Métabolisme des phosphopeptides et des phosphoprotéines de microsomes isolés du cerveau de rat

BIOCHIM1E, 197'8, 60, 601-607.

Mdtabolisme des phosphopeptides et des phosphoprotdines de microsomes isolds du cerveau de rat. Marc LEDIG ( *) ~ , Jean-Yves LE DEAUT et Paul MANDEL.

Centre de Neurochimie du CNRS, Institat de Chimie Bioloyique,

(23-1~-1977).

11, rue Humann, 67085 Strasboury Cedex France.

R~sum~.

are preferentially localized in membranous formations. The phosphopeptides were solubilized b y extractinq delipidated microsomes with an acidified methanol-chloroform solution ; the solution w as shaken with 1/5 of its volume of water, the phosphopeptides were found in the upper phase and their specific radioactivity was measured.

Nous avons mis en 6vidence des phosphopeptides qui pourraient ~tre impliqu6s dans le m6canisme du transport actif [1]. Leur localisation membranaire pr6f6rentielle de m~me que le renouvellement rapide de leur copule phosphor6e parlent en faveur d'un tel r61e" semblable & celui des phosphoprot6ines. Nous avons 6tudi6 l'incorporation de phosphate ~P dans les phosphopeptides et phosphoprot6ines de microsomes de cerveau de rat incub6s en pr6sence de [~2p] ATP. L'effet de I'ATP, de I'ADP, du sodium et du potassium a 6t6 6tudi6. Par aiUeurs, nous avons isol6 de la phosphos6rine m a r q u e e au 32p & partir de phosphopeptides isol6s du cerveau de porc, incubus en pr6sence de [y32p] ATP et de microsomes de cerveau de rats. Ces exp6riences suqqbrent que les phosphopeptides pourraient ~tre des accepteurs du Py de I'ATP dans le m6canisme des activit&s ATPasiques intervenant a u cours du transport actif.

Summary. W e studied the incorporation of 32p into phosphopeptides and phosphoproteins after incubation of rat brain microsomes in the presence of [s2p.~] ATP and various factors involved in (Na +, K+) ATPase dependent reactions. The phosphopeptides are different from the phosphoproteins, since their phosphate is stable under alcaline condition. They contain hiqh amounts of phosphoserine and qlycine ; they

(*) Chargd de Recherche au CNRS. (> To w h o m all correspondence s h o u l d be addressed.

The residue was hydrolysed durinq 15 h at 37°C with N KOH; the phosphate of the phosphoproteins was liberated and its specific radioactivity was measured. The kinetics of 32p incorporation into the phosphopeptides w as found to be different accordinq to the ATP concentration in the incubation me, dium. When ATP was 0,025 mM the maximum 32p incorporation was reached after 15 rain ; when ATP w as 1,5 mM the maximum was reached within 1 rain, then decreased. In presence of 5 mM ADP the rate of 32p incorporation was reduced in the phosphopeptides and in the phosphoproteins. W h e n K was omitted the specific radioactivity increased mainly in the phosphoproteins. When K and Na were omitted the specific radioactivity increased in the phosphoproteins, but decreased in the phosphopeptides. We also showed that the 32p was ensymatically transferred from ATP to the phosphopeptides b y the isolation of ~'~P labeled phosphoserine from partially purified phosphopeptides of piq brain incubated with (32P7) ATP and Triton X-100 treated rat brain microsomes taken as a ~ crude enzyme preparation of phosphopeptide phosphokinase ,,. No labeled phosphoserine was found when the microsomes were boiled before incubation. Our data show that the phosphopeptides as well as the phosphoproteins m a y be acceptors of the 7P from ATP, related to m em brane ATPase activities.

