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Les substances de groupes sanguins A et B
Transfusion. T. II. N° 1 - - 1959
Les substances de groupes sanguins A et B I.- Activitg immunologique de polyosides puri/igs d'origine animale par J. M. F I N E * et R. AUDRAN ~*
L
ETUDE chimique et immunologlque des substances de groupes sanguins A, B e t H a fair l'objet en particulier des remarquables travaux de deux 6quipes de chercheurs, celle de K a b a t aux Etats-Unis et celle de Morgan en Angleterre. Dans la pratique s6rologique courante, peu de laboratoires disposent actuellement de substances de groupes purifi6es pouvant servir de point de comparaison lots de la recherche du caractbre s6cr6teur dans la salive humaine. I1 est intSressant en effet de pouvoir r a p p o r t e r le pouvoir i n h i b i t e n r plus ou mo~ns important d'une salive ~ l'6quivalent en poids de substances pnrifi6es produisant l'inhibition de la m~me quantit~ d'unit~s agglutinantes de l'antis6rum. Nous avons, au cours de ce travail, prSpar$ des substances polyosidiques purifi6es ayant une sp$cificit6 A ou B, et d'origine animale. Nous envisagerons successivement : - - La recherche de substances de groupe dans les organes des diverses esp~ces animales utilisSes. * Centre N a l i o n a l de T r a n s f u s i o n S a n g u i n e , 6, r u e A l e x a n d r e - C a b a n e l , P a r i s (XVe). ** Attach6 de R e c h e r c h e d u C.N.R.S., I n s t i t n t P a s t e u r , P a r i s .
58
L-M. F I N E et R. A U D R A N
L'obtention de polyosides possSdant une action inhibitrice sur les agglutinines anti-A ou anti-B. - - L ' ~ t u d e de l'activit6 i m m u n o l o g i q u e des diverses substances --
obtenues.
I. - -
Origine
des
substances
A
et B
Dans un p r e m i e r temps, nous avons recherch6 la presence de substances de groupes sanguins A e t B dans les produits d'hydrolyse enzym a t i q u e par la papaYne d'estomacs, de pancr6as ou de glandes salivaires de cheval, porc, m o u t o n et ch~vre. Nous avons ainsi examin6 les organes de 25 chevaux, 10 porcs, 10 moutons et 6 ch~vres. Une substance de sp~cificit~ A peut ~tre mise en ~vidence dans les organes de certains chevaux, porcs, moutons et ch~vres. La substance B n'6tant rencontrSe que chez le cheval, soit ~ l'6tat isol~, soit associ6e ~ la substance A (voir tableau I ) . La recherche de ces substances a ~t~ effectu~e p a r une m~thode d'inhibition simple qualitative et quantitative. Toutes nos recherches ont $t6 effectuSes avec un s6rum anti-A et un sSrum anti-B dont nous possSdons un stock suffisamment i m p o r t a n t . Ces deux sSrums donnaient une agglutination m a c r o s c o p i q n e m e n t visible ~ la dilution 1/1000. La recherche qualitative 6tait effectuSe p a r mise en contact p e n d a n t 30 minutes de 0,5 ml de la substance "~ Studier avec 0,5 ml de l'anti-s6rum suivi du titrage des agglutinines restantes. Suivant le degr~ de neutralisation des agglutinines on conclut ~ la pr6sence ou ~ l'absence de substance. On peut ~galement chiffrer en << unit~s arbitraires >> l'action inhibitrice de la substance Studi~e, l'unit6 correspondant ~ la neutralisation complete de 0,2 ml de s~rum anti.A titrant 1/1000 (vis ~ vis de globules rouges At) p a r 0,2 ml de substance ~ ~tudier. Si u n e dilution au 1/8 e de la substance neutralise sous 1 volume de 0,2 les 0,2 m l de s6rum anti-A, cette substance contiendra 8 unit~s p a r 0,2 ml soit 40 U / m l (1). Cette m 6 t h o d e simple nous a $t6 e x t r ~ m e m e n t utile p o u r suivre l'activit$ inhibitrice de ces substances au cours de leur purification.
