Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungenan Polystictus versicolor1)

Flora, Bd. 150, Heft 2/3 (Aus dem Institut fiir Mikrobiologie und experimentelle Therapie Jena der Deutschen Akademio der Wissenschaften zu Berlin) .

Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen an Polystictus versicolor!) V. Zur Frage der Kernfarbung mit Eisen-Hamatoxylin Von

Manfred Girbardt Mit 19 Abbildungen im Text (Eingegangen am 17. November 1960)

Einleitung

In den meisten pilzkaryologischen Arbeiten ist entweder ausschlie13lich oder zumindest teilweise mit der Eisenhamatoxylinfarbung nach HEIDENHAIN gearbeitet worden. Um einen sinnvollen AnschluB an die Ergebnisse alterer Autoren zu erreichen, ist es vorteilhaft, diese Methode trotz ihrer seit langem bekannten Unspezifitat zumindest fUr Vergleichszwecke anzuwenden; Die Hamatoxylinfarbung bei Pilzen muBte einer eingehenden Analyse unterzogen werden, da die Befunde von ROBINOW (1957 a und b) am Interphasekern von Mucor hiemalis zeigen, daB weder Kernmembran noch Chromatin mit dieser Methode darstellbar sind. Es besteht daher die Gefahr, bei kritikloser Beurteilung des cytologischen Bildes den groBen, haufig sogar strukturierten Nucleolus als eigentlichen Kern anzusehen. BAKERSPIGEL (1959a und b) bestatigt die Befunde von ROBIN ow an Gelasinospora tetrasperma und Neurospora crassa. Auch in den Kernen von Schizophyllum commune ist nach BAKERSPIGEL (1959 c) nur der Nucleolus mit Hamatoxylin tingierbar. Diese Ergebnisse zeigen, daB wahrscheinlich nicht objektbedingte Eigenheiten fUr das farberische Verhalten verantwortlich zu machen sind. ROBINOW (1957 a) halt es fUr moglich, daB die Farbeergebnisse darauf hindeuten, daB in den Pilzkernen eine besondere Art von Chromatin vermutet werden darf. Dieses vielleicht auch in der Histon-Komponente vom normalen abweichende Chromatin ist identifizierbar mit Hilfe des Feulgen-Testes, laBt sich jedoch nicht mit Eisen-Hamatoxylin anfarben. Die photographisch gut belegten Beobachtungen stehen im Widerspruch zu den Ergebnissen vieler alterer Autoren sowie denen, die fUr Polystictus versicolor (GIRHerrn Prof. Dr. K.

MOTHES

zum 60. Geburtstag in Ehrerbietung gewidmet

428

MANFRED GIRBARDT

BARDT 1955) berichtet wurden. Es muBte daher versucht werden, die Grtinde flir die unterschiedlichen Farbeergebnisse zu finden. Methodisches Die HEIDENHAINsche Eisenhamatoxylin-Farbung wird in der iiblichen Weise (ROMEIS 1948) an Objekttrager-Kulturen durchgefiihrt. Der Agarfilm braucht nicht entfernt zu werden, da der in ihm gebildete Farblack bei der Differenzierung zuerst verschwindet, so daB saubere Zellfarbungen zu erreichen sind. Die vorbereitenden Prozeduren (Wasserung, Beizung) miissen moglichst steril erfolgen, da die Nahrbodenfilme sonst leicht von Bakterien und Hefen besiedelt werden, die den Farbstoff in kurzer Zeit unbrauchbar machen. Fiir Fixierungen bei unterschiedlichem pH-Wert werden die Fixantien (2%ige OS04' 2%ige K 2 Cr 2 0?, 6%iges Formol und gesattigte Sublimatlosung) mit Pufferlosungen nach MICHAELIS (RAUEN 1956) im Verhaltnis 1: 1 verdiinnt. Das anschlieBende Wassern erfolgt entweder in den Pufferlosungen mit entsprechendem PH-Wert oder in Aqua dest. Das Farbeergebnis ist durch die Wasserung nicht beeinfluBbar. Die iibrigen methodischen und photographischen Daten sind bei GIRBARDT (1960) angegeben.

