Effets de l'acide tannique et du metabisulfite de potassium, en association avec l'ethanol, sur quelques activites de detoxication enzymatique des microsomes hepatiques du rat

Fd Cosmrr.

Toxicol.

Vol. 14. pp. 123-127.

Pergamon

Press 1976. Printed

in Great Britain

EFFETS DE L’ACIDE TANNIQUE ET DU METABISULFITE DE POTASSIUM, EN ASSOCIATION AVEC L’ETHANOL, SUR QUELQUES ACTIVITES DE DETOXICATION ENZYMATIQUE DES MICROSOMES HEPATIQUES DU RAT D. Glaupe

et G.

GAILLARD

CHAMOKEAU

de Recherches sur /a Toxicologic des Alirnents et des Boissons, INSERM-U.87. Uniuersit& Paul Sahotier, 2 Rue Fran(ois Magendie. 314UU-Toulouse, France

et

M. SUSCHETET Sturion

de Recherches

sur la Qua/ire

des Alimenls (Recu

de I’Homme,

Ie 25 @i/let

INRA,

7 Rue Sully, 2100-Dijon,

France

IY75)

Rbum&Les activitts de la Ndemethylase du pyramidon. de I’O-d&m&thylase du p-nitroanisole et de l’hydroxylase aromatique de l’aniline ainsi que le taux du cytochrome P-450, au niveau de la fraction microsomale hipatique, sont Cvaluts chez des rats femelles soumis pendant 9 semaines & des rkgimes contenant de l’acide tannique, du metabisulfite de potassium et de l’tthanol administrts soit sCparCment soit ensemble dans toutes leurs combinaisons possibles. L’Cthanol & l’acide tannique, individuellement, stimulent les activitts de detoxication de quelques monooxygtnases microsomales et font augmenter le taux du cytochrome P-450. Lorsque ces deux substances sont administries conjointement, leurs effets deviennent additifs. ParalMement, les concentrations en prottines et en ARN des microsomes sont augmenttes en prtsence d’ethanol mais pas d’acide tannique. Bien que le sulfite ne semble pas avoir d’effet principal sur ces paramttres, il potentialise les eKets de I’acide tannique et de Ethanol sur le taux du cytochrome P-450. Abstract-The activities of amidopyrine N-demethylase, pnitroanisole O-demethylase and aniline hydroxylase, as well as the level of cytochrome P-450, were determined in the microsomal fraction of the livers of female rats maintained for 9 wk on diets containing tannic acid, potassium metabisulphite and ethanol either separately or together in each of the possible combinations. Given alone, ethanol and tannic acid each stimulated the detoxicating activities of the microsomal monooxygenases and increased the level of cytochrome P-450. When the two substances were administered together, their effects were additive. Parallel increases in the concentrations of microsomal protein and ribonucleic acid were induced by ethanol but not by tannic acid. Although the sulphite did not appear to have a significant effect on these parameters, it potentiated the effect of tannic acid and ethanol on the lever of cytochrome P-450. INTRODUCHON

Les microsomes

hCpatiques sont pourvus d’une grande diversitt d’enzymes qui peuvent mktaboliser une quantitt innombrable de substances exogines naturelles ou synthCtistes (Conney, 1967; Gaillard ct Derache, 1972). Les activitts de ces enzymes microsomales peuvent ktre stimulkes ou inhibCes 1970). par de nombreuses substances (Fouts, Cependant les ttudes concernant les interactions de plusieurs inducteurs ou inhibiteurs, administrks en mime temps, sont beaucoup plus restreintes; pourtant, il est possible que leurs effets, sur les activitCs de dttoxication enzymatique par les microsomes