(1) FINE (J. M.) et EYQUEM (A.), Anr~ales de rInstitut Pasteur, 1955, 89, 460.
LES SUBSTANCES DE GROUPES SANGUINS A ET B
59
TABLEAU I
Recherche des substances de groupes ehez d i f ~ r e n t e s esp~ces
SUBSTANCES
NOMBRE ESe~CE
D~INDI. VIDUS
ORGANE
NOMBRE
A
25
Estomac G1. salivaires Paner6as
24 16 6
Pore . . . . . . .
10
Estomae Paner6as
10 10
Mouton ....
10
Estomae Paner6as Estomae Paner6as
Cheval . . . . .
Ch~vre . . . . .
B
A+B
6 2 3
11 9
8 8
0 0
0 0
10 10
4 4
0 0
0 0
5 5
2 2
0 0
0 0
II. - - P r e p a r a t i o n de s u b s t a n c e s d e g r o u p e s
1
purifi6es
PRINCIPE : Nous avons utilis6 la pr$cipitation aleoolique des polysaceharides pr6sents dans les produits de digestion enzymatique des estomacs animaux par la papafne. Les pr6cipit6s remis en solution sont ensuite d6barrass6s des impuret6s prot6iniques par la m6thode de Sevag (voir c). TECHNIQUE : a) Digestion enzymatique. On met en contact 1.000 g d'organe hach$, 1.000 g d'eau physiologique et 6 g de papaine. On porte ~ 80 ° C pendant 5 minutes. On filtre sur papier Chardin et le fihrat est autoclav$. b) Pr6cipitation alcoolique. La pr6cipitation des polysaccharides est effectu$e par addition de 4 volumes d ' E t h a n o l ~ 95 % en pr6sence d'ac6tate de sodium. c) Puriflcatiort. Le pr$cipit$ est lav6 ~ l'alcool, s$ch$ puis repris p a r 250 ml d'eau distill6e. A 250 ml de cette solution on ajoute :
J..M. FINE et R. A U D R A N
60
10 g d'ac6tate de sodium 5 ml d'acide ac6tique glacial puis 50 ml d e chloroforme 10 ml de n-butanol. On agite m6caniquement ce m6lange pendant 1 heure et on centrifuge h 3.000 t / m pendant 30 minutes. Apr~s centrifugation, on a trois zones de densit6s diffSrentes : a) un surnageant acqueux contenant les polysaccharides b) une couche de gel prot$ique interm6diaire c) une couche profonde correspondant au solvant (chloroforme). On pipette le surnageant et on r6pSte cette operation jusqu'h absence de formation de gel protSique ~ l'interface solution acqueuse/ chloroforme. I1 est parfois n6cessaire d'effectuer 8 ~ 10 purifications successives. d) Le dernier surnageant une lois recueilli, on effectue la precipitation des polysaccharides par l'6thanol h 95 % (4 volumes). Apr~s !avage du pr6cipit6 5 l'alcool on redissout le pr6cipit5 dans une solution de C1Na ~ 9 g/1. La dessiccation est effectu6e par lyophilisation. -
-
-
-
~ESULTATS :
Nous avons pu obtenir - - une preparation de une preparation de - - une pr6paration de une prSparation de - - une prSparation de -
-
ainsi : substance substance substance substance substance
A B A A A
d'origine d'origine d'origine d'origine d'origine
p o r c (A 355). cheval (B 1332). porc (P. IV). mouton (M. III). ch~vre (C. V).
HI. - - Activit6 i m m u n o l o y i q u e de Ces pr6parations TECHNIQUE :
Ces diff6rentes pr6parations ont 6t6 ~tudi6es, soit par la m6thode quantitative d$crite pr$cSdemment (r$sultats en unit~s arbitraires) soit par la mSthode d'inhibition de l'agglutination d$cl~te par Kabat (2). - - L e sSrum anti-A ou anti-B employ5 est dilu$ de maniSre •contenir 10 unitSs agglutinantes. (2) KASAT (E. A.) Blood Group Substances. Academic Press. New-York.
