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L'étude des canaux ioniques : le patch-clamp
CAHIER N°123 DANS LA REVUE BIOFUTUR N°201
JUIN 2 0 0 0
~r-nLl~
Pourquoi les ions se d~placent-ils ? Les canaux ioniques ." des portes mol~culaires La ~> I'echnoscope coordonne par Nicolas Cheva
L' tude des canaux ioniques :
ITEe NOSCOPEJ Christ~le Horeau~, BenoRLacombe~, Jean-BapUste Thibaud et Anne-Alienor Very Bi0chimie et physi010gie m01~culaire des plantes, UMR 5004, Agr0-M0ntpellier, CNRS, Inra. universite M0ntpellier 2, 34060 M0ntpellier cedex 01 Actuellement chez San0fi-Synthelab0 Recherche, 371, rue du Pr-J -Blayac, 34184 M0ntpellier cedex 04 2 Actuellement au Julius-von-Sachs Institut, Lehrstuhl Molekulare Pflanzenphysiologie und Biophysik, Juliusvon-Sachs-Platz 2, D-97082 Wflrzburg, Allemagne. Photo d'ouverture (© M. KAGE/ OKAPIA/CNRI)
(~)
~s la fin des ann~es 1940, les biologistes anglais Alan Hodgkin et Andrew Huxley, alors 5. l'universit& de Cambridge, avaient montr~ que les signaux ~lectriques qui parcourent les membranes des cellules nerveuses pouvaient s'expliquer par des mouvements rapides d'ions potassium et sodium fl travers la membrane cellulaire. Les membranes lipidiques avant une faible perm~abilit~ ~ ces ions, ces chercheurs (laurdats du prix Nobel de m~decine en 1963) avaient alors suppose5 l'existence de structures ins6r~Ses dans la membrane, permettant aux ions de la traverser : ils inventaient ainsi le concept de ,, canaux ioniques ,,. La structure mol~culaire de ces canaux, qu'ils imaginaient comme de grosses prot~ines formant des pores dans la membrane, &ait hors de pottle des m~thodologies exp&imentales de l'~poque. Ce n'est qu'fl partir du d6bat des ann~es 1980 que la structure des canaux ioniques a 6t6 d6couverte, grfice aux progras de la biologie mol&ulaire. C'est aussi fl cette 6poque, (fin des ann&s 1970) que fur inventde une technique d'~lectrophysiologie qui permet d'enregistrer le courant de tr~s faible intensit~ circulant ~ travers un seul canal ionique : le patchclamp. L'usage combin~ des techniques de biologie mol&ulaire et d'~lectrophysiologie s'est g~n&alisd au cours des anndes 1990 et il est maintenant courant de coupler IkStude du g~ne codant un canal fl l'&ude des propri&& fonctionnelles de ce canal en patch-clamp. L'industrie pharmaceutique, en particulier, utilise ces techniques pour dissdquer la fonction de certains r&cepteurs membranaires et tester les effets de nouvelles mol6cules. Ceux pour qui les termes ~, ~lectrophysiologie % patch-clamp et ,, canal ionique ,, restent obscurs voire rebarbatifs sont ici invitas fl entrouvrir la porte d'un laboratoire oO sont atudids des canaux ioniques et fl d~couvrir le charme de ces techniques permettant de visualiser sur un dcran d'oscilloscope des ph& nomenes de nature quantique, qui se d&oulent l'&helle molfculaire, et en quelques milliemes de secondes. Le terme ,, ~lectrophysiologie ,, fair souvent penser 5. l'6tude des cellules nerveuses ou
S
i la vie est apparue darts lamer, les cellules vivantes contiennent bien autre chose que de I'eau de mer ! Elles rec~lent ~videmment des mol6cules organiques complexes qu'elles synthetisent, mais aussi des ions min~raux. Ces ions sont certes presents dans I'eau de mer, mais se trouvent dans les cellules & des concentrations tr~s differentes. Par exemple, I'ion sodium, tr~s concentr~ dans I'eau de mer, est moins a b o n d a n t dans le cytoplasme, et la situation inverse s'observe pour I'ion potassium, qui est le cation dissous le plus abondant dans les cellules vivantes. L'une des activites constantes des cellules vivantes consiste & d~penser de I'energie pour cr(~er et entretenir ces gradients. Pour cela, elles disposent de membranes intrins~quement 6tanches & la plupart des ions, mais pourvues de systemes de transport sp~cialis6s, c o m m e la p o m p e Na+:K + des cellules animales. Cette compartimentation des ions et des molecules, qui est I'une des caracteristiques du vivant, se retrouve aussi au niveau des organites cellulaires (mitochondries, reticulum endoplasmique, chloroplastes, vacuoles, etc.). L'un des aspects les plus connus de cette ,, b i o c h i m i e vect er i el l e ,, impliquant des transports d'un compartiment a un autre & travers une (ou des) membrane(s) est le couplage 6nergetique de la chaine respiratoire, avec la synth~se d'ATP que Peter Mitchell avait decrit darts se fameuse theorie ,, chimiosmotique ,,. Mitchell a C=galement 6nonc~ un critere thermodynamique pour classer les transports d'ions & travers une mem-
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musculaires. Pourtant, tousles types cellulaires possedent des canaux permdables aux ions dans leurs membranes. Aux d~buts de l'dlectrophysiologie moderne, c'est d'ailleurs sur certaines algues g6antes que les chercheurs enregistraient des potentiels d'action lorsque les fibres nerveuses de calmar (leur module favori) venaient 5. manquer. Pour illustrer ce technoscope, nous montrerons des exemples d'exp& riences r~alis6es dans notrc laboratoire sur des canaux potassiques de cellules vJg6tales.
QU'EST-CE QUE L ~LE~,t ROPHYS!,3LOGtE ? Certaines prot~ines membranaires catalysent le passage d'un substrat "~ travers la membrane (systSmes de transport au sens large) ; elles pnss~dent, en d'autres termes, une activit8 vectorielle (voir l'encadr~ 1). Lorsque le substrat transport8 possSde une charge 81ectrique nette (il s'agit par exemple d'un ion min&al), cette activit8 vectorielle a une <
brane en transports actifs ou passifs. Dans le cas d'une membrane s~parant la solution extracellulaire (e) et le cytoplasme (1~,on peut calculer pour chaque ion X son gradient transmembranaire de potentiel ~lectrochimique (en Joules par mole) : APx = (Px),-(PX)e = R T I n ( x ~ ) + z x F E ou X~ et Xi sont les concentrations extracellulaire et cytoplasmique (en moles par m3), z x est la valence de I'ion, E la difference de potentiel & travers la membrane (en volts, couramment d6sign6e par . potentiel de membrane ,,), R e s t la constante des gaz parfaits (8,31 en Joules par degr~ Kelvin et par mole), T la temperature (en degr~s Kelvin) et F l e Faraday (96 500 Coulombs par mole). Si la membrane possede des canaux perm6ables aux ions X, ces ions auront tendance & passer du compartiment cO leur potentiel electrochimique est le plus ~lev6 au compartiment o0 leur potentiel 61ectrochimique est le plus faible. Les canaux ne perrnettent aux ions que de ,, descendre ,, leur gradient de potentiel ~lectrochimique : ils catalysent un transport dit passif. Au contraire, les pompes ioniques, en utilisant une source d'~nergie (par exemple I'hydrolyse de I'ad~nosine triphosphate), permettent aux ions de ,, remonter ,, leur gradient de potentiel electrochimique : elles catalysent un transport dit actif. •
D
ans I'L~luation I x = Gx(E-Ex), qui donne le courant port~ par un ion X, Ix, en fonction de la diff0rence entre le potentiel de membrane, E, et le potentiel d'L.=quilibre de I'ion, Ex, le param~tre Gx a la dimension d'une conductance : la conductance de la membrane ou du canal pour l'ion X. Contrairement a la conductance d'un circuit L=lectrique, Gx n'est pas une constante ind0pendante de E et n'est en far qu'une ,, b o r e noire ,, qui regroupe tous les d0terminants de I x autres que (E-Ex). Dans les ann0es 1940, David Goldman, Alan Hodgkin et Bernard Katz (1, 2) ont propos0 un module, souvent appel~ aujourd'hui ,, module de GHK ,,, qui explicite I'expression math0matique de G x en fonction de E, des concentrations de X de part et d'autre de la membrane, et d'un param~tre intrins~que du couple ion X-canal : le ,, coefficient de perm0abilit~ ~. Comme G x d0pend de E (saul dans le cas d'une &luimolarite de X de part et d'autre de la membrane), la repr0sentation de I x = f(E) ne donne pas une droite, comme dans le cas de la Ioi d'Ohm. En fait, on obtient une courbe monotone croissante b concavit0 toum0e vers le haut ou vere te bas selon que X~ > X e ou )~ < X e (voir l a figure). Le module de GHK, pourtant fond0 sur des postulats difficilement v0rifiables (et pour certains contestables) reste cependant acceptable comme le sugg6re I'~tude rOcente d'un canal K* o0 les donnoes IK = f(E) correspondent aux predictions de ce module (3). Certaines d0viations par rapport au mod01e de GHK peuvent s'expliquer par I'effet du potentiel sur les canaux. Par ailleurs, les interactions de comp0tition ou de ,, cooperativit0 ,, entre ions lots du processus de permeation, I'effet des agents bloquants, etc. peuvent ~tre d0crits par des modules cinetiques calqu0s sur ceux d0velopp0s pour les enzymes classiques, mais avec cette particularit0 que certaines 0tapes du cycle r0actionnel d0pendent du potentiel de membrane (4). •
(1) D.E. Goldman (1943) J. Gen. PhysioL 27, 37-60. (2) A.L. Hodgkin, B. Katz (1949) J. PhysioL 108, 37-77. (3) S.A.N. Goldstein et aL (1996) Proc. Natl. Acad. ScL USA 93, 13256-13261. (4) E. Marban, G.F.Tomaselli (1997) Trends Neurosci. 20, 144-147.
Comme certaines techniques d'imagerie, les techniques d'electrophysiologie offrent l'acc& fi des donn~es sur la fonction d'entit& moleculaires intdgrees dans un environnement biologique complexe. I1 est ainsi possible de montrer la participation de canaux ioniques fi des chalnes de transduction de signaux et de comprendre leur integration dans des fonctions cellulaires. Apr~s avoir isole le gane codant un canal, il est possible d'etudier les bases mol&ulaires des propri~t& fonctionnelles des canaux (&ude de la <, relation structure-fonction ,,), en comparant les propri&& fonctionnelles du canal de type sauvage avec celles de canaux modifi& dans leur sequence peptidique par introduction artificielle de mutations.