Vorversuche

a) Farbstoff: Geprtift werden 3 Hamatoxyline verschiedener Herkunft und eine gebrauchsfertige FarblOsung (GRUBLER). Nach gleichbleibender Fixierung (CHAMPY) ist das Farbebild in allen 3 FarblOsungen tibereinstimmend. b) Eisenalaun: Die zur Herstellung der Beize benutzten Chemikalien unterscheiden sich im auBeren Aussehen. Verwitterte, gelbliche Kristalle sollen (HEIDENHAIN 1896) unbrauchbar sein. Bei Polystictus versicolor ist die Kernfarbung auch nach Beizung mit Losungen verwitterter Alaunkristalle moglich. Sie ist jedoch besser, wenn frisch auskristallisiertes Ferriammoniumsulfat verwendet wird. Bei Gebrauch alterer Kristalle tritt leicht eine Trtibung des gesamten Praparates auf, die von einem kolloidalen Niederschlag auf dem Agarfilm herzurtihren scheint. c) Reifung des Farbstoffes: Da die Gtite der Anfarbung vom "Reifegrad" des Hamatoxylins, d. h. seiner oxydativen Umwandlung in Hamatein abhiingig ist, werden die Praparate in frisch angesetzter, 14, 30, 60 und 120 Tage alter "nattirlich" gereifter und in 4 sowie 12 Tage alter, mit NaJO a gereifter HamatoxylinlOsung gefarbt. Die frisch angesetzte FarblOsung tingiert kaum und ist daher unbrauchbar. Mit allen anderen Losungen ist die Farbung einwandfrei durchflihrbar. In keinem FaIle tritt unterschiedliche Farbung der Kernkomponenten auf. d) Farbedauer: Die Praparate werden 1-48 Std. gefarbt. Bei kurzen Farbezeiten (bis 4 Std.) ist eine Differenzierung sehr schwierig, da der gebildete Farblack fast gleichzeitig von allen gefarbten Strukturen entfernt wird. Liegen die Farbezeiten tiber 12 Std., ist eine einwandfreie Differenzierung verschiedener Zellkomponenten durchflihrbar. e) Differenzierung: Wie zu erwarten, zeigt sich die Differenzierungszeit als der am schwierigsten zu handhabende Faktor. Da im basophilen Cytoplasm a auch starke

Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen an Polystictus versicolor

429

Farblackbildung auftritt, sind die Kerne bei zu kurzer Differenzierung nicht zu sehen. Wird die Differenzierung dagegen zu lange ausgedehnt, so bleibt schlieLHich nur der Nucleolus angefarbt. Die mikroskopische Kontrolle des Differenzierungsprozesses gibt die einzige Gewahr, den AuJ3enkern, falls er gefarbt ist, auch einwandfrei erkennen zu konnen. Es darf angenommen werden, daJ3 die eingangs erwahnten unterschiedlichen Farbeergebnisse am Pilzkern nicht auf technische Unzulanglichkeit zuruckgefUhrt werden durfen. Bei Untersuchung einer groJ3eren Anzahl von Praparaten wird selbst bei routinemaJ3iger Massendifferenzierung zumindest gelegentlich die optimale Differenzierungszeit erhalten.

Der Einflu8 der Fixierung Es liegen zahlreiche Untersuchungen an verschiedenen Objekten vor, die zeigen, daB nicht nur der Erhaltungszustand der Zellstrukturen (vgl. WOLMAN 1955), sondern auch die Fiirbung der Zelle weitgehend von der Art des Fixierungsmittels abhiingig ist. RITCHIE (1941) kann an Hand umfangreicher Fixierungsserien zeigen, daB die HEIDENHAINsche Kernfiirbung in den Basidien von Russula emetica sehr variabel ist. Es gelingt dabei sogar, nach Fixierung mit Ameisensiiure-Acetaldehyd, den Nucleolus ungefiirbt zu lassen, wiihrend das Chromatin angefiirbt ist. SASS (1928) kommt bei 1 Psalliota campestris zu iihnlichen Ergebnissen. Besonders dem pH-Wert des Fixierungsmittels wird eine entscheidende Rolle zugeschrieben (YAMAHA 1925). Das saure "Fixierungsbild" (ZIRKLE 1928), das nach Fixierungen unter pH 2 4,2 sichtbar wird, unterscheidet sich deutlich vom "basischen Erscheinungsbild". ZIRKLE (1928, 1929) findet, daB der kritische Bereich fiir zahlreiche Objekte zwischen pH 4,2 und pH 5,2 liegt. In ihm schliigt das "saure" ins "basische" Erscheinungsbild um. Besonders die Eisenhiimatoxylinfiirbung wird von der Fixie3 rungsart abhiingig gefunden (NAYLOR 1926).

