Lipase und Phospholipase C von Staphylococcus aureus verschiedener Herkunft I. Nachweis und vorkommen

Zbl. Bakt. Hyg., 1. Abt. Orig. A 248, 229-233 (1980)

Aus dem Institut fur Bakteriologie und Immunologie der Universitat GieBen

Lipase und Phospholipase C von Staphylococcus aureus verschiedener Herkunft I. Nachweis und Vorkommen Lipase and Phospholipase C from Staphylococcus aureus of Different Origin I. Determination and Occurrence Y. J. D. BERETEl, W. SCHAEG,

J. BRDCKLER

und H. BLOBEL

Mit 2 Abbildungen . Eingegangen am 20. Februar 1980

Abstract Lipase and phospholipase C from Staphylococcus aureus of different ongm were demonstrated qualitatively by agar diffusion on tributyrin- and lecithinagar. On test media with either 0,3 Ofo Na-azide or 0,3 % KCN lipase-activity was not inhibited, phospholipase C, on the other hand, completely blocked (Table 1, Fig. 2). In this manner a tentative differentiation was possible between lipase and phospholipase C. For the quantitative determination of lipase the hydrolysis of p-nitrophenylpalmitate proved to be most useful (Fig.1). S. aureus-cultures of human origin produced more often and more actively lipase and phospholipase C than those from cattle (Table 2).

Zusammenfassung Lipase und Phospholipase C von Staphylococcus aureus verschiedener Herkunft konnten im Agardiffusionsverfahren auf Tributyrin- und Lezithinagar qualitativ nachgewiesen werden. Durch Zusatz von 0,3 % Na-Azid oder KCN zu den Testmedien wurde die Lipase-Aktivitat nicht beeinfluBt, Phospholipase C dagegen vollstandig gehemmt. Damit gelang eine vorlaufige Differenzierung dieser Enzyme (Tab. 1, Abb.2). Zur quantitativen Lipasebestimmung eignete sich die Hydrolyse von p-Nitrophenylpalmitat (Abb.1). Die untersuchten S. aureus-Kulturen vom Menschen bildeten haufiger und in starkerern MaBe Lipase und Phospholipase C als die vom Rind (Tab. 2).

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Stipendiat des Deutschen Akademischen Austauschdienstes (DAAD).

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Y.J.D.Berete, W.Schaeg, j.Bnickler und H.Blobel

Einleitung

Staphylococcus aureus kann Lipase und Phospholipase C bilden (Abramson, 1972). Lipase und Eigelbfaktor triiben Eigelbbouillon (Adler et al., 1953) und spalten Tributyrin sowie Tween 60. Der Eigelbfaktor ist als eine Iipovitelleninspaltende Lipoproteinlipase identifiziert worden (Tirunarayanan u. Lundbeck, 1967) und wahrscheinlich mit der Lipase identisch (Shah u. Wilson, 1963; Tirunarayanan u. Lundbede, 1968). Zur weiteren Charakterisierung von Lipase und Phospholipase C hatten die vorliegenden Untersuchungen das Ziel, zunachst ihren Nachweis zu verbessern und ihr Vorkommen bei S. aureus-Kulturen verschiedener Herkunft festzustellen. Material und Methoden Material Die verwendeten Staphylokokken-Kulturen wurden als S. aureus identifiziert (BairdParker, 1974). Von den 242 S. aureus-Kulturen stammten 106 aus Untersuchungsmaterial vom Menschen! (Kristallviolett-(KV)Typ C, Meyer, 1967) und 136 aus Mastitisproben vom Rind (KV-Typ A). Zur Produktion von Lipase und Phospholipase C wurden die Staphylokokken als Vorkulturen 16 h bei 37 °C in "Tryptone Soya Broth" (TSB, Fa. Oxoid, London) bebriitet, Jeweils 5 ml Vorkultur gaben wir zu 50 ml TSB in 500 mlErlenmeyer-Kolben und inkubierten 24 h bei 37 °C auf einer rotierenden Schuttelmaschine (60 U/min). Diese Inkubationszeit erwies sich in Vorversuchen als optimal. Nach Abzentrifugieren (20 min, 16300 x g, 4 0C) erfolgte die Filtration (MiIIiporefilter, mittIerer Porendurchmesser 0,22 ,urn, Fa. MiIIipore, Bedford, Mass., USA). Der qualitative Nachweis von Lipase und Phospholipase C erfolgte im Agardiffusionsverfahren. Tributyrinagar (Fa. Oxoid) wurde nach den Vorschriften des Herstellers, Lezithinagar nach den Angaben von Chrisope et al. (1976) zubereitet und steril zu je 10 ml in Petrischalen (Durchmesser von 9 em) pipettiert. Auf diese Testplatten kamen in der Anordnung einer unter der Petrischale liegenden Schablone 5 sterile Metallzylinder mit einem inneren Durchmesser von 6 mm, einem au1Seren von 8 mm und einer Hohe von 9 mm. Ein Zylinder war zentral und die anderen 4 peripher angeordnet, etwa 2,5 em von der Mitte entfernt. In die peripheren Zylinder kamen die zu untersuchenden sterilfiltrierten Kulturiiberstande unverdiinnr, 1:10, 1:100 und 1:1000 in TSB verdiinnt, Dabei enthielten 2 gegeniiberliegende Zylinder die gleiche Probe und der Zentralzylinder unbeimpfte TSB als Kontrolle, jeweils 200,u1. In Parallelansatzen verwendeten wir Tributyrin- und Lezithinagar-platten mit je 0,05, 0,1, 0,3 und 0,5 Ofo Na-Azid oder in denselben Konzentrationen KCN. Die Platten wurden in allen Fallen 48 h bei 37 °c bebriitet. Die Messung der Reaktionshofe (in mm) erfolgte mit einer Meflupe (Behringwerke AG, Marburg), direkt vom Deckel der Petrischale. Eine positive Reaktion lag bei einem Gesamtdurchmesser des Reaktionshofes von mindestens 9 mm vor. Der quantitative Nachweis von Lipase beruhte auf der Hydrolyse des farblosen pNitrophenylpalmitat zum gelben, photometrisch me1Sbaren p-Nitrophenol. AIs Stammlosung diente eine 0,01 M alkoholische Losung von p-Nitrophenylpalmitat (Fa. Serva, Heidelberg). Zu ihrer Herstellung wurden in einem mit Methanol zur Halfte gefiillten 20 ml-Meskolben 75,5 mg festes p-Nitrophenylpalmitat gegeben und durch Schiitteln bei 50 °C im Wasserbad gelost, Nach Abkiihlung auf Raumtemperatur wurde der Me1S2 Freundlicherweise vom Institut fur medizinische Mikrobiologie der Justus LiebigUniversitat, Gie1Sen, zur Verfugung gestellt.