POURQUOI LES IONS SE DEPLACENT-tLS ? L'agitation thermique a tendance fi disperser les ions, comme si une force s'exerqait sur ces particules, les obligeant fi diffuser d'un point off elles sont plus concentrdes vers un autre off elles le sont moins. Par ailleurs, chaque ion est soumis fi une force ~lectrique proportionnelle fi sa charge quand il est placd dans un champ electrique : un cation, par exemple, aura tendance fi se deplacer vers les points off le potentiel est plus n~gatif que lfi off il se trouve. La combinaison de ces deux ~nergies potentielles, l'une , osmotique ,, et l'autre electrique, determine ce que l'on
I x (unites arbitraires)
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-3 PrOvisions du module de Goldman-Hodgkin-Katz. Une m e m b r a n e permeable a I'ion monovalent X s0pare un compartiment i qui contient X 150 m M et un compartiment e qui contient une concentration de X (1 m M en jaune ; 10 m M en bleu ; 100 m M en rouge ; 150 m M en orange ; 300 m M en vert. Celles-ci repr0sentent le courant porto par I'ion monovalent X (Ix, en unites arbitraires) en fonction de la difference de potentiel E (E i - E e, en mV). Une fl~che verticale indique E x pour chaque courbe.
appelle le potentiel electrochimique de l'ion, note p (voir l'encadrd 1). Si l'on consid~re une membrane separant des solutions contenant des ions, il existe pour chaque ion une valeur remarquable du potentiel de membrane pour laquelle le potentiel electrochimique est le mSme de chaque c6td de la membrane. I1 s'agit du potentiel ,~ de Nernst ,,, ou potentiel d'equilibre de l'ion X, note E x = -(RT/zxF)ln(Xi/Xe). Au potentiel de Nernst (E = Ex), l'effet de la force electrique compense exactement celui de la force osmotique et aucun courant dans un canal (i.e. courant passif) ne peut alors &re port8 par l'ion X. L'Squation suivante, calqu~e sur la loi d ' O h m applicable aux circuits electriques (I = G.E, off I est le courant en AmpSres, G la conductance en Siemens et E la diff&ence de potentiel en volts) donne la relation gen~rale entre le potentie] de membrane et le courant I x vehicul~ par un ion X fi travers la membrane : I x = Gx(E-Ex) (1) off G x (> O) represente la conductance de la membrane ~ l'ion X (voir l'encadrd 2). L'~quation (1) permet de prSvoir le sens du courant port~ par un ion donne en fonction du signe du terme (E-Ex). Voyons maintenant quelques exemples. Comme K + est generalement plus concentre dans le cytoplasme qu'fi l'exterieur de la cellule, EK est gen&alement n6gatif. Si le potentiel de membrane (gen&alement ndgatif dans une cellule) est moins negatif que EK et qu'un canal perm&ble fi K+ est ouvert, K÷ ne pourra LE TECHNOSCOPEDE BIOFUTUR201 " Juin 2000 3
[TEC..OSCOP'q que sortir de la cellule ~ travers ce canal (courant I K sortant, positif avec la convention de signe en 61ectrophysiologie). En revanche, si le potentiel de membrane est plus n6gatif que E K (situation fr4quente dans les cellules v6g&ales), K+ ne pourra qu'entrer dans la cellule fi travers un canal K + (IK entrant, n6gatif). Au contraire, Ec~ est positif, ainsi que ENa et EH, dans la plupart des cellules. Dans les conditions physiologiques off E est toujours alg6briquement inf&ieur ENa , Eta et EH, les ions Na+, Ca 2+ et H+ ne pourront qu'entrer dans la cellule fi travers des canaux qui les laisseraient passer. Pour terminer, rappelons la r6gle de l'61ectroneutralit6, qui veut que la somme de tous les courants port4s par toutes les charges 41ectriques franchissant la membrane soit nulle. En ne consid~rant, par simplification, que les courants passifs d4crits par l'~quation (1), on peut 6crire • =
X
=
X
.x
X
~7 ~ ((;xEx)
=
0
X
On en tire que :
E-
X X
(CxLx)
((;x)
Bien qu'approximative, cette relation permet de comprendre pourquoi l'ouverture ou la fermeture de canaux perm~ables fi un type d'ion peut faire varier le potentiel de membrane. Par exemple, si la cellule est polaris& fi 60 mV et que des canaux perm6ables ~ Na + s'ouvrent (GNa augmente et devient grand devant les autres termes Gx), E v a tendre vers le potentiel d'dquilibre de Na+, c'est-~-dire se rapprocher de z&o (se ~, d~polariser ,), puisque ENa est positif. Si des canaux perm6ables fi K÷ s'ouvrent alors, et que G K domine les autres termes Gx, E tendra fi revenir vers la valeur ndgative EK, c'est-h-dire se ,, repolariser ,>. C'est approximativement ainsi que Hodgkin, Huxley et Katz avaient propos6 que le potentiel d'action des cellules nerveuses consiste en une d6polarisation produite par l'ouverture de canaux Na+ suivie d'une repolarisation r6sultant de la fermeture de ces canaux et l'ouverture de canaux K + (1).
LES C A N A U X IONJQUES : DES PORTES MOL, ECULA~RES Les canaux ioniques sont des protdines fortunes par l'assemblage de plusieurs sous-unit&. Les sous-unit6s , fonctionnelles ,, (ix) traversent la membrane et menagent en leur sein le pore aqueux dans lequel circulent les ions. Les sous-unit~s ,< r6gulatrices , (13,7, 8) interagissent avec les ix. Elles s'&endent sur l'6paisseur de la membrane, ou restent sur l'interface membranecytoplasme. Des sites de glycosylation et de phosphorylation sont rep&ds dans la s6quence des r6gions extra- et intraceltulaires des diff~rentes sous-unit6s (2). Un canal ionique est un peu comparable fi une porte, il peut 6tre d~crit en fonction de son 6tat : ouvert ou ferm4. Bien que plus de deux conformations mol6culaires existent, on peut consid&er, par approximation, que chaque canal oscille de fa~on aldatoire e n t r e un &at ouvert de p r o b a b i l i t 6 0 et un ~tat fermd de probabilit6 F, avec O + F = 1. Si l'agitation thermique &ait le seul facteur fi consid&er, on pourrait &rire, en appliquant la loi de Boltzmann, que le rapport O/F est dgal fi e x p ( - A G o / R T ) , off AGo est le 4 LE TECHNOSCOPEDE BIOFUTUR201 • Juin 2000
changement d'dnergie conformationnelle lors de la transition de l'&at ferm4 fi l'6tat ouvert (pour une mole de canal). Comme O + F = 1, on en tire l'expression de la probabilit6 de l'~tat ouvert • O-
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1+ exp ( ~N/ i l Mais les choses sont en rdalitd plus compliqu4es, et d'autres facteurs que l'agitation thermique interviennent dans le changement conformationnel. On peut grosso modo distinguer trois modes de contr61e de l'ouverture des canaux : la r&eption membranaire d'un signal extracellulaire (neurom8diateur, hormone, variation de pH,...), le contr61e par un facteur cytoplasmique (Ca 2+, kinase/phosphatase, pH, nucl~otide cyclique, ATP...) et le contr61e par te potentiel de membrane (voltage-gating). Les canaux r~gulds par le potentiel de membrane sont les mieux d&rits au niveau mol&ulaire. Leurs sous-unit6s c~ pr&entent une s&ie d'acides amines charg& positivement dans un domaine consid&d comme le senseur de voltage (voltage sensor). En se d@laCant fi travers la membrane sous l'effet d'une variation du potentiel de membrane, ce domaine faciliterait le passage d'une configuration "a l'autre (3). Darts ce cas, toujours en appliquant la loi de Boltzmann, on calcule la probabilit6 de l'&at ouvert ~i l'aide de l'dquation suivante : O=
1
1 + exp(AGORTgFE ) oil E est le potentiel de membrane et Zg est un param~tre appel~ ,, charge de gating ,, qui rend compte des propri6t~s du senseur de voltage. Outre les m~canismes de contr61e de leur ouverture, deux autres propri6t& fonctionnelles des canaux ioniques sont largement dtudides : leur s61ectivit6 ionique et leur sensibilitd fi des agents bloquants ou pharmacologiques. Ces deux propri4tds impliquent de fa~on pr@ond&ante un autre domaine des sousunit~s ix , le domaine <, P ,, (P pour pore). Le terme de s~lectivit8 englobe toutes les interactions entre les ions et le canal qui concourent '5. ce r~sultat surprenant : en ddpit d'une capacitd fi assurer un mouvement tr~s rapide des ions (plusieurs millions par seconde), certains canaux opSrent un tri sdv~re, ne permettant le passage que de quelques types d'ions (4). La s~lectivitd des canaux ioniques fait l'objet d'6tudes sophistiqu&s qui combinent les enregistrements ~lectrophysiologiques, la mutagen~se des canaux et tes 6tudes structurales. Des agents bloquants de canaux ioniques sont, par exemple, des toxines purifi6es dans des venins de serpents, araign6es, scorpions, etc. D'autres agents, comme certains ions, ou des mol6cules de synth6se peuvent bloquer des canaux. La d&ouverte d'une mol6cule capable de bloquer un canal peut avoir des applications th&apeutiques, par exemple. Mais, pour l'~lectrophysiologiste, les agents bloquants, dits ,, pharmacologiques % pr6sentent aussi un int6r6t m&hodologique. En effet, il faut se rendre compte que la membrane d'une cellule possE& des dizaines de types de canaux diffdrents, et il est souvent compliqud d'&udier le courant qui circule fi travers un type de canaux donn6. Dans le cas des canaux rdgul4s par le potentiel de membrane, on pourra travailler pr~f&entiellement dans le domaine de potentiel off les canaux que l'on
es courants ~lectriques h travers les membranes biologiques correspondent h des mouvements d'ions. En effet, dans les solutions ~lectrolytiques qui baignent les deux faces d'une membrane, et travers cette membrane, les porteurs de charge sont des ions : par exemple, Hon potassium (not(~ K*) porte une charge 616mentaire positive. Une mole de K*, soit 6,02 10 =3 ions K*, porte une charge de 1 Faraday, suit 96 500 Coulombs. Cela signifie qu'un courant de 1 picoamp~ro (1 pico-Coulomb par seconde) ~. travers une membrane correspond au passage de plus de 6 millions d'ions K* par seconde. Darts les appareils de mesure, les courants ~lectdques sont port6s par des 61ectrons et non par des ions. A I'interface entre ces apparoils et la pr6paration biologique, les 61ectmdes sont charg6es d'effectuer la conversion entre les deux types de porteurs de charge (ions et 61ectmns). Le type d'61ectmde le plus couramment utilis6 en dlectrophysiologie est 1'61ectrode Ag/AgCI form(~e d'argent m6tallique (connect6 au circuit de mesuro] recouvert de chlorure d'argent (en contact avec la solution dlectrolytique). Le fonctionnement de cette 61ectrode est r6sum6 par 1'6quilibre : AgCI + e- <--> Ag + CI-. Les ~lectrons sont ,, convertis - en ions chlorure et r6ciproquement, & condition que cette ~lectrode soit expos~e h une solution contenant des ions CI-. Le sch6ma ci-dessous montro un fil d'argent chlomr~ & sa surface (l'61ectrode proprement dite) implant6 dens une micropipette de verre remplie d'un 61ectmlyte contenant des ions CI-. La micropipette est obtenue par dtirement d'un tube de verre : & son extr6mit~ fine, I'ouverturo a un diam6tro inf~=rieur au microm~tre ! Grace aux 6tirouses programmables modemes, il est possible d'ajuster la Iongueur de la partie ~tir~e et le diam~ro de I'ouverturo. Le r61e de la micropipette est de contenir 1'61ectrode proprement dite et d'assurer la connexion avec les compartiments cellulaires, grSce h la miniaturisation de sa pointe. On peut, en perforant la membrane
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veut etudier sont actifs et off d'autres sont silencieux. On peut parfois remplacer les ions responsables de courants que l'on ne souhaite pas etudier par d'autres ions de m~me valence, mais qui ne peuvent passer fi travers les canaux. Une autre possibilite consiste ~ utiliser des agents pharmacologiques pour inhiber les canaux que l'on ne souhaite pas etudier, ou observer en quoi leur fonctionnement participe fi la polarisation electrique de la membrane ou fi d'autres fonctions cellulaires. Enfin, l'etude des interactions des bloqueurs de structure connue et d'un canal est souvent utile pour elaborer un modEle structural du pore de ce canal.