61
LES S U B S T A N C E S DE GROUPES S A N G U I N S A ET B
On titre le s6rum vis h vis de globules rouges soit A1, soit B, apr~s avoir effectu6 des dilutions r6elles du s6rum h titrer. C h a q u e dilution 6tant faite p a r le m61ange de s6rum p u r et d ' e a u physiologique. -On p~se 20 mg de substance ~ titter que l'on dissout darts 20 m l d'eau physiologique. On obtient ainsi une dilution contenant 1 m g / m l . A p a r t i r de cette solution I on p r e p a r e u n e solution I I ~ t 100 t~g/ml, une solution I I [ h 10 ~g/ml, enfin une solution I V h 1/~g/ml. Le dosage est r4sum4 dans le T a b l e a u I L
TABLEAU I I
NUMEROTATION DES TUBES
2
3
0,1
0,1
II 0,5 50
0,7
Globules rouges A1 h 4 p. 100 . . . . . . 0,1
Anti-A, 10 unit6s agglutinantes . . . . . . Substance A : Solution . . . . . . . . Quantit6 en ml .. Quantit~ en #g/ml. Eau physlologique 0,9 g/p. 100 . . . . . .
0,1 I
5
6
7
8
0,I
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
I! 0~255
II 0,1 10
III 0~5
III 0~25
III 011
IV 0,5 0,5
IV 0,25 0,2
IV 0,1 0,1
0,3
0,55
0,7
0,3
0,55
0,7
0,3
0,55
0,7
0,1
0~1
0,1
0,1
03
0,1
0,1
0,1
0,1
10
Le p o r t o i r de tubes est plac~ au bain-marie h 37°C p e n d a n t 60 minutes puis chaque t u b e est eentrifug6 "~ 1000 t / m p e n d a n t 1 m. L'agglutination est lue p a r agitation sur nn m i r o i r concave. La quantit6 de substance n$cessaire p o u r p r o d u i r e l'inhibition complete de 10 unit6s agglutinantes de s6rum anti-A p a r exemple perm e t t r a de c o m p a r e r l'activit$ inhibitrice de divers 6chantillons de substances de g r o u p e A. Les r6sultats de la r6action d'inhibition s o n t exprim$s dans le tableau I I I .
J.-M. FINE et R. A U D R A N 62 TABLEAU I I I
TUBES
1
Substance 5000 gg/ml A (CV) • 0 0 h (MIlI) 0 A (P IV) A (355) . 0 0 B (1.332)
2
3
4
5
6
2000 1000 500 100 50 0 0 0 0 0 o o o o 0 o o o o 0 o o o o 0 + + ++ ++ 0
7
8
25 + + o o ++
10 + + o o +++
9
5 ++ ++ o o +++
10
2 ++ ++ o + +++
11
12
13
14
1 0,5 0,2 0,1 ++++++++++++ ++++++++~-+++ + ++ +++ +++ ++ +++++++++ +++ +++ +++ +++
Conclusion P a r u n e m 6 t h o d e r e l a t i v e m e n t s i m p l e , nous avons p u p u r i f i e r d e s p o l y s a c c h a r i d e s de s u b s t a n c e s de g r o u p e s s a n g u i n s A et B dou6s d ' u n e a c t i v i t 6 i n h i b i t r i c e sp6cifique sur les a n t i - s 6 r u m s c o r r e s p o n d a n t s , l'$val u a t i o n d u p o u v o i r n e u t r a l i s a n t 6 t a n t r a p p o r t 6 ~ u n p o i d s connu. Ces p r 6 p a r a t i o n s peu,~ent n o u s p e r m e t t r e d ' u t i l i s e r d e u x de ce|les-ci (A 355 et B 1332) d e n t nous avons p u p r 6 p a r e r u n e q u a n t i t $ a p p r e c i a b l e cornm e r6fSrence d a n s n o t r e l a b o r a t o i r e , p o u r l'~valuati~)n q u a n t i t a t i v e d u p o u v o i r d e s$crStion s a l i v a i r e .