602

M. L e d i 9 , J . - Y . L e D e a u t et P. M a n d e l .

Introduction. Au cours de recherches ant&rieures, nous avons 6 t u d i 6 le m d t a b o l i s m e d e s p h o s p h o p e p t i d e s et d e s phosphoprot6ines d a n s d e s c o u p e s et d a n s d e s m i c r o s o m e s isol6s d u c e r v e a u d e r a t [11. Ces p h o s p h o p e p t i d e s se d i s t i n g u e n t d e s p h o s p h o p r o t d i n e s e s s e n t i e l l e m e n t p a r 1cur c o m p o r t e m e n t e n m i l i e u a l c a l i n . Le P d e s p h o s p h o p r o t d i n e s est h y d r o l y s 6 e n m i l i e u a l c a l i n N h 37°C a l o r s q u e c e l u i d e s phosphopeptides n e P e s t p a s ; p a r c o n t r e , les phosphopeptides sont extr6mement labiles en milieu acide. Ces p h o s p h o p e p t i d e s r e n f e r m e n t d e la p h o s p h o sdrine que nous avons caractdris6e apr6s une hydrolyse partiell, e des phosphopeptides ; l'analyse d e l e u r c o m p o s i t i o n e n a c i d e s a m i n d s i n d i q u e la p r d s , e n c e de q u a n t i t d s p r d d o l n i n a n t e s d e g l y c o colle, d e s d r i n e e,t d ' a c i d e s amin6.s <>, l e u r c o n f d r a n t des p r o p r i 6 t d s de v d r i t a b l e s 6 c h a n g e u r s d'ions. N o u s a v o n s s u g g d r 6 q u e ces p h o s p h o p e p t i d e s pourraient intervenir conjointement a v e c les p h o s p h o p r o t d i n e s darts le m d c a n i s m e d u t r a n s p o r t actif. E n effet, l e u r s t r u c t u r e p o l y a n i o n i q u e , l e u r l o c a l i s a t i o n m e I n b r a n a i r e p r d f d r e n t i e l l e [21 et le renouvelleulent extr&mement rapide de leur c o p u l e p h o s , p h o r d e El, 3, 4, 5~ c o n s t i t u e n t d e s a r g u m e n t s e n f a v e u r d ' u n t e l r51e. Gette 6tude apporte un compldment d'informat i o n s a u x t r a v a u x de R o d n i g h t et d e ses c o l l a b o r a t e u r s q u i o u t 6 t u d i 6 d e p u i s p l u s i e u r s a n n 6 e s , la phosphorylation des protdines membranaires E613~. Ces a u t e u r s o n t m o n t r 6 q u ' a u c o u r s d e s a c t i v i t d s A T P a s i q u e s q u i i n t e r v i e n n e n t d a n s lc m d c a n i s m e d u t r a n s p o r t actif, le P ~ d e I ' A T P se f i x a i t p a r d i v e r s t y p e s d e l i a i s o n s s u r des i n t e r m 6 d i a i r e s d e n a t u r e p o l y p e p t i d i q u e s . Ces l i a i s o n s s o n t , les u n e s l a b i l e s , t e l l e s les l i a i s o n s a c y l - p h o s p h a t e s , les a u t r e s p l u s s t a b l e s c o m m e la l i a i s o n e s t e r p h o s phate. Or, n o u s a v o n s m o n t r 6 p r d c 6 d e m m e n t [2! q u e ces phosphopeptides renfermaient des liaisons amides qui sont stables en milieu alcalin et tr6s l a b i l e s e n m i l i e u a c i d e . O n s a l t e n e f f e t E14] q u ' e n m i l i e u a c i d e , le P li6 h la sdrin,e p e u t s u b i r u n e t r a n s f o r m a t i o n i n t r a m ~ l & c u l a i r e d e l a l i a i s o n P-O en une liaison P-N beaucoup plus labile, comme Pest l a l i a i s o n a c y l - p h o s p h a f e . Ce t r a v a i l c o n c e r n e l ' d t u d e d u m 6 t a b o l i s m e d e s p h o s p h o p e p f i d e s et d e s p h o s p h o p r o t d i n e s e n r e l a t i o n a v e c d e s p a r a m 6 t r e s i n t e r v e n a n t d a n s les r d a c t i o n s A T P a s i q u e s (Na, K +) d 6 p e n d a n t e s , t e l l e s la c o n c e n t r a t i o n e n A T P , e t e n A D P o u la p r d s e n c e

BIOCHIMIE, 1978, 60, n ° 6-7.

de cations susceptib}es d'6tre transportds h trav e r s les m e m b r a n e s c e l l u l a i r e s . N o u s avon,s 6galement abordd l'dtude de la phosphorylation in vitro d e p h o s p h o p e p t i d e s prdalablement isolds afin d e m o n t r e r q u e le PV d e I ' A T P p e u t d a n s c e r taines conditions 6tre transfdr6 sur ces phosphopeptides.

Mat4riel

et Mdthodes.

Prdparation et incubalion des microsomes. Les p h o s p h o p e p t i d e s et les p h o s p h o p r o t d i n e s ont 6t6 isolds /l p a r t i r de microsomes de cerveau de r a t et out 6t6 analysds comme n o u s l ' a v o n s ddcrit prdcddemm e n t [1]. L ' h o m o g 6 n a t de cerveau dans du sacrose 0,25 M a 6td centrifugal p e n d a n t 15 m n h 26 000 g afin de ddposer les d6bris cellulaires, les n o y a u x et la f r a c t i o n m i t o c h o n d r i a l e ; puts le s u r n a g e a n t a 6t6 centrifugal pend a n t 90 m n / l 8~1 (~00 g afin de ddposer la f r a c t i o n microsomale. Chaque 6 c h a n t i l l o n c o n t e n a n t les microsolnes prov e n a n t de 2 cerveanx de r a t s (environ 10 mg de protdines) a dtd incub6 sous a g i t a t i o n dans 2 ml de milieu s t a n d a r d c o n t e n a n t : Tris-HC1 pH 7,4 24 mM:, glucose 11 mM, NaG1 137 raM, KG1 6 mM', MgC12 1,5 mM. Les modifications apportdes ~_ ee milieu scront indiqudes dans les rdsultats. L'ATP [y32p], prdpar6 selon G l y n n ct Ghappel [17], a 6td ujout6 apr6s 15 m n de p r d i n c u b a t i o n h 37°C. Les i n c u b a t i o n s ont 6t6 a r r i t d e s h des ddlais v a r i a b l e s suiv a n t le type d'expdrience p a r de l'acide perchlorique coneentrd froid (0,6 N final). Les dchantillons ont 6t6 centrifugals et l a r d s p a r de l'aeide perchlorique 0,6 N c o n t e n a n t 1 mg de p h o s p h a t e de sodimn p a r ml puts q u a t r e fois avec de l'eau et sdchds p a r l'acdtone.