LA MI~THODE DU VOLTAGE ~MPOSE De l'equation (1), on retiendra que les informations qui caractErisent le canal et ses interactions avec les ions, avec le potentiel de membrane, ou avec des ligands extra- ou intracellulaires, sont ~ contenues >> dans le paramEtre Gx. Comment determiner ce parametre ? La conductance d'un circuit electrique n'est pas mesuree directement ; elle est donnee par le rapport entre le courant qui parcourt ce circuit et la difference de potentiel qui est appliquee. De mame, G x n'est pas directement mesurable, mais pour peu que l'on sache calculer E x et mesurer E et Ix, l'equation (1) permet de d~terminer G x. La conductance 81ectrique membranaire, c'est-fi-dire la conductance de l'ensemble des systemes de transport electrogEnes qui se trouvent dans la membrane, a pour valeur celle de la pente de la courbe I -- f(E). En pratique, faire du voltage impose, ou voltageclamp, correspond fi forcer un courant I fi circuler ~t
cellulaire & I'aide de la micropipette, obtenir une connexion de I'dlectrode avec le cytoplasme (enregistroment intracellulairo). Si la micropipette est appmch~e au contact de la membrane, il est possible, en aspirant N~g~mmment,de faire adh6ror la membrane au verro. Un petit morceau de membrane (patch) est ainsi isol~ au bout de la pipette : c'est le principe du patch-clamp. •
travers la membrane, de faqon ~ ce que E prenne une valeur precise, egale fi EClam p. On peut construire la courbe I = f(E) au cours d'une serie d'episodes de voltage impose. On impose un potentiel <, de maintien ,> fi la cellule (HP, pour holding potential) souvent choisi au voisinage du potentiel de repos (Eo) : le courant est alors faible (voire nul, si HP = Eo). Au cours d'un premier episode, on impose une premiere valeur de Eclamp, on enregistre le courant I qu'il est ndcessaire de faire circuler ~ travers la membrane, puis on revient fi HP : on obtient ainsi un premier point sur la courbe I = f(E). Au cours d'un deuxieme episode, on impose une autre valeur de Eclamp avant de revenir fi HP, pour obtenir un nouveau point sur cette courbe, et ainsi de suite jusqu'fi ce que l'on dispose de suffisamment de points pour apprecier la pente de la courbe I = f(E) et donc la conductance membranaire dans la gamme de potentiel que l'on a exploree. D'un point de vue materiel, rdaliser une experience de voltage impose necessite d'Etablir une connexion Electrique avec chacun des deux compartiments separes par la membrane dtudiee : c'est le r61e des microelectrodes (voir l'encadrd 3). La configuration experimentale la plus simple met en jeu une microelectrode au contact d'un compartiment cellulaire et une electrode de reference plongee dans la solution exterieure. Dans tousles cas, la (ou les) microelectrode(s) et l'Electrode de reference sont connectees ~ un dispositif (amplificateur de voltage-clamp ou de patch-clamp) permettant de contraindre un courant dlectrique fi circuler d'une electrode ~ l'autre, fi travers la membrane, de faqon fi contr61er la diffdrence de potentiel fi travers celle-ci. L'Electrode de reference est appelee ainsi parce qu'elle est relide fi la terre, et que son potentiel Electrique est donc par definition egal 8 zero : le potentiel LE TECHNOSCOPEDE BIOFUTUR201 • Juin 2000 5
FIG. 1 - Un poste d'enregistrement en patch-clama. A gauche : 1. Microscope ; 2. Micromanipulateur ; 3. Systeme de perfusion ; 4. Table anti-vibration ; 5. Cage de Faraday. ~, droite : 1. I~iectrode de patch ; 2. l~lectrode de r~ference ; 3. Syst~me de perfusion ; 4. Preparation biologique.
electrique de tousles autres pomts du circuit est deftni/mesurd par rapport 'a cette rdf&ence. Les signaux analogiques (potentiels et courants 61ectriques) 8 la sortie de l'amplificateur sont dchantillonnds, c'est-Mdire numdrises pour pouvoir 8tre stock4s puis analyses dans un ordinateur grace 'a un convertisseur analogique/digital (A/D). Les exp& riences de voltage impose sont gdn&alement contr6l&s par l'ordinateur, grace h u n convertisseur digital/analogique (D/A) qui 6met en direction de l'amplificateur des signaux electriques de pilotage. Outre les ~lectrodes, l'amplificateur, l'ordinateur et les convertisseurs A/D et D/A, un poste d'enregistrement (voir la figure 1) comprend un syst@me de perfusion de la solution extracellulaire, des micromanipulateurs permettant de d~placer les electrodes, un microscope avec &entuellement une camera video, un oscilloscope, une cage de Faraday et une table antivibration. Ces deux derniers equipements ont pour r61e d'isoler la pr@aration des perturbations 61ectromagn&iques et m&aniques, et contribuent par 1~ 'a minimiser le bruit dans les enregistrements. Nous ne d&aillerons pas ici les diff@entes techniques de voltage impose, et nous ne distinguerons que deux situations exp4rimentales : le mode <,, pour l'~tude du courant << macroscopique ,, enregistre h travers la membrane d'une cellule entiSre.
LA VIE <~J,~NIIQL.~! DES CANAL!X C'est h la fin des ann~es 1970, dans le laboratoire d'Erwin Neher et Bert Sakmann (laureats du prix 6 LE TECHNOSCOPEDE BIOFUTUR201, Juin 2000
Nobel de physiologie-medecine en 1991) au Max Planck Institut de G6ttingen, en Allemagne, qu'eurent lieu les premiSres tentatives d'enregistrement de l'activite de canaux ioniques ~'t l'echelle mol6culaire. L'id& &ait d'approcher I'extr6mite d'une micro61ectrode de verre tr~s prSs de la membrane d'une cellule musculaire, afin de mesurer le courant dlectrique traversant le fragment de membrane (le patch, en anglais) cerne par l'ouverture de la micropipette. Dans certains cas, les chercheurs constat&rent que la rdsistance electrique de la micro~lectrode augmentait consid&ablement, pour atteindre plusieurs gigaOhms : ils qualifi~rent cet dv6nement de ~, gigaseal ,~ (de l'anglais to seal : sceller) et l'interpret~rent comme un contact &roit entre le ,~ patch ,, et l'extr& mit8 de la pipette. En 6loignant la pipette de la cellule, le patch scell8 "a l'extremit~ de la pipette &ait separ8 de la cellule et se trouvait baignd sur une face par la solution extracellulaire et sur l'autre par la solution de remplissage de la micropipette (voir la figure 2). L'int@St de cette situation &ait que tout courant ~lectrique passant par la micro~lectrode circulait obligatoirement ~1 travers le patch et donc ~ travers les quelques canaux (ou l'unique canal) presents dans cette route petite portion de membrane, baignee par des ~lectrolytes de composition connue. La technique du patch-clamp &ait nSe. Les premiers rSsultats ont 8t8 publics dans la revue Nature (5), puis, apr~s d'importantes ameliorations, la technique fur d&rite en d6tail dans un article cSl~bre (6), bien que public dans une revue moins connue. D'emblee, avant les innombrables applications qu'elle devait trouver depuis, cette formidable avancee technique faisait d'un simple 8cran d'oscilloscope une fen&re ouverte sur la <~vie quantique >> des canaux ioniques. Les ev~nements al~atoires d'ouverture et de fermeture de
chaque canal se traduisent en effet par des fluctuations du c o u r a n t et c'est toujours un spectacle extraordinaire de voir le faisceau lumineux danser sur l'~cran de l'oscilloscope au r y t h m e des c a n a u x ioniques. Aujourd'hui, la technique du patch-clamp a ~t6 appliqude fi u n n o m b r e consid&able de preparations biologiques diff&entes, y compris fi des microorganismes et fi des mat&iels v~g&aux (voir
l' encadrd 4). La figure 3 m o n t r e u n exemple d ' e n r e g i s t r e m e n t s de c o u r a n t ~lectrique fi travers un p a t c h c o n t e n a n t un seul canal. Le p o t e n t i e l de m e m b r a n e impos~ (Eclamp) est indiqu~ en millivolts fi c6t6 de c h a q u e enregistrement. Lorsque ce canal est ferm& le cour a n t oscille faiblement a u t o u r d ' u n niveau de base (&at F). Cet infime c o u r a n t de base circule dans les ,, fuites ,, entre le p a t c h et l'extr~mit~ de la pipette. Lorsque le canal s ' o u v r e (&at O), le c o u r a n t
,, saute ,, fi un autre niveau, puis revient au niveau de base q u a n d le canal se ferme, et ainsi de suite. Des livres entiers ont dt~ consacr6s fi l'analyse de l ' a m p l i t u d e des ,, sauts ,, de c o u r a n t et des temps d ' o u v e r t u r e et de fermeture, en fonction des conditions ioniques, du temps, du potentiel, de la prdsence d ' a g e n t s p h a r m a c o l o g i q u e s , etc. Cela p e r m e t en effet de pr6ciser le m o d e de p e r m 6 a t i o n des ions, le mode d ' a c t i o n des agents p h a r m a c o l o g i q u e s , de d~couvrir c o m b i e n d'dtats c o n f o r m a t i o n n e l s distincts sont occup~s p a r le canal au cours de son ,, cycle r~actionnel ,, (voir l'encadrd 2), de calculer les c o n s t a n t e s de vitesse des transitions entre ces ~tapes, etc. Parmi les i n f o r m a t i o n s que nous pouvons extraire d ' e n r e g i s t r e m e n t s c o m m e ceux de la figure 3, nous ne consid~rerons ci-dessous que l'effet du potentiel de m e m b r a n e sur la probabilit8 de l'&at ouvert et la c o n d u c t a n c e . unitaire ,,.