Les substances de groupes sanguins A et B I.- Activitg immunologique de polyosides puri/igs d'origine animale par J. M. F I N E * et R. AUDRAN ~*
L
ETUDE chimique et immunologlque des substances de groupes sanguins A, B e t H a fair l'objet en particulier des remarquables travaux de deux 6quipes de chercheurs, celle de K a b a t aux Etats-Unis et celle de Morgan en Angleterre. Dans la pratique s6rologique courante, peu de laboratoires disposent actuellement de substances de groupes purifi6es pouvant servir de point de comparaison lots de la recherche du caractbre s6cr6teur dans la salive humaine. I1 est intSressant en effet de pouvoir r a p p o r t e r le pouvoir i n h i b i t e n r plus ou mo~ns important d'une salive ~ l'6quivalent en poids de substances pnrifi6es produisant l'inhibition de la m~me quantit~ d'unit~s agglutinantes de l'antis6rum. Nous avons, au cours de ce travail, prSpar$ des substances polyosidiques purifi6es ayant une sp$cificit6 A ou B, et d'origine animale. Nous envisagerons successivement : - - La recherche de substances de groupe dans les organes des diverses esp~ces animales utilisSes. * Centre N a l i o n a l de T r a n s f u s i o n S a n g u i n e , 6, r u e A l e x a n d r e - C a b a n e l , P a r i s (XVe). ** Attach6 de R e c h e r c h e d u C.N.R.S., I n s t i t n t P a s t e u r , P a r i s .
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L-M. F I N E et R. A U D R A N
L'obtention de polyosides possSdant une action inhibitrice sur les agglutinines anti-A ou anti-B. - - L ' ~ t u d e de l'activit6 i m m u n o l o g i q u e des diverses substances --
obtenues.
I. - -
Origine
des
substances
A
et B
Dans un p r e m i e r temps, nous avons recherch6 la presence de substances de groupes sanguins A e t B dans les produits d'hydrolyse enzym a t i q u e par la papaYne d'estomacs, de pancr6as ou de glandes salivaires de cheval, porc, m o u t o n et ch~vre. Nous avons ainsi examin6 les organes de 25 chevaux, 10 porcs, 10 moutons et 6 ch~vres. Une substance de sp~cificit~ A peut ~tre mise en ~vidence dans les organes de certains chevaux, porcs, moutons et ch~vres. La substance B n'6tant rencontrSe que chez le cheval, soit ~ l'6tat isol~, soit associ6e ~ la substance A (voir tableau I ) . La recherche de ces substances a ~t~ effectu~e p a r une m~thode d'inhibition simple qualitative et quantitative. Toutes nos recherches ont $t6 effectuSes avec un s6rum anti-A et un sSrum anti-B dont nous possSdons un stock suffisamment i m p o r t a n t . Ces deux sSrums donnaient une agglutination m a c r o s c o p i q n e m e n t visible ~ la dilution 1/1000. La recherche qualitative 6tait effectuSe p a r mise en contact p e n d a n t 30 minutes de 0,5 ml de la substance "~ Studier avec 0,5 ml de l'anti-s6rum suivi du titrage des agglutinines restantes. Suivant le degr~ de neutralisation des agglutinines on conclut ~ la pr6sence ou ~ l'absence de substance. On peut ~galement chiffrer en << unit~s arbitraires >> l'action inhibitrice de la substance Studi~e, l'unit6 correspondant ~ la neutralisation complete de 0,2 ml de s~rum anti.A titrant 1/1000 (vis ~ vis de globules rouges At) p a r 0,2 ml de substance ~ ~tudier. Si u n e dilution au 1/8 e de la substance neutralise sous 1 volume de 0,2 les 0,2 m l de s6rum anti-A, cette substance contiendra 8 unit~s p a r 0,2 ml soit 40 U / m l (1). Cette m 6 t h o d e simple nous a $t6 e x t r ~ m e m e n t utile p o u r suivre l'activit$ inhibitrice de ces substances au cours de leur purification.