Es erscheint daher geboten, im Fixierungsmittel einen entscheidenden Faktor fUr den Ausfall der Hamatoxylinfarbung zu suchen. Die an Polystictus versicolor durchgefUhrten Fixierungsserien verfolgen auJ3erdem den Zweck, das AusmaJ3 der Artefaktbildung moglichst genau abzuschatzen, urn spater die Bilder der fixierten Kernteilungsstadien vergleichend werten zu konnen. Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in Tabelle 1 zusammengefaJ3t. Nach dem Farbebild des Interphasekernes von Polystictus versicolor lassen sich die Fixantien in 3 Gruppen einteilen. Die der Gruppe I gestatten eine Anfarbung von AuJ3enkern und Nucleolus (Ab b.1-4).

4 Abb. 1-4. Polystictus versicolor, Interphasekerne. Fiirbung: Eisenhiimatoxylin. AuBenkern und Nucleolus sind tingiert bei Fixierungnach Champy (Abb.1), Orth . (Abb. 2), Erlicki (Abb. 3) und Methanol (Abb.4). - VergriiBerung 3000: 1. Hellfeld.

430

MANFRED GIRBARDT

Bei Anwendung von Fixierungsmitteln der Gruppe II umgibt der formgetreu erhaltene Au.Benkern als unstrukturierter (Abb.5) oder mit fadigen Strukturen (Abb. 6, 7) durchsetzter Hof den deutlich gefarbten Nucleolus. Abb. 8 bildet bereits den Ubergang zur nachsten Gruppe. In dieser (Gruppe III) sind solche Fixantien vereinigt, die in der Zelle nur den Nucleolus zu erhalten scheinen (Abb. 9-12). Das Kernkiirperchen. erweckt den Eindruck, als lage es unmittelbar im Cytoplasma. Kleine helle Hiife (Abb. 11, 12), die ihn gelegentlich umgeben, miissen als Schrumpfungsartefakte gedeutet werden (KNIEP 1915), da sie nach ihrer Form nicht dem Au.Bcnkern entsprechen. Die phasenoptische U ntersuchung un g ehr b t er, nach verschiedenen Methoden fixierter Hyphen gibt die gleichen Bilder, wie nach Hamatoxylinfarbung. Der Au.Benkern ist phasenoptisch dicht und homogen nach CHAMPY-Fixierung (Abb. 13). Nach Einwirkungen von Fixantien der Farbegruppe II ist er etwas weniger dicht als das umgebendc Cytoplasm a (NAWASHIN, Abb. 14) und erscheint aufgehellt. Nach BOUIN-

5

9

6

10

7

11

8 Abb.0-8

12 Abb.9-12

Abb. 5-8. Polys/ictus versicolor, Interphasekerne. Fiirbung: Eisenhiimatoxylin. Der gut angefiirbte Nucleolus liegt im weitgehend ungefiirbten AuBenkernraum bei Fixierung nach HELLY (Abb. 0), TELLYESNYCZKI (Abb. 6), ALLEN (Abb. 7), REGAUD (Abb. 8). VergroBerung: 3000: 1. Hellfeld. Abb. 9-12. Polystictus versicolor, Interphasekerne. Fiirbung: Eisenhiimatoxylin. Der AuBenkern ist nicht tingiert, die Nucleolen scheinen unmittelbar im Cytoplasma zu liegen. Fixierung mit Formol (Abb. 9), nach HEIDENHAIN (Abb. 10), STIEVE (Abb. 11) und BourN (Abb. 12). - VergroBerung: 3000: 1. HeUfeld.

Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen an ~olystictus versicolor

+31

Fixierung (Farbegruppe III) ist auch phasenoptisch nur der stark strukturierte Nucleolus nachweisbar (Abb. 15). 13 Die Einordnung der gefarbten Kerne in die verschiedenen Gruppen fiillt haufig nicht leicht. Das subjektive Moment kann nicht ausgeschaltet werden. Besonders fiir die Beurteilung, 14 ob ein heller Schrumpfungshof oder nicht tingierter AuBenkern vorliegt, muB die genaue Kenntnis des Lebendbildes vorausgesetzt werden. Andererseits sind bei man chen Fixierungsmitteln, die Plasmoptysen der Zellen 15 Abb. 13-15. Polystictus versicolor, Interphasekerne, hervorrufen (vgl. Tabelle 1, Spalte 18) nur wenige Kerne eindeutig zu idenohne Farbung, Fixierung nach CUA}IPY (Abb. 13), NAWASHIX (Abb.14) und BOLIN (Abb.15). Phasentifizieren. Es kommt auch vor, daB bei kontrast; VergriiBerung: 3000: 1. gleicher Fixierung einige Kerne yom iiberwiegend vertretenen Habitus abweichen und in eine andere Gruppe einzuordnen waren. Dies ist vor allem nach Fixierungen der Gruppe II und III der Fall. Die getroffene Gruppierung bezieht sich daher auf den im Praparat vorherrschenden Farbetyp. Die Angaben iiber den Erhaltungszustand des Cytoplasmas nach Einwirkung der verschiedenen Fixierungen sind in den Spalten 16 und 17 (TabeUe 1) zusammengefaBt. Die Spalte 19 (Tabelle 1) enthalt Hinweise auf entsprechende Abbildungen, so daB sich eine nahere Charakterisierung der gewahlten Begriffe (homogen, feinkiirnig usw.) eriibrigt. Die lebensahnliche Konservierung der Chondriosomen (Spalte 17) ist an den fiidigen Formen der Subterminalen getestet worden.