I1 faut noter toutefois, que t&s peu d’Ctudes,concemantce sujet,portent sur les additifs alimentaires ou les substances naturellesdes plantesqui se trouvent danslesaliments.QuelquesCtudesont Ctkentreprisesconcernant l’tthanol qui stimule l’activit6 de dbtoxication enzymatiquemicrosomale,lorsqu’il est introduit dansle rtgime du rat (Rubin,Bacchin,Gang et Lieber, 1970; Rubin et Lieber, 1968). Lorsque l’Cthano1est administrkavecdu phtnobarbital 16-24 hr avant le sacrificedesrats, cesdeux substances ont un effet additif sur l’activitk des enzymesmicrosomales(Ariyoshi, Takabatake et Remmer.1970).Par ailleurs,l’introduction de chlorcyclizine, de DDT et d’ithanol dans des rtgimes provoque individuellementdesinductionsdeI’OdCmtthylasedu p-nitroanisoleet fait tlever le taux du cytochrome P-450; en combinaison,il y a unesommationde l’action de ces substances (Singlevichet Barboriak, 1971). A la suite de ces donntes, nous nous sommes demand&ssi l’effet stimulateurde l’ethanol sur les monooxygenases microsomales ne peut pas Ctre ren-

hbpatiques,puissentse potentialiserou exercer soit dessynergismes soit desantagonismes en entrainant desmodificationsdes actions pharmacologiques ou toxicologiquesindividuelles.Ainsi, il est connu, en clinique, que plusieursm&licamentsadministrb en memetempsg des maladespeuvent provoquer des accidentsgravestelle l’administrationconjointe d’anticoagulantset de phtnobarbital (Cucinell, Conney, lb& Sansuret Bums, 1965). 123

ou attenut: par I’administration

conjointe

de

124

D. GAILLARD.

G. CHAMOISEAU

deux substances qui se trouvent Cgalement dans l’alimentation de I’homme: les tannins et les sulfites. En effet, les tannins sont abondants, g Yetat naturel, dans des fruits (cerises, fraises, pommes), des vCgttaux (cacao. laitues) et kgalement dans des boissons comme le vin, le thi et le cafi; les sulfites sont ajoutks en quantitC non nkgligeable dans de nombreux produits alimentaires, entre autres le vin, le cidre, la bitre, ies .jus de fruits, les fruits sets. les poissons s&h& et la moutarde. Ces deux substances peuvent &re ingerCes journellcment en mZme temps que de I’Cthanol et meme itre associCes avec lui dans certaines boissons. C’est pourquoi, il nous a paru intkressant d’Ctudier les effets de I’Cthanol. de I’acide tannique* et du sulfite, soit skparkment soit associirs, sur quelques activi& de dktoxication enzymatique au niveau des microsomes hkpatiques du rat. Ces trois substances sont administrkes dans des rkgimes semi-synthbtiques, pendant 9 semaines, dans toutes leurs combinaisons possibles. Notre expCrience Porte done sur huit groupes d’animaux soumis chacun ?I un rCgime contenant soit sCparCment le sulfite, le tannin et 1’Cthanol soit les combinaisons: sulfite-tannin, sulfite-&hanol, tannin4thanol et sulfite-tannin4thanol. Le groupe tCmoin ne rqoit aucune de ces substances. METHODES

EXPERIMENTALES

hinwux et rPgiwes. Des rats femelles SPF Wistar (provenant de 1’Clevage de la Station de Recherches sur la QualitC des Aliments de 1’Homme. INRA. Dijon. France) dgirs de 28 jours, sont divisCs en huit groupes de 16 animaux chacun. 11s reqoivent comme nourriture, pendant 9 semaines, des rkgimes semisynthktiques trb hydra& dont la composition est indiquie dans le Tableau 1. Le sulfite (mttabisuhite de

*Les termes acide tannique et tannin sont employ&s indiffiremment. Tableau

I. Compositiorl

des rigimes

et

M.

SUSCHETET

potassium, E. Merck), I’acide tannique (E. Merck) et I’kthanol absolu introduits dans certains de ces rCgimes se substituent g une partie des glucides; le sulfite se substitue pondCralement au saccharose et l’acide tannique g I’amidon. En ce qui concerne I’Cthanol, la substitution est r&lisCe sur une base isocalorique (300, des calories d’origine glucidique des rCgimes n’en contenant pas). L’aliment et I’eau de boisson sont donnks ad lib. La thiamine. pouvant itre dirtruite dans les rtgimes contenant du sulfite, n’est pas introduite dans le mClange vitaminique mais est allouke aux animaux i la pipette deux fois par semaine. Pr+urutiorz

de

/r

fktiorl

rnicrosor~lalr

hf~pufiqrr.