Exlraction des phosphopeptides et des phosphoprol~ines. Apr6s u n e ddlipidation p a r u n mdlange m d t h a n o l c h l o r o f o r m e 1-2 v/v, les rdsidus ont 6t6 e x t r a i t s avec u n mdlange mdthanol-ehloroforme-HC1 12 N 100-200-1 v / v qui solubilise les phosphopeptides. Cette solution a dt6 agitde avee 1/5 de son volume d'eatt et les phosphopeptides passent dans la p h a s e supdrieure dans laquelle nous avons ddtermin6 l e u r radioactivit6 spdcifique. Les rdsidus d ' e x t r a e t i o n des p h o s p h o p e p t i d e s ont 6t6 sdchds p a r l'acdtone puts hydrolysds p e n d a n t 15 h h 37°C p a r de la potasse 1N qui libbre le P des phosphoprotdines sous f o r m e de P i n o r g a n i q u e d o n t nous avons ddtermin6 la radioactivitd spdcifique. Le P des p h o s p h o p e p t i d e s a dt6 ddtermin6 p a r la mdthode de Chen et coll. [18] apr6s m i n d r a l i s a t i o n des dehantillons p a r 0,1 ml d'acide sulfurique concentr6, le P i n o r g a n i q u e p r o v e n a n t des p h o s p h o p r o t d i n e s a dtd ddtermin6 p a r la mdthode de M a r t i n et Doty [191. La

Mdtabolisme des phosphopeplides el des phosphoprotdines. radioactivit6 a ~t6 mesur6e par scintillation liquide. Les rdsultats ont 6t6 exprim6s en cpm/~xgP. Phosphorylation in vitro de phosphopeptides isolds du cerveau de pore. P o u r l'6tude de la p h o s p h o r y l a t i o n in vitro de phospbopeptides pr6alablemcnt isol6s nons avons utilisfi des p h o s p h o p e p t i d e s extraits du cervean de pore. Apr6s une d6lipidation tr6s poussde du tissu par nn m61ange m 6 t h a n o l - e h l o r o f o r m e 1-1 v / v suivi d'une extraction par un m61ange m6thanol-chloroforme-KC1 2M [20], les p h o s p h o p e p t i d c s ont ~t6 solubilis6s an m o y e n d ' u n m61ange KCI-10-1 M, EDTA 10-8 M. Dithi0thrditol 1~)-4 M puis fil¢r6s sur charbon actif et ddsal6s sur Sephadex G 10. De cette mani6re, les p h o s p h o p e p tides sont extraits en 6vitant toute d6gradation aeide. Ces p h o s p h o p e p t i d e s ont 6t~ incubds h raison de 160 Ixg par ~eh.antillon p e n d a n t 15 m n h 37°C sous agitation dans le milieu s t a n d a r d (2 ml/~chantiHon) c o n t e n a n t des mierosomes de eerveau de rat (10 m g / ~chantillon) et de I'ATP [y32p] 0,025 mM (5 X 106 c p m / ~ehantillon). A la fin des incubations, les ~chantillons ont ~t6 centrifuges p e n d a n t 30 m n h 100 000 g, les p h o s p h o p e p t i d e s du cerveau de pore se t r o u v e n t dans le surnageant. A p a r t i r de ces phosphopeptides, nous avons isol~ de la phosphos6rine m a r q u e e au 32p. Mise en dvidence de phosphosdrine radioactive. E t a n t donn6 que le P d.es p h o s p h o p e p t i d e s est rapid e m e n t hydrolys6 en milieu acide et qu'il est r6sistant h l ' h y d r o l y s e alcaline, nous avons isol6 la phosphos6rine par le proc~d6 suivant : la solution de p h o s p h o peptides a 6t~ hydrolys6e p e n d a n t 15 h h 100°C en milieu I(OH3N. L ' h y d r o l y s a t a dr6 neutralis~ par l'acide perchlorique et l e perchlorate de p o t a s s i u m formd a 6td $1imin~ p a r centrifugation, puts l ' h y d r o lysat a 6t~ concentr$ e t soumis h une 61ectrophor6se sur papier p e n d a n t 2 h sous 2 000 V dans u n t a m p o n acide f o r m i q u e 5 p. cent acide ac6tique 15 p. cent, en presence d'un m a r q u e u r de phosphos6rine pure non radioactive. Apr6s rep~rage de la phosphos6rine par coloration de l'~lectrophor~gramme, p a r une solution ac~tonique de n i n h y d r i n e /l 2 p. cent, l'dlectrophordg r a m m e a 6td d6coup6 en bandes de 1 cm de large et la radioactivitd a ~t6 mesur6e par scintillation liquide. La phosphos@ine a ~t6 raise en 6vidence de la m6me mani6re en effectuant une c h r o m a t o g r a p h i e sur papier dans l e solvant pyridine-ethan01-ammoniaque-14N-eau 3-3-3-1 v / v p e n d a n t 15 h h temp6rature a m b i a n t e [1].

R~sultats. E f [ e t de la c o n c e n t r a t i o n en A T P sur r i n c o r p o r a t i o n d u P 7 de I ' A T P darts les p h o s p h o p e p t i d e s et les p h o s p h o p r o t ~ i n e s de m i c r o s o m e s isol~s du c e r v e a u de rat. BIOCHIMIE, 1978, 60, n" 6-7.