FIG. 2 - Les diff~rentes configurations de la cellule pour les enregistrements en patch-clamp. LE TECHNOSCOPEDE BIOFUTUR201 ° Juin 2000 7
hez les v6g6taux, la membrane plasmique est entour(~e d'une paroi pecto-cellulosique qu'il faut pr6alablement ~liminer Iorsqu'on veut utiliser la technique du patch-clamp. Classiquement, on proc~de & une digestion enzymatique de I'organe etudi6 pour obtenir des cellules d6pourvues de leur paroi, appel6es protoplastes. Les premiers enregistrements sur protoplastes ont dt6 publi~s quelques ann6es seulement apr~s la technique du patch-clamp (1, 2). La digestion enzymatique produit un grand nombre de protoplastes, mais I'origine tissulaire de ceux-ci n'est pas toujours identifiable. Une autre technique a 6t(~ d(~velopp6e r6cemment : la dissection de la paroi au laser (3). La paroi de la cellule etudi~e est d6coup6e et le protoplaste lib~r6 est immL=diatement ,, patch~ ,,. Pour le moment, cette m~thode n'est appliqude qu'aux tissus extemes (polls absorbants, ~piderme...). Elle pr6sente I'avantage de mieux pr6server I'~tat physiologique d'origine de la cellule qu'apr~s digestion enzymatique. Un autre int~r~t de cette technique consiste & pouvoir travailler sur une cellule dont on connaR I'origine exacte, et m~me examiner I'activite des canaux a differents endroits de la membrane (par exemple la r6gion apicale ou basale du poll absorbant). III
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(1) N. Moran et aL, (1984) Science 226, 835-838. (2) J.I. Schroederet al., (1984) Nature 312, 361-362. (3) A.R. Taylor, C. Brownlee (1992) Plant Physiol. 99, 1686-1688,
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Patch-clamp sur protoplaste isol~ par dissection au laser : (a) apex racinaire d'Arabidopsis. (b-e) Isolement d'un protoplaste de poll absorbant I'aide d'un laser : (b) plasmolyse d'un poll absorbant, la membrane se r~tracte de la paroi & I'apex de la cellule ; (c) d6capitation de la paroi du poll au laser ; (d) liberation du protoplaste par d6plasmolyse de la cellule ; (e) enregistrement en patch-clamp apr~s excision du protoplaste.
La probabilit~ de 1'6tat ouvert On observe sur la figure 3 que les p~riodes pendant lesquelles le canal occupe les &ats O et F o n t des durdes aldatoires quel que soit le potentiel, mais on volt nettement que l'&at O pr6domine plut6t aux potentiels trbs n6gatifs qu'aux potentiels peu n~gatifs. ]~ -160 mV, par exemple, le canal est le plus souvent ouvert, m&me s'il se ferme souvent pour de courts instants (remarquer l'&helle de temps). ~ 80 mV, au contraire, on n'observe aucun 6v6nement d'ouverture sur la portion visible de l'enregistrement. Cela indique que la probabilit~ de l'dtat ouvert de ce canal augmente quand le potentiel de membrane devient plus ndgatif, c'est-fi-dire que ce canal est contr616 par le potentiel de membrane. En pratique, la probabilitd de l'&at ouvert, not& O dans l'dquation (2), s'obtient en divisant la somme des durdes off le courant est au niveau ,, O ,, par la dur~e totale de l'enregistrement. ~. gauche, sous les enregistrements, on volt la courbe O = f(E) qui a une allure sigmoidale, comme ]e pr~voit l'~quation (2) : lorsqu'on a suffisamment de donn6es, on peut calculer la valeur des param~tres zg et AGo de cette ~quation.
La conductance unitaire On observe sur les enregistrements que, pour un potentiel donnd, les sauts de courant, lorsqu'ils ont lieu, sont d'amplitude constante : en &udiant le rapport entre ce courant unitaire (I) et le potentiel de membrane (E), on d&ermine la conductance unitaire du canal. Dans cet exemple, les solutions baignant le patch ont une concentration en K + de 120 m M et la courbe I = f(E) est pratiquement lindaire (5. droite, sous les enregistrements), comme le prdvoit le module de GoldmanHodgkin-Katz (voir l'encadrd 2). La conductance tmitaire est d'environ 6 picoSiemens (pS) dans ces conditions. Avec des solutions contenant 120 m M de Rb +, on trouve pour ce canal une conductance unitaire voisine de 2 pS. Puisque GK/GRb = 3, ce canal est environ 3 fois plus perm&ble au K + qu'au Rb ÷. 8 LE TECHNOSCOPE DE BIOFUTUR 201 • Juin 2000
,,,
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:~ J D E D~: L A - RELA[tON S [ R U C IL.i~,E.~F 0 NC TION Lorsque le g~ne codant un canal a ~t~ clone, il est souvent possible de l'exprimer artificiellement dans une cellule ais~ment manipulable. Au laboratoire, nous utilisons par exemple les ligndes cellulaires COS et Sf9 provenant respectivement du singe Cercopithecus aetbiops et du l@idopt~re Spodoptera frugiperda , et surtout les ovocytes de xdnope. Le xSnope est un batracien dont les ovocytes mesurent 1 fi 2 millimbtres de diam~tre, ce qui facilite beaucoup certaines expdriences d'81ectrophysiologie. L'ovocyte de x~nope est l'un des ~ syst~mes d'expression h&drologue ,, les plus utilis~s, notamment pour l'&ude des canaux ioniques. Quel que soit le systbme choisi, l'iddal est de surexprimer le canal dtudid par rapport aux syst~mes de transport endog~nes pour qu'on puisse ndgliger la contribution de ces derniers fi la conductance membranaire. On parle de ,~ courant macroscopique ,,, et non plus de courant unitaire, car ce courant r~sulte de l'activit~ des milliers de canaux exprim&. L'enregistrement et l'analyse du courant macroscopique sont relativement plus simples que ceux du courant unitaire. Une approche extr~mement f~conde consiste fi comparer le fonctionnement du canal sauvage ~ celui de canaux mut& sur certains acides amin& (7, 8). Cela permet d'identifier les ~ldments structuraux impliquds dans les propri&~s fonctionnelles du canal. II s'agit de l'dtude de la ,, relation structure-fonction ,,. Nous en verrons quelques exemples plus loin. Auparavant, nous allons voir quoi ressembtent ces courants macroscopiques et comment ils nous renseignent, par exemple, sur le m&anisme d'action d'ions bloquants des canaux potassiques, le c&ium (Cs +) et le t&ra&hylammonium (TEA+). La figure 4 montre des courants enregistrds sur des cellules Sf9 exprimant le canal AKT1. On utilise la configuration , cellule enti&re ,, de la technique du patch-clamp (voir la figure 2). Le canal A K T I est le premier canal fi avoir dtd clon~ chez la plante modUle Arabidopsis tbaliana (9). II est exprim6 dans les tis-
sus p~riph6riques de la racine (10) o~ il est pr~sum~ participer ~i l ' a b s o r p t i o n des ions K ÷ (11). Le p r o t o c o l e consiste ~l i m p o s e r / l la cellule des c h a n g e m e n t s i n s t a n t a n & de s o n potentiel de m e m b r a ne p o u r m e s u r e r les c o u r a n t s qui e n r6sultent. La figure 4 (en h a u t , en bleu) m o n t r e les c o u r a n t s e n r e g i s t r & p o u r E = - 5 0 mV, - 1 2 0 m V ou - 1 8 0 mV. II n ' y a pas de c o u r a n t d a n s le p r e m i e r cas. A u x d e u x autres potentiels, le c o u r a n t s'active l e n t e m e n t et finit p a r a t t e i n d r e une valeur n6gative s t a t i o n n a i r e . E n r e p o r t a n t celle-ci en f o n c t i o n de E, o n o b t i e n t la c o u r b e IAKTa = f(E) (figure 4, en bas, en bleu). Cette c o u r b e a u n e allure tr6s diff6rente de celle des c o u r b e s pr~dites p a r le m o d u l e de G H K (voir l'encadr3 2) : p o u r E sup~rieur /i e n v i r o n - 6 0 mV, il n ' y a pas de c o u r a n t h l ' & a t s t a t i o n n a i r e / i travers les c a n a u x A K T 1 . Par analogie avec la p r o p r i & 6 de , rectification ,, des diodes 61ectroniques, o n p a r l e r a de la rectification e n t r a n t e du c o u r a n t A K T 1 . Grfice ~t l'analyse d ' a u t r e s e x p & i e n c e s n o n m o n t r & s ici, n o u s s a v o n s que cette rectification est due fi l'effet de E sur la p r o b a b i l i t 6 de l ' & a t o u v e r t : cette p r o b a b i l i t~ est nulle t a n t que E est sup6rieur fi - 60 m V et elle a u g m e n t e si E d e v i e n t plus n 6 g a t i f que - 60 m V (12). V o y o n s m a i n t e n a n t ce qui se passe si n o u s a j o u t o n s des ions T E A + ou des ions Cs ÷ d a n s la s o l u t i o n ext6rieure. D a n s le p r e m i e r cas (figure 4, en h a u t , en vert), il y a une i n h i b i t i o n de 40 % e n v i r o n du c o u r a n t A K T 1 . Cette i n h i b i t i o n est la m ~ m e fi tous les potentiels & u d i & (figure 4, en bas, en vert). Si l ' o n fait la m S m e experience avec Cs + (figure 4, en h a u t , en rose), o n voit que l ' i n h i b i t i o n est plus forte (presque 100 %) - 180 m V qu'fi - 120 m V (fi peu pros 50 % ) : de ce fait, en p r & e n c e de Cs ÷, il y a m o i n s de c o u r a n t fi - 180 m V q u ' h - 120 mV. Cet effet d o n n e une allure curieuse fi la c o u r b e IAKT1 = f(E) en pr6sence de Cs ÷ (figure 4, en bas, en rose). Ces o b s e r v a t i o n s s o n t classiques p o u r les c a n a u x p o t a s s i q u e s (4) et s'interp r & e n t de la m a n i 6 r e suivante. Le T E A +, t r o p gros
FIG. 3 - letude d'un canal isol~ a diff&ents potentiels.