Die Wirkungsart komplex zusammengesetzter Fixierungsmittel ist schwer iiberschaubar. Das Bild der fixierten Zelle andert sich oft, wenn das Fixantium nur wenig verandert wird. Dies gilt im besonderen MaBe fUr die Substrukturen, auBert sich jedoch auch in den lichtoptisch faBbaren Dimensionen. So andert bereits der Zusatz von Natriumsulfat zu sonst gleichen Fixierungsmitteln das Farbebild (Tabelle 1, Nr. 4 und 12) . .A.hnliches gilt, wenn Trichloressigsaure zugesetzt wird (Tabelle 1, Nr. 24, 25 und 33). Es ist daher auch nicht zu erwarten, daB sich die unterschiedlichen Farbebilder eindeutig auf die verschiedenen Konstituenten der Fixantien zuriickfUhren lassen. Jedoch zeichnen sich einige Gesichtspunkte ab, die an Hand der Tabelle 1 dargestellt werden sollen. a) Die Chrom-Osmium-Verbindungen miissen im wesentlichen flir den Farbetyp I.verantwortlich gemacht werden. Bis auf eine Ausnahme (Tabelle 1, Nr. 6) enthalten aIle Fixantien der Farbegruppe I diese Verbindungen. b) Enthalten die Fixierungsmittel auBer den unter a) genannten Verbindungen noch Essigsaure, so wirkt diese bestimmend auf das Bild, es erseheint Farbetyp 2. Flora, Band 150

28

432

:\L","XFRED GIRBARDT Tabelle 1

Chemische Zusammensetzung der angewandten Fixierungsgemische, geordnet nach den Farbebildern des Interphasekernes von Polystictus versicolor. Definition der "Farbegruppen" s. Text. In Spalte 16-18 ist der Erhaltungszustand von Cytoplasma und Chondriosomen angegeben.

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grobkiirnig feinkiirnig feinkiirnig feinkiirnig grobkiirnig fadigkiirnig grobkiirnig feinkiirnig geklumpt grobkiirnig grobkiirnig geklumpt geklumpt geklumpt feinkiirnig feinkiirnig schollig schollig geklumpt grobkiirnig

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Abb. 1, 13

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+Abb.2

-1-- -1-- Abb.3 -I-I-I-I-I-

Abb.4

Abb. H -I- 2g Harnstoff, Abb.7

-1-Abb.8 Abb.6

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Abb.5

433

Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen an Polystictlls yprsicolor

1

2

3

4

5

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9 10 11 12 13 14 15

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i=Q

Abb.9 Abb. 10 Abb.11

Abb. 12, 15

Das Farbeergebnis nach Anwendung der schwachen FLEMlVIINGSchen Losung (Tabelle 1, Nr. 2) widerspricht dieser Aussage nicht, da die Essigsaure in dies em Fixantium nur in 0,1 %iger Konzentration vorhanden ist und daher nicht im tiblichen MaBe auf das Fixationsbild einwirkt. c) Enthalten die Fixierungsgemische Sublimat und Formol, so konnen fast ausnahmslos nur Bilder der Farbegruppe 2 oder 3 entstehen. Der EinfluB dieser beiden Komponenten ist so stark, daB sogar die Wirkung der Chrom-Osmium-Verbindungen kompensiert (Tabelle 1, Nr. 38, 39) wird. d) Athylalkohol ist bestimmend fUr den Farbetyp 2 (Tabelle 1, Nr. 19-22 und ~r. 26-30). Seine Anwendung fUhrt allerdings stets zur Plasmoptyse, gleichgtiltig, in welchem Gemisch er enthalten ist. Es gelten daher die oben gemachten Einschrankungen. In welcher Weise Methanol (Tabelle 1, Nr. 6) wirkt, bleibt ungeklart. Der Einflu8 des Fixierungs-pH-Wertes