(1) FINE (J. M.) et EYQUEM (A.), Anr~ales de rInstitut Pasteur, 1955, 89, 460.
LES SUBSTANCES DE GROUPES SANGUINS A ET B
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TABLEAU I
Recherche des substances de groupes ehez d i f ~ r e n t e s esp~ces
SUBSTANCES
NOMBRE ESe~CE
D~INDI. VIDUS
ORGANE
NOMBRE
A
25
Estomac G1. salivaires Paner6as
24 16 6
Pore . . . . . . .
10
Estomae Paner6as
10 10
Mouton ....
10
Estomae Paner6as Estomae Paner6as
Cheval . . . . .
Ch~vre . . . . .
B
A+B
6 2 3
11 9
8 8
0 0
0 0
10 10
4 4
0 0
0 0
5 5
2 2
0 0
0 0
II. - - P r e p a r a t i o n de s u b s t a n c e s d e g r o u p e s
1
purifi6es
PRINCIPE : Nous avons utilis6 la pr$cipitation aleoolique des polysaceharides pr6sents dans les produits de digestion enzymatique des estomacs animaux par la papafne. Les pr6cipit6s remis en solution sont ensuite d6barrass6s des impuret6s prot6iniques par la m6thode de Sevag (voir c). TECHNIQUE : a) Digestion enzymatique. On met en contact 1.000 g d'organe hach$, 1.000 g d'eau physiologique et 6 g de papaine. On porte ~ 80 ° C pendant 5 minutes. On filtre sur papier Chardin et le fihrat est autoclav$. b) Pr6cipitation alcoolique. La pr6cipitation des polysaccharides est effectu$e par addition de 4 volumes d ' E t h a n o l ~ 95 % en pr6sence d'ac6tate de sodium. c) Puriflcatiort. Le pr$cipit$ est lav6 ~ l'alcool, s$ch$ puis repris p a r 250 ml d'eau distill6e. A 250 ml de cette solution on ajoute :
J..M. FINE et R. A U D R A N
60
10 g d'ac6tate de sodium 5 ml d'acide ac6tique glacial puis 50 ml d e chloroforme 10 ml de n-butanol. On agite m6caniquement ce m6lange pendant 1 heure et on centrifuge h 3.000 t / m pendant 30 minutes. Apr~s centrifugation, on a trois zones de densit6s diffSrentes : a) un surnageant acqueux contenant les polysaccharides b) une couche de gel prot$ique interm6diaire c) une couche profonde correspondant au solvant (chloroforme). On pipette le surnageant et on r6pSte cette operation jusqu'h absence de formation de gel protSique ~ l'interface solution acqueuse/ chloroforme. I1 est parfois n6cessaire d'effectuer 8 ~ 10 purifications successives. d) Le dernier surnageant une lois recueilli, on effectue la precipitation des polysaccharides par l'6thanol h 95 % (4 volumes). Apr~s !avage du pr6cipit6 5 l'alcool on redissout le pr6cipit5 dans une solution de C1Na ~ 9 g/1. La dessiccation est effectu6e par lyophilisation. -
-
-
-
~ESULTATS :
Nous avons pu obtenir - - une preparation de une preparation de - - une pr6paration de une prSparation de - - une prSparation de -
-
ainsi : substance substance substance substance substance
A B A A A
d'origine d'origine d'origine d'origine d'origine
p o r c (A 355). cheval (B 1332). porc (P. IV). mouton (M. III). ch~vre (C. V).
HI. - - Activit6 i m m u n o l o y i q u e de Ces pr6parations TECHNIQUE :
Ces diff6rentes pr6parations ont 6t6 ~tudi6es, soit par la m6thode quantitative d$crite pr$cSdemment (r$sultats en unit~s arbitraires) soit par la mSthode d'inhibition de l'agglutination d$cl~te par Kabat (2). - - L e sSrum anti-A ou anti-B employ5 est dilu$ de maniSre •contenir 10 unitSs agglutinantes. (2) KASAT (E. A.) Blood Group Substances. Academic Press. New-York.
