de la c h r o m a t o g r a p h i e , nous i n d i q u o n s les v a l e u r s o b s e r v 6 e s en mesur a n t d ' u n e p a r t la s u r f a c e des pics d6tect6s h 280 n m et d ' a u t r e p a r t la q u a n t i t 6 de p r o t d i n e s p r 6 s e n t e d a n s ces pics 6valu6e p a r la m d t h o d e de LOWRY et coll. [11]. On c o n s t a t e que la p r o p o r t i o n de h a u t s p o l y m 6 r e s e s t i m d e p a r la m 6 t h o d e de LOWRY et coll. est v o i s i n e de celle o b t e n u e p a r 61ectrophor6se a l o r s que des p o u r c e n t a g e s plus 61ev6s (environ 40 %) s o n t o b t e n u s p a r la p l a n i m 6 t r i e des pics chromatographiques. DISCUSSION La p h a r m a c o p 6 e e u r o p 6 e n n e r e c o m m a n d e l ' a n a l y s e des s o l u t i o n s d ' a l b u m i n e p a r c h r o m a t o g r a p h i e s u r gel de p e r m d a t i o n et l ' e s t i m a t i o n q u a n t i t a t i v e des p r o t d i n e s p r 6 s e n t e s d a n s le pic exclu de la c h r o r n a t o g r a p h i e . L ' a n a l y s e des d i f f 6 r e n t s pics c h r o m a t o g r a p h i q u e s p a r 61ectrophorbse en g r a d i e n t de p o l y a c r y l a m i d e nous a p e r m i s
SOLUTIONS D'ALBUMINE HUMAINE
495
de m o n t r e r que le pic 1 c o r r e s p o n d non /~ l'ensemble des formes polymdrisdes mais seulement aux hauts polymbres (t6tram6res, pentam6res, etc.) et fi des agr6gats. Les autres pics chromatographiques sont h4tdrog6nes g l'61ectrophorhse, puisque le pic 2 contient du trim6re et du dim~re et le pic 3 du m o n o m 6 r e et du dim6re. L'dlectrophorhse en gradient de polyacrylamide, sans t r a i t e m e n t prdalable de la solution d ' a l b u m i n e p a r un agent dissociant, p e r m e t de s 6 p a r e r p a r f a i t e m e n t le monom6re, le dim~re, le trim6re, mais se r4v61e inutilisable p o u r la quantification des hauts polym6res et des agrdgats c o r r e s p o n d a n t au pic I de la chromatographie. Par contre, cette m~me technique, utilisde aprhs traiteinent de la solution d ' a l b u m i n e p a r le SDS et dans les conditions d'expdrience que nous prdconisons (ddp6t de 350 Ixg de produit, coloration fi l'Amidoschwarz), p e r m e t d'6valuer q u a n t i t a t i v e m e n t les hauts polymhres pr6sents dans les solutions ainsi que ceux rdsultant de la dissociation des agr6gats. Les pourcentages ainsi observ6s sont voisins de ceux obtenus par la c h r o m a t o g r a p h i e ~t condition d'estimer la quantit6 de hauts polym6res par une mdthode chimique c o m m e le r e c o m m a n d e la Pharmacop6e, et non p a r la m e s u r e de l ' a b s o r b a n c e ~t 280 nm. BERTOLINI [1] a r d c e m m e n t m o n t r 6 clairement l'existence de tels 6carts entre ces deux types de mesure. Nous avons pu 6galement v6rifier sur des lots d ' a l b u m i n e p r o v e n a n t d'autres Centres de Transfusion fran~ais, que les r6sultats de l'estimation des prot6ines r6alisde par la m 6 t h o d e de Lowry, ceux effectu4s par dosage de l'azote (selon Kjeldahl) et ceux rdalis6s par 61ectrophor6se dtaient similaires. Par contre la m e s u r e de l ' a b s o r b a n c e dans I'UV entraine dans la plupart des cas une s u r e s t i m a t i o n i m p o r t a n t e (environ 40 %) de la proportion des protdines pr6sentes dans le volume exclu de la chromatographie. En ce qui concerne la pr6cision des mesures, il est ~t n o t e r que l'6valuation quantitative des hauts polym6res, fraction qui repr6sente entre 1 et 10 % de la totalit6 de la solution d ' a l b u m i n e demeure quelle que soit la m d t h o d e employ6e ( c h r o m a t o g r a p h i e ou 61ectrophorhse en gradient de polyacrylamide) entachde d'un coefficient de variation de ± 20 % de la valeur ddtermin6e. I1 faut dgalement r e m a r q u e r que si le SDS se rdvhle capable de solubiliser les agr6gats d'albumine, il ne peut dissocier les polym6res qui rdsultent d'une interaction p r o b a b l e m e n t covalente entre les moldcules d'albumine. Cette interaction est sans doute lide /~ l'existence de g r o u p e m e n t s SH fibres qui p e r m e t t e n t l'association des moldcules d'albumine entre elles p o u r f o r m e r des polym~res selon un processus encore mal expliqu6 [7].