Aprb 9 semaines de rCgimes, les animaux sont sacrifiCs par dkcapitation. Le foie est prClev& immCdiatement et pest. Une partie aliquote est aussitst plongCe dans de I’azote liquide ot elle est conservee jusqu’au moment des dosages. Sitbt aprts dCcongClation, le foie est broyt au moyen d’un Potter dans 4 vols de tampon phosphate de potassium (0.1 M, pH 7,4) glack. L’azote liquide ayant modifik la texture du tissu httpatique, une premiire centrifugation g 26OOOg. pendant 15 min ti 4”C, permet d’eliminer les ,noyaux. les mitochondries et les dCbris cellulaires. Le surnageant est alors centrifugk g 4°C g 105OOOg pendant 1 hr (ultracentrifugeuse MSE). Le culot. contenant les microsomes, est mis en suspension dans le tampon phosphate glaci: de facon g avoir une concentration en prottines de I’ordre de 8 mg/ml. Les concentrations en protkines et en acide ribonuclCique (ARN) sont dCterminCes dans la fraction microsomale respectivement selon une mkthode g la bromosulfophtal&ne (Paul, 1961) et selon la technique de Wannemacher, Banks et Wunner (1965). Les standards de protCines sent faits avec de la s&urn albumine humaine, fraction V (Nutritional Biochemicals Corp., Cleveland, Ohio); I’ARN est &al& par rapport ti de I’ARN de foie de mouton (Choay. Paris).

exp&-imentuux

administrh

au

rats

pendant

Y semaiws

Composition (g) des rkgimes

Constituants Castine Amidon Saccharose Huile de mai’s Melange salin* Methionine Agar-agar M&abisulfite de K Acide tannique Ethanol Eau MClange vitaminiquet *Mblange de Hubbel, ZnCl,

Temoin

Sulfite

23 38 28 4

23 38 27 5 4

5

Tannin

Ethanol

23 34.8 28 5 4

23 26 20 5 4

Sulfite +

Sulfite +

Tannin

tannin

kthanol

ithanoI

23 34,8 21 5 4

23 26 19 5 4

+

Sulfite

23 22.8 20 5 4

23 22.8 19 5 4

0,1

0.1

W

0,1

0.1

0,1

0.1

O,l

2

2

2

2

2

2

2

2

-

1

1

1

3.2

11.5 199 1

3,2

199

I

Mendel et Wakeman 1.66; CoCl,,6H20 0,08.

199 I

199 I

(1937)

B ccs diff&ences

prts (en g/kg

199 I de mtlange

11.5 199 1 salin):

+

tannin + &than01

-

I

3.2

32

l1,5 199 I

199 I

MnSO,,H?O

Il.5

3.50;

tLe melange vitaminique apporte, pour 1 kg de rkgime set: vitamine A “hydrosoluble” 6000 UI, vitamine D, 500 UI, vitamine E “hydrosoluble” 100 mg, vitamine K, 1 mg, riboflavine 4 mg, vitamine B, 4 mg, acide pantothtnique IOmg, amide nicotinique 50mg, acide folique 1 mg, biotine 0.2 mg, vitamine B,2 0.03 mg, chlorure de choline tOGO mg, inositol 200 mg, acide p-aminobenzdique 500 mg. La thiamine est administree siparkment g la pipette (environ 250 pg/jour).

Tannin. sulfite, &hanol et microsomes La teneur en cytochrome P-450 est Cgalement dtterminCe, en employant le coefficient d’extinction molaire de 9l/cm/mM (Omura et Sato, 1964). Er?aluation de Pactiuith de par les microsomes kpatiques.

dPtoxication

125

polynomes orthogonaux et l’analyse de variance classique permet. grdce au test de F, d’exprimer la signification des rCsultats (Lison, 1968).