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LES S U B S T A N C E S DE GROUPES S A N G U I N S A ET B
On titre le s6rum vis h vis de globules rouges soit A1, soit B, apr~s avoir effectu6 des dilutions r6elles du s6rum h titrer. C h a q u e dilution 6tant faite p a r le m61ange de s6rum p u r et d ' e a u physiologique. -On p~se 20 mg de substance ~ titter que l'on dissout darts 20 m l d'eau physiologique. On obtient ainsi une dilution contenant 1 m g / m l . A p a r t i r de cette solution I on p r e p a r e u n e solution I I ~ t 100 t~g/ml, une solution I I [ h 10 ~g/ml, enfin une solution I V h 1/~g/ml. Le dosage est r4sum4 dans le T a b l e a u I L
TABLEAU I I
NUMEROTATION DES TUBES
2
3
0,1
0,1
II 0,5 50
0,7
Globules rouges A1 h 4 p. 100 . . . . . . 0,1
Anti-A, 10 unit6s agglutinantes . . . . . . Substance A : Solution . . . . . . . . Quantit6 en ml .. Quantit~ en #g/ml. Eau physlologique 0,9 g/p. 100 . . . . . .
0,1 I
5
6
7
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0,I
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
I! 0~255
II 0,1 10
III 0~5
III 0~25
III 011
IV 0,5 0,5
IV 0,25 0,2
IV 0,1 0,1
0,3
0,55
0,7
0,3
0,55
0,7
0,3
0,55
0,7
0,1
0~1
0,1
0,1
03
0,1
0,1
0,1
0,1
10
Le p o r t o i r de tubes est plac~ au bain-marie h 37°C p e n d a n t 60 minutes puis chaque t u b e est eentrifug6 "~ 1000 t / m p e n d a n t 1 m. L'agglutination est lue p a r agitation sur nn m i r o i r concave. La quantit6 de substance n$cessaire p o u r p r o d u i r e l'inhibition complete de 10 unit6s agglutinantes de s6rum anti-A p a r exemple perm e t t r a de c o m p a r e r l'activit$ inhibitrice de divers 6chantillons de substances de g r o u p e A. Les r6sultats de la r6action d'inhibition s o n t exprim$s dans le tableau I I I .
J.-M. FINE et R. A U D R A N 62 TABLEAU I I I
TUBES
1
Substance 5000 gg/ml A (CV) • 0 0 h (MIlI) 0 A (P IV) A (355) . 0 0 B (1.332)
2
3
4
5
6
2000 1000 500 100 50 0 0 0 0 0 o o o o 0 o o o o 0 o o o o 0 + + ++ ++ 0
7
8
25 + + o o ++
10 + + o o +++
9
5 ++ ++ o o +++
10
2 ++ ++ o + +++
11
12
13
14
1 0,5 0,2 0,1 ++++++++++++ ++++++++~-+++ + ++ +++ +++ ++ +++++++++ +++ +++ +++ +++
Conclusion P a r u n e m 6 t h o d e r e l a t i v e m e n t s i m p l e , nous avons p u p u r i f i e r d e s p o l y s a c c h a r i d e s de s u b s t a n c e s de g r o u p e s s a n g u i n s A et B dou6s d ' u n e a c t i v i t 6 i n h i b i t r i c e sp6cifique sur les a n t i - s 6 r u m s c o r r e s p o n d a n t s , l'$val u a t i o n d u p o u v o i r n e u t r a l i s a n t 6 t a n t r a p p o r t 6 ~ u n p o i d s connu. Ces p r 6 p a r a t i o n s peu,~ent n o u s p e r m e t t r e d ' u t i l i s e r d e u x de ce|les-ci (A 355 et B 1332) d e n t nous avons p u p r 6 p a r e r u n e q u a n t i t $ a p p r e c i a b l e cornm e r6fSrence d a n s n o t r e l a b o r a t o i r e , p o u r l'~valuati~)n q u a n t i t a t i v e d u p o u v o i r d e s$crStion s a l i v a i r e .