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Les tests de tropisme du VIH à l’heure de la mise à disposition du 1er anti-CCR5
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Médecine et maladies infectieuses 38 (2008) S7–S11
Les tests de tropisme du VIH à l’heure de la mise à disposition du 1erþanti-CCR5 HIV tropism assays when first CCR5-antagonist becomes available C.þSoulié, V.þCalvez* Laboratoire de Virologie, CERVI, Hôpital de la Pitié-Salpêtrière, 47-83 boulevard de l’hôpital, 75651 Paris cedex 13, France
Résumé Depuis la découverte des co-récepteurs du VIH, son tropisme est défini par le type de co-récepteur qu’il utilise pour infecter ses cellulesciblesþ: R5 pour les virus utilisant exclusivement CCR5, X4 pour les virus utilisant exclusivement CXCR4, et R5/X4 pour les virus capables d’utiliser les 2 co-récepteurs encore appelés à double tropisme. Les tests de tropisme actuellement plébiscités sont des tests phénotypiques recombinants, techniquement complexes, longs à réaliser et coûteux, dont la pratique est réservée à quelques laboratoires hautement qualifiés. Le développement de la nouvelle classe thérapeutique des inhibiteurs de CCR5, dont la prescription nécessite la connaissance préalable du tropisme des souches virales du patient, incite au développement de tests génotypiques, basés sur le séquençage de la boucle V3 de la glycoprotéine d’enveloppe gp120 (gène env) et son interprétation à l’aide d’un algorithme. Comme pour les tests de résistance il y a 10þans, ces tests génotypiques pourront plus facilement faire partie de la prise en charge habituelle des patients. Ils permettront à la fois la sélection des patients avant prescription d’un anti-CCR5, et le suivi des patients traités par cette classe d’antirétroviraux à la recherche d’un éventuel changement de tropisme sous traitement. ©2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Abstract Since its co-receptors were discovered, HIV tropism is defined by the type of co-receptor used to infect its host cellsþ: R5 for viruses using only CCR5, X4 for viruses using only CXCR4, and R5/X4 or dual for viruses using either CCR5 or CXCR4. Tropism prediction actually made is via recombinant phenotypic assays, which are labour-intensive, long-lasting and expensive, available in only a few highly qualified laboratories. Prescription of CCR5-antagonists requires screening for the presence of X4 variants before starting therapy. With development of this new class of antiretrovirals there is a need for genotypic tests, based on V3 loop gp120 env gene sequencing and its interpretation with an algorithm. As for resistance tests 10 years ago, these genotypic tests will be easier to introduce into routine clinical practice. These genotypic tropism assays will help to select patients before CCR5-antagonist prescription and to follow patients treated by this class of antiretrovirals, looking for a potential switch of tropism during therapy. ©2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Mots clésþ: CCR5þ; Co-récepteurþ; Inhibiteur de CCR5þ; Tropisme viralþ; VIH Keywords: CCR5; CCR5-inhibitor; Co-receptor; HIV; Viral tropism
* Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (V. Calvez)
© 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
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1. Introduction Le tropisme d’un isolat de VIH est défini par le type cellulaire dans lequel il est capable de répliquer in vitro. Cette définition a évolué avec le temps et la compréhension progressive des mécanismes moléculaires de l’interaction entre les protéines de l’enveloppe virale et les récepteurs membranaires des cellules-cibles du VIH, permettant l’entrée du virus dans ces cellules. Les tests de tropisme ont évolué parallèlement à la compréhension du phénotype viral. Une première définition a été basée sur les effets cytopathiques d’un isolat de VIH-1 en culture sur cellules sanguines mononuclées (Peripheral Blood Mononuclear Cell ou PBMC) humaines stimulées [1]. Les virus capables d’induire des syncitia (cellules géantes multinucléées) en culture sont nommés SI (pour syncitia-inducing) et les virus incapables d’induire cet effet cytopathogène NSI (pour non-syncitiainducing) [1]. Le taux et la vitesse de réplication sur PBMC ont permis d’établir une seconde classificationþ: les virus à multiplication lente/faible (SL pour slow/low) et les virus à