p o u r passer d a n s la p l u p a r t de ces c a n a u x , o b s t r u e l ' e n t r & du pore. I1 ne p~n&re pas (ou peu) d a n s le c h a m p ~lectrique t r a n s m e m b r a n a i r e " le blocage ne
FIG. 4 - #tude du blocage d'un canal potassique par le tetraethylammonium et le cdsium. LE TECHNOSCOPE DE BIOFUTUR201 • Juin 2000 9
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JUIN 2 0 0 0
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Pourquoi les ions se d~placent-ils ? Les canaux ioniques ." des portes mol~culaires La ~
L' tude des canaux ioniques :
ITEe NOSCOPEJ Christ~le Horeau~, BenoRLacombe~, Jean-BapUste Thibaud et Anne-Alienor Very Bi0chimie et physi010gie m01~culaire des plantes, UMR 5004, Agr0-M0ntpellier, CNRS, Inra. universite M0ntpellier 2, 34060 M0ntpellier cedex 01 Actuellement chez San0fi-Synthelab0 Recherche, 371, rue du Pr-J -Blayac, 34184 M0ntpellier cedex 04 2 Actuellement au Julius-von-Sachs Institut, Lehrstuhl Molekulare Pflanzenphysiologie und Biophysik, Juliusvon-Sachs-Platz 2, D-97082 Wflrzburg, Allemagne. Photo d'ouverture (© M. KAGE/ OKAPIA/CNRI)
(~)
~s la fin des ann~es 1940, les biologistes anglais Alan Hodgkin et Andrew Huxley, alors 5. l'universit& de Cambridge, avaient montr~ que les signaux ~lectriques qui parcourent les membranes des cellules nerveuses pouvaient s'expliquer par des mouvements rapides d'ions potassium et sodium fl travers la membrane cellulaire. Les membranes lipidiques avant une faible perm~abilit~ ~ ces ions, ces chercheurs (laurdats du prix Nobel de m~decine en 1963) avaient alors suppose5 l'existence de structures ins6r~Ses dans la membrane, permettant aux ions de la traverser : ils inventaient ainsi le concept de ,, canaux ioniques ,,. La structure mol~culaire de ces canaux, qu'ils imaginaient comme de grosses prot~ines formant des pores dans la membrane, &ait hors de pottle des m~thodologies exp&imentales de l'~poque. Ce n'est qu'fl partir du d6bat des ann~es 1980 que la structure des canaux ioniques a 6t6 d6couverte, grfice aux progras de la biologie mol&ulaire. C'est aussi fl cette 6poque, (fin des ann&s 1970) que fur inventde une technique d'~lectrophysiologie qui permet d'enregistrer le courant de tr~s faible intensit~ circulant ~ travers un seul canal ionique : le patchclamp. L'usage combin~ des techniques de biologie mol&ulaire et d'~lectrophysiologie s'est g~n&alisd au cours des anndes 1990 et il est maintenant courant de coupler IkStude du g~ne codant un canal fl l'&ude des propri&& fonctionnelles de ce canal en patch-clamp. L'industrie pharmaceutique, en particulier, utilise ces techniques pour dissdquer la fonction de certains r&cepteurs membranaires et tester les effets de nouvelles mol6cules. Ceux pour qui les termes ~, ~lectrophysiologie % patch-clamp et ,, canal ionique ,, restent obscurs voire rebarbatifs sont ici invitas fl entrouvrir la porte d'un laboratoire oO sont atudids des canaux ioniques et fl d~couvrir le charme de ces techniques permettant de visualiser sur un dcran d'oscilloscope des ph& nomenes de nature quantique, qui se d&oulent l'&helle molfculaire, et en quelques milliemes de secondes. Le terme ,, ~lectrophysiologie ,, fair souvent penser 5. l'6tude des cellules nerveuses ou
S
i la vie est apparue darts lamer, les cellules vivantes contiennent bien autre chose que de I'eau de mer ! Elles rec~lent ~videmment des mol6cules organiques complexes qu'elles synthetisent, mais aussi des ions min~raux. Ces ions sont certes presents dans I'eau de mer, mais se trouvent dans les cellules & des concentrations tr~s differentes. Par exemple, I'ion sodium, tr~s concentr~ dans I'eau de mer, est moins a b o n d a n t dans le cytoplasme, et la situation inverse s'observe pour I'ion potassium, qui est le cation dissous le plus abondant dans les cellules vivantes. L'une des activites constantes des cellules vivantes consiste & d~penser de I'energie pour cr(~er et entretenir ces gradients. Pour cela, elles disposent de membranes intrins~quement 6tanches & la plupart des ions, mais pourvues de systemes de transport sp~cialis6s, c o m m e la p o m p e Na+:K + des cellules animales. Cette compartimentation des ions et des molecules, qui est I'une des caracteristiques du vivant, se retrouve aussi au niveau des organites cellulaires (mitochondries, reticulum endoplasmique, chloroplastes, vacuoles, etc.). L'un des aspects les plus connus de cette ,, b i o c h i m i e vect er i el l e ,, impliquant des transports d'un compartiment a un autre & travers une (ou des) membrane(s) est le couplage 6nergetique de la chaine respiratoire, avec la synth~se d'ATP que Peter Mitchell avait decrit darts se fameuse theorie ,, chimiosmotique ,,. Mitchell a C=galement 6nonc~ un critere thermodynamique pour classer les transports d'ions & travers une mem-
2 LE TECHNOSCOPE DE BIOFUTUR 201 • Juin 2000
musculaires. Pourtant, tousles types cellulaires possedent des canaux permdables aux ions dans leurs membranes. Aux d~buts de l'dlectrophysiologie moderne, c'est d'ailleurs sur certaines algues g6antes que les chercheurs enregistraient des potentiels d'action lorsque les fibres nerveuses de calmar (leur module favori) venaient 5. manquer. Pour illustrer ce technoscope, nous montrerons des exemples d'exp& riences r~alis6es dans notrc laboratoire sur des canaux potassiques de cellules vJg6tales.
QU'EST-CE QUE L ~LE~,t ROPHYS!,3LOGtE ? Certaines prot~ines membranaires catalysent le passage d'un substrat "~ travers la membrane (systSmes de transport au sens large) ; elles pnss~dent, en d'autres termes, une activit8 vectorielle (voir l'encadr~ 1). Lorsque le substrat transport8 possSde une charge 81ectrique nette (il s'agit par exemple d'un ion min&al), cette activit8 vectorielle a une <
brane en transports actifs ou passifs. Dans le cas d'une membrane s~parant la solution extracellulaire (e) et le cytoplasme (1~,on peut calculer pour chaque ion X son gradient transmembranaire de potentiel ~lectrochimique (en Joules par mole) : APx = (Px),-(PX)e = R T I n ( x ~ ) + z x F E ou X~ et Xi sont les concentrations extracellulaire et cytoplasmique (en moles par m3), z x est la valence de I'ion, E la difference de potentiel & travers la membrane (en volts, couramment d6sign6e par . potentiel de membrane ,,), R e s t la constante des gaz parfaits (8,31 en Joules par degr~ Kelvin et par mole), T la temperature (en degr~s Kelvin) et F l e Faraday (96 500 Coulombs par mole). Si la membrane possede des canaux perm6ables aux ions X, ces ions auront tendance & passer du compartiment cO leur potentiel electrochimique est le plus ~lev6 au compartiment o0 leur potentiel 61ectrochimique est le plus faible. Les canaux ne perrnettent aux ions que de ,, descendre ,, leur gradient de potentiel ~lectrochimique : ils catalysent un transport dit passif. Au contraire, les pompes ioniques, en utilisant une source d'~nergie (par exemple I'hydrolyse de I'ad~nosine triphosphate), permettent aux ions de ,, remonter ,, leur gradient de potentiel electrochimique : elles catalysent un transport dit actif. •
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ans I'L~luation I x = Gx(E-Ex), qui donne le courant port~ par un ion X, Ix, en fonction de la diff0rence entre le potentiel de membrane, E, et le potentiel d'L.=quilibre de I'ion, Ex, le param~tre Gx a la dimension d'une conductance : la conductance de la membrane ou du canal pour l'ion X. Contrairement a la conductance d'un circuit L=lectrique, Gx n'est pas une constante ind0pendante de E et n'est en far qu'une ,, b o r e noire ,, qui regroupe tous les d0terminants de I x autres que (E-Ex). Dans les ann0es 1940, David Goldman, Alan Hodgkin et Bernard Katz (1, 2) ont propos0 un module, souvent appel~ aujourd'hui ,, module de GHK ,,, qui explicite I'expression math0matique de G x en fonction de E, des concentrations de X de part et d'autre de la membrane, et d'un param~tre intrins~que du couple ion X-canal : le ,, coefficient de perm0abilit~ ~. Comme G x d0pend de E (saul dans le cas d'une &luimolarite de X de part et d'autre de la membrane), la repr0sentation de I x = f(E) ne donne pas une droite, comme dans le cas de la Ioi d'Ohm. En fait, on obtient une courbe monotone croissante b concavit0 toum0e vers le haut ou vere te bas selon que X~ > X e ou )~ < X e (voir l a figure). Le module de GHK, pourtant fond0 sur des postulats difficilement v0rifiables (et pour certains contestables) reste cependant acceptable comme le sugg6re I'~tude rOcente d'un canal K* o0 les donnoes IK = f(E) correspondent aux predictions de ce module (3). Certaines d0viations par rapport au mod01e de GHK peuvent s'expliquer par I'effet du potentiel sur les canaux. Par ailleurs, les interactions de comp0tition ou de ,, cooperativit0 ,, entre ions lots du processus de permeation, I'effet des agents bloquants, etc. peuvent ~tre d0crits par des modules cinetiques calqu0s sur ceux d0velopp0s pour les enzymes classiques, mais avec cette particularit0 que certaines 0tapes du cycle r0actionnel d0pendent du potentiel de membrane (4). •
(1) D.E. Goldman (1943) J. Gen. PhysioL 27, 37-60. (2) A.L. Hodgkin, B. Katz (1949) J. PhysioL 108, 37-77. (3) S.A.N. Goldstein et aL (1996) Proc. Natl. Acad. ScL USA 93, 13256-13261. (4) E. Marban, G.F.Tomaselli (1997) Trends Neurosci. 20, 144-147.
Comme certaines techniques d'imagerie, les techniques d'electrophysiologie offrent l'acc& fi des donn~es sur la fonction d'entit& moleculaires intdgrees dans un environnement biologique complexe. I1 est ainsi possible de montrer la participation de canaux ioniques fi des chalnes de transduction de signaux et de comprendre leur integration dans des fonctions cellulaires. Apr~s avoir isole le gane codant un canal, il est possible d'etudier les bases mol&ulaires des propri~t& fonctionnelles des canaux (&ude de la <, relation structure-fonction ,,), en comparant les propri&& fonctionnelles du canal de type sauvage avec celles de canaux modifi& dans leur sequence peptidique par introduction artificielle de mutations.
POURQUOI LES IONS SE DEPLACENT-tLS ? L'agitation thermique a tendance fi disperser les ions, comme si une force s'exerqait sur ces particules, les obligeant fi diffuser d'un point off elles sont plus concentrdes vers un autre off elles le sont moins. Par ailleurs, chaque ion est soumis fi une force ~lectrique proportionnelle fi sa charge quand il est placd dans un champ electrique : un cation, par exemple, aura tendance fi se deplacer vers les points off le potentiel est plus n~gatif que lfi off il se trouve. La combinaison de ces deux ~nergies potentielles, l'une , osmotique ,, et l'autre electrique, determine ce que l'on
I x (unites arbitraires)
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l
-3 PrOvisions du module de Goldman-Hodgkin-Katz. Une m e m b r a n e permeable a I'ion monovalent X s0pare un compartiment i qui contient X 150 m M et un compartiment e qui contient une concentration de X (1 m M en jaune ; 10 m M en bleu ; 100 m M en rouge ; 150 m M en orange ; 300 m M en vert. Celles-ci repr0sentent le courant porto par I'ion monovalent X (Ix, en unites arbitraires) en fonction de la difference de potentiel E (E i - E e, en mV). Une fl~che verticale indique E x pour chaque courbe.
appelle le potentiel electrochimique de l'ion, note p (voir l'encadrd 1). Si l'on consid~re une membrane separant des solutions contenant des ions, il existe pour chaque ion une valeur remarquable du potentiel de membrane pour laquelle le potentiel electrochimique est le mSme de chaque c6td de la membrane. I1 s'agit du potentiel ,~ de Nernst ,,, ou potentiel d'equilibre de l'ion X, note E x = -(RT/zxF)ln(Xi/Xe). Au potentiel de Nernst (E = Ex), l'effet de la force electrique compense exactement celui de la force osmotique et aucun courant dans un canal (i.e. courant passif) ne peut alors &re port8 par l'ion X. L'Squation suivante, calqu~e sur la loi d ' O h m applicable aux circuits electriques (I = G.E, off I est le courant en AmpSres, G la conductance en Siemens et E la diff&ence de potentiel en volts) donne la relation gen~rale entre le potentie] de membrane et le courant I x vehicul~ par un ion X fi travers la membrane : I x = Gx(E-Ex) (1) off G x (> O) represente la conductance de la membrane ~ l'ion X (voir l'encadrd 2). L'~quation (1) permet de prSvoir le sens du courant port~ par un ion donne en fonction du signe du terme (E-Ex). Voyons maintenant quelques exemples. Comme K + est generalement plus concentre dans le cytoplasme qu'fi l'exterieur de la cellule, EK est gen&alement n6gatif. Si le potentiel de membrane (gen&alement ndgatif dans une cellule) est moins negatif que EK et qu'un canal perm&ble fi K+ est ouvert, K÷ ne pourra LE TECHNOSCOPEDE BIOFUTUR201 " Juin 2000 3
[TEC..OSCOP'q que sortir de la cellule ~ travers ce canal (courant I K sortant, positif avec la convention de signe en 61ectrophysiologie). En revanche, si le potentiel de membrane est plus n6gatif que E K (situation fr4quente dans les cellules v6g&ales), K+ ne pourra qu'entrer dans la cellule fi travers un canal K + (IK entrant, n6gatif). Au contraire, Ec~ est positif, ainsi que ENa et EH, dans la plupart des cellules. Dans les conditions physiologiques off E est toujours alg6briquement inf&ieur ENa , Eta et EH, les ions Na+, Ca 2+ et H+ ne pourront qu'entrer dans la cellule fi travers des canaux qui les laisseraient passer. Pour terminer, rappelons la r6gle de l'61ectroneutralit6, qui veut que la somme de tous les courants port4s par toutes les charges 41ectriques franchissant la membrane soit nulle. En ne consid~rant, par simplification, que les courants passifs d4crits par l'~quation (1), on peut 6crire • =
X
=
X
.x
X
~7 ~ ((;xEx)
=
0
X
On en tire que :
E-
X X
(CxLx)
((;x)
Bien qu'approximative, cette relation permet de comprendre pourquoi l'ouverture ou la fermeture de canaux perm~ables fi un type d'ion peut faire varier le potentiel de membrane. Par exemple, si la cellule est polaris& fi 60 mV et que des canaux perm6ables ~ Na + s'ouvrent (GNa augmente et devient grand devant les autres termes Gx), E v a tendre vers le potentiel d'dquilibre de Na+, c'est-~-dire se rapprocher de z&o (se ~, d~polariser ,), puisque ENa est positif. Si des canaux perm6ables fi K÷ s'ouvrent alors, et que G K domine les autres termes Gx, E tendra fi revenir vers la valeur ndgative EK, c'est-h-dire se ,, repolariser ,>. C'est approximativement ainsi que Hodgkin, Huxley et Katz avaient propos6 que le potentiel d'action des cellules nerveuses consiste en une d6polarisation produite par l'ouverture de canaux Na+ suivie d'une repolarisation r6sultant de la fermeture de ces canaux et l'ouverture de canaux K + (1).
LES C A N A U X IONJQUES : DES PORTES MOL, ECULA~RES Les canaux ioniques sont des protdines fortunes par l'assemblage de plusieurs sous-unit&. Les sous-unit6s , fonctionnelles ,, (ix) traversent la membrane et menagent en leur sein le pore aqueux dans lequel circulent les ions. Les sous-unit~s ,< r6gulatrices , (13,7, 8) interagissent avec les ix. Elles s'&endent sur l'6paisseur de la membrane, ou restent sur l'interface membranecytoplasme. Des sites de glycosylation et de phosphorylation sont rep&ds dans la s6quence des r6gions extra- et intraceltulaires des diff~rentes sous-unit6s (2). Un canal ionique est un peu comparable fi une porte, il peut 6tre d~crit en fonction de son 6tat : ouvert ou ferm4. Bien que plus de deux conformations mol6culaires existent, on peut consid&er, par approximation, que chaque canal oscille de fa~on aldatoire e n t r e un &at ouvert de p r o b a b i l i t 6 0 et un ~tat fermd de probabilit6 F, avec O + F = 1. Si l'agitation thermique &ait le seul facteur fi consid&er, on pourrait &rire, en appliquant la loi de Boltzmann, que le rapport O/F est dgal fi e x p ( - A G o / R T ) , off AGo est le 4 LE TECHNOSCOPEDE BIOFUTUR201 • Juin 2000
changement d'dnergie conformationnelle lors de la transition de l'&at ferm4 fi l'6tat ouvert (pour une mole de canal). Comme O + F = 1, on en tire l'expression de la probabilit6 de l'~tat ouvert • O-
1
1+ exp ( ~N/ i l Mais les choses sont en rdalitd plus compliqu4es, et d'autres facteurs que l'agitation thermique interviennent dans le changement conformationnel. On peut grosso modo distinguer trois modes de contr61e de l'ouverture des canaux : la r&eption membranaire d'un signal extracellulaire (neurom8diateur, hormone, variation de pH,...), le contr61e par un facteur cytoplasmique (Ca 2+, kinase/phosphatase, pH, nucl~otide cyclique, ATP...) et le contr61e par te potentiel de membrane (voltage-gating). Les canaux r~gulds par le potentiel de membrane sont les mieux d&rits au niveau mol&ulaire. Leurs sous-unit6s c~ pr&entent une s&ie d'acides amines charg& positivement dans un domaine consid&d comme le senseur de voltage (voltage sensor). En se d@laCant fi travers la membrane sous l'effet d'une variation du potentiel de membrane, ce domaine faciliterait le passage d'une configuration "a l'autre (3). Darts ce cas, toujours en appliquant la loi de Boltzmann, on calcule la probabilit6 de l'&at ouvert ~i l'aide de l'dquation suivante : O=
1
1 + exp(AGORTgFE ) oil E est le potentiel de membrane et Zg est un param~tre appel~ ,, charge de gating ,, qui rend compte des propri6t~s du senseur de voltage. Outre les m~canismes de contr61e de leur ouverture, deux autres propri6t& fonctionnelles des canaux ioniques sont largement dtudides : leur s61ectivit6 ionique et leur sensibilitd fi des agents bloquants ou pharmacologiques. Ces deux propri4tds impliquent de fa~on pr@ond&ante un autre domaine des sousunit~s ix , le domaine <, P ,, (P pour pore). Le terme de s~lectivit8 englobe toutes les interactions entre les ions et le canal qui concourent '5. ce r~sultat surprenant : en ddpit d'une capacitd fi assurer un mouvement tr~s rapide des ions (plusieurs millions par seconde), certains canaux opSrent un tri sdv~re, ne permettant le passage que de quelques types d'ions (4). La s~lectivitd des canaux ioniques fait l'objet d'6tudes sophistiqu&s qui combinent les enregistrements ~lectrophysiologiques, la mutagen~se des canaux et tes 6tudes structurales. Des agents bloquants de canaux ioniques sont, par exemple, des toxines purifi6es dans des venins de serpents, araign6es, scorpions, etc. D'autres agents, comme certains ions, ou des mol6cules de synth6se peuvent bloquer des canaux. La d&ouverte d'une mol6cule capable de bloquer un canal peut avoir des applications th&apeutiques, par exemple. Mais, pour l'~lectrophysiologiste, les agents bloquants, dits ,, pharmacologiques % pr6sentent aussi un int6r6t m&hodologique. En effet, il faut se rendre compte que la membrane d'une cellule possE& des dizaines de types de canaux diffdrents, et il est souvent compliqud d'&udier le courant qui circule fi travers un type de canaux donn6. Dans le cas des canaux rdgul4s par le potentiel de membrane, on pourra travailler pr~f&entiellement dans le domaine de potentiel off les canaux que l'on
es courants ~lectriques h travers les membranes biologiques correspondent h des mouvements d'ions. En effet, dans les solutions ~lectrolytiques qui baignent les deux faces d'une membrane, et travers cette membrane, les porteurs de charge sont des ions : par exemple, Hon potassium (not(~ K*) porte une charge 616mentaire positive. Une mole de K*, soit 6,02 10 =3 ions K*, porte une charge de 1 Faraday, suit 96 500 Coulombs. Cela signifie qu'un courant de 1 picoamp~ro (1 pico-Coulomb par seconde) ~. travers une membrane correspond au passage de plus de 6 millions d'ions K* par seconde. Darts les appareils de mesure, les courants ~lectdques sont port6s par des 61ectrons et non par des ions. A I'interface entre ces apparoils et la pr6paration biologique, les 61ectmdes sont charg6es d'effectuer la conversion entre les deux types de porteurs de charge (ions et 61ectmns). Le type d'61ectmde le plus couramment utilis6 en dlectrophysiologie est 1'61ectrode Ag/AgCI form(~e d'argent m6tallique (connect6 au circuit de mesuro] recouvert de chlorure d'argent (en contact avec la solution dlectrolytique). Le fonctionnement de cette 61ectrode est r6sum6 par 1'6quilibre : AgCI + e- <--> Ag + CI-. Les ~lectrons sont ,, convertis - en ions chlorure et r6ciproquement, & condition que cette ~lectrode soit expos~e h une solution contenant des ions CI-. Le sch6ma ci-dessous montro un fil d'argent chlomr~ & sa surface (l'61ectrode proprement dite) implant6 dens une micropipette de verre remplie d'un 61ectmlyte contenant des ions CI-. La micropipette est obtenue par dtirement d'un tube de verre : & son extr6mit~ fine, I'ouverturo a un diam6tro inf~=rieur au microm~tre ! Grace aux 6tirouses programmables modemes, il est possible d'ajuster la Iongueur de la partie ~tir~e et le diam~ro de I'ouverturo. Le r61e de la micropipette est de contenir 1'61ectrode proprement dite et d'assurer la connexion avec les compartiments cellulaires, grSce h la miniaturisation de sa pointe. On peut, en perforant la membrane
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veut etudier sont actifs et off d'autres sont silencieux. On peut parfois remplacer les ions responsables de courants que l'on ne souhaite pas etudier par d'autres ions de m~me valence, mais qui ne peuvent passer fi travers les canaux. Une autre possibilite consiste ~ utiliser des agents pharmacologiques pour inhiber les canaux que l'on ne souhaite pas etudier, ou observer en quoi leur fonctionnement participe fi la polarisation electrique de la membrane ou fi d'autres fonctions cellulaires. Enfin, l'etude des interactions des bloqueurs de structure connue et d'un canal est souvent utile pour elaborer un modEle structural du pore de ce canal.
LA MI~THODE DU VOLTAGE ~MPOSE De l'equation (1), on retiendra que les informations qui caractErisent le canal et ses interactions avec les ions, avec le potentiel de membrane, ou avec des ligands extra- ou intracellulaires, sont ~ contenues >> dans le paramEtre Gx. Comment determiner ce parametre ? La conductance d'un circuit electrique n'est pas mesuree directement ; elle est donnee par le rapport entre le courant qui parcourt ce circuit et la difference de potentiel qui est appliquee. De mame, G x n'est pas directement mesurable, mais pour peu que l'on sache calculer E x et mesurer E et Ix, l'equation (1) permet de d~terminer G x. La conductance 81ectrique membranaire, c'est-fi-dire la conductance de l'ensemble des systemes de transport electrogEnes qui se trouvent dans la membrane, a pour valeur celle de la pente de la courbe I -- f(E). En pratique, faire du voltage impose, ou voltageclamp, correspond fi forcer un courant I fi circuler ~t
cellulaire & I'aide de la micropipette, obtenir une connexion de I'dlectrode avec le cytoplasme (enregistroment intracellulairo). Si la micropipette est appmch~e au contact de la membrane, il est possible, en aspirant N~g~mmment,de faire adh6ror la membrane au verro. Un petit morceau de membrane (patch) est ainsi isol~ au bout de la pipette : c'est le principe du patch-clamp. •
travers la membrane, de faqon ~ ce que E prenne une valeur precise, egale fi EClam p. On peut construire la courbe I = f(E) au cours d'une serie d'episodes de voltage impose. On impose un potentiel <, de maintien ,> fi la cellule (HP, pour holding potential) souvent choisi au voisinage du potentiel de repos (Eo) : le courant est alors faible (voire nul, si HP = Eo). Au cours d'un premier episode, on impose une premiere valeur de Eclamp, on enregistre le courant I qu'il est ndcessaire de faire circuler ~ travers la membrane, puis on revient fi HP : on obtient ainsi un premier point sur la courbe I = f(E). Au cours d'un deuxieme episode, on impose une autre valeur de Eclamp avant de revenir fi HP, pour obtenir un nouveau point sur cette courbe, et ainsi de suite jusqu'fi ce que l'on dispose de suffisamment de points pour apprecier la pente de la courbe I = f(E) et donc la conductance membranaire dans la gamme de potentiel que l'on a exploree. D'un point de vue materiel, rdaliser une experience de voltage impose necessite d'Etablir une connexion Electrique avec chacun des deux compartiments separes par la membrane dtudiee : c'est le r61e des microelectrodes (voir l'encadrd 3). La configuration experimentale la plus simple met en jeu une microelectrode au contact d'un compartiment cellulaire et une electrode de reference plongee dans la solution exterieure. Dans tousles cas, la (ou les) microelectrode(s) et l'Electrode de reference sont connectees ~ un dispositif (amplificateur de voltage-clamp ou de patch-clamp) permettant de contraindre un courant dlectrique fi circuler d'une electrode ~ l'autre, fi travers la membrane, de faqon fi contr61er la diffdrence de potentiel fi travers celle-ci. L'Electrode de reference est appelee ainsi parce qu'elle est relide fi la terre, et que son potentiel Electrique est donc par definition egal 8 zero : le potentiel LE TECHNOSCOPEDE BIOFUTUR201 • Juin 2000 5
FIG. 1 - Un poste d'enregistrement en patch-clama. A gauche : 1. Microscope ; 2. Micromanipulateur ; 3. Systeme de perfusion ; 4. Table anti-vibration ; 5. Cage de Faraday. ~, droite : 1. I~iectrode de patch ; 2. l~lectrode de r~ference ; 3. Syst~me de perfusion ; 4. Preparation biologique.
electrique de tousles autres pomts du circuit est deftni/mesurd par rapport 'a cette rdf&ence. Les signaux analogiques (potentiels et courants 61ectriques) 8 la sortie de l'amplificateur sont dchantillonnds, c'est-Mdire numdrises pour pouvoir 8tre stock4s puis analyses dans un ordinateur grace 'a un convertisseur analogique/digital (A/D). Les exp& riences de voltage impose sont gdn&alement contr6l&s par l'ordinateur, grace h u n convertisseur digital/analogique (D/A) qui 6met en direction de l'amplificateur des signaux electriques de pilotage. Outre les ~lectrodes, l'amplificateur, l'ordinateur et les convertisseurs A/D et D/A, un poste d'enregistrement (voir la figure 1) comprend un syst@me de perfusion de la solution extracellulaire, des micromanipulateurs permettant de d~placer les electrodes, un microscope avec &entuellement une camera video, un oscilloscope, une cage de Faraday et une table antivibration. Ces deux derniers equipements ont pour r61e d'isoler la pr@aration des perturbations 61ectromagn&iques et m&aniques, et contribuent par 1~ 'a minimiser le bruit dans les enregistrements. Nous ne d&aillerons pas ici les diff@entes techniques de voltage impose, et nous ne distinguerons que deux situations exp4rimentales : le mode <
LA VIE <~J,~NIIQL.~! DES CANAL!X C'est h la fin des ann~es 1970, dans le laboratoire d'Erwin Neher et Bert Sakmann (laureats du prix 6 LE TECHNOSCOPEDE BIOFUTUR201, Juin 2000
Nobel de physiologie-medecine en 1991) au Max Planck Institut de G6ttingen, en Allemagne, qu'eurent lieu les premiSres tentatives d'enregistrement de l'activite de canaux ioniques ~'t l'echelle mol6culaire. L'id& &ait d'approcher I'extr6mite d'une micro61ectrode de verre tr~s prSs de la membrane d'une cellule musculaire, afin de mesurer le courant dlectrique traversant le fragment de membrane (le patch, en anglais) cerne par l'ouverture de la micropipette. Dans certains cas, les chercheurs constat&rent que la rdsistance electrique de la micro~lectrode augmentait consid&ablement, pour atteindre plusieurs gigaOhms : ils qualifi~rent cet dv6nement de ~, gigaseal ,~ (de l'anglais to seal : sceller) et l'interpret~rent comme un contact &roit entre le ,~ patch ,, et l'extr& mit8 de la pipette. En 6loignant la pipette de la cellule, le patch scell8 "a l'extremit~ de la pipette &ait separ8 de la cellule et se trouvait baignd sur une face par la solution extracellulaire et sur l'autre par la solution de remplissage de la micropipette (voir la figure 2). L'int@St de cette situation &ait que tout courant ~lectrique passant par la micro~lectrode circulait obligatoirement ~1 travers le patch et donc ~ travers les quelques canaux (ou l'unique canal) presents dans cette route petite portion de membrane, baignee par des ~lectrolytes de composition connue. La technique du patch-clamp &ait nSe. Les premiers rSsultats ont 8t8 publics dans la revue Nature (5), puis, apr~s d'importantes ameliorations, la technique fur d&rite en d6tail dans un article cSl~bre (6), bien que public dans une revue moins connue. D'emblee, avant les innombrables applications qu'elle devait trouver depuis, cette formidable avancee technique faisait d'un simple 8cran d'oscilloscope une fen&re ouverte sur la <~vie quantique >> des canaux ioniques. Les ev~nements al~atoires d'ouverture et de fermeture de
chaque canal se traduisent en effet par des fluctuations du c o u r a n t et c'est toujours un spectacle extraordinaire de voir le faisceau lumineux danser sur l'~cran de l'oscilloscope au r y t h m e des c a n a u x ioniques. Aujourd'hui, la technique du patch-clamp a ~t6 appliqude fi u n n o m b r e consid&able de preparations biologiques diff&entes, y compris fi des microorganismes et fi des mat&iels v~g&aux (voir
l' encadrd 4). La figure 3 m o n t r e u n exemple d ' e n r e g i s t r e m e n t s de c o u r a n t ~lectrique fi travers un p a t c h c o n t e n a n t un seul canal. Le p o t e n t i e l de m e m b r a n e impos~ (Eclamp) est indiqu~ en millivolts fi c6t6 de c h a q u e enregistrement. Lorsque ce canal est ferm& le cour a n t oscille faiblement a u t o u r d ' u n niveau de base (&at F). Cet infime c o u r a n t de base circule dans les ,, fuites ,, entre le p a t c h et l'extr~mit~ de la pipette. Lorsque le canal s ' o u v r e (&at O), le c o u r a n t
,, saute ,, fi un autre niveau, puis revient au niveau de base q u a n d le canal se ferme, et ainsi de suite. Des livres entiers ont dt~ consacr6s fi l'analyse de l ' a m p l i t u d e des ,, sauts ,, de c o u r a n t et des temps d ' o u v e r t u r e et de fermeture, en fonction des conditions ioniques, du temps, du potentiel, de la prdsence d ' a g e n t s p h a r m a c o l o g i q u e s , etc. Cela p e r m e t en effet de pr6ciser le m o d e de p e r m 6 a t i o n des ions, le mode d ' a c t i o n des agents p h a r m a c o l o g i q u e s , de d~couvrir c o m b i e n d'dtats c o n f o r m a t i o n n e l s distincts sont occup~s p a r le canal au cours de son ,, cycle r~actionnel ,, (voir l'encadrd 2), de calculer les c o n s t a n t e s de vitesse des transitions entre ces ~tapes, etc. Parmi les i n f o r m a t i o n s que nous pouvons extraire d ' e n r e g i s t r e m e n t s c o m m e ceux de la figure 3, nous ne consid~rerons ci-dessous que l'effet du potentiel de m e m b r a n e sur la probabilit8 de l'&at ouvert et la c o n d u c t a n c e . unitaire ,,.
FIG. 2 - Les diff~rentes configurations de la cellule pour les enregistrements en patch-clamp. LE TECHNOSCOPEDE BIOFUTUR201 ° Juin 2000 7
hez les v6g6taux, la membrane plasmique est entour(~e d'une paroi pecto-cellulosique qu'il faut pr6alablement ~liminer Iorsqu'on veut utiliser la technique du patch-clamp. Classiquement, on proc~de & une digestion enzymatique de I'organe etudi6 pour obtenir des cellules d6pourvues de leur paroi, appel6es protoplastes. Les premiers enregistrements sur protoplastes ont dt6 publi~s quelques ann6es seulement apr~s la technique du patch-clamp (1, 2). La digestion enzymatique produit un grand nombre de protoplastes, mais I'origine tissulaire de ceux-ci n'est pas toujours identifiable. Une autre technique a 6t(~ d(~velopp6e r6cemment : la dissection de la paroi au laser (3). La paroi de la cellule etudi~e est d6coup6e et le protoplaste lib~r6 est immL=diatement ,, patch~ ,,. Pour le moment, cette m~thode n'est appliqude qu'aux tissus extemes (polls absorbants, ~piderme...). Elle pr6sente I'avantage de mieux pr6server I'~tat physiologique d'origine de la cellule qu'apr~s digestion enzymatique. Un autre int~r~t de cette technique consiste & pouvoir travailler sur une cellule dont on connaR I'origine exacte, et m~me examiner I'activite des canaux a differents endroits de la membrane (par exemple la r6gion apicale ou basale du poll absorbant). III
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(1) N. Moran et aL, (1984) Science 226, 835-838. (2) J.I. Schroederet al., (1984) Nature 312, 361-362. (3) A.R. Taylor, C. Brownlee (1992) Plant Physiol. 99, 1686-1688,
P,311s aDsoroaNs
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Patch-clamp sur protoplaste isol~ par dissection au laser : (a) apex racinaire d'Arabidopsis. (b-e) Isolement d'un protoplaste de poll absorbant I'aide d'un laser : (b) plasmolyse d'un poll absorbant, la membrane se r~tracte de la paroi & I'apex de la cellule ; (c) d6capitation de la paroi du poll au laser ; (d) liberation du protoplaste par d6plasmolyse de la cellule ; (e) enregistrement en patch-clamp apr~s excision du protoplaste.
La probabilit~ de 1'6tat ouvert On observe sur la figure 3 que les p~riodes pendant lesquelles le canal occupe les &ats O et F o n t des durdes aldatoires quel que soit le potentiel, mais on volt nettement que l'&at O pr6domine plut6t aux potentiels trbs n6gatifs qu'aux potentiels peu n~gatifs. ]~ -160 mV, par exemple, le canal est le plus souvent ouvert, m&me s'il se ferme souvent pour de courts instants (remarquer l'&helle de temps). ~ 80 mV, au contraire, on n'observe aucun 6v6nement d'ouverture sur la portion visible de l'enregistrement. Cela indique que la probabilit~ de l'dtat ouvert de ce canal augmente quand le potentiel de membrane devient plus ndgatif, c'est-fi-dire que ce canal est contr616 par le potentiel de membrane. En pratique, la probabilitd de l'&at ouvert, not& O dans l'dquation (2), s'obtient en divisant la somme des durdes off le courant est au niveau ,, O ,, par la dur~e totale de l'enregistrement. ~. gauche, sous les enregistrements, on volt la courbe O = f(E) qui a une allure sigmoidale, comme ]e pr~voit l'~quation (2) : lorsqu'on a suffisamment de donn6es, on peut calculer la valeur des param~tres zg et AGo de cette ~quation.
La conductance unitaire On observe sur les enregistrements que, pour un potentiel donnd, les sauts de courant, lorsqu'ils ont lieu, sont d'amplitude constante : en &udiant le rapport entre ce courant unitaire (I) et le potentiel de membrane (E), on d&ermine la conductance unitaire du canal. Dans cet exemple, les solutions baignant le patch ont une concentration en K + de 120 m M et la courbe I = f(E) est pratiquement lindaire (5. droite, sous les enregistrements), comme le prdvoit le module de GoldmanHodgkin-Katz (voir l'encadrd 2). La conductance tmitaire est d'environ 6 picoSiemens (pS) dans ces conditions. Avec des solutions contenant 120 m M de Rb +, on trouve pour ce canal une conductance unitaire voisine de 2 pS. Puisque GK/GRb = 3, ce canal est environ 3 fois plus perm&ble au K + qu'au Rb ÷. 8 LE TECHNOSCOPE DE BIOFUTUR 201 • Juin 2000
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:~ J D E D~: L A - RELA[tON S [ R U C IL.i~,E.~F 0 NC TION Lorsque le g~ne codant un canal a ~t~ clone, il est souvent possible de l'exprimer artificiellement dans une cellule ais~ment manipulable. Au laboratoire, nous utilisons par exemple les ligndes cellulaires COS et Sf9 provenant respectivement du singe Cercopithecus aetbiops et du l@idopt~re Spodoptera frugiperda , et surtout les ovocytes de xdnope. Le xSnope est un batracien dont les ovocytes mesurent 1 fi 2 millimbtres de diam~tre, ce qui facilite beaucoup certaines expdriences d'81ectrophysiologie. L'ovocyte de x~nope est l'un des ~ syst~mes d'expression h&drologue ,, les plus utilis~s, notamment pour l'&ude des canaux ioniques. Quel que soit le systbme choisi, l'iddal est de surexprimer le canal dtudid par rapport aux syst~mes de transport endog~nes pour qu'on puisse ndgliger la contribution de ces derniers fi la conductance membranaire. On parle de ,~ courant macroscopique ,,, et non plus de courant unitaire, car ce courant r~sulte de l'activit~ des milliers de canaux exprim&. L'enregistrement et l'analyse du courant macroscopique sont relativement plus simples que ceux du courant unitaire. Une approche extr~mement f~conde consiste fi comparer le fonctionnement du canal sauvage ~ celui de canaux mut& sur certains acides amin& (7, 8). Cela permet d'identifier les ~ldments structuraux impliquds dans les propri&~s fonctionnelles du canal. II s'agit de l'dtude de la ,, relation structure-fonction ,,. Nous en verrons quelques exemples plus loin. Auparavant, nous allons voir quoi ressembtent ces courants macroscopiques et comment ils nous renseignent, par exemple, sur le m&anisme d'action d'ions bloquants des canaux potassiques, le c&ium (Cs +) et le t&ra&hylammonium (TEA+). La figure 4 montre des courants enregistrds sur des cellules Sf9 exprimant le canal AKT1. On utilise la configuration , cellule enti&re ,, de la technique du patch-clamp (voir la figure 2). Le canal A K T I est le premier canal fi avoir dtd clon~ chez la plante modUle Arabidopsis tbaliana (9). II est exprim6 dans les tis-
sus p~riph6riques de la racine (10) o~ il est pr~sum~ participer ~i l ' a b s o r p t i o n des ions K ÷ (11). Le p r o t o c o l e consiste ~l i m p o s e r / l la cellule des c h a n g e m e n t s i n s t a n t a n & de s o n potentiel de m e m b r a ne p o u r m e s u r e r les c o u r a n t s qui e n r6sultent. La figure 4 (en h a u t , en bleu) m o n t r e les c o u r a n t s e n r e g i s t r & p o u r E = - 5 0 mV, - 1 2 0 m V ou - 1 8 0 mV. II n ' y a pas de c o u r a n t d a n s le p r e m i e r cas. A u x d e u x autres potentiels, le c o u r a n t s'active l e n t e m e n t et finit p a r a t t e i n d r e une valeur n6gative s t a t i o n n a i r e . E n r e p o r t a n t celle-ci en f o n c t i o n de E, o n o b t i e n t la c o u r b e IAKTa = f(E) (figure 4, en bas, en bleu). Cette c o u r b e a u n e allure tr6s diff6rente de celle des c o u r b e s pr~dites p a r le m o d u l e de G H K (voir l'encadr3 2) : p o u r E sup~rieur /i e n v i r o n - 6 0 mV, il n ' y a pas de c o u r a n t h l ' & a t s t a t i o n n a i r e / i travers les c a n a u x A K T 1 . Par analogie avec la p r o p r i & 6 de , rectification ,, des diodes 61ectroniques, o n p a r l e r a de la rectification e n t r a n t e du c o u r a n t A K T 1 . Grfice ~t l'analyse d ' a u t r e s e x p & i e n c e s n o n m o n t r & s ici, n o u s s a v o n s que cette rectification est due fi l'effet de E sur la p r o b a b i l i t 6 de l ' & a t o u v e r t : cette p r o b a b i l i t~ est nulle t a n t que E est sup6rieur fi - 60 m V et elle a u g m e n t e si E d e v i e n t plus n 6 g a t i f que - 60 m V (12). V o y o n s m a i n t e n a n t ce qui se passe si n o u s a j o u t o n s des ions T E A + ou des ions Cs ÷ d a n s la s o l u t i o n ext6rieure. D a n s le p r e m i e r cas (figure 4, en h a u t , en vert), il y a une i n h i b i t i o n de 40 % e n v i r o n du c o u r a n t A K T 1 . Cette i n h i b i t i o n est la m ~ m e fi tous les potentiels & u d i & (figure 4, en bas, en vert). Si l ' o n fait la m S m e experience avec Cs + (figure 4, en h a u t , en rose), o n voit que l ' i n h i b i t i o n est plus forte (presque 100 %) - 180 m V qu'fi - 120 m V (fi peu pros 50 % ) : de ce fait, en p r & e n c e de Cs ÷, il y a m o i n s de c o u r a n t fi - 180 m V q u ' h - 120 mV. Cet effet d o n n e une allure curieuse fi la c o u r b e IAKT1 = f(E) en pr6sence de Cs ÷ (figure 4, en bas, en rose). Ces o b s e r v a t i o n s s o n t classiques p o u r les c a n a u x p o t a s s i q u e s (4) et s'interp r & e n t de la m a n i 6 r e suivante. Le T E A +, t r o p gros
FIG. 3 - letude d'un canal isol~ a diff&ents potentiels.
p o u r passer d a n s la p l u p a r t de ces c a n a u x , o b s t r u e l ' e n t r & du pore. I1 ne p~n&re pas (ou peu) d a n s le c h a m p ~lectrique t r a n s m e m b r a n a i r e " le blocage ne
FIG. 4 - #tude du blocage d'un canal potassique par le tetraethylammonium et le cdsium. LE TECHNOSCOPE DE BIOFUTUR201 • Juin 2000 9
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