enzymatiyue

L’activitt: desenzymes RESULTATS microsomalesest estimkeapr& incubation dans un tannique’et de /‘Ethanol sut milieude 6 ml contenant0,75pmol de triphosphopyr- Efits du sulfite. de facide idine nuclkotide,50 pmol de glucose-6-phosphate, 0,5 les poids des foies et .sw les taux des pror&nes. de UI de glucose-6-phosphate dCshydrogCnase, 25 pmol /‘ARN et du cytochrorne P-450des microsowes he’patidechlorure de magnCsium, 100pmol de nicotinamide, ques du rat 5 pmol de diphosphopyridinenuclkotiderkduit et 290 LeTableau2 donnelesmoyennesdesrCsultatspour jtmol de tampon phosphatede potassium,pH 7,4. lesparametrespoidscorporel, poidsdesfoieset taux Les concentrationsen substratssont de 5 PM pour desprotCines,de l’ARN et du cytochromeP-450 de I’anilineet le pyramidonet de 3 pM pour le p-nitroani- la fraction microsomaledesanimauxsoumisaux huit sole.La quantitk de proteinesmicrosomales prCsente rkgirnes.L’tthanol (F = 9,6) et le tannin (F = 104,O) dansles6 ml de milieu d’incubationest approximati- font, tous deux, diminuerle poids desanimauxaprks vement de 20 mg. L’incubation est mente, pendant 9 semaines de rCgime,alorsqu’il n’y a pasde modifi30 min sousagitation (150oscillations/min),dansun cation apris traitementau sulfite.En ce qui concerne appareilGallenkampthermostat6g 37”C,l’air servant le poids du foie rapport6 g IOOgde poids corporel, de phasegazeuse. le phtnomtne est plus complexe;le tannin fait augLes quantitt%de metabolitesform& 1 partir des menterle poidsdu foie (F = 84,4)alors que l’tthanol trois substrats utilisCs sont ensuite d6terminCes. le fait diminuer(F = 5,l). Bien que le sulfiten’ait pas L’hydroxylation aromatiquede I’aniline est &al&e d’effet principal, en combinaison avec I’tthanol par l’apparition de p-aminophtnol (Kato et Gillette. (F = 11,4)ou le tannin (F = 6,5) il se produit des 1965),I’@dCmtthylationdu p-nitroanisoleest estimte interactions,c’est-h-direqueleseffetsde cesdeux subpar la formation de p-nitrophCno1(Kato et Gillette, stancessont mod%& en prbence du sulfite qui sem1965)et la N-dtmtthylation du pyramidon est dCter- ble attCnuer leur action, ccc! se retrouvant dans la minkepar la formation de Caminoantipyrine(La Du, combinaisonsulfite-tanninGthan (F = 5,3).CepenGaudette,Trousof et Brodie, 1955).Les rCsultatssont dant I’ktude deseffetssimplesmontre que le tannin exprimesen nmolsde mitabolite forrnk/mg de pro- garde nCanmoinsune action prkpondkrantedu fait tCinesmicrosomales en 30min d’incubation. que le poids desfoies desrats soumisau tannin est Calculs statistiques. Notre expCrienceest du type toujourssignticativementplusClevt que lorsquecette expkriencefactorielle23, ?Itrois facteurs(sulfite, tan- substanceestabsentedesrCgimes. nin, Cthanol)chacun B deux niveaux (absenceou Seull’kthanolprovoque uneaugmentationdestaux prCsence du facteur);dansleshuit rtgimessont reprt- des protCines(F = 9,4) et de I’ARN (F = 7,2) au sent& les trois facteursdans toutes leurs combinai- niveau des microsomes htpatiques. Le tannin sonspossibles soit stparCmentsoit ensemble.Sur un (F = 18,5)et I’Cthanol(F = 12,l) font augmentersigparametredon&, on peut db lors &valuerI’effet pro- nificativementla concentrationen cytochrome P-450 pre de chaquefacteur et celui qui rCsultede son as- de la fraction microsomalealorsque le sulfite n’a pas sociationavec lesautres.Lesvariations entre lesdif- d’action. Lorsque les facteurssont combin& 2 g 2, fkrents groupesont 6tt: d&compostesen variations les effetsne sont qu’additifset il n’y a pasd’interacduesaux effetsprincipaux desfacteurssulfite, tannin, tion; par contre, lorsque les trois facteurs sont &than01et aux effetsd’interactionssulfite-tannin, sul- administrtsdansle m&merkgime,il y a unepotentiafite-Cthanol,tanninitthanol et sulfite-tanninGthano1. lisation du phCnom&ne dont le sulfite serait responsLes calculs ont 6tC faits suivant la technique des able (F = 6,2). Tableau2. Effets

du taux

sulfite, du tannin et de des prothines, de I’ARN

PithanoI. administrb et du cytochrome

daw

P-450des

des Ggimes, microsomes

sur le poids des foies hPpatiques du rat

et sur

/es

Poidsdu foie Prottines ARN Poidscorporel (g/100g poids microsomales microsomal CytochromeP-450 corporel) (mg/gde foie) (mg/gde foie) (nmols/gde foie) (ia Rigimes

Nombre d’animaux...