Der pH-Wert des Fixierungsmittels (Spalte 15) tibt nicht den beherrschenden EinfluB aus, wie ursprtinglich erwartet wurde. Zwar sind in der Gruppe 1 hauptsachlich pH -W erte der Fixantien zu finden, die nach ZIRKLE (1928) das "basische Bild" erzeugen, sowohl Fixierung Nr. 1 wie die Fixierungen Nr. 20, 27, 28 und 32 zeigen jedoch, daB diese Befunde nicht zu verallgemeinern sind. Zumindest darf der pH -Wert nicht als allein fUr das Farbeergebnis verantwortlicher Faktor angesehen 28*

434

MANFRED

GIRBERDT

werden. Andererseits laBt jedoch ein Vergleich der Fixierung Nr. 2 mit Fixierung Nr. 7 es geboten erscheinen, den EinfluB des pH-Wertes weiter zu verfolgen. Urn leichter iiberschaubare Verhaltnisse zu erhalten, empfiehlt es sieh, mit Einzelkomponenten der Fixierungsgemische zu arbeiten. Es bieten sich jene Fixantien an, die auch bei alleiniger Anwendung eine relativ gute Erhaltung der Zellstrukturen gewahrleisten. Nach Vorversuchen besitzen OS04' K 2Cr 2 0 7 , Formol und Sublimat diese Eigenschaften. Es ist giinstig, daB die beiden erstgenannten im wesentlichen das Bild der Farbegruppe 1 bestimmen, wahrend nach Anwendung von Formol und Sub lim at die Farbegruppe 3 vorherrschend ist. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse. Tabelle 2 EinfluB des Fixierungs-pH-Wertes auf die Eisenhamatoxylinfarbung des Interphasekernes von Polystictus versicolor. Die Zahlen in der Spalte "Farbetyp" geben an, welcher Farbegruppe (vgl. Tabelle 1) das Erscheinungsbild der Kerne zuzuordnen ist. pH-Wert des Fix.-Mittels

2,2 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 6,0 8,0

Tritt ein Farbetyp nur in wenigen Fallen in den Praparaten auf, so ist seine entsprechende Kummer in Klammer gesetzt. Die Fixierungen mit OS04 bei pH 5,0 und 6,0 ergeben so "dichtes" Plasma, daB auch mit EinschluBmitteln hOherer Brechungsindices keine Aufhellung und damit sichere Identifizierung des Kernes mehr moglich ist. Nach K 2 Cr 2 0,-Fixierungen sind die Kerne bei pH-Werten zwischen pH 3,5 und pH 6,0 mit Eisenhamatoxylin nicht anfarbbar. Cytoplasma und Organellen stauen sich in der Spitzenregion, dort wird der Farblack hartnackig festgehalten. Die Differenzicrung muB daher iibermaBig lange ausgedehnt werden. Es miBlingt bei dies en Fixierungen sogar die Nucleolus-Darstellung.

Das Farbebild nach OsO 4-Fixierungen entspricht der Vorstellung yom " Umschlag en" eines Erscheinungsbildes in ein anderes in bestimmten pH-Bereichen. Ein Vergleich der Farbebilder nach Einwirkung der vier verschiedenen Fixantien laBt das OsO 4 als den bestimmcnden Faktor fiir die Erzeugung des Farbetyps 1 erkennen. Kaliumbichromat hat nur bei pH 2,5 eine Farbung des gesamten Kernes zur Folge. Bei hiiheren pH-Worten ist diese Farbung nur zu erreichen, wonn Na- oder

Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen an Polystictus versicolor

435

Cu-Sulfat der ungepufferten BichromatlOsung zugesetzt wird (Fixierung nachMuLLER, ORTH und ERLICKI, Tabelle 1, Nf. 3, 4, 5). Formol- und Sublimatfixierungen (Tabelle 2) zeigen sich praktisch unabhangig vom pH-Wert. Das lichtoptische Bild bleibt gut analysierbar tiber dem gesamten pH-Bereich. Damitbestatigen sich die Befunde (vgl. Tabelle 1), daB nach Anwendung von Gemischen, die die beiden Fixantien enthalten, von pH 0,7 bis pH 6,0 nur die Farbetypen III und II zu finden sind. Viillig unerwartet zeigt sich im basischen Bereich nach Bichromat- und Formolfixierung der Farbetyp 1. Dieser Erscheinung wurde jedoch nicht weiter nachgegangen, da in beiden Fallen der Kern nicht form- und griiBengetreu erhalten ist. Nach Formoleinwirkung ist def Zellkern unregelmaBig konturiert und nach Bichromatfixierung vollkommen abgekugelt. In seinem Innern liegt ein viel zu kleiner, ebenfalls kugeliger Nucleolus. Farbeergebnisse bei anderen Pilzarten