multiplication rapide/élevée (RH pour rapid/high) [2]. Une troisième classification a été basée sur la capacité du virus à répliquer soit dans des macrophages dérivés de monocytes primaires humains (souches à tropisme macrophagique, Mtropiques) soit dans des lignées cellulaires T CD4+þ(souches à tropisme lymphocytaire T, T-tropiques) [3,4]. En 1996, deux principales protéines ont été identifiées comme étant indispensables, en plus des récepteurs CD4, à l’entrée du virus dans les cellules-ciblesþ: les co-récepteurs CCR5 (Chemokine CC motif Receptor 5) et CXCR4 (Chemokine CXC motif Receptor 4), dont le rôle physiologique est de reconnaître des chimiokines sécrétées par la cellule (MIP-1α, MIP-1β, Rantes, ligands naturels de CCR5 et SDF1, ligand naturel de CXCR4) [5-10]. Le co-récepteur CCR5, en plus du récepteur CD4, permet l’entrée dans les cellulescibles des virus NSI/M-tropiques, tandis que le co-récepteur CXCR4 a une fonction équivalente pour les souches SI/Ttropiques. Aujourd’hui, la nomenclature est simplifiéeþ: un virus capable d’utiliser CCR5 mais pas CXCR4 est appelé R5þ; un virus capable d’utiliser CXCR4 mais pas CCR5 est appelé X4þ; un virus capable d’utiliser l’un ou l’autre des 2 corécepteurs est appelé R5X4 ou à double tropisme [11]. La population virale existante chez un patient peut être un mélange hétérogène de virus à tropismes différents. Un échantillon plasmatique peut donc contenir à la fois des virus R5, X4 et/ou R5X4. Une population virale contenant des virus à tropisme R5 et X4, est dite à tropisme mixte. Les tests de tropisme sont incapables de faire la différence entre une population virale à tropisme mixte et à double tropisme. C’est pourquoi on utilise volontiers le terme de tropisme double/mixte pour désigner ces échantillons [12]. 2. Le test sur cellules MT-2 Ce test phénotypique est une mesure indirecte de l’utilisation des co-récepteurs. Il nécessite la préparation de stocks
de virus à partir des lymphocytes du patient préalablement stimulés par phytohémagglutinine ou anticorps anti-CD3. Ces stocks viraux sont ensuite titrés et utilisés pour infecter des cellules MT-2 en culture. Lorsque les co-récepteurs CXCR4 et CCR5 ont été découverts, Moore et collaborateurs [13] ont mis en évidence que les cellules MT2 exprimaient uniquement CXCR4 mais pas CCR5 à leur surface. Le phénotype SI sur cellules MT2 signifie donc que le virus est capable d’utiliser le co-récepteur CXCR4, et est de tropisme X4 ou R5X4. Les inconvénients de ce test sont l’utilisation de VIH issu de lymphocytes stimulés qui peut être sensiblement différent du virus plasmatique, le caractère qualitatif de l’interprétation du résultat (positif ou négatif), la seule détection des souches SI, l’interprétation subjective observateur dépendant de l’effet cytopathogène du virus [14,15], le temps et la complexité du déroulement de l’essai. Ce sont les raisons pour lesquelles il n’a jamais fait partie du suivi de routine des patients infectés par le VIH, au même titre que la charge virale plasmatique et le taux de lymphocytes CD4.
3. Les tests sur d’autres lignées cellulaires Des tests de tropisme utilisant des lignées cellulaires exprimant différents types de récepteurs à leur surface ont ensuite été développés, mais sont beaucoup moins utilisés. Les cellules GHOST, dérivées d’un ostéosarcome humain, expriment en surface le récepteur CD4 et différents récepteurs de chimiokines. L’un des inconvénients majeurs de cette lignée cellulaire est son faible niveau d’expression de CXCR4, avec risque de faux négatifs [12]. La plupart des tests de tropisme actuels utilisent des lignées cellulaires de gliome malin humain (U87, U373) modifiées pour exprimer CD4 et différents types de récepteurs de chimiokines à leur surface [16]. Ces cellules n’expriment pas naturellement CCR5 et CXCR4, d’où une très faible capacité à être infectées à leur état de base. Ces lignées cellulaires poussent en milieu solide, ce qui facilite les méthodes de détection par rapport aux milieux liquides. Elles sont bien adaptées à la croissance en culture, capables de supporter un fort taux de réplication virale, et peuvent maintenir de façon stable un haut niveau d’expression des différents récepteurs. L’un de leurs inconvénients est que leur niveau d’expression des récepteurs et co-récepteurs est largement supérieur à celui retrouvé sur les cellules-cibles naturelles du VIH.