TCmoin Sulfite Tannin Ethanol Sulfite-tannin Sulfitedthanol Tannin-&than01 Sulfite-tannindthanol

16

+ 6.26 + 7,57 20281f 3,61 234,50 f 5.96 208,93 f 3,25 228,06 f. 5,27 198,12 f 2,68 203.68 f 3.80 247.00 250,18

16 3.18 3,18 3,60 3,03 3,29 3,lO 3.38 3.44

f 0,05 f 0,04 f 0,05 + 0,03 310,03 f 0,03 f 0,05 + 0,05

14

t 0,61 f 0,56 f 0,45 18,05f 0.64 IS,61 f 0.58 18.57k 0,67 18,69+ 0,61 18,14 f 0,45

16,52 16.50 16,77

14

14 2,52 2,52 2,52 2,69 2,72 2.77 2,77 2.67

f 0,08 + 0.05 f 0,09 f 0,lO f 0.07 f 0,09 f 0.05 k 406

k 0.74 + 0.68 + 0.67 f 0,43 11.61f 0.61 IO,63 f 0,70 1I,12f 0,99 12,06 f 0,79 8,23 6,98 8.64 8,78

Lesvaleursreprtsententla moyenne+ l’erreurstandardpour le nombred’anirnauxde chaquegroupeutilisi: pour I’ttudedu parambtrecorrespondant.

D. GAILLARD,

126

Tableau 3.

E’rs

du

su/jte. du dir pyramidon

tarwirl

G. CHAMOISEAU

et de fL;thol.

adrninistrds rliorau

Ed du p-aitroanisole au

et

des

M. SUSCHETET

dam des rL;yimrs. sur /es nitaholismes microsorws hhpariyues du rat

de

fmilinr.

Activite enzymatique (nmols de metabolite formi/mg proteines microsomalesJ30 min) Aniline (hydrokylation aromatique) Regimes

Nombre d’animaux...

Temoin Sulfite Tannin Ethanol Sulfite-tannin Sulfite-ethanol Tannin-ethanol Sulfite-tanninethanol

Pyramidon (N-dtmithylation) 7

7 12,16 + 0.59 12.26 + I.02 12.36 f 0,30

IS.05 f 0.64 12,02 * 0,99 20.61 f IS,42

p-Nitroanisole (O-demethylation)

1.12

+ 0.69

l7,46 f 0,73

9.01 8,68 7.68 7,92 8.08 8,52 7.36 7.71

* f + & + + + *

7 0.51 0,64 0,31 0.38 0.51 0.51 0.31 0.34

l9,44 l9,14 23.15 25.43 28,8l 28,34 28.64 32.54

f f + + f k k k

1,06 1.07 1,05 1,37 I,72 I,46 1,36 0.42

Les valeurs representent la moyenne + I’erreur standard pour les sept animaux de chaque groupe utilises pour I’etude enzymatique correspondante.

&fits flu sdfite. de rude tanr7iyue et de I’L;t/tatd sui I’acrivitr’ de dhosicatiorl des ~~ic~.osome.shPpatiyues Les resultats rapport& dans le Tableau 3 montrent que l’ethanol provoque des augmentations significatives des activites des enzymes, au niveau des microsomes hepatiques, en presence de deux substrats utiIis& lors de notre experience: l’aniline (F = 100.5) et le p-nitroanisole (F = 69,2). Avec le tannin, il y a augmentation de l’activite de I’O-demethylase du pnitroanisole (F = 20,O) et une leg&e modification de l’activite de la N-dtmethylase du pyramidon (F = 5.8). Ces cffets stimulateurs des activites de detoxication en/! matique se retrouvent dans la combinaison des facteurs, mais cependant ils ne sont qu’additifs et il n’y a pas d’interaction. DISCUSSION