Die Zellkerne von Polystictus versicolor kiinnten beztiglich ihres Verhaltens bei der Hamatoxylinfarbung eine Ausnahmestellung einnehmen. Es soIl daher geprtift Tabelle 3 Farbeergebnisse mit Hamatoxylin (Heidenhain) nach Anwendung verschiedener Fixantien auf Pilzarten unterschiedlicher systematischer Zugehorigkeit. Die Zahlen in der SpaJte "Farbebild" geben an, welcher Fiirbegruppe (vgl. Tabelle 1) das Erscheinungsbild der Kerne zuzuordnen ist. Lfd. Nr.

Species

Fiirbebild bei Fixierung nach Champy

Nawashin

Stieve

2 2

2,3 3

Bemerkungen

1 2

Trameles gibbosa Pleurotus ostreatus

1 1

3

Pellicularia flavescens

1

4

Ccratobasidium anccps

1

1 (2)

1 (3)

5 6

Exidia glandulosa Fomes fomentarius

1 1

2 (3) 2

3,2 3 (2)

7

Agaricus campestris

1 (2)

2,3

3 (2)

8 9 10

Aspergillus oryzae Fimetaria fimicola Neurospora crassa

1 1 1 (2)

2,3 2 2,3

3,2 3,2 2

Abb.17

11 12

Basidiobolus ranarum ""'1 ucor hiemalis

1 (2) 1 (2)

2 2

2,3 3 (1)

Abb.19

13 14

Stamm 243 Stamm 513

1 1

2 2,3

2 3,2

Kerne nicht mit Sicherheit identifizierbar

Abb.16

Abb.18

436 werden, wie sich die Rerne anderer Pilze verschiedener systematischer Zugehorigkeit verhalten. Von den Basidiomyceten werden weitere schnallenbildende zweikernige (Tabelle 3, Nr. 1 und 2), schnaIlenlose zweikernige (Tabelle 3, Nr. 3, 4), einkernige (Tabelle 3, Nr. 0, 6) und vielkernige (Tabelle 3, Nr. 7) Arten ausgewahlt. Drei Vertreter der Ascomyceten (TabeIle 3, Nr. 8, 9, 10), zwei der Phycomyceten (TabeIle 3, Nr. 11, 12) sowie zwei unidentifizierte Fungi imperfecti (TabeIle 3, Nr. 13, 14) soIlen das Bild run den (TabeIle 3). Die Objekttragerkulturen werden nach Champy, Nawashin und Stieve fixiert und nach HEIDENHAIN mit Hamatoxylin gefarbt. Die in Tabelle 3 jeweils zuerst stehende Zahl in der Rubrik "Farbebild" kennzeichnet den vorherrschenden Farbetyp. In Klammern gesetzte Zahlen bedeuten, daB geIegentIich auch die angegebenen anderen Typen gefunden werden. Die Beurteilung, welchem Farbetyp die Kerne zuzuordnen sind, wird bei einigen Arten dadurch erschwert, daB die kleinen Kerne (Tabelle 3, Nr. 8, 10, 13) relativ groBe Nucleolen besitzen, die von einem kaum griiBeren AuBenkern umgeben sind. Nur der Vergleich mit dem Lebendbild ermoglicht dann die Entscheidung, ob ein sichtbarer heller Hof urn den Nucleolus als Schrumpfungshof oder als strukturloser, ungefarbter AuBenkern anzusprechen ist (Abb. 17 a, c).

a

a

b

b

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c

d Abb. 16

d

Abb. 17

Abb. 16. Fames famentarius, Interphasekern. a) lebend, b-d Hamatoxylinfarbung nach Fixierung durch CHAMPY (b), NAwAsHIN (c) und STIEVE (d). YergroBerung: a = 1500: 1, b-d = 2000:1. a) Phasenkontrast. b-d Hellfeld Abb. 17. Aspergillus oryzae, Interphasekerne. Praparative und VergroBerungsdaten wie in Abb. 16. - Nach CHA~IPY-Fixierung platzen die meisten Hyphen. Die in b wiedergegebenen Kerne liegen in ausgestoBenem Cytoplasma.