603

Au cours de nos exp6riences an t6rieures [1], la p h o s p h o r y t a t i o n des p h o s p h o p e p t i d e s et des phosp h o p r o t 6 i n e s avait 6t6 6tudi6e ,en pr6sence de faibles c o n c e n t r a t i o n s en ATP (0,02.5 raM). A pr6sent, nous avons incub6 des microsomes de cerveau de rat dans le milieu s t a n d a r d c o n t e n a n t de I'ATP 1,5 mM ce qui c o r r e s p o n d h u n taux 6gal /I celui du Mg÷÷ n6cessaire h l'activit6 optimale de l'ATPase (Na +, K +) d 6 p e n d a n t e [21]. Nous avons

|

1 ~

6000

-~ o. o '~, 4000 .~ "0 2000

.

t

~

t

5 10 temps (mn)

15

Fro. 1. - - Activitd spdcifique des phosphopeptides (. . . . . ) et des phosphoprotdines ( --) de microsomes isolds du cerveau de ral et incubus ~ 37°C en presence d ' A T P [ys2p] (5 X 108 cpm),, 1,5 mM dans le milieu standard (0), en prdsence d'ADP 5 mM (&). Moyenne de 6 exp6riences.

m e s u r 6 l ' i n c o r p o r a t i o n d u 32p d a n s les p h o s p h o p e p t i d e s et d a n s les p h o s p h o p r o t 6 i n e s e n pr61evant des 6chantillons de m i c r o s o m e s h diff6rents d61ais d ' i n c u b a t . i o n et a v o n s c o n s t a t 6 d a n s ces conditions un marquage trbs rapide des phosphop e p t i d e s qui d 6 c r o i t e n t r e 1 et 15 m n d ' i n c u b a t i o n (fig. 1). C e i t e c i n 6 t i q u e est d i f f 6 r e n t e d e c e l l e q u e n o u s a v o n s o b s e r v 6 e en p r 6 s e n c e d e f a i b l e s c o n c e n t r a , t i o n s e n A T P (0,025 raM), c ' e s t - h - d i r e u n m a x i m u m d ' i n c o r p o r a t i o n d u 32p a p r 6 s 15 m i n d ' i n c u b a t i o n en p r 6 s e n c e d ' A T P [v32P]. P a r c o n t r e , la c i n 6 t i q u e d e ]a p h o s p h o r y l a t i o n d e s p h o s p h o p r o t 6 i n e s est la m 6 m e q u e la con~en= t r a t i o n en A T P d u m i l i e u d ' i n c u b a t i o n soit 0,025 mM ou 1,5 raM.

M . L e d i g , J . - Y . L e D e a u l el P . M a n d e l .

604

E f f e t de I ' A D P s u r l ' i n c o r p o r a t i o n d u P v de I ' A T P d a n s les p h o s p h o p e p t i d e s el les p h o s p h o p r o M i n e s isolds d u c e r v e a u de rat.

E [ f e t des c a t i o n s m o n o v a l e n t s s u r l ' i n c o r p o r a tion d u P v de I ' A T P dans les p h o s p h o p e p t i d e s el les p h o s p h o p r o t ~ i n e s isolds au c e r v e a u de rat.

II u o u s a p a r u i n t 6 r e s s a n t d e v o i r si la c o n c e n tration en ADP constitue un fact eur limitant dans la p h o s p h o r y l a t i o n des phosphopeptides et d e s p h o s g h o p r o t 6 i n e s . A c e t effet, n o u s a v o n s i n c u b 6

N o u s a v o n s 6 t u d i 6 l ' i n f l u e n c e d e s i o n s N a ÷ et K ÷ s u r la p h o s p h o r y l a t i o n d e s p h o s p h o p e p t i d e s et des phosphoprot6ines en supprimant soit l'un, s o i t les d e u x i o n s h la f o i s d a n s le m i l i e u d ' i n c u b a r t o n (fig. 2). L o r s q u e o n s u p p r i m e le K ~, o n c o n s t a t e u n e augm e n t a t i o n i m p o r t a n t e ( e n v i r o n 100 p. c e n t ) de la p h o s p h o r y l a t i o n d e s p h o s p h o p r o t 6 i n e s h t o u t e s les

8000 P inorganique 50000 I

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1

5

10

15

temps (mn) FIG. 2. - - Radioactivit~ sp~eifique des phosphopeptides (. . . . . . ) el des phosphoproldines ( ) de microsomes isol~s du eerveau de rat et incubds dl 37°C en presence d'ATP [yszp] (5 X 106 cpm) 1,5 mM dans le milieu standard (O)', en l'absence de K + (A), en absence de K + et de Na + (B). Moyenne de 6 expfiriences.

les l n i c r o s o m e s e n p r 6 s e n c e d ' A T P 1,5 m M c o m m e n o u s v e n o n s d~e l e d 6 c r i r e et e n a j o u t a n t d e I ' A D P 5 m M a u m i l i e u d ' i n c u b a t i o n (fig. 1). Darts ces conditions, nous avons constat6 une diminution d e l ' i n c o r p o r a t i o n d u a2p darts les p h o s p h o p e p t i d e s et darts les p h o s p h o p r o t 6 . i n e s , p l u s i m p o r t a n t e ( e v n i r o n 30 p. c e n t ) p o u r les c o u r t e s d u r 6 e s d ' i n c u b a t i o n q u e p o u r les dur6,es p l u s l o n g u e s . P a r a i l l e u r s , n o u s a v o n s c o n s t a t 6 q u e I ' A D P est s a n s e f f e t t o r s q u e o n s u p p r i m e le N a ÷ et le K ~ darts le milieu d'incubation. BIOCHIMIE, 1978, 60, n ° 6-7.