En ce qui conceme l’elTet individuel de l’ethanol, apres 9 semaines d’administration dans des regimes, nos resultats recoupent ceux don& dans la litterature bien qu’ils ne nous permettent pas de savoir s’il s’agit dune induction enzymatique (Lieber, 1973) ou d’une stimulation des monooxygtnases microsomales (Ioannides et Parke, 1973). En effet, dans nos conditions experimentales, l’ethanol fait augmenter les vitesses de metabolisme de l’aniline et du p-nitroanisole; nos resultats montrent par ailleurs que le traitement a Iethanol n’aurait pas d’effet significatif sur la N-demethylase du pyramidon. L’activation des enzymes de detoxication s’accompagne. dans nos conditions experimentales, d’augmentations des taux de I’ARN et des prottines au niveau des microsomes comme cela se produit classiquement lors de ce phenomene. 11 y a Cgalement une elevation importante de la concentration en cytochrome P-450 recoupant, 18 encore. les resultats trouves dans la bibliographie. Lors dun travail anterieur, nous avions mis en evidence une inhibition de l’activite de detoxication enzymatique des microsomes aprts injection intraperitoneale d’acide tannique, alors qu’il n’y avait

aucun effet lors d’administration orale par intubation, assurement dfi au fait que le tannin ne traverse pas, dans ces conditions, la barriere intestinale en quantite suthsante pour produire le m&me phenomene (Gaillard, Mitjavila et Derache, 1974). Par contre, apres administration dans les regimes a dose nettement moins importante, nos resultats montrent qu’il y a stimulation de I’O-demtthylase du p-nitroanisole et, dans une moindre mesure, de la N-dtmethylase du pyramidon. 11 n’y a pas paralltlement de modifications des taux des proteines et de I’ARN; il est possible qu’apres passage dans les cellules hepatiques, le tannin se trouve lie dans les noyaux a I’ADN, interf&rant ainsi dans la transcription ADN-ARN (Racela, Grady et Svoboda, 1967). Lorsque l’acide tannique et l’ethanol sont administres ensemble il y a une sommation des activations de I’O-demethylase du pnitroanisole; des faits sirnilaires ont eti: signales lors de combinaison, dans des regimes, d’tthanol et de deux inducteurs: le DDT et la chlorcyclizine (Singlevich et Barboriak, 1971). Ce phtnomene se retrouve pour le cytochrome P-450 oh I’augmentation de sa concentration est additive en presence d’tthanol et d’acide tannique. Le sulfite n’a pratiquement pas #influence sur la detoxication enzymatique dans nos conditions experimentales; il est possible que le metabisulfite de potassium utilist dans les regimes soit detruit au pH de l’estomac. Neanmoins lorsqu’il est administre conjointement a l’ethanol et a I’acide tannique, dans le meme regime, il y a une potentialisation de I’augmentation du taux du cytochrome P-450, c’est-a-dire que l’elkation de la concentration en cytochrome P-450 est superieure a celle qu’on devrait normalement observer en additionnant les effets principaux des trois substances. Ceci n’est pas a negliger du fait que le cytochrome P-450 joue un r61e important dans les phtnomenes de dttoxication enzymatique; en effet, il est responsable de l’activation de I’oxygene moltculaire (Omura, Sato, Cooper, Rosenthal et Estabrook, 1965) et de la liaison avec le substrat (Imai et Sato, 1966: Schenkman, Remmer et Estabrook, 1967), per-

Tannin, sulfite. ethanol et microsomes mettant ainsi l’oxydation de nombreuses substances exogtnes (Gillette, 1966). Notre experience ne permet pas de dkfinir les mkanismes par lesquels se produisent ces phtnomtnes. Cependant. du fait de la consommation importante des boissons alcooliques qui d’ailleurs peuvent contenir des tannins et des sulfites. composes se trouvant en quantite relativement importante dans l’alimentation de l’homme. le problkme conccrnant la stimulation des monooxygcnases microsomales par ces trois substances n’est pas a negliger. Remerciements-Noous tenons a remercier tout particulierement Monsieur M. Chamoiseau. qui a bien voulu effectuer les calculs statistiques de cette experience et nous aider pour l’expression des resultats. Ce travail a bentficii de l’aide financitre du Ministere de la Protection de la Nature et de I’Environnement. convention de recherche no. 73-63 ( 140). REFERENCES

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