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P. et coll.
EN CONCLUSION, l'61ectrophor6se en g r a d i e n t de p o l y a c r y l a m i d e SDS, utilis6e selon certaines modalitds pr6cis6es dans ce travail, p e r m e t l'6valuation q u a n t i t a t i v e du p o u r c e n t a g e des h a u t s p o l y m 6 r e s et agr6gats des p r 6 p a r a t i o n s c o m m e r c i a l e s d ' a l b u m i n e d ' u n e m a n i 6 r e simple et rapide. RESUME
Les p r 6 p a r a t i o n s d ' a l b u m i n e purifi6e c o n t i e n n e n t ~t c6t6 du monom 6 r e de poids mol6culaire 66 000, u n p o u r c e n t a g e variable de polym b r e s qui a p p a r a i s s e n t d u r a n t le f r a c t i o n n e m e n t , le c h a u f f a g e et la c o n s e r v a t i o n des solutions. Un faible p o u r c e n t a g e de h a u t s polym~res est le reflet d ' u n e b o n n e stabilit6 de la solution. La m 6 t h o d e d'6valuation de la p r o p o r t i o n des p o l y m ~ r e s a c t u e l l e m e n t pr6conis6e consiste en u n e c h r o m a t o g r a p h i e d'exclusion. Dans ce travail, nous avons utilis6 le h a u t p o u v o i r de rdsolution de l'61ectrophor~se en gradient de p o l y a c r y l a m i d e p o u r s 6 p a r e r les m o n o m 6 r e s et les diff6rents p o l y m b r e s des solutions d ' a l b u m i n e et p o u r c o n n a i t r e la c o m p o s i t i o n des diff6rents pics c h r o m a t o g r a p h i q u e s . Nous avons p u m o n t r e r que le pic exclu (ou pic 1) contient les h a u t s p o l y m b r e s de l ' a l b u m i n e et des agr6gats, alors que le pic 2 c o r r e s p o n d aux f o r m e s dim6riques et t r i m 6 r i q u e s et que le pic 3 contient e s s e n t i e l l e m e n t le m o n o m 6 r e . Les agr6gats du pic 1 p e u v e n t 6tre dissocids p a r le SDS. L'utilisation de l'61ectrophor6se en gradient de p o l y a c r y l a m i d e selon les conditions pr6cisdes dans ce travail, en p a r t i c u l i e r aprbs t r a i t e m e n t de l'6chantillon p a r le SDS p e r m e t u n e 6valuation q u a n t i t a t i v e des h a u t s p o l y m b r e s et des agr6gats dans les solutions d ' a l b u m i n e et ceci avec u n e reproductibilit6 trbs satisfaisante. Ces r6sultats sont voisins de ceux o b t e n u s p a r c h r o m a t o g r a phie suivie de la m e s u r e c h i m i q u e de la quantit6 de prot6ine pr6sente dans les 61uats m a i s inf6rieurs h ceux r 6 s u l t a n t de la m e s u r e planim 6 t r i q u e des t r a c f s c h r o m a t o g r a p h i q u e s o b t e n u s p a r une lecture h 280 nm. SUMMARY I s o l a t e d a l b u m i n a l m o s t always contains p o l y m e r i z e d f o r m s w h i c h a p p e a r during p r e p a r a t i o n a n d storage of the protein. The p r o p o r tion of p o l y m e r i z e d f o r m s reflects the degree of stability of the solution. The q u a n t i t a t i v e e s t i m a t i o n of the p o l y m e r s is usually p e r f o r m e d b y gel c h r o m a t o g r a p h y . I n this w o r k , the high r e s o l u t i o n p o w e r of p o l y a c r y l a m i d e gradient gel e l e c t r o p h o r e s i s (Gradient PAGE) was u s e d to s e p a r a t e the p o l y m e r s p r e s e n t in the p r e p a r a tions of h u m a n s e r u m albumin.
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The analysis of the different peaks obtained by gel chromatog r a p h y allows to conclude that peak 1 contains aggregates and high polymers, peak 2 t r i m e r and d i m e r and peak 3 the m o n o m e r of albumin. The aggregates of the peak 1 can be dissociated by SDS and correspond, in gradient PAGE, to the high polymers. By using gradient PAGE in the presence of SDS u n d e r the conditions described in this paper, it is possible to estimate the p r o p o r t i o n of high p o l y m e r s and aggregates present in albumin preparations. These results are similar to those obtained by c h r o m a t o g r a p h y followed by a protein assay b u t noticeably inferior to those resulting f r o m m e a s u r e m e n t s p e r f o r m e d by a b s o r b a n c e at 280 nm. LAMBIN, Centre National de Transfusion Sanguine, 6, rue Alexandre-Cabanel, 75015 PARIS. P.
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