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kolben auf 20 ml mit Methanol gefullt, Die Losung wurde bei 4 °C lichtgeschiitzt aufbewahrt, p-Nitrophenylpalmitat fiel dabei aus, konnte jedoch vor Gebrauch bei 50°C wieder in Losung gebracht werden. Zur Herstellung der Gebrauchslosung wurden 4 ml der Stammlosung tropfenweise unter Riihren zu 100 ml 0,1 M Tris-Puffer, pH 8,0 mit 0,1 % Na-Taurocholat (als Emulgator) pipettiert, Die quantitativen Lipase-Bestimmungen erfolgten nach Mischung von jeweils 50 ftl Staphylokokken-Kulturiiberstand mit 3 ml der Gebrauchslosung in einem Rohrchentest. Die Kulturuberstande stammten von dem stark lipase-positiven Stamm K 619 und dem lipase-negativen Stamm Rd 271. Zur Kontrolle verwendeten wir in gleichen Volumina Phospholipase C von Bacillus cereus (Fa. Boehringer, Mannheim), TSB und TSB mit 0,5 % Na-Azid. Die Mischungen wurden 60 min bei 30°C im Wasserbad inkubiert und die Extinktionsmessungen bei 405 nm in Kiivetten mit einer Schichtlange von 1 em in Abstanden von 10 min vorgenommen. Die Giiltigkeit des Lambert-Beer'schen Gesetzes wurde nach einer Reaktionszeit von 30 min mit dem Kulturiiberstand des lipase-positiven Stammes K 619 iiberpriift (Berete, 1979) und eine Eichkurve erstellt (Abb. 1).

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Abb. 1. Quantitative Bestimmung der Lipase-Aktivitat von Staphylococcus aureus, K 619 in Abhangigkeit von dem Volumen zugegebener Kultuniberstande.

Ergebnisse Lipase verursachte auf Tributyrinagar vollstandige und auf Lezithinagar U11vollstandige Aufhellungen. Phospholipase C bedingte auf Tributyrinagar keine Veranderungen, verdichtete jedoch Lezithinagar (Tab. 1, Abb. 2). Lipase wurde in Tabelle 1. Reaktionen von Lipase und Phospholipase C im Agardiffusionsverfahren auf Tributyrin- und Lezithinagar (ohne (I) und mit (II) Zusatz von 0,3 % Na-Azid Enzyme Lipase Phospholipase C

Tributyrinager I II

Lezithinagar I II

A

a V

A = Vollstandige Aufhellung a = Teilweise Aufhellung V = Verdichtung - = keine Reaktion 16 ZbI. Bakt. Hyg., I. Abr. Orig. A 248