4. Les tests phénotypiques recombinants Pour déterminer directement le tropisme du virus d’isolats cliniques, deux tests de type RVA (Recombinant Virus Assay)þ: Phenoscript™ (VIRalliance, Paris, France) [17] et Trofile™ (auparavant appelé PhenoSense™, Monogram
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Biosciences, San Francisco, États-Unis) [18] sont actuellement commercialisés. Les deux tests amplifient une séquence de l’enveloppe (env) à partir d’extraits d’ARN plasmatique des patients pour produire un virus. Ce virus sera ensuite testé pour sa capacité à entrer dans des cellules cibles qui expriment de façon stable le récepteur CD4 en combinaison avec CCR5 ou CXCR4. L‘entrée virale est mesurée par l’activation d’un gène rapporteur présent dans les cellules cibles (PhenoscriptTM) ou sur d’autres virus recombinants (TrofileTM) [12,17]. Une comparaison des principales caractéristiques de ces 2 tests est présentée dans le tableauþI.
Tableauþ1 Comparaison des principales caractéristiques des tests de tropisme du VIH Phenoscript™ et Trofile™ [12, 21] Table 1 Comparison of the main characteristics of the HIV tropism assays Phenoscript™ and Trofile™ [12, 21] Phenoscript™ VIRalliance (Paris, France)
Trofile™ Monogram Biosciences (San Francisco, États-Unis)
gp120 +þectodomaine de gp41 (environ 900 bp, contenant V1-V3)
Totalité de la gp160 (environ 2þ500 bp)
Vecteur
pNL43-ΔV
PCXAS-vecteur d’expression de l’enveloppe +þvecteur génomique VIH-luciférase
Stocks de virus
Capables de réplication
Défectifs pour la réplication
Construction du vecteur
Par recombinaison
Par enzymes de restriction
Cellules productrices
293T
293
Cellulescibles
U373-CD4-CCR5 et U373CD4-CXCR4 avec cassette VIH-1 LTR-lacZ
U87-CD4-CCR5 et U87-CD4-CXCR4
Gène reporter
β-galactosidase
Luciférase
Densité optique par test colorimétrique
RLU (relative light units)
Séquence amplifiée
Méthode de détection
La limite de détection du test Phenoscript™ est de l’ordre de 10 à 20þ% [19]. La sensibilité de l’amplification par RT-PCR pour le test Trofile™ est de 95þ% pour des charges virales ≥ 1000 copies/ml. La sensibilité de détection des populations minoritaires est de 100þ% de détection pour une population supérieure à 10þ% et de 85þ% pour une population de 5þ% [18,20]. La charge virale plasmatique minimale nécessaire à l’amplification des échantillons est de l’ordre de 1þ000 copies/ml. Dans
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l’étude de Skrabal et al. [21] comparant les résultats des deux tests sur 74 échantillons, la concordance est de 85,1þ%. C’est le test Trofile™ qui a été utilisé dans les essais de développement du maraviroc et des autres inhibiteurs de CCR5, ainsi que dans le programme d’accès précoce au maraviroc mis en place à la fois aux EtatsUnis et en Europe avant son autorisation de mise sur le marché. Il présente cependant deux inconvénients majeursþ: d’une part il n’est réalisé aujourd’hui que dans le laboratoire de la firme qui le commercialise aux Etats-Unis, ce qui nécessite le transport des échantillons outre-atlantiqueþ; d’autre part, comme tout test phénotypique, il est techniquement complexe et d’un coût élevé.
5. Le génotypage de la boucle V3 Pour éviter les contraintes à la fois techniques et économiques des tests phénotypiques, de nombreux laboratoires de virologie travaillent à l’élaboration ou à l’amélioration d’algorithmes permettant de prédire le tropisme d’une souche de VIH à partir du séquençage de son génome. Ce test génotypique permettrait donc d’établir un «þphénotype virtuelþ» de tropisme, au même titre que les tests génotypiques de résistance permettent de prédire le «þphénotype virtuelþ» de résistance. Les principaux déterminants du tropisme du VIH se situent dans la région hypervariable V3 de sa protéine d’enveloppe gp120. Selon une première règle, dite «þ11/25þ», les virus comportant des acides aminés chargés positivement (Lysine ou Arginine) en position 11 et 25 de la boucle V3 de la gp120 sont de tropisme X4 [22-24]. Plusieurs algorithmes génotypiques plus élaborés ont été établis pour prédire le phénotype SI/NSI ou R5/X4 à partir du séquençage de la boucle V3þ: matrice de score spécifique (PSSMþ: http://ubik.microbiol.washington.edu/computing/ pssm/) [25,26], support vector machine (Geno2phenoþ: httpþ: // coreceptor.bioinf.mpi-sb.mpg.de/cgi-bin/coreceptor.pl) [27]þ; http://genomiac2.ucsd.eduþ: 8080/wetcat/v3.html), réseaux neuronaux [28], arbre décisionnel [29]. Dans l’étude de Skrabal et al. [21] comparant les résultats obtenus avec les deux tests phénotypiques recombinants (Trofile™ et Phenoscript™) et ceux obtenus avec un algorithme d’interprétation (Geno2Pheno), la concordance génotype-phénotype était de 86,5þ% avec le test Trofile™, et de 79,7þ% avec le test Phenoscript™. Les avantages du test génotypique par rapport aux tests phénotypiques seront sa simplicité technique, sa rapidité, son faible coût et sa faisabilité. Il pourra être couplé avec la réalisation du génotype de résistance, sur le même prélèvement, réalisé dans les mêmes laboratoires de virologie, et rendu dans les mêmes délais, permettant ainsi l’entrée de la détermination du tropisme viral dans la prise en charge clinique de routine des patients infectés par le VIH.
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6. Tests de tropisme et prescription d’un inhibiteur de CCR5 La proportion de souches X4 ou R5X4 est non négligeable dans la population de patients porteurs du virus VIH-1, ce qui a été démontré dans deux cohortes de patients naïfs de traitement antirétroviral (19,9þ% et 18,2þ% respectivement dans les cohortes London et HOMER) [30,31], ainsi que chez des patients prétraités ayant une charge virale détectable [32]. De par leur mécanisme d’action par inhibition sélective du co-récepteur CCR5, les inhibiteurs de CCR5 ne sont efficaces que sur les virus R5, et non pas sur les virus X4 ni sur les virus R5/X4. Cela a été bien démontré pour le maraviroc à la fois in vitro [33] et lors d’une étude clinique réalisée chez 190 patients porteurs de virus R5X4, étude dans laquelle la baisse de charge virale dans les groupes traités par le maraviroc n’a pas été significativement supérieure à celle du groupe placebo [34]. L’indication du maraviroc, limitée aux patients porteurs de VIH-1 à tropisme exclusivement CCR5, et la prévalence des souches X4 ou R5X4 rendent nécessaires la réalisation d’un test de tropisme avant introduction d’un antirétroviral de la classe des inhibiteurs du CCR5. Ces tests seront également utiles pour surveiller l’évolution du tropisme viral sous traitement par anti-CCR5. Dans les essais cliniques de maraviroc, l’émergence de virus de souche X4 ou R5X4 a été observée [13,35,36]. En cas de changement de tropisme sous traitement, la poursuite de l’inhibiteur de CCR5 n’est pas recommandée. Au moment de la mise à disposition du maraviroc, seul le test phénotypique Trofile™ est exigé avant la mise sous traitement, avec les contraintes évoquées plus haut d’envoi des prélèvements dans un laboratoire aux Etats-Unis et de délai de rendu des résultats. De nombreuses équipes de recherche, dont les équipes françaises de l’Action Coordonnée 11 de l’Agence Nationale de Recherche contre le Sida (ANRS), travaillent activement à la validation d’un algorithme fiable de prédiction du tropisme à partir du séquençage de l’enveloppe virale. On peut ainsi espérer la mise à disposition rapide d’un test génotypique de tropisme de qualité, facilement réalisable par les laboratoires faisant aujourd’hui des tests génotypiques de résistance.
cela a été le cas il y a une dizaine d’années pour les tests de résistance, il est très probable qu’ils seront rapidement remplacés par des tests génotypiques avec interprétation par des algorithmes, plus simples, plus rapides et moins coûteux, pouvant être réalisés de paire avec le génotype de résistance dans les mêmes laboratoires de virologie. Conflits d'intérêts : C. Soulié n’a déclaré aucun conflit d’intérêt. V. Calvez intervient comme membre de comités scientifiques et comme orateur pour les laboratoires GSK, BMS, Gilead Sciences, Abbott, MSD, Pfizer, Tibotec.
Référence [1]
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7. Conclusion [10] er
À l’heure de la mise à disposition du 1 þinhibiteur de CCR5, le maraviroc, il est important de disposer de tests de tropisme du VIH fiables et accessibles, afin de pouvoir sélectionner les patients susceptibles de bénéficier de ce type de traitement d’une part, et de pouvoir surveiller la survenue éventuelle d’un changement de tropisme sous traitement d’autre part. Les tests phénotypiques recombinants actuellement disponibles ont l’inconvénient d’être techniquement complexes, longs à réaliser et coûteux. Comme
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Médecine et maladies infectieuses 38 (2008) S7–S11
Les tests de tropisme du VIH à l’heure de la mise à disposition du 1erþanti-CCR5 HIV tropism assays when first CCR5-antagonist becomes available C.þSoulié, V.þCalvez* Laboratoire de Virologie, CERVI, Hôpital de la Pitié-Salpêtrière, 47-83 boulevard de l’hôpital, 75651 Paris cedex 13, France
Résumé Depuis la découverte des co-récepteurs du VIH, son tropisme est défini par le type de co-récepteur qu’il utilise pour infecter ses cellulesciblesþ: R5 pour les virus utilisant exclusivement CCR5, X4 pour les virus utilisant exclusivement CXCR4, et R5/X4 pour les virus capables d’utiliser les 2 co-récepteurs encore appelés à double tropisme. Les tests de tropisme actuellement plébiscités sont des tests phénotypiques recombinants, techniquement complexes, longs à réaliser et coûteux, dont la pratique est réservée à quelques laboratoires hautement qualifiés. Le développement de la nouvelle classe thérapeutique des inhibiteurs de CCR5, dont la prescription nécessite la connaissance préalable du tropisme des souches virales du patient, incite au développement de tests génotypiques, basés sur le séquençage de la boucle V3 de la glycoprotéine d’enveloppe gp120 (gène env) et son interprétation à l’aide d’un algorithme. Comme pour les tests de résistance il y a 10þans, ces tests génotypiques pourront plus facilement faire partie de la prise en charge habituelle des patients. Ils permettront à la fois la sélection des patients avant prescription d’un anti-CCR5, et le suivi des patients traités par cette classe d’antirétroviraux à la recherche d’un éventuel changement de tropisme sous traitement. ©2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Abstract Since its co-receptors were discovered, HIV tropism is defined by the type of co-receptor used to infect its host cellsþ: R5 for viruses using only CCR5, X4 for viruses using only CXCR4, and R5/X4 or dual for viruses using either CCR5 or CXCR4. Tropism prediction actually made is via recombinant phenotypic assays, which are labour-intensive, long-lasting and expensive, available in only a few highly qualified laboratories. Prescription of CCR5-antagonists requires screening for the presence of X4 variants before starting therapy. With development of this new class of antiretrovirals there is a need for genotypic tests, based on V3 loop gp120 env gene sequencing and its interpretation with an algorithm. As for resistance tests 10 years ago, these genotypic tests will be easier to introduce into routine clinical practice. These genotypic tropism assays will help to select patients before CCR5-antagonist prescription and to follow patients treated by this class of antiretrovirals, looking for a potential switch of tropism during therapy. ©2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Mots clésþ: CCR5þ; Co-récepteurþ; Inhibiteur de CCR5þ; Tropisme viralþ; VIH Keywords: CCR5; CCR5-inhibitor; Co-receptor; HIV; Viral tropism
* Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (V. Calvez)
© 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
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1. Introduction Le tropisme d’un isolat de VIH est défini par le type cellulaire dans lequel il est capable de répliquer in vitro. Cette définition a évolué avec le temps et la compréhension progressive des mécanismes moléculaires de l’interaction entre les protéines de l’enveloppe virale et les récepteurs membranaires des cellules-cibles du VIH, permettant l’entrée du virus dans ces cellules. Les tests de tropisme ont évolué parallèlement à la compréhension du phénotype viral. Une première définition a été basée sur les effets cytopathiques d’un isolat de VIH-1 en culture sur cellules sanguines mononuclées (Peripheral Blood Mononuclear Cell ou PBMC) humaines stimulées [1]. Les virus capables d’induire des syncitia (cellules géantes multinucléées) en culture sont nommés SI (pour syncitia-inducing) et les virus incapables d’induire cet effet cytopathogène NSI (pour non-syncitiainducing) [1]. Le taux et la vitesse de réplication sur PBMC ont permis d’établir une seconde classificationþ: les virus à multiplication lente/faible (SL pour slow/low) et les virus à multiplication rapide/élevée (RH pour rapid/high) [2]. Une troisième classification a été basée sur la capacité du virus à répliquer soit dans des macrophages dérivés de monocytes primaires humains (souches à tropisme macrophagique, Mtropiques) soit dans des lignées cellulaires T CD4+þ(souches à tropisme lymphocytaire T, T-tropiques) [3,4]. En 1996, deux principales protéines ont été identifiées comme étant indispensables, en plus des récepteurs CD4, à l’entrée du virus dans les cellules-ciblesþ: les co-récepteurs CCR5 (Chemokine CC motif Receptor 5) et CXCR4 (Chemokine CXC motif Receptor 4), dont le rôle physiologique est de reconnaître des chimiokines sécrétées par la cellule (MIP-1α, MIP-1β, Rantes, ligands naturels de CCR5 et SDF1, ligand naturel de CXCR4) [5-10]. Le co-récepteur CCR5, en plus du récepteur CD4, permet l’entrée dans les cellulescibles des virus NSI/M-tropiques, tandis que le co-récepteur CXCR4 a une fonction équivalente pour les souches SI/Ttropiques. Aujourd’hui, la nomenclature est simplifiéeþ: un virus capable d’utiliser CCR5 mais pas CXCR4 est appelé R5þ; un virus capable d’utiliser CXCR4 mais pas CCR5 est appelé X4þ; un virus capable d’utiliser l’un ou l’autre des 2 corécepteurs est appelé R5X4 ou à double tropisme [11]. La population virale existante chez un patient peut être un mélange hétérogène de virus à tropismes différents. Un échantillon plasmatique peut donc contenir à la fois des virus R5, X4 et/ou R5X4. Une population virale contenant des virus à tropisme R5 et X4, est dite à tropisme mixte. Les tests de tropisme sont incapables de faire la différence entre une population virale à tropisme mixte et à double tropisme. C’est pourquoi on utilise volontiers le terme de tropisme double/mixte pour désigner ces échantillons [12]. 2. Le test sur cellules MT-2 Ce test phénotypique est une mesure indirecte de l’utilisation des co-récepteurs. Il nécessite la préparation de stocks
de virus à partir des lymphocytes du patient préalablement stimulés par phytohémagglutinine ou anticorps anti-CD3. Ces stocks viraux sont ensuite titrés et utilisés pour infecter des cellules MT-2 en culture. Lorsque les co-récepteurs CXCR4 et CCR5 ont été découverts, Moore et collaborateurs [13] ont mis en évidence que les cellules MT2 exprimaient uniquement CXCR4 mais pas CCR5 à leur surface. Le phénotype SI sur cellules MT2 signifie donc que le virus est capable d’utiliser le co-récepteur CXCR4, et est de tropisme X4 ou R5X4. Les inconvénients de ce test sont l’utilisation de VIH issu de lymphocytes stimulés qui peut être sensiblement différent du virus plasmatique, le caractère qualitatif de l’interprétation du résultat (positif ou négatif), la seule détection des souches SI, l’interprétation subjective observateur dépendant de l’effet cytopathogène du virus [14,15], le temps et la complexité du déroulement de l’essai. Ce sont les raisons pour lesquelles il n’a jamais fait partie du suivi de routine des patients infectés par le VIH, au même titre que la charge virale plasmatique et le taux de lymphocytes CD4.
3. Les tests sur d’autres lignées cellulaires Des tests de tropisme utilisant des lignées cellulaires exprimant différents types de récepteurs à leur surface ont ensuite été développés, mais sont beaucoup moins utilisés. Les cellules GHOST, dérivées d’un ostéosarcome humain, expriment en surface le récepteur CD4 et différents récepteurs de chimiokines. L’un des inconvénients majeurs de cette lignée cellulaire est son faible niveau d’expression de CXCR4, avec risque de faux négatifs [12]. La plupart des tests de tropisme actuels utilisent des lignées cellulaires de gliome malin humain (U87, U373) modifiées pour exprimer CD4 et différents types de récepteurs de chimiokines à leur surface [16]. Ces cellules n’expriment pas naturellement CCR5 et CXCR4, d’où une très faible capacité à être infectées à leur état de base. Ces lignées cellulaires poussent en milieu solide, ce qui facilite les méthodes de détection par rapport aux milieux liquides. Elles sont bien adaptées à la croissance en culture, capables de supporter un fort taux de réplication virale, et peuvent maintenir de façon stable un haut niveau d’expression des différents récepteurs. L’un de leurs inconvénients est que leur niveau d’expression des récepteurs et co-récepteurs est largement supérieur à celui retrouvé sur les cellules-cibles naturelles du VIH.
4. Les tests phénotypiques recombinants Pour déterminer directement le tropisme du virus d’isolats cliniques, deux tests de type RVA (Recombinant Virus Assay)þ: Phenoscript™ (VIRalliance, Paris, France) [17] et Trofile™ (auparavant appelé PhenoSense™, Monogram
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Biosciences, San Francisco, États-Unis) [18] sont actuellement commercialisés. Les deux tests amplifient une séquence de l’enveloppe (env) à partir d’extraits d’ARN plasmatique des patients pour produire un virus. Ce virus sera ensuite testé pour sa capacité à entrer dans des cellules cibles qui expriment de façon stable le récepteur CD4 en combinaison avec CCR5 ou CXCR4. L‘entrée virale est mesurée par l’activation d’un gène rapporteur présent dans les cellules cibles (PhenoscriptTM) ou sur d’autres virus recombinants (TrofileTM) [12,17]. Une comparaison des principales caractéristiques de ces 2 tests est présentée dans le tableauþI.
Tableauþ1 Comparaison des principales caractéristiques des tests de tropisme du VIH Phenoscript™ et Trofile™ [12, 21] Table 1 Comparison of the main characteristics of the HIV tropism assays Phenoscript™ and Trofile™ [12, 21] Phenoscript™ VIRalliance (Paris, France)
Trofile™ Monogram Biosciences (San Francisco, États-Unis)
gp120 +þectodomaine de gp41 (environ 900 bp, contenant V1-V3)
Totalité de la gp160 (environ 2þ500 bp)
Vecteur
pNL43-ΔV
PCXAS-vecteur d’expression de l’enveloppe +þvecteur génomique VIH-luciférase
Stocks de virus
Capables de réplication
Défectifs pour la réplication
Construction du vecteur
Par recombinaison
Par enzymes de restriction
Cellules productrices
293T
293
Cellulescibles
U373-CD4-CCR5 et U373CD4-CXCR4 avec cassette VIH-1 LTR-lacZ
U87-CD4-CCR5 et U87-CD4-CXCR4
Gène reporter
β-galactosidase
Luciférase
Densité optique par test colorimétrique
RLU (relative light units)
Séquence amplifiée
Méthode de détection
La limite de détection du test Phenoscript™ est de l’ordre de 10 à 20þ% [19]. La sensibilité de l’amplification par RT-PCR pour le test Trofile™ est de 95þ% pour des charges virales ≥ 1000 copies/ml. La sensibilité de détection des populations minoritaires est de 100þ% de détection pour une population supérieure à 10þ% et de 85þ% pour une population de 5þ% [18,20]. La charge virale plasmatique minimale nécessaire à l’amplification des échantillons est de l’ordre de 1þ000 copies/ml. Dans
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l’étude de Skrabal et al. [21] comparant les résultats des deux tests sur 74 échantillons, la concordance est de 85,1þ%. C’est le test Trofile™ qui a été utilisé dans les essais de développement du maraviroc et des autres inhibiteurs de CCR5, ainsi que dans le programme d’accès précoce au maraviroc mis en place à la fois aux EtatsUnis et en Europe avant son autorisation de mise sur le marché. Il présente cependant deux inconvénients majeursþ: d’une part il n’est réalisé aujourd’hui que dans le laboratoire de la firme qui le commercialise aux Etats-Unis, ce qui nécessite le transport des échantillons outre-atlantiqueþ; d’autre part, comme tout test phénotypique, il est techniquement complexe et d’un coût élevé.
5. Le génotypage de la boucle V3 Pour éviter les contraintes à la fois techniques et économiques des tests phénotypiques, de nombreux laboratoires de virologie travaillent à l’élaboration ou à l’amélioration d’algorithmes permettant de prédire le tropisme d’une souche de VIH à partir du séquençage de son génome. Ce test génotypique permettrait donc d’établir un «þphénotype virtuelþ» de tropisme, au même titre que les tests génotypiques de résistance permettent de prédire le «þphénotype virtuelþ» de résistance. Les principaux déterminants du tropisme du VIH se situent dans la région hypervariable V3 de sa protéine d’enveloppe gp120. Selon une première règle, dite «þ11/25þ», les virus comportant des acides aminés chargés positivement (Lysine ou Arginine) en position 11 et 25 de la boucle V3 de la gp120 sont de tropisme X4 [22-24]. Plusieurs algorithmes génotypiques plus élaborés ont été établis pour prédire le phénotype SI/NSI ou R5/X4 à partir du séquençage de la boucle V3þ: matrice de score spécifique (PSSMþ: http://ubik.microbiol.washington.edu/computing/ pssm/) [25,26], support vector machine (Geno2phenoþ: httpþ: // coreceptor.bioinf.mpi-sb.mpg.de/cgi-bin/coreceptor.pl) [27]þ; http://genomiac2.ucsd.eduþ: 8080/wetcat/v3.html), réseaux neuronaux [28], arbre décisionnel [29]. Dans l’étude de Skrabal et al. [21] comparant les résultats obtenus avec les deux tests phénotypiques recombinants (Trofile™ et Phenoscript™) et ceux obtenus avec un algorithme d’interprétation (Geno2Pheno), la concordance génotype-phénotype était de 86,5þ% avec le test Trofile™, et de 79,7þ% avec le test Phenoscript™. Les avantages du test génotypique par rapport aux tests phénotypiques seront sa simplicité technique, sa rapidité, son faible coût et sa faisabilité. Il pourra être couplé avec la réalisation du génotype de résistance, sur le même prélèvement, réalisé dans les mêmes laboratoires de virologie, et rendu dans les mêmes délais, permettant ainsi l’entrée de la détermination du tropisme viral dans la prise en charge clinique de routine des patients infectés par le VIH.
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6. Tests de tropisme et prescription d’un inhibiteur de CCR5 La proportion de souches X4 ou R5X4 est non négligeable dans la population de patients porteurs du virus VIH-1, ce qui a été démontré dans deux cohortes de patients naïfs de traitement antirétroviral (19,9þ% et 18,2þ% respectivement dans les cohortes London et HOMER) [30,31], ainsi que chez des patients prétraités ayant une charge virale détectable [32]. De par leur mécanisme d’action par inhibition sélective du co-récepteur CCR5, les inhibiteurs de CCR5 ne sont efficaces que sur les virus R5, et non pas sur les virus X4 ni sur les virus R5/X4. Cela a été bien démontré pour le maraviroc à la fois in vitro [33] et lors d’une étude clinique réalisée chez 190 patients porteurs de virus R5X4, étude dans laquelle la baisse de charge virale dans les groupes traités par le maraviroc n’a pas été significativement supérieure à celle du groupe placebo [34]. L’indication du maraviroc, limitée aux patients porteurs de VIH-1 à tropisme exclusivement CCR5, et la prévalence des souches X4 ou R5X4 rendent nécessaires la réalisation d’un test de tropisme avant introduction d’un antirétroviral de la classe des inhibiteurs du CCR5. Ces tests seront également utiles pour surveiller l’évolution du tropisme viral sous traitement par anti-CCR5. Dans les essais cliniques de maraviroc, l’émergence de virus de souche X4 ou R5X4 a été observée [13,35,36]. En cas de changement de tropisme sous traitement, la poursuite de l’inhibiteur de CCR5 n’est pas recommandée. Au moment de la mise à disposition du maraviroc, seul le test phénotypique Trofile™ est exigé avant la mise sous traitement, avec les contraintes évoquées plus haut d’envoi des prélèvements dans un laboratoire aux Etats-Unis et de délai de rendu des résultats. De nombreuses équipes de recherche, dont les équipes françaises de l’Action Coordonnée 11 de l’Agence Nationale de Recherche contre le Sida (ANRS), travaillent activement à la validation d’un algorithme fiable de prédiction du tropisme à partir du séquençage de l’enveloppe virale. On peut ainsi espérer la mise à disposition rapide d’un test génotypique de tropisme de qualité, facilement réalisable par les laboratoires faisant aujourd’hui des tests génotypiques de résistance.
cela a été le cas il y a une dizaine d’années pour les tests de résistance, il est très probable qu’ils seront rapidement remplacés par des tests génotypiques avec interprétation par des algorithmes, plus simples, plus rapides et moins coûteux, pouvant être réalisés de paire avec le génotype de résistance dans les mêmes laboratoires de virologie. Conflits d'intérêts : C. Soulié n’a déclaré aucun conflit d’intérêt. V. Calvez intervient comme membre de comités scientifiques et comme orateur pour les laboratoires GSK, BMS, Gilead Sciences, Abbott, MSD, Pfizer, Tibotec.
Référence [1]
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7. Conclusion [10] er
À l’heure de la mise à disposition du 1 þinhibiteur de CCR5, le maraviroc, il est important de disposer de tests de tropisme du VIH fiables et accessibles, afin de pouvoir sélectionner les patients susceptibles de bénéficier de ce type de traitement d’une part, et de pouvoir surveiller la survenue éventuelle d’un changement de tropisme sous traitement d’autre part. Les tests phénotypiques recombinants actuellement disponibles ont l’inconvénient d’être techniquement complexes, longs à réaliser et coûteux. Comme
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