FIG. 3. - - ElectrophorEgramme d'un h y d r o l g s a t de phosphopeptides. RadioaetiviM mesur~e apr~s Electrophor~se sur papier (2 h sous 2000 V dans un melange HCOOH 5 p. cent - - C H , COOH 15 p. cent) d'un hydrolysat partiel de phosphopeptides de ceroeau de porc incubus in vitro en presence d'ATP [y32p] 0,025 mM et de microsomes de ceroeau de rats : (0) Incubation dans le milieu standard, (O) ~ incubation en prdsence d'EDTA 10-~ M + Triton X-IO0 2 p. cent, (B) incubation avec des microsomes bouillis, (A) incubation en absence de phosphopeptides.

dur6es d'incubations que nous avons ~tudides. L ' a u g m e n t a t i o n d e la p h o s p h o r y l a l i o n d e s p h o s phopeptides est moins importante mats atteint n 6 a n m o i n s 50 p. c e n t a p r 6 s 15 m i n d ' i n c u b a t i o n . L o r s q u e o n s u p p r i m e h la fois le K + et le N a ÷ clans le m i l i e u d ' i n c u b a t i o n , o n c o n s t a t e u n e augmentation de l a lahosphorylation des phosphoprot6ines s.emblable h celle que l'on observe en a b s e n c e d e s i o n s K ÷ s e u l e m e n t . E n ce q u i c o n cern, e 1.es p h o s p h o , p e p t i d e s , o n c o n s t a t e u n e d i m i n u t i o n d e l ' i n c o r p o r a f i o n d u 32]) p l u s i m p o r t a n t e ( . e n v i r o n 30 p. c e n t ) p o u r l es c o u r t e s d u r 6 e s d ' i n c u b a t i o n q u e p o u r les d u r 6 e s p l u s l o n g u e s .

Mdtabolisme des phosphopeptides

et d e s p h o s p h o p r o t d i n e s .

605

TABLE I. p. cent de radioaetivit6 au niveau de la phosphos6rine

Milieu d'incubation Standard -{- EDTA 10-'2M ~- EDTA 10-UM-3t- sodium dod6cyl sulfate 2 p. cent ~- EDTA 10-UM ~-triton X-100 2 p.cent

0,50 1,10 1,60 1,98

-I~-t-I-

0,19 0,42"* 0,26"* 0,77"*

Pourcentage de la radioactivitd retrouv6e au niveau de la phosphos6rine isol6e par 6lectrophorSse sur papier h partir d'un hydrolysat partiel, de phosphopeptides de eerveau de pore incubus en pr6sence d'ATP [~32p1 0,025 mM (5 × 10e cpm) pendant 15 mn ~ 37°C. ~oyenne de 5 exp6riences. (**) p = 0,01.

P h o s p h o r y l a t i o n in v i t r o de p h o s p h o p e p t i d e s isolds du cerveau de porc en p r e s e n c e de m i c r o somes isol~s du cerveau de rat. Nous avons c h e r c h 6 h m e t t r e en 6vidence le t r a n s f e r t in vitro du Pv de I ' A T P sur des p h o s p h o pepti.des p r 6 a t a b l e m e n t isot6s en les m.ettant en pr6sence d'un syst6me e n z y m a f i q u e b r u t non p u r i fi6 r e n f e r m a n t les phospho:kinases susceptibles d ' i n t e r v e n i r clans la p h o s p h o r y l a t i o n des p h o s p h o peptides. A cet effet, des m i c r o s o m e s de c e r v e a u de rat ont 6t6 in cubds ,dans le m i l i e u s t a n d a r d contenant un m61ange de p h o s p h o p e p t i d e s isol.6s du c e r v e a u de p o r c et d'AT.P [V:~P 1. Nous a v o n s utilis6 une faible c o n c e n t r a t i o n en ATP p o u r 6tre dans les con.dit,ions du m a r q u a g e lent [1] 6tant donn6 la dur6e des op6rations. A p a r t i r de ces phosphopeptid.es, nous avon,s iso16 de 1.a p h o s p h o s6rine m a r q u 6 e au z2p ce qui constitue le test de l ' i n c o r p o r a t i o n du P'I d~e I'ATP dans les p h o s p h o p e p t i d e s isol~s du c e r v e a u de porc. Nous avons constat6. (table I) que le taux de p h o s p h o s 6 r i n e r a d i o a c t i v e ainsi raise en 6vidence, bien que faible en v a l e u r :absolue, double en pr6sence d ' E D T A 10 -2 M. L o r s q u e on a joute en plus des d6tergents au m i l i e u d ' i n c u b a t i o n le taux de p h o s p h o s 6 r i n e r a d i o a c t i v e tri,ple en pr6s, ence de s o d i u m dod6cyl sulfate 2 p. cent et q u a d r u p l e en pr6sence de T r i t o n X-100 2 p. cent. H s'agit bien d ' u n e i n c o r p o r a t i o n de P radioactif darts la p h o s p h o s 6 r i n e des p h o s p h o p e p t i d e s du c e r v e a u de p o r e p a r l ' i n l e r m 6 d i a i r e d'un syst6me e n z y m a t i q u e corrtenu darts l es m i c r o s o m e s de c e r v e a u de rat c a r on ne t r o u v e pas de phosp h o s 6 r i n e r a d i o a c t i v e l o r s q u e les inct~bations ont 6t~ effectu6es en p r 6 s e n c e de m i c r o s o m e s pr6al a b l e m e n t bouillis (fig. 3). 11 ne s'agit pas de phosp h o s 6 r i n e l ibSr6e p a r les m i c r o s o m e s c a r on ne