A

a

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v

a

A

Abb.2. Reaktionsbilder im Agardiffusionsverfahren. A Vollstandige Aufhellung durch Lipase auf Tributyrinagar. a Teilweise Aufhellung durch Lipase auf Lezithinagar. V Verdichtung durch Phospholipase C auf Lezithinagar. ihrer Aktivitat durch den Zusatz von Na-Azid oder KCN nicht beeintrachtigt, Phospholipase C dagegen auf Lezithinagar mit steigenden Na-Azid- bzw. KCNKonzentrationen gehemmt. Bei einer Konzentration von 0,3 010 Na-Azid bzw. KCN blieb die Phospholipase C-Reaktion vollstandig aus . Die bei der quantitativen Lipase-Bestimmung herangezogene Hydrolyse von p-Nitrophenylpalrnitat war eine Lipolyse . Eine spont ane Hydrolyse der Substrarlosung wahrend der Inkubation konnte nicht beobachtet werden. Sie wurde weder durch lipasefreie Stoffwechselprodukte der Staphylokokken noch durch Phospholipase Coder durch die anderen Kontrollsubstanzen katalysiert, Eine Extinktion von E405 = 0,188 entsprach 10- 5 Mol freigesetztem p-Nitrophenol, Unrer den Versuchsbedingungen war eine Reaktionszeit von 30 min am besten geeignet. Die LipaseAkti virat war dem gebildeten p-Nitrophenol und der Probenmenge proportional (Abb.1) . Die untersuchten S. aureus-Kulturen vom Menschen bildeten haufiger und m starkerem Ma~e Lipase und Phospholipase C als die vom Rind (Tab. 2). Tabelle 2. Nachweis von Lipase und Phospholipase C bei Staphylococcus aureus-Kulturen vom Mensch (I, n = 106) und Rind (II, n = 136)im Agardiffusionsverfahren Enzyme Lipase 1 Phospholipase C 2 1 2

1 II I II

unverdiinnt 1:10

1:100

1:1000

101 (95 %) 50 (37 %) 27 (25 %) 6 (4 %)

93 (88 %) 10 (7 %) 7 (7 %) 4 (3 % )

78 (74 %) 5 (3,5 %)

99 (93 %) 30 (22 %) 23 (22 %) 6 (4 %)

auf Tributyrinagar auf Lezirhinagar

Diskussion 1m Agardiffusionsverfahren konnten Lipase auf Tributyrin- und Phospholipase C auf Lezithmagar unter Verwendung von Stahlzylindern rationell nachgewiesen und

Lipase und Phospholipase C von Staphylococcus aureus

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differenziert werden. Die Stoffwechselinhibitoren Na-Azid und KCN hemmten die Phospholipase C-Aktivitiit vollstandig, wenn sie in Konzentrationen von 0,3 0J0 oder hoher dem Lezithinagar zugesetzt waren. Sie hemmten aber nicht Lipase. Daher boten die Lezithinagarplatten mit und ohne Zusatz von 0,3 Ofo Na-Azid die Moglichkeit einer Differenzierung zwischen Lipase und Phospholipase C. Die photometrische quantitative Lipase-Bestimmung erwies sich als ein schneller und gut reproduzierbarer Lipasetest. Sie beruhte auf der enzymatischen Hydrolyse von p-Nitrophenylpalrnitat und der Extinktionsmessung des freigesetzten p-Nitrophenols. Literatur Abramson, C.: Staphylococcal enzymes. In: Coben.]. O. (ed.): The staphylococci. WileyInterscience, New York (1972) Alder, V. G., W. A. Gillespie, and G. Herdan: Production of opacity in egg yolk broth by staphylococci from various sources. J. Path. Bact. 66 (1953) 205-210 Baird-Parker, A. C.: Genus II. Staphylococcus. In: Buchanan, R. E., N. E. Gibbons, S. T. Cowan, ]. G. Holt, ]. Liston, R. G. E. Murray, C. F. Niven, A. W. Ravin, and R. Y. Stanier (eds.): Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Williams & Wilkins Company, Baltimore (1974) Berete, Y.]. D.: Lipase, Eigelbfaktor und Phospholipase C von Staphylococcus aureus. Vet.-Med. Diss., Giel~en (1979) Cbrisope, G. 1., C. W. Fox, and R. T. Marshall: Lecithinagar for detection of microbial phospholipases. Appl. Environ. Microbiol. 31 (1976) 784-786 Meyer, W.: Ober die Brauchbarkeit des Kristallviolett-Testes zur Differenzierung von Staphylococcus aureus-Stammen. Z. Hyg. Infekt.-Kr. 153 (1967) 158-168 Shah, D. B. and ]. B. Wilson: Egg yolk factor of Staphylococcus aureus. I. Nature of the substrate and enzyme involved in the egg yolk opacity reaction. J. Bact. 85 (1963) 516-521 Tirunarayanan, M. O. and H. Lundbeck: Investigations on the enzymes and toxins of staphylococci. Identification of the substrate and the products formed in the "egg yolk reaktion", Acta path. microbiol. scand. 69 (1967) 314-320 Tirunarayanan, M. O. and H. Lundbeck: Investigations on the enzymes and toxins of staphylococci. Hydrolysis of triglycerides and other esters by lipase. Acta path. microbioI. scand. 73 (1968) 437-449 Dr. Y. ]. D. Berete, Dr. W. Schaeg, Dr. ]. Briickler, Prof. Dr. H. Blobel, Institut fiir Bakteriologie und Immunologie, Frankfurter Str. 107, D-6300 GieBen, Bundesrepublik Deutschland