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Bei allen untersuchten Pilzarten ist der homogen crscheinende Inhalt des AuBenkernes mit Eisenhiimatoxylin anfarbbar, wenn die Fixierung nach CHAMPY angewandt wird (Abb. 16b, 17b, 18b, 19b). Seine farberische Darstellung gelingt jedoch nur in einem Ausnahmefall Cera to basidium) auch nach Anwendung der beiden anderen Fixantien. Wie bei Polystictus versicolor ist nach NAWASHIN-Fixierung der AuBenkern nur als heller Hof (Abb. 16 c, 17 c, 18 c) bzw. nach STIEVE-Fixierung (Abb. 16 d, 17 d, 18 d) gar nicht nachweisbar. An dem auffallend groBen Interphasekern von Basidiobolus mnarum (Abb. 19) wird deutlich, daB die Koagulate im AuBenkernraum je nach Fixierungsmittel grtiBenmaBig variieren. Sie unterscheiden sich bei Fixierung nach STIEVE nur wenig von den cytoplasmatischen Koagulaten (Abb. 19 d). An der Nucleolusperipherie zeigen sich sowohl nach NAWASHIN- wie nach STIEVE-Fixierungen die bereits erwahnten Schrumpfungshtife (Abb. 19c, d), die nach dem Lebend- und CHAMPy-Bild als Kunstprodukte angesehen werden mussen. Besprechuug der Ergebnisse

Deuten die Ergebnisse darauf hin, daB je nach Fixierungsart verschiedene Komponenten des AuBenkernes mit Eisenhiimatoxylin

Stamm 513 (Fungus imperfectus) Interphasekerne. Priiparative und VergroJ.\erungsdaten wie in Abb. 16. Abb. 19. Basidiobolus ranarum, Interphasekern. Der Inhalt der auffallend groJ.\en NucleolusVakuolen (a) wird durch Eisenhiimatoxylin mitgefarbt, gibt jedoch den Farblack bei anhaltender Differenzierung friiher als die Nucleolarsubstanz abo Praparative Daten wie in Abb. 16. VergroJ.\erung: 1000: 1 (a), die iibrigen 1350: 1.

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kommt nach eingehenden Untersuchungen an tierischen Zellen zu dem SchluB, daB bei Fixierungs-pH-W erten tiber 4,2 vornehmlich die Karyolymphe tingiert wird. Diese Hypothese ist einleuchtend, da del' Kernsaft proteinartiger Natur sein dtirfte (NEMEC 1929, GERSCH 1940, CLAUDE 1943), wie inzwischen auch papierchromatographisch bestatigt werden konnte (BROWN et al 1950). Die unterschiedlichen Farbeergebnisse bei Polystictus versicolor nach Anwendung von OS04 bei variierten pH -W erten kiinnten danach so erklart werden, daB del' IEP der Kernsaftkolloide zwischen pH 3,0 und 4,0 liegt und an diesem Bereich die Farbbarkeit umschHigt. Diese Vorstellung konnte jedoch mit Hilfe von Farbstoffpaaren (ToluidinblauSaurefuchsin, DRAWERT 1937) nicht bestatigt werden. AuBerdem widerspricht ihr die vom pH -Wert unabhangige Farbung nach FormolBichromat- und Sublimatfixierung und die Erscheinung, daB die des Chroma tins entkleidete Karyolymphe kurz VOl' Einsetzen der Kernteilung mit Hamatoxylin selbst nach Anwendung von Fixantien del' Farbegruppe I nicht mehr dargestellt werden kann. Nach den Untersuchungen von VENDRELY (1950) besitzen isolierte reine DNS sowie histonhaltige DNS die Eigenschaft, Hamateinlacke zu bilden. Die unterschiedlichen Ergebnisse am Pilzkern kiinnten also anzeigen, daB die DNS durch die verschiedenen Fixantien chemisch stark verandert worden ist, odeI' ein besonderes Nucleoproteid im Pilzkern vermutet werden dad. Diese Miiglichkeit kann nach den Feulgen-Befunden nicht von der Hand gewiesen werden, da sich auch dabei zeigte, daB die Art der Fixierung groBen EinfluB auf die Nuclealreaktion austibt. Der Hamatoxylin-Farbeeffekt mtiBte danach auf die Menge farbbaren Chromatins zurtickgefUhrt werden kiinnen. Die Farbintensitat ware dann bei Farbetyp II und III fUr mikroskopische Beobachtung nicht ausreichend. Die bekannte hohe Sensibilitat del' Eisenhamatoxylinfarbung und die Tatsache, daB nach Einwirkung der meisten Fixantien die Farbetypen II und IJI entstehen, sprechen gegen einen solchen Deutungsversuch. AuBerderri. zeigt die Hamatoxylinfarbung bei Polystictus versicolor gerade in den pH-Bereichen, die nach LISON et al (1955/56) minimale Feulgen-Reaktionen ergeben, maximale Farbintensitat. Es hat den .Anschein, als ob die im Augenblick plausibelste Erklarung der beobachteten Phanome nicht im Chemismus der Farbung, sondeI'll im Fallungsbild der AuBenkernkolloide gesucht werden muB. In guter Ubereinstimmung mit YAMAHA (1926, 1927 a, b) fUhrt jenes Fixierungsmittel (OsO 4)' das "homogene" Fallungen erzeugt, zur Anfarbung des AuBenkernes. Die Anwendung der gebrauchlichen Fixantien haben nach YAMAHA "netziggerinnselige" Fallungen zur Folge. Nimmt man an, daB bei etwa gleicher Tingierbarkeit der plasmatischen und karyotischen Koagulate die Fallungen im AuBenkern

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etwas grober sind als im umgebenden Cytoplasma, so erscheint Farbetyp II. Seine extreme Ausbildung mit vollig leer erscheinendem AuBenkern kann so zustande kommen, daB die Koagulate sich am Nucleolus oder der Kernmembran ansammoln. In beiden Fallen konnen sie mikroskopisch nicht erfaBt werden. Die Entstehung des Farbetyps 3 ist so vorstellbar, daB die Fallungen im AuBenkern nach Form und GroBe nicht von den koagulierten Plasmastrukturen unterscheidbar sind. Moglicherweise ist mit Fixantien, die diesen Farbetyp erzeugen, auch die Kernmombran nicht oder schlecht zu konservieren, so daB der Ubergang vom Cyto- zum Karyoplasma auch aus diesem Grunde nicht sichtbar wird. Mit dieser Deutung sind sowohl die Ergebnisse am phasenoptisch untersuchten, ungefarbten fixierten Kern von Polystictus wie die Bilder der gefarbten groBen Kerne von Basidiobolus gut vereinbar. Unter Berucksichtigung der hier dargestellten Befunde darf die Eisenhamatoxylinfarbung auch weiterhin zur Darstellung des Pilzkernes empfohlen werden. Die Methode liefert unzweifelhaft die detailliertesten mikroskopischen Bilder mid entspricht damit einer Forderung, die bei der Analyse der oft winzigen Strukturen stets erhoben werden muB. Zusammenfassung~der

Ergebnisse

Die Farbung des Interphasekernes von Polystictus versicolor mit Eisenhamatoxylin ist abhangig von der Art des angewandten Fixierungsmittels. Bei Prufung von 40 verschiedenen Fixierungsgemischen zeigt sich, daB nach Einwirkung von Chrom-Osmium-Verbindungen AuBenkern und Nucleolus tingierbar sind. Ein Zusatz von Essigsaure hebt die Anfarbbarkeit des AuBenkernes auf. Enthalten die Fixantien Sublimat und Formol, so bleibt der AuBenkern als ungefarbter Raum sichtbar oder seine Darstellung miBlingt uberhaupt, so daB der Nucleolus unmittelbar im Cytoplasma zu liegen scheint. Eine Beeinflussung des Farbebildes durch den pH -Wert des Fixierungsmittels ist nur bei 080 4 moglich. Nach Fixierung mit reinen, gepufferten Losungen von Sublimat, Formol und Bichromat ist der Farbetyp unabhangig vom pH-W,ert. Die unter8chiedlichen Farbeergebnisse nach Anwendung verschiedener Fixantien lassen sich an Hand der analog en Kernfarbungen bei weiteren 14 Pilzarten bestatigen. Die verschiedenen Anfarbungen scheinen durch die differenten Fallungen im AuBenkernraum zustande zu kommen. Literatur BAKERSPIGEL, A., 1959 a. The structure and manner of division of the nuclei in the vegetative mycelium of Gelasinospora tetrasperma Dowd. Can. J. Microbiol. 5, 125-130. - Ders., 1959b. The structure and manner of division of the nuclei in the vegetative mycelium of Neurospora crassa. Am. J. Bot. 46, 180-190. - Ders., 1959c. The structure and manner of division

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