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t r o u v e pas de p h o s p h o s 6 r i n e r a d i o a c t i v e en incuba'nt les m i c r o s o m e s en a b s e n c e de p h o s p h o p e p tid, es de c e r v e a u de p o r e (fig. 3).

Discussion. A ta suite des t r a v a u x d ' u n g r a n d h o m b r e d'auteurs [15, 16] a y a n t ,d6montr6 l ' i n t e r v e n t i o n de prot6ines p h o s p h o r y l 6 e s dans le m 6 c a n i s m e ATPase d6p'endant du t r a n s p o r t actif, nos r e c h e r ches .sur les phosphopeptid,es t e n d e n t h m o n t r e r que ces constituants essen.tiellement membnanaires p o u r r a i e n t 6galement j o u e r un rSle au cours du t r a n s p o r t acAif. Darts ce but, nous avons 6tudi6 'la phosphoryl.ation des p h o s p h o p e p t i d e s et des p h o s p h o p r o t 6 i n e s en p r 6 s e n c e ou absence de divers facteurs i n t e r v e n a n t dans les m 6 c a n i s m e s du t r a n s p o r t actif, en c h o i s i s s a n t c o m m e t y p e de m e m b r a n e s , les m i c r o s o m e s isol6s du c e r v e a u de rat. Nous avons constat6 que l ' i n c o r p o r a t i o n de a2p darts 1,es p h o s p h o p e p t i d e s d 6 p e n d a i l du taux d ' A T P darts le m i l i e u d ' i n c u b a t i o n , c'est-~-dire de l ' e n v i r o n n e m e n t 6nerg6tique des m e m b r a n e s . En pr6sence d'un faible taux d ' A T P (0,025 raM), la p h o s p h o r y l a t i o n des p h o s p h o p e p t i d e s est lente, elle n ' a t t e i n t son m a x i m u m qu',aprbs 15 m i n d'inc u b a t i o n alors q u ' e n p r 6 s e n c e d ' A T P 1,5 mM, ce qui r e p r 6 s e n t e un taux plus p h y s i o l o g i q u e , la p h o s p h o r y l a t i o n est extr6m.ement r a p i d e donc c o m p a l i b l e avec la rapidit6 d ' u n m 6 c a n i s m e de transport. La c i n 6 t i q u e de la phosphoryla,tion des p h o s p h o p r o t 6 i n e s ne semble pas 6tre affect6e p a r la c o n c e n t r a t i o n en ATP du milieu ext6rieur.

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M. Ledig, J.-Y. Le D e a u t et P. Mandel.

Ces observations s o n t h r a p p r o c h e r de celles de Hems et R o d n i g h t E8~ qui onl ~tudi6 le m 6 c a n i s m e de la p h o s p h o r y l a t i o n des m~crosomes du cerveau de boeuf :au cours des activit6s A T P a s i q u e s . Ils ont montr6 que la cin~tique de l'inc'(~rpotation du 32p dans le.s prot~ines qui i n t e r v i e n n e n t dans le m 6 c a n i s m e des activit6s A T P a s i q u ~ d6pendait de la c o n c e n t r a t i o n en ATP du m i l i e u d ' i n c u b a t i o n . Doherty et Matsumura ~22~ ont 6galement montr6 l'influence de la c o n c e n t r a t i o n en ATP sur la phosp h o r y l a t i o n de prot6ines i,sol6es d'axones d e h o m a r d qui servent d'interm6,diaires~dans les acti: vit6s ATPasiques. Dans le m6me ordre d'id6e F r o e h l i c h [231 a m o n t r 6 l ' i n c i d e n c e de la c o n c e n t r a t i o n en ATP et l'effet du ~(+ sur une e n z y m e phosphoryl6e, isol6e des m i c r o s o m e s d'61ectropl~aques de l'anguille 61ectriqu,e. L'6tude de l'effet des ,cations m o n o v a l e n t s sur la p h o s p h o r y l a l i o n des p h o s p h o p e p t i d e s et des phosphoprot~.ines a m0ntr~ q u e l e Na + a u n effet stimul.ant s u r cel]e d e s phosphopeptides' 6rant donn6 que les activil6s spdcifiques des phosphopeptides sont plus faibles l o r s q u e le Na + est supprim6, du m i l i e u d ' i n c u b a t i o n . La p h o s p h o r y l a t i o n des p h o s p h o p r o t 6 i n e s ne semble pas 6tre i n f l u e n c6,e p a r les ions Na +. Le K÷ p a r contre agit essentiell~ement sur la p h o s p h o r y l a t i o n des phospboprot~ines car les activit6s sp6cifiques sont plus 61ev6es lorsque l'on s u p p r i m e le K + clans ~e m i l i e u d ' i n c u b a t i o n . Le ~(? a 6galement u n effet i n h i b a n t sur l.a p h o s p h o r y l a t i o n des phosphopeptides, mats m o i n d r e que sur celle des phosphoprot6ines. Dans l'ensemble, les ions Na + s t i m u l e n t plut6t des activil6s prot6ine kinasiques, a l o r s que les ions I( + a u g m e n t e n t plut6t .des activi[6s phosphatasiques. L'ADP p r o d u i t au cours de l ' h y d r o l y s e de I'ATP semble i n h i b e r la p h o s p h o r y l a t i o n des phosphopeptides el des p h o s p h o p r o t 6 i n e s comme ! ' i n d i q u e la d i m i n u t i o n des activit6s s,p6cifiqu.es lorsque les microsomes out 6t6 incub6s en presence d ' u n excbs d'ADP (5 raM). Cette i n h i b i t i o n des r6acl i o n s d e p h o s p h o r y l a t i o n p a r I'ADP a 6galement 6t6. observ6e p a r Miller et P a u s e n [24] d a n s les segments externes d e la r6tine et par Mhrdh ~25] lors de la p h o s p h o r y l a t i o n de l'ATPase (Na +, K +) d 6 p e n d a n t e isol6e du c e r v e a u de boeuf. P a r ailleurs, nos exp6riences ont montr6 que I'ADP n ' a pas d'effet lorsque le.s m i c r o s o m e s ont 6t6 incub6s en absence de Na + et de K +, c'est-h-dire lorsque l'ATtPas,e (Na +, K+) d 6 p e n d a n t e n'est pas stimul6e. Ge,ci a 6.gal.ement 616 sugg6r6 p a r T o b i n el .coil [26] dans les p h o s p h o r y l a t i o n s qui interv i e n n e n t au cours des activit6s ATPasiques d u eerveau de rat. Leurs exp6riences m o n l r e n t que I'ADP agit seulement sur la p h o s p h o r y l a t i o n des prot6ines en pr6sence de quantit6s 61ev6es d'ions

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Na +. Averuch et F a i r b a n k s [27] ont observ6 des effets de I'ATP, de I'ADP et des cations, semblables h ceux que nous avons conslat6s chez les microsomes de cerveatt de rat, en 6tudiant des phosphopeptides isol6s p a r des solutions de forces ioniques faibles h p a r t i r des m e m b r a n e s d'6rythrocytes h u m a i n s . Afin de d 6 m o n t r e r que les p h o s p h o p e p t i d e s que nous avons isol6s sont b i e n des accepteurs du P~t de I'ATP au cours de son hydro]yse et que les mic r o s o m e s eonti.ennenl des activit6s e n z y m a t i q u e s capables d'effectuer ce lranSfert nous avons montr6 q u ' e n in c u b a n t des microsomes de cerv.eau de rat avec les phosphotieptides p r 6 a l a b l e m e n l isol6s du cerveau de p o r e et de I'ATP [~uP~, il esl possible d'isoler de la p h o s p h o s 6 r i n e radioactive p a r t i r de ces phosphopeplid,es. Nous avons choisi comme mesure de la phosp h o r y l a t i o n in vitro des p h o s p h o p e p t i d e s le pourcentage de radioactivit6 d6tect6 au n i v e a u de 1.a p h o s p h o s 6 r i n e que nous avons isol6e p a r h y d r o lyse partielle des phosphopeptides, mOme si ce p o u r e e n t a g e est faible. Nous avons utilis6 une h y d r o l y s e a l c a l i n e pouss6e plut6t q u ' u n e hydrolyse acide car la destruction de la p h o s p h o s 6 r i n e en cours de l ' h y d r o l y s e aeide est trbs i m p o r t a n t e [ ~ ] . C~es p h o s p h o p e p t i d e s ont en effet la propri6t~ d'etre plus stables e n milieu alcalin q u ' e n m i l i e u acide. Nous avons constat6 que la phosphor y l a t i o n in vitro des p h o s p h o p e p t i d e s 6tai,l plus i m p o r t a n t e e n pr6sence d ' E D T A ceci semble 6tre dfi h la chelation des cations bival,ents qui f o r m e n t des ponts entre les diff6renls p h o s p h o p e p t i d e s comme nous l'avons sugg6r6 p r 6 c 6 d e m m e n t [201. E n pr6sence d'EDTA, ces ponts p o u r r a i e n t 6tre rompus, r e n d a n t l es g r o u p e m e n l s phosphates accessibles h la p h o s p h o r y l a t i o n . Nous avons 6gal,ement montr6 que la phosphor y l a t i o n des p h o s p h o p e p t i d e s in vitro 6tait facilit6e p a r la pr6sence de d6tergents dans le milieu d ' i n c u b a t i o n ; ce qui semble 6tre dfl '~ la solubilisation des enzymes impliqu6es dans le m6canisme du l r a n s f e r t du P't de I'ATP sur les p h o s p h o p e p tides. Un p h 6 n o m b n e semblable a 6galement 6t6 montr6 p o u r u n syst~me .enzymatique phosphor y l a n t des prot6ines de fragments m e m b r a n a i r e s isol6s de l'organe 61ectrique de l'anguille 61ectrique [29]. Une s t i m u l a t i o n de l'activit6 ATPasique (Na +, K +) d 6 p e n d a n t e p a r ]e Lubrol et le Triton X100 a 6galement 6t6 observ6e [30~. Nous avons m o n t r 6 que le P7 de I'ATP 6tait bien transf6r6 sur les p h o s p h o p e p t i d e s par u n systbme e n z y m a l i q u e c a r nous n ' a v o n s pas pu mettre en 6vidence de p h o s p h o s 6 r i n e radioactive en ineu-

Mdtabolisme des phosphopeptides et des phosphoprotdines. bant des p h o s p h o p e p t i d e s isol6s du cerveau de p o r c a v e c des m i c r o s o m e s p r 6 a l a b l e m e n t b o u i l l i s afin d e d 6 t r u i r e r o u t e a c t i v i t 6 e n z y m a t i q u e . N o t r e t r a v a i l t e n d h m o n t r e r q u e les p h o s p h o p e p f i d e s q u e n o u s a v o n s isol6s p o u r r a i e n t ~tre d e s a c c e p t e u r s d u P,: 'de I ' A T P l o t s d e s o n h y d r o l y s e p a r les ATPas.es m e m b r a n a i r e s a u c o u r s d u t r a n s p o r t a c t i f et q u e 1.eur m 6 t a b o l i s m e est li6 h c e l u i d e s p h o s p h o p r o t 6 i n e s d o n t o n c o n n a l t le r S l e d a n s ce m 6 c a n i s m e . A p r 6 s e n t , n o u s a l l o n s e s s a y e r de c a r a c t 6 r i s e r }e s y s t 6 m e e n z y m a t i q u e i m p l i q u 6 clans le m 6 t a b o l i s m e d e s p h o s p h o p e p f i d e s .

BIBLIOGRAPHIE. 1. Ledig, M., Le Deaut, J. Y. ~ Mandel, P. (1974) Biochem. Biophys. Acta, 381, $24-336. 2. Ledig, M. a Mandel, P. (197.5) Biochimie, 57, 13771984. 3. Ledig, M. ~ Mandel, P. (19,6,9) C. R. Soe. Biol., 163, 1640-1644. 4. Ledig, M. a Mandel, P. (1969) J. Physiol. (Paris), 62, 180. 5. Ledig, M., H a u p t m a n n , G. R., Waltz, P. ~ Mandel° P. (1970) Bull. Soe. Chim. Biol., 52, 12~94-1296. 6. Rodnight, R. ~ Lavin, B. E. (1966) Biochem. J., 101, 495-501. 7. Rodnight, R., Hems, D. A. & Lavin, B. E. (1966) Biochem. J., 101, 502-515. 8. Hems, D. A. a Rodnight, R. (1966) Biochem. J., 101, 516-523. 9. Weller, M. ~ Rodnight, R. (1971) Biochem. J., 124, 393-406.

BIOCHIM1E, 1978, 60, n ° 6-7.

607

10. Weller, M. ~ Rodnight, R. (1973) Biochem. J., 132, 483~492. II. Williams, M. a R'odnight, R. (1974) Brain Res., 77, 502-5@6. 12. Alexander, D. R. a Rodnight, R. (1974) Biochem. J., 137, 253-262, 13. Dunkley, P. R., Holmes, H. a Rodnight, R. (19'77) Biochem. J., 163, 369-378. 14. Breyer, U., Lapidot, Y., Kurtz, J., Bohak, Z. a Katchalski, E. (1967) Monats Hefte f/it Chemie, 98, 1386-1394. 15. Dahl, J. L. & Hokin, L. E. (1974) Ann. Bey. Biochem., 43, 327-3:56. 16. Rubin, C. S. ~ Rosen, O. M. (1975) Ann. Bey. Biochem., 44, 831-887. 17. Glynn, I. M. ~ Ghappel, J. B. (19:63) Biochem. J., 90, 147-149. 18. Ghen, P. S., Toribara, T. a Warner, H. (1956~ Anal. Chem., 28, 1756-1758. 19. Martin, J. B., Doty, P. M. (1969) Anal. Chem., 21, 965-967. 20. Ledig, M. a Mandel, P. (1978) Biochimie, 60, 24-35. 21. Schoner, W., Von Ilberg, C., Kramer, R. ,~ Seubert, W. (1967) Eur. J. Biochem., 1, 334-343. 22. Doherty, J. D. a Matsumura, F. (1974) Biochem. Biophys. Res. Comm., 57, 987-992. 23. Froehlich, J. P. (1976) J. Biol. Chem., 251, 21862188. 24. Miller, J. A. a Paulsen, R. (]9:75) J. Biol. Chem., 250, 44~7-4432. 25. M~rdh, S. (1975) Biochem. Biophys. Acta, 391, 464470. 26. Tobin, R., Adera, T. & Brody, T. M. (1975) Biochem. Biophys. Acta, 389, 117-125. 27. Avrucht, J. ~ Fairbanks, G. (1974) Biochemistry, 13, 5.507-5521. 28. Bylund, D. B. a Huang, T. S. (19.76) Anal. Biochem., 73, 477-485. 29. Teichberg, V. I. a Changeux, J. P. (1977) FEBS Letters, 74, 71-81. 30. Baner, Jee, S. P., Dwosh, I. L., Khanna, V. K. a Sen. A. K. (1.970) Biochem. Biophys. Acta, 